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乳腺癌转移抑制蛋白1下调 PI3 K／AKT1通路抑制骨肉瘤细胞转移
目的：探讨乳腺癌转移抑制蛋白1（ BRMS1）在骨肉瘤转移中的作用和机制。方法免疫组化检测骨肉瘤组织中BRMS1蛋白表达；荧光定量聚合酶链反应（ Q-PCR）法检测8例骨肉瘤组织和8个骨肉瘤细胞系BRMS1 mRNA表达的变化；western blot检测正常成骨细胞系（ HOSB）及人骨肉瘤细胞系（ OS187、COL、LM7、SJSA、MG63、HOS、SAOS-2、CCH-D）和BRMS1蛋白和AKT1蛋白磷酸化的水平；侵袭小室（ Transwell）法检测过表达BRMS1的HOS细胞转移能力的变化。结果骨肉瘤组织中BRMS1蛋白表达较癌旁正常骨组织明显减少。骨肉瘤细胞OS187、COL、LM7、SJSA、MG63、HOS、SAOS-2和CCH-D BRMS1 mRNA和蛋白的表达水平较正常成骨细胞HOSB明显降低，而AKT1蛋白磷酸化水平明显升高。 HOS细胞过表达BRMS1后，HOS细胞转移能力和AKT1蛋白磷酸化水平明显降低。运用AKT1蛋白磷酸化抑制剂LY294002明显抑制HOS细胞转移能力。结论 BRMS1可以抑制骨肉瘤细胞HOS细胞转移，其机制可能与抑制AKT1蛋白磷酸化有关。
关键词： 乳腺癌转移抑制蛋白1 人类 骨肉瘤 原癌基因蛋白质c-akt 肿瘤转移 -
卵巢上皮性癌组织中磷酸化蛋白激酶B和PTEN蛋白的表达及其意义
目的 探讨磷酸化蛋白激酶B(pAKT)和PTEN蛋白在卵巢上皮性癌(卵巢癌)组织中的表达及其相互关系,并分析两者与卵巢癌患者预后的关系.方法 应用免疫组化法,检测12份正常卵巢、20份卵巢良性上皮性肿瘤、12份卵巢交界性上皮性肿瘤、80份卵巢癌组织中pAKT和PTEN蛋白的表达,并分析两者间的关系.采用单因素和多因素生存分析法分析pAKT和PTEN蛋白表达与卵巢癌患者预后的关系.结果 pAKT蛋白在正常卵巢、卵巢良性上皮性肿瘤组织中的阳性表达率分别为8%、10%,显著低于卵巢癌组织的55%(P＜0.01);而PTEN蛋白在卵巢癌组织中的阳性表达率为45%,显著低于正常卵巢和良性上皮性肿瘤组织的100%、80%(P＜0.01).pAKT和PTEN蛋白在交界性肿瘤组织中的阳性表达率分别为25%、67%,分别与卵巢癌组织比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).pAKT和PTEN蛋白表达与卵巢癌手术病理分期、病理分级、有无淋巴结转移和远处转移有关(P＜0.05),而与年龄、病理类型、有无腹水无关(P＞0.05).卵巢癌组织中pAKT和PTEN蛋白间的表达呈明显负相关关系(r=-0.444,P＜0.01).单因素生存分析显示,手术病理分期、病理分级、有无淋巴结转移和远处转移、pAKT和PTEN蛋白阳性表达与患者预后有关(P＜0.05).Cox回归多因素分析表明,PTEN蛋白阳性表达和手术病理分期是影响卵巢癌患者预后的独立危险因素(P＜0.05).结论 pAKT蛋白过度表达伴随PTEN蛋白表达缺失可能参与卵巢癌的发生、发展,PTEN蛋白表达缺失是卵巢癌患者预后不良的独立危险因素.
关键词： 卵巢肿瘤 PTEN磷酸水解酶类 原癌基因蛋白质c-akt 预后 -
GPER在雌激素激活的子宫内膜癌细胞内PI3K/Akt信号通路中的作用
目的 探讨G蛋白偶联ER (GPER)在17β雌二醇(17β-E2)激活的子宫内膜癌细胞内磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路中的作用.方法 应用免疫组化SP法检测子宫内膜癌细胞系HEC-1A和Ishikawa细胞中GPER、ERα、ERβ、Akt和磷酸化Akt (p-Akt)蛋白的表达部位.应用蛋白印迹法检测1×10-6mol/L的17β-E2处理不同时间(分别为0、15、30、60、120 min)后HEC-1A和Ishikawa细胞中Akt蛋白活化水平及GPER、ERα和ERβ蛋白表达水平的变化.结果 免疫组化SP法检测显示,在HEC-1A细胞中,GPER、Akt、p-Akt蛋白在细胞质呈棕黄色阳性表达,ERα蛋白在细胞核呈棕黄色阳性表达,ERβ蛋白呈阴性表达；在Ishikawa细胞中,GPER、Akt、p-Akt蛋白在细胞质中均呈棕黄色阳性表达,ERα、ERβ蛋白在细胞核呈棕黄色阳性表达.蛋白印迹法检测显示,1×10-6 mol/L的17β-E2处理后,Ishikawa和HEC-1A细胞中GPER蛋白的表达水平从处理15 min开始即明显升高(P＜0.05),其中Ishikawa细胞在处理30 min时达高(为0.192±0.004),HEC-1A细胞在处理15 min时达高(为0.184±0.006)；Ishikawa和HEC-1A细胞中Akt蛋白的活化水平从处理15 min开始即明显升高(P＜0.05),其中Ishikawa细胞在处理30 min时达高(为0.666±0.021),HEC-1A细胞在处理15 min时达高(0.788±0.035)；而Ishikawa和HEC-1A细胞中ERα和ERβ蛋白的表达水平无明显变化(P＞0.05).结论 GPER可能介导了PI3K/Akt信号通路的活化,参与了子宫内膜癌的非基因转录效应.
关键词： 子宫内膜肿瘤 受体 雌激素 G-蛋白偶联 雌二醇 1-磷脂酰肌醇3-激酶 原癌基因蛋白质c-akt -
PI3K/Akt/NF-κB信号通路在FSH促进卵巢癌细胞增殖与侵袭中的作用
目的 探讨磷脂酰肌醇3激酶( PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/核因子κB(NF-κB)信号通路在卵泡刺激素(FSH)促进卵巢癌细胞增殖和侵袭中的作用.方法 培养卵巢癌细胞株SKOV3、3AO细胞,取对数生长期细胞用于以下实验,实验分为4组,即对照组、FSH组、LY294002(PI3K抑制剂)组、FSH+ LY294002组.采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度(分别为10、20、40、80、160 U/L) FSH处理不同时间(分别为12、24、48、72h)后SKOV3、3AO细胞的增殖情况,倒置显微镜观察各组SKOV3、3AO细胞的形态,体外侵袭实验检测各组SKOV3、3AO细胞的侵袭能力,蛋白印迹法检测各组SKOV3、3AO细胞中FSH受体(FSHT)、Akt1/2、磷酸化Akt (p-Akt)、NF-κB p65蛋白的表达.结果 (1)SKOV3、3AO细胞增殖率的比较:SKOV3、3AO细胞经不同浓度FSH处理不同时间后,其增殖率明显高于相应对照细胞(P＜0.05).40U/L的FSH处理SKOV3细胞48 h、3AO细胞24h时,其细胞增殖率高,分别为(166.9±1.1)％、(173.9±1.6)％.(2)各组细胞的形态:对照组SKOV3细胞为短梭形、3AO细胞为长梭形,胞核均呈圆形或椭圆形,胞质透亮；FSH组细胞变长或呈多角形,胞核较前稍增大,细胞密度较对照组增大；LY294002组细胞体积变小,胞质浓缩,部分细胞变圆漂浮；FSH+ LY294002组细胞形态较对照组无明显改变,细胞密度小于FSH组.(3)各组细胞的侵袭能力:对照组、FSH组、LY294002组及FSH+ LY294002组SKOV3细胞的穿膜细胞数分别为(26±6)、(118±19)、(18±5)、(38±7)个；3AO细胞分别为(19±4)、(134±20)、(12±3)、(58±11)个.FSH组两种细胞的穿膜细胞数均明显多于对照组(P＜0.05),LY294002组及FSH+ LY294002组两种细胞的穿膜细胞数均明显少于FSH组(P＜0.05).(4)各组细胞中相应蛋白的表达:FSH组、LY294002组、FSH+ LY294002组SKOV3、3AO细胞FSHR、Akt1/2蛋白的表达水平分别与对照组比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).FSH组SKOV3、3AO细胞p-Akt蛋白的表达水平及胞核与胞质中NF-κB p65蛋白表达的比值高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)；LY294002组、FSH+LY294002组SKOV3、3AO细胞p-Akt蛋白的表达水平及胞核与胞质中NF-κB p65蛋白表达的比值低于FSH组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 FSH可能是通过PI3K/Akt信号通路调节卵巢癌SKOV3、3AO细胞中NF-κB的活性,实现对卵巢癌细胞的促增殖和侵袭作用.
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PTX对GPER介导的雌激素激活的子宫内膜癌细胞中PI3K/Akt信号通路的影响
目的 研究百日咳毒素(PTX)对G蛋白偶联ER(GPER)介导的雌激素激活的子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1A细胞中磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路的影响.方法 采用免疫组化SP法检测Ishikawa和HEC-1A细胞中GPER蛋白的表达.将不同浓度(0、0.1、0.5、1.0 μg/ml)的PTX分别处理Ishikawa和HEC-1A细胞30 min后,再予上述浓度的PTX分别联合17β雌二醇(17β-E2；1×10-6molL)共同处理HEC-1A细胞15 min、Ishikawa细胞30 min,采用蛋白印迹法检测Ishikawa和HEC-1A细胞中GPER、ERα、ERβ蛋白的表达及Akt的活化状态[Akt的活化状态以磷酸化Akt(p-Akt)/Akt表示].结果(1)免疫组化法检测显示,在Ishikawa和HEC-1A细胞中GPER蛋白均在细胞质中呈棕黄色阳性表达.(2)蛋白印迹法检测显示,不同浓度(0、0.1、0.5、1.0μg/ml)的PTX联合17β-E2(1×10-6 mol/L)处理后,在Ishikawa细胞中,p-Akt/Akt分别为0.74±0.54、0.34 ±0.06、0.18±0.03、0.07±0.15,GPER蛋白的表达水平分别为0.872±0.490、0.395 ±0.054、0.145 ±0.014、0.034±0.008,随着PTX浓度的增加,p-Akt/Akt、GPER蛋白的表达水平均明显下降(P＜0.05),且当PTX浓度为1.0μg/ml时下降显著(F=63.729,P=0.0001;F ＝160.284,P=0.0001)；而ERα和ERβ蛋白的表达水平均无明显变化(P＞0.05).在HEC-1A细胞中,p-Akt/Akt分别为0.73 ±0.09、0.26±0.14、0.11 ±0.03、0,GPER蛋白的表达水平分别为0.927±0.134、0.485±0.022、0.194±0.004、0,随着PTX浓度的增加,p-Akt/Akt、GPER蛋白的表达水平均明显下降(P＜0.05),且当PTX浓度为1.0 μg/ml时均降至0(F=1039.321,P=0.0001；F=109.646,P=0.0001)；而ERα蛋白的表达水平无明显变化(P＞0.05),ERβ蛋白呈阴性表达.结论 在子宫内膜癌HEC-1A和Ishikawa细胞中,FTX阻断GPER后,可抑制雌激素对子宫内膜癌细胞PI3K/Akt信号通路的活化作用.
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多囊卵巢综合征患者子宫内膜组织中胰岛素PI3K/Akt信号通路的活化及其意义
目的 通过分析多囊卵巢综合征(PCOS)患者子宫内膜组织中胰岛素的磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路中Akt的表达及其活化程度,探讨PI3K/Akt信号通路活化在PCOS子宫内膜增生及癌变形成中的作用及意义,并分析影响该信号通路活化程度的因素.方法 选择2007年1月-2008年6月在天津医科大学总医院就诊的PCOS患者52例为PCOS组,非PCOS(输卵管因素不孕或卵巢良性肿瘤)患者32例为对照组；测定所有患者的血清生殖激素水平、空腹血糖及胰岛素水平,并取子宫内膜组织行病理检查；计算体质指数(BMI)、稳态模型评估法计算的胰岛素抵抗指数(HOMA-IR).对PCOS组患者根据病理检查结果分为正常子宫内膜、子宫内膜增生及癌变,根据是否存在胰岛素抵抗分为胰岛素抵抗和非胰岛素抵抗.蛋白印迹法检测子宫内膜组织中Akt、磷酸化Akt(p-Akt)蛋白的表达水平.结果(1)PCOS组患者子宫内膜组织中p-Akt蛋白的表达水平[(46±18)％]高于对照组[(33±9)％],两组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).(2)PCOS组子宫内膜增生及癌变患者子宫内膜组织中p-Akt蛋白的表达水平[(56±19)％]高于正常子宫内膜者[(31±12)％],两者比较,差异有统计学意义(P＜0.05)；胰岛素抵抗患者子宫内膜组织中p-Akt蛋白的表达水平[(50±19)％]高于非胰岛素抵抗者[(34±10)％],两者比较,差异有统计学意义(P＜0.01).(3)HOMA-IR、BMI与子宫内膜组织中p-Akt蛋白的表达水平呈正相关(r=0.400、0.326,P均＜0.05).结论 PCOS患者子宫内膜存在胰岛素PI3K/Akt信号通路的过度活化,该信号通路过度活化与PCOS子宫内膜增生及癌变有关.胰岛素抵抗、肥胖可能是影响子宫内膜组织中胰岛素PI3K/Akt信号通路过度活化的独立风险因素.
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肝脏组织磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路参与降低胎儿生长受限大鼠的胰岛素敏感性
目的 探讨肝脏组织磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinosital 3-kinase/protein kinase B,PI3-K/AKT)信号通路在胎儿生长受限(fetal growth restriction,FGR)大鼠胰岛素敏感性降低中的作用. 方法 母鼠受孕后第1天始随机分为对照组和低蛋白组,各10只.低蛋白组孕鼠采用低蛋白饮食法(粗蛋白含量为8.00％)建立FGR仔鼠模型.测定对照组和低蛋白组FGR仔鼠生后3、7、14、30、60及90 d(每组每个时间点取雄性仔鼠8只)空腹血浆葡萄糖和血清胰岛素,计算胰岛素抵抗指数及胰岛素敏感指数.实时荧光定量聚合酶链反应技术检测雄性仔鼠生后7、14、30、60及90 d肝脏组织胰岛素受体底物1、2和葡萄糖转运蛋白4 mRNA表达水平,采用Western印迹技术测定胰岛素受体底物1、PI3-K(p110β亚基)、AKT、磷酸化AKT蛋白表达水平.采用简单相关及多重线性回归分析肝脏组织中PI3-K/AKT信号通路关键分子表达改变与胰岛素敏感性变化间的关系. 结果 (1)低蛋白组新生仔鼠平均出生体重为(4.92±0.36)g,低于对照组的(6.43±0.59)g,差异有统计学意义(t=14.73,P＜0.05).低蛋白组仔鼠中FGR发生率为88.2％(97/110),其中雄性仔鼠FGR发生率为94.1％ (48/51).(2)生后60 d时FGR仔鼠空腹血浆葡萄糖开始高于对照组,直至90 d.FGR仔鼠空腹血清胰岛素和胰岛素抵抗指数30 d时显著高于对照组,持续至90 d.FGR仔鼠胰岛素敏感指数自30 d始即显著低于对照组,直至90 d,差异均有统计学意义(P均＜0.05).(3)与对照组相比,FGR仔鼠7d时胰岛素受体底物1、2 mRNA表达均显著降低(0.45±0.02与0.68±0.03,t=16.633,P＜0.05;0.34±0.10与0.70±0.19,t=4.864,P＜0.05),并持续至生后90 d(0.48±0.03与0.59±0.05,t=5.237,P＜0.05;0.49±0.20与0.70±0.11,t=2.253,P＜0.05)；胰岛素受体底物1、PI3-K及磷酸化AKT蛋白表达自14d时出现降低(0.22±0.05与0.52±0.11,t=7.024,P＜0.05;0.46±0.03与0.97±0.08,t=17.508,P＜0.05;0.62±0.10与0.89±0.08,t=6.100,P＜0.05),持续至生后90 d(1.11±0.08与1.32±0.14,t=3.714,P＜0.05;0.63±0.07与1.00±0.19,t=5.206,P＜0.05;0.28±0.03与0.45±0.10,t=4.880,P＜0.05).(4)FGR仔鼠磷酸化AKT蛋白表达量与胰岛素敏感指数呈正相关(r=0.704,P＜0.05)；磷酸化AKT蛋白表达量分别与空腹血浆葡萄糖、空腹血清胰岛素和胰岛素抵抗指数变化呈负相关(r分别为-0.609、-0.561和-0.577,P均＜0.05). 结论 FGR仔鼠肝脏组织中PI3-K/AKT信号通路中某些关键分子表达发生变化,可能参与了胰岛素抵抗的发生.
关键词： 胎儿生长迟缓 胰岛素抗药性 1-磷脂酰肌醇3-激酶 原癌基因蛋白质c-akt 肝 疾病模型 动物 -
滋养细胞自噬在子痫前期胎盘中的形成及调控机制
目的 探讨自噬在子痫前期患者胎盘滋养细胞中的形成及调控机制.方法 选择2016年8月至2016年11月在南京医科大学附属常州妇幼保健院产科剖宫产的20例重度子痫前期患者为子痫前期组,随机选取同期剖宫产的血压正常、无蛋白尿的20例正常孕妇为对照组.同时收集2组孕妇胎盘组织,采用透射电镜观察胎盘滋养细胞的超微结构及自噬体形成情况,实时定量聚合酶链反应和Western印迹法检测胎盘组织中微管相关蛋白l轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B,MAPlLC3B,亦称LC3B)和Beclin 1的表达情况,以及Western印迹法检测胎盘组织中蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,亦称Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路的活性.采用两独立样本t检验或Mann-Whitney U检验对数据进行统计学分析.结果 透射电镜可观察到重度子痫前期患者胎盘滋养细胞胞膜微绒毛稀少、排列紊乱,胞质中可见典型的自噬体形成增加.子痫前期组孕妇胎盘组织中LC3B mRNA和蛋白的表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-I比值均高于对照组[分别为3.37 (2.37～6.11)与0.62(0.25～4.15)、1.40±0.17与1.00±0.13及1.57±0.25与1.00±0.31,Z或t值分别为-4.440、3.274及3.113,P值均＜0.05].而2组孕妇胎盘组织中Beclin 1 mRNA和蛋白的表达差异无统计学意义(P值均＞0.05).与对照组相比,子痫前期组孕妇胎盘组织中Akt和mTOR蛋白的磷酸化修饰水平明显下降(分别为1.00±0.29与0.64±0.21、1.00±0.32与0.60±0.22,t值分别为-3.672及-2.895,P值均＜ 0.05);但2组胎盘组织中Akt及mTOR蛋白表达差异均无统计学意义(P值均＞0.05).结论 重度子痫前期患者胎盘中Akt/mTOR通路活性下降,滋养细胞自噬过度激活,提示Akt/mTOR通路活性下降致使滋养细胞自噬过度激活可能是子痫前期发病的重要机制.
关键词： 先兆子痫 滋养层 自噬 胎盘 原癌基因蛋白质c-akt TOR丝氨酸-苏氨酸激酶 -
慢性鼻-鼻窦炎鼻黏膜中糖原合成酶激酶3β与PI3K/Akt及白细胞介素6间的相关性
目的 研究慢性鼻-鼻窦炎鼻黏膜中糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)与PI3K/Akt信号通路以及细胞因子白细胞介素(interleukin,IL)6之间的相关性及其意义.方法 分别用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组化法检测30例慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps,CRSwNP)患者、20例慢性鼻-鼻窦炎不伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis without nasal polyps,CRSsNP)患者的组织标本以及20例鼻中隔偏曲患者的鼻黏膜标本中GSK3β、PI3K、Akt的mRNA和蛋白质的表达,并用半定量RT-PCR检测细胞因子IL-6在CRSwNP组、CRSsNP组和对照组鼻黏膜中的表达.采用SPSS 16.0软件进行统计学分析.结果 GSK3β、PI3K、Akt、IL-6 mRNA在CRSwNP组中的相对表达量分别为0.6254±0.0584、0.8239±0.7186、0.9369±0.0823、0.8973±0.0680,在对照组分别为0.2684±0.0726、0.3578±0.0994、0.6721±0.0590、0.5898 ±0.0891,差异有统计学意义(t值分别为2.358、3.071、2.764、2.239,P值均＜0.05).以上四项指标在CRSwNP组和CRSsNP组之间的表达差异无统计学意义(t值分别为1.597、1.842、1.468、0.926,P值均＞0.05).GSK3β、PI3K、Akt蛋白主要表达在黏膜上皮细胞、黏膜下腺体细胞及炎性细胞中,阳性染色主要定位于胞质,其在CRS鼻黏膜中的阳性表达率明显高于对照组中的阳性表达率,差异有统计学意义(x2值分别为16.42、16.25、15.57,P值均＜0.01).GSK3β、PI3K、Akt蛋白在CRSwNP组和CRSsNP组的阳性表达率差异无统计学意义(x2值分别为3.27、2.85、2.46,P值均＞0.05).GSK3β与PI3K、Akt以及IL-6在CRS患者中的表达呈正相关趋势(r值分别为0.645、0.617、0.583,P值均＜0.01).结论 IL-6、PI3K、Akt、GSK3β在CRS鼻黏膜中的异常表达可能在CRS的发生、发展讨程中发挥着一定的作用.
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结肠癌细胞对吉非替尼的敏感性与Akt、MAPK表达的关系
达弱(P<0.05).结论 Akt、MAPK及其磷酸化蛋白的表达水平与结肠癌细胞对吉非替尼的敏感性不一致,提示结肠癌对吉非替尼的反应性不能完全由EGFR表达和活性决定,也与其下游信号蛋白Akt、MAPK无关.
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EGFR信号通路的活化状态与结肠癌细胞对吉非替尼敏感性的关系
vo、HT29和HCT116细胞内PTEN的表达均无明显变化(P>0.05).结论 耐受吉非替尼的细胞表现为其生长不依赖EGFR,且下游信号通路的活化状态不伴随EGFR活性受阻而受抑制.结肠癌细胞对吉非替尼的敏感程度是由细胞对EGFR的依赖性以及EGFR和下游信号通路的伴随性所决定的.
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Akt信号途径参与二氮嗪预处理抑制缺氧复氧损伤大鼠海马神经元的凋亡
目的 探讨二氮嗪(DZ)预处理能否通过上调Akt信号增强Bcl-2表达、抑制Bax表达发挥抗凋亡作用.方法 离体培养9～10 d SD大鼠海马神经元分为正常对照组(A组)、缺氧组(B组)、缺氧+DZ 100 μmol/L组(c组)、缺氧+DZ 100 μmol/L+5-羟癸酸100 μmol/L组(D组)、缺氧+DZ 100 μmol/L+LY294002 50 μmol/L组(E组),自缺氧前2 d开始,神经元接受DZ预处理,每天1次,每次1 h.每次实验,每组16孔或2皿细胞,实验重复3次.比较缺氧4 h复氧48 h各组海马神经元的活力、凋亡率、Akt、Bcl-2和Bax蛋白的表达程度.结果 缺氧复氧后C组吸光度值较B、D、E组显著增高(P＜0.05);其他缺氧各组间比较,差异无统计学意义(P＞0.05).C组凋亡率较B、D、E组显著减低(P＜0.05).C组Akt、Bcl-2表达较B、D、E组强烈(P＜0.05),Bax表达则减弱(P＜0.05).B、D、E组问比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 DZ可经Akt信号通路上调Bcl-2/Bax蛋白比值而抑制缺氧复氧损伤大鼠海马神经元的凋亡.
关键词： 二氮嗪 缺氧 凋亡 原癌基因蛋白质c-akt 原癌基因蛋白质c-bcl-2 -
Akt/mTOR在高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化中的表达及对核心结合因子的调节
目的 观察蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Akt/mTOR)在高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)钙化模型中的表达及其对核心结合因子α1(Cbfα1)表达的调节.方法 体外培养的大鼠VSMC,分为正常磷组(1.3 mmol/L)和高磷组(2.6 mmol/L),培养7d后,观察细胞形态及茜素红染色细胞钙盐沉积,实时定量PCR检测Cbfα1、骨桥蛋白(OPN) mRNA水平,Western印迹检测磷酸化Akt(p-Akt)(ser473)、磷酸化mTOR(p-mTOR)(S2448)、Cbfα1和OPN蛋白的表达.检测到Akt、mTOR活化表达后,给予不同浓度的渥曼青霉素(5、10、30、50和100 nmol/L)和雷帕霉素(1、10和100 ng/ml)干预24、48 h后,检测Cbfα1、OPN、p-Akt和p-mTOR基因和蛋白表达,7d后观察VSMC钙盐沉积变化.结果 VSMC高磷干预7d后,与正常磷组相比,高磷组钙盐沉积明显,Cbfα1、OPN mRNA表达增高(均P＜0.05),p-Akt、p-mTOR、Cbfα1和OPN蛋白表达增高(均P＜0.05).渥曼青霉素、雷帕霉素干预24 h后,相对于高磷组,高磷+渥曼青霉素30、50、100 nmol/L组Cbfα1、OPNmRNA表达明显下调(均P＜0.05);高磷+雷帕霉素1、10和100 ng/ml组Cbfα1、OPN mRNA表达下调(均P＜0.05).渥曼青霉素、雷帕霉素干预48 h后,与高磷组比较,高磷+渥曼青霉素30、50、100 nmol/L)组p-Akt、Cbfα1和OPN蛋白表达明显下调(均P＜0.05);高磷+雷帕霉素1、10、100 ng/ml组,p-mTOR、Cbfα1和OPN蛋白表达呈剂量依赖性下调(均P＜0.05).VSMC培养7d后,与高磷组相比,高磷+渥曼青霉素和高磷+雷帕霉素组钙盐沉积明显减轻.结论 高磷可体外诱导大鼠VSMC钙化,Akt、mTOR参与了高磷诱导的大鼠VSMC钙化,并可能通过调控Cbfα1因子而起作用.
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肝癌中NDRG2、AKT2 mRNA及其磷酸化蛋白的表达
目的：检测不同病理级别原发性肝细胞癌中N-myc下游调节基因2( NDRG2)和蛋白激酶B2( AKT2) mRNA及其磷酸化蛋白的表达水平。方法收集不同病理级别原发性肝细胞癌组织及癌旁正常肝组织标本各30例,检测标本中NDRG2、AKT2 mRNA及其磷酸化蛋白的表达情况,并对其间的相互关系进行分析。结果30例原发性肝细胞癌组织中NDRG2 mRNA表达低于瘤旁组织(P<0．05),AKT2 mRNA与瘤旁组织无明显差异(P>0．05),两者均与病理级别无关(P>0．05),且NDRG2与AKT2表达无相关性(P>0．05)。在高表达474位丝氨酸磷酸化的AKT2蛋白(P-AKT2-SER474)分子的标本中,两个NDRG2磷酸化分子多为低表达,相反,在低表达P-AKT2-SER474分子的标本中,两个NDRG2磷酸化分子多为高表达。结论在mRNA表达水平,还不能认为NDRG2与AKT2之间有相关性。在蛋白质水平,NDRG2的磷酸化不依赖于AKT2的磷酸化,且NDRG2与AKT2的磷酸化作用可能存在竞争关系。
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抑制酰基-辅酶A去饱和酶1表达对食管鳞癌细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制探讨
目的:检测酰基-辅酶A去饱和酶1(stearoyl-CoA desaturase-1,SCD-1)在食管鳞癌组织和细胞中的表达,分析其表达下调对食管鳞癌EC1细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其相关的分子机制.方法:采用免疫组织化学和原位杂交法检测60例食管鳞癌组织及其相应癌旁正常食管黏膜组织中SCD-1 mRNA和蛋白的表达,实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测正常食管组织(作为阴性对照)和食管鳞癌细胞株中SCD-1 mRNA和蛋白的表达.不同浓度SCD-1小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)转染食管鳞癌EC1细胞后,采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测SCD-1 mRNA和蛋白的表达,应用CCK-8法检测转染前后EC1细胞增殖的变化,FCM检测转染前后EC1细胞凋亡的改变,蛋白质印迹法检测总Akt、p-Akt、bcl-2和bax蛋白的表达.结果:食管鳞癌组织中SCD-1 mRNA和蛋白表达的阳性率显著高于正常食管黏膜组织(P＜0.05),其表达上调与肿瘤组织分级、TNM分期和淋巴结转移密切相关(P＜0.05).此外,与正常食管组织相比,食管鳞癌EC9706、Eca109和EC1细胞中SCD-1 mRNA和蛋白表达均显著上调(P＜0.05),其中EC1细胞中SCD-1的表达水平高.50 nmol/L SCD-1 siRNA能显著下调EC1细胞中SCD-1 mRNA和蛋白的表达.SCD-1表达下调可显著抑制EC1细胞的增殖,诱导细胞凋亡；同时,显著上调bax蛋白的表达,并下调p-Akt和bcl-2蛋白的表达,但不改变总Akt的表达水平.结论:SCD-1可能在食管鳞癌的发生和发展中具有重要作用,抑制SCD-1的表达有望成为食管鳞癌重要的分子治疗策略之一.
关键词： 食管肿瘤 硬脂酰CoA去饱和酶 细胞增殖 细胞凋亡 原癌基因蛋白质c-akt -
磷酸化AKT与磷酸化EGFR在非小细胞肺癌中的表达及意义
目的:评价磷酸化表皮生长因子受体(phosphorylated epidermal growth factor receptor,p-EGFR)及其信号转导通路下游分子AKT的活化形式磷酸化AKT(phosphorylated AKT,p-AKT)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中的表达及其意义.方法:免疫组织化学法检测95例NSCLC组织中p-AKT和p-EGFR蛋白的表达,并分析2种蛋白表达之间的关系及与预后的相关性.结果: p-EGFR的阳性表达率为57.89%(55/95),在低年龄组(33/46)、女性组(24/30)和腺癌组(35/52)的表达率较高,差异有统计学意义(P=0.008, P=0.003, P=0.009).p-AKT的阳性表达率为66.32%(63/95),在低分化组(20/23)、有淋巴结转移组(29/37)和肿瘤较小(≤3 cm)组(36/46)的表达率较高,差异有统计学意义(P=0.036,P=0.047,P=0.017).单因素分析显示,p-AKT和p-EGFR蛋白表达与预后无关(P=0.854,P=0.729).多因素分析显示,2种蛋白表达与生存时间也无关(P=0.497,P=0.731).p-AKT表达与p-EGFR表达呈正相关性(r=0.204,P=0.047).结论:p-EGFR和p-AKT的阳性表达率对NSCLC患者预后无提示意义,二者均不能成为预后指标.
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PI3K/Akt信号通路与神经保护
PI3K/Akt通路是由磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)始动的生物信号转导通路,在细胞增殖、细胞周期调控、凋亡启动、血管生成等方面发挥着关键作用.此外,PI3K/Akt通路还与中枢神经系统损伤的保护机制密切相关.深入研究PI3K/Akt、下游分子及其调控机制可能为脑损伤的治疗提供新的思路和方法.
关键词： 磷脂酰肌醇3-激酶类 原癌基因蛋白质c-akt 脑缺血 血脑屏障 神经保护药 -
永久性大脑中动脉闭塞大鼠梗死周围组织p-Akt(Ser473)、p-Bad(Ser136)表达与细胞凋亡
目的 探讨永久性大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠脑梗死周围组织p-Akt(Ser473)、p-Bad(Serl36)表达的变化及其与细胞凋亡关系.方法 60只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术、MCAO 3 h、MCAO 12 h、LY294002干预MCAO 3 h和 LY294002干预MCAO 12 h组,每组12只.改良线栓法制作永久性MCAO模型,LY294002干预组在模型制作前15min经侧脑室给药.采用Longa法进行神经功能评分,氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC)法检测梗死体积,免疫组织化学染色法检测梗死周围组织p-Akt(Ser473)和p-Bad (Ser136)表达,TUNEL法检测梗死周围组织凋亡细胞.结果 模型制作后3h,所有实验大鼠均从麻醉中清醒.假手术组神经功能缺损评分为0分,MCAO 3 h组、MCAO 12 h组、LY294002干预MCAO 3 h组和LY294002干预MCAO 12 h组分别为(2.25±0.45)、(2.92±0.99)、(3.00±0.95)和(3.02 ±0.36)分,各组间存在显著性差异(F =26.520,P=0.000).其中,LY294002干预MCAO 3 h组显著性高于MCAO 3 h组(P=0.009),LY294002干预MCAO 12 h组与MCAO 12 h组无显著性差异(P=0.354).TTC染色显示,假手术组未见梗死灶,MCAO 3 h组、MCAO 12 h组、LY294002干预MCAO 3 h组和LY294002干预MCAO 12 h组梗死体积分别为(23.4±1.4)、(40.3±1.1)、(31.9±6.0)和(44.4±3.8)mm3,各组间存在显著性差异(F=30.440,P=0.000).其中,LY294002干预MCAO 3 h组显著性大于MCAO 3 h组(P =0.002),LY294002干预MCAO 12 h组与MCAO 12 h组无显著性差异(P=0.113).与假手术组相比,MCAO 3 h组梗死周围组织p-Akt(Ser473)表达显著性增高,MCAO 12 h组显著性下降；p-Bad(Ser136)表达水平随着MCAO时间的推移呈现进行性下降,同时凋亡细胞数量进行性增多.LY294002干预后,MCAO 3 h时梗死周围组织p-Akt(Ser473)和p-Bad(Ser136)表达水平均显著性下降,凋亡细胞数量显著性增多(P＜0.05),但对MCAO后12 h时的各指标无显著性影响.结论 脑梗死早期P13K/Akt信号转导通路的激活以及该通路关键蛋白p-Akt(Ser473)的应激性升高具有脑保护作用,而脑梗死后期该通路活性的衰竭及其关键蛋白的急剧降低则与脑损伤有关.
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抑制可溶性环氧物酶对局灶性脑缺血再灌注大鼠的神经保护作用
目的 探讨可溶性环氧物酶(soluble epoxide hydrolase,sEH)抑制剂12-(3-金刚烷-1-基脲基)-十二烷酸[12-(3-adamant an-1-yl-ureido)-dodec-anoic acid,AUDA]对局灶性脑缺血再灌注大鼠的神经保护作用和机制.方法 60只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组、生理盐水对照组以及小剂量(0.157 ml/kg)、中剂量(0.235 ml/kg)和大剂量(0.314 ml/kg) AUDA处理组(每组12只),各组随机取4只大鼠分别用于梗死体积、细胞凋亡和p-Akt免疫组织化学检测.线栓法建立大脑中动脉闭塞再灌注模型.各AUDA处理组和生理盐水对照组均在再灌注前分别经腹腔给予相应剂量的AUDA或等体积生理盐水.再灌注24 h时进行神经功能缺损评分.2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色法检测脑梗死体积.原位缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)检测梗死周围区脑组织细胞凋亡.免疫组织化学法检测梗死周围区脑组织p-Akt表达.结果 TTC染色显示,假手术组未见梗死.生理盐水对照组以及小剂量、中剂量和大剂量AUDA组梗死体积分别为(254.146±25.481)、(212.679±7.514)、(150.188±33.997)和(99.563±3.415) mm3,存在显著性差异(F=39.637,P=0.000).各剂量AUDA组均显著性小于对照组(P均=0.000).中剂量AUDA组显著性小于小剂量AUDA组(P=0.002),而大剂量AUDA也显著性小于小剂量AUDA组(P =0.000)和中剂量AUDA组(P=0.006).TUNEL染色法显示,假手术组仅可见少量凋亡细胞[(6.400±1.477)个/高倍视野].生理盐水对照组以及小剂量、中剂量和大剂量AUDA组凋亡细胞数量分别为(57.550±13.067)、(47.030±8.423)、(34.530±4.393)和(26.400±2.683)个/高倍视野,各剂量AUDA组显著性少于生理盐水对照组(P均＜0.01),中剂量和大剂量AUDA组显著性少于小剂量AUDA组(P均＜0.01),大剂量AUDA组也显著性少于中剂量AUDA组(P＜0.01).免疫组织化学显示,假手术组仅可见少量p-Akt阳性细胞[(3.325±1.438)个/高倍视野],生理盐水对照组以及小剂量、中剂量和大剂量AUDA组p-Akt阳性细胞数量分别为(9.450 ±2.531)、(16.400 ±3.865)、(22.875±7.974)和(29.300±3.203)个/高倍视野,各剂量AUDA组显著性多于生理盐水对照组(P均＜0.01),中剂量和大剂量AUDA组显著性多于小剂量AUDA组(P均＜0.01),大剂量AUDA组也显著性多于中剂量AUDA组(P＜0.01).结论 抑制sEH可能通过上调PI3K/Akt通路减少梗死周围区神经元凋亡和缩小梗死体积,对局灶性脑缺血再灌注大鼠具有神经保护作用.
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信号素3A诱导培养大鼠皮质神经元凋亡与PI3K/Akt通路有关
目的 探讨外源性信号素3A(semaphorin 3A,Sema3A)对原代培养大鼠皮质神经元凋亡的影响和磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine kinase,Akt)通路在Sema3A诱导凋亡中的作用.方法 体外培养新生Sprague-Dawley大鼠皮质神经元,并用微管相关蛋白-2免疫荧光染色鉴定.培养大鼠皮质神经元随机分为正常对照组和不同浓度Sema3A(500、1 000和2 000 μg/ml)组.CCK8法检测神经元存活率,Hoechst33342染色和TUNEL染色观察神经元凋亡,蛋白质印迹法检测P-Akt、Akt和Bcl-2表达.结果 培养的皮质神经元纯度达95％以上.CCK8检测显示,500、1 000、2 000 μg/ml Sema3A组细胞存活率分另为对照组的(80.9±5.3)％、(67.5±3.9)％和(50.2±4.4)％(F=165.042,P=0.000).Hoechst33342染色显示,正常对照组及500、1 000、2 000μg/ml Sema3A组神经元凋亡率分别为(22.4±1.2)％、(34.0±1.2)％、(39.3±1.4)％和(47.3 ±2.3)％ (F=103.237,P=0.ooo).TUNEL染色显示,正常对照组及500、1 000、2 000 μg/ml Sema3A组神经元凋亡率分别为(23.9±1.1)％、(31.9±1.0)％、(40.1±1.5)％和(51.4±3.4)％ (F=103.118,P=0.000).蛋白质印迹法显示,随着Sema3A浓度的增高,P-Akt(F=15.959,P=0.001)和Bcl-2(F=18.776,P=0.001)表达逐渐下调;而Akt表达无显著改变(F=0.590,P=0.639).结论 Sema3A主要通过诱导神经元凋亡而降低培养皮质神经元存活率,其机制可能与下调P-Akt和Bcl-2表达有关.
