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信号素3A和基质金属蛋白酶-14在非小细胞肺癌中的表达及意义
目的 检测非小细胞肺癌组织中信号素3A(Semaphorin3A和基质金属蛋白酶-14(MMP-14)的表达关系,探讨联合检测Semaphorin3A及MMP-14对预后的判断价值.方法 94例非小细胞肺癌术后留取的蜡块及临床资料作为观察组,选择80例正常肺组织作为对照组,应用免疫组织化学技术检测二组中Semaphorin3A和MMP-14的表达,分析肿瘤中Semaphorin3A及MMP-14的关系.结果 观察组中Semaphorin3A蛋白表达的阳性率明显低于对照组,观察组中MMP-14表达的阳性率明显高于对照组.观察组中Semaphorin3A及MMP-14表达的阳性率均与肿瘤的胸膜侵犯、淋巴结转移、淋巴结转移个数、分化程度、脉管浸润及PCNA的表达密切相关;Semaphorin3A蛋白的表达与肿瘤的大直径密切相关;Semaphorin3A及MMP-14的表达具有负相关性,生存分析显示Semaphorin3A及MMP-14的表达与预后相关.结论 非小细胞肺癌组织中Semaphorin3A低表达、MMP-14高表达时促进肿瘤的发生和进展,二者可能具有负向协同作用,术后联合检测Semaphorin3A及MMP-14的表达对判断预后有一定价值.
关键词： 癌 非小细胞肺 信号素3A 基质金属蛋白酶-14 -
颞叶癫(癎)大鼠模型内嗅皮质和齿状回内Sema3A及其受体Np1的表达变化
目的 探讨颞叶癫(癎)大鼠脑内Sema3A及其受体Np1的表达变化在癫(癎)发病中的作用.方法 SD大鼠制成颞叶癫(癎)模型,Neo-Timm染色证实苔藓纤维出芽,免疫组化和原位杂交技术对致(癎)后不同时间点内嗅皮质和齿状回的Sema3A mRNA、Np1 mRNA和蛋白表达进行分析.结果 与对照组比较,颞叶癫(癎)大鼠海马齿状回内分子层存在苔藓纤维出芽(7 d:0.70±0.42,15 d:1.50±0.52,30 d:2.20±0.41,60 d:2.50±0.51,P＜0.05);在匹罗卡品致(癎)后7 d,实验组内嗅皮质区Sema3A mRNA的表达(0.3006±0.0675)明显低于对照组(0.4562±0.0457,P＜0.01);齿状回内Np1mRNA(0.2337±0.0358)及蛋白(0.2706±0.0389)的表达亦明显低于对照组(P＜0.01).结论 内嗅皮质区Sema3A mRNA、齿状回内Np1 mRNA和蛋白的表达下调,可能参与了苔藓纤维的出芽机制.
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信号素3A 对氧诱导视网膜病变大鼠视网膜细胞凋亡的影响
目的：探讨信号素3A（ SEMA3A）在大鼠氧诱导视网膜病变（ OIR）模型中的表达变化及其对视网膜组织损伤的影响。方法实验研究。采用随机数字表法将新生大鼠48只分为4组，每组12只（12眼）。正常对照组于正常空气环境下饲养，余3个组隔天交替吸入氧含量为50％和10％的氮氧混合气体，制备OIR模型。 OIR＋SEMA3A抑制组于出生后7 d给予单眼玻璃体腔注射兔抗大鼠SEMA3A多克隆抗体（40 mg/L，2μl）；OIR＋IgG组出生后7 d给予单眼玻璃体腔注射等量兔IgG （40 mg/L，2μl）；OIR组不进行玻璃体腔注射。各组大鼠出生后18 d取材，HE染色检测视网膜厚度、神经节细胞层（ RGCL）细胞数和突破内界膜内皮细胞数，TUNEL染色检测视网膜细胞凋亡并计算凋亡指数（ AI）；免疫印迹法检测视网膜SEMA3A和Caspase-3蛋白p17亚基表达；免疫荧光染色定位检测SEMA3A表达。各组大鼠视网膜厚度、RGCL细胞数、突破内界膜内皮细胞数，视网膜AI，SEMA3A和Caspase-3蛋白p17亚基相对表达量的比较采用单因素方差分析，进一步的两两比较采用LSD-t检验。结果 HE染色结果显示，正常对照组视网膜厚度为（117.07±8.13）μm，OIR组为（70.93±5.68）μm，OIR＋SEMA3A抑制组为（91.28±4.58）μm，OIR＋IgG组为（67.27±10.15）μm，差异有统计学意义（F＝13.222，P＝0.002）。正常对照组RGCL细胞数为42.7±3.6，OIR组为24.3±3.1， OIR＋SEMA3A抑制组为35.0±6.2，OIR＋IgG组为22.8±4.3，差异有统计学意义（ F＝22.537，P＝0.000）。正常对照组突破内界膜的内皮细胞数为1.0±0.3，OIR组为14.2±3.2，OIR＋SEMA3Aab组为9.6±1.1， OIR ＋IgG 组为10.8±1.6，差异有统计学意义（ F ＝14.478， P ＝0.002）。 OIR ＋SEMA3A抑制组视网膜厚度、RGCL细胞数均低于正常对照组（P＜0.01），但均较OIR组和OIR＋IgG组明显增高（P＜0.01）；OIR＋SEMA3A抑制组突破内界膜的内皮细胞数高于正常对照组（P＜0.01），但与OIR组和OIR＋IgG组差异无统计学意义（P＞0.05）。正常对照组视网膜AI值为27.67±2.51， OIR组为58.33±8.50，OIR＋SEMA3A抑制组为37.33±5.03，OIR＋IgG组为61.67±6.65，差异有统计学意义（F＝19.250，P＝0.001）。 OIR＋SEMA3A抑制组视网膜AI较OIR＋IgG组和OIR组降低（P＜0.01）。应用TatolLab 2.01软件对免疫印迹法检出的蛋白条带进行分析，正常对照组SEMA3A相对表达量为0.64±0.03，OIR组为0.97±0.05，OIR＋SEMA3A抑制组为0.41±0.02，OIR＋IgG组为1.03±0.15，差异有统计学意义（F＝38.59，P＝0.000）。 OIR组视网膜组织SEMA3A蛋白相对表达量较正常对照组明显增高（ P＜0.01）；OIR＋SEMA3Aab组视网膜组织SEMA3A蛋白相对表达量明显低于OIR组和OIR＋IgG组（P＜0.01）。免疫荧光染色结果显示，正常对照组SEMA3A主要分布于光感受器细胞层， OIR 组和 OIR ＋IgG 组 SEMA3A 荧光强度明显增加，各层均可见着染， OIR ＋SEMA3A抑制组其荧光强度明显减弱。免疫印迹法检测各组视网膜组织Caspase-3蛋白p17亚基相对表达量，正常对照组为0.00±0.00，OIR组为0.30±0.02，OIR＋SEMA3A抑制组为0.12±0.01， OIR＋IgG组为0.27±0.02，差异有统计学意义（ F＝304.619，P＜0.01）。其中OIR＋SEMA3A抑制组较OIR＋IgG组和OIR组明显降低（P＜0.01）。结论大鼠OIR模型视网膜组织中SEMA3A表达上调可能促进视网膜神经细胞凋亡。阻断SEMA3A可减轻视网膜组织的凋亡程度。（中华眼科杂志，2014，50：440-447）
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信号素3A刺激的干细胞膜片对2型糖尿病大鼠骨再生作用的研究
目的 评价信号素3A刺激的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)膜片对2型糖尿病大鼠新骨形成的影响.方法 通过注射链脲佐菌素构建2型糖尿病大鼠模型,分离、培养BMSC并鉴定,诱导成膜;使用随机数字表法将15只2型糖尿病大鼠随机分为对照组、膜片组、信号素3A膜片组(每组5只),构建大鼠颅骨极限骨缺损模型,对照组植入骨粉,膜片组植入BMSC细胞膜片和骨粉,信号素3A膜片组植入用1.0 mg/L信号素3A刺激的BMSC细胞膜片和骨粉,8周后取材分别行显微CT扫描及HE染色,分析新骨形成情况,免疫组化观察Ⅰ型胶原、骨形态发生蛋白2和骨钙蛋白的表达.结果 分离培养的2型糖尿病大鼠BMSC经茜素红、油红O染色鉴定具有多向分化潜能.构建大鼠颅骨极限骨缺损模型8周后,显微CT扫描可见,信号素3A膜片组新骨形成多,骨体积分数(bone volume/tissue volume,BV/TV)(0.516±0.070)显著大于膜片组(0.319±0.050)和对照组(0.224±0.037)(P＜0.05),膜片组BV/TV显著大于对照组(P＜0.05);而3组骨小梁厚度差异无统计学意义(P＞0.05).HE染色分析显示,信号素3A膜片组新骨形成比值(0.421±0.069)显著大于膜片组(0.174±0.051)和对照组(0.099±0.033)(P＜0.05),膜片组新骨形成比值显著大于对照组(P＜0.05).免疫组化染色观察可见,膜片组Ⅰ型胶原、骨形态发生蛋白2、骨钙蛋白阳性表达多于对照组,而信号素3A膜片组Ⅰ型胶原、骨钙蛋白阳性表达多于膜片组和对照组.结论 联合植入信号素3A刺激的BMSC细胞膜片和骨粉,可显著增加2型糖尿病大鼠的骨再生能力.
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信号素3A在骨自稳态与骨重塑中的作用
信号素3A(semaphorin 3A,Sema3A)属于轴突导向因子超家族的成员.近来研究发现,该蛋白在骨自稳态和骨重塑过程中发挥重要调节作用.本文从Sema3A的生物学特性、细胞调控作用和对骨骼系统的神经分布影响等方面出发,对Sema3A在骨自稳态和骨重塑中的作用进行综述,为临床骨质疏松药物靶点研究提供参考.
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Semaphorin3 A抗骨质疏松作用靶点的研究进展
骨重塑是一个动态、持续的过程，包括两个阶段：破骨细胞作用下骨的吸收、迁移和成骨细胞作用下新骨的合成，一旦此平衡失调，就会导致严重的骨代谢疾病。目前临床中已广泛应用的抗骨质疏松药物存在一个共性问题，即抑制骨吸收的同时也抑制了新骨的形成。而Semaphorin3A作为成骨细胞产生的一种分泌型蛋白，抑制骨吸收的同时促进了新骨的再生，在骨质疏松的治疗方面具有双向调节作用，为骨质疏松的治疗提供了新视野。本文就Semaphorin3A在抗骨质疏松作用靶点上的相关分子机制研究进展作一综述。
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缺氧大鼠乳鼠心肌细胞中sema3a调节connexin43磷酸化水平的相关性研究
目的:研究缺氧大鼠乳鼠心肌细胞中信号素3A(sema3a)与p-connexin 43(Ser 279/282)的相关性变化.方法:体外培养大鼠乳鼠心肌细胞并缺氧,检测sema3 a与p-connexin 43(Ser 279/282)在不同缺氧时间的变化.慢病毒构建并转染心肌细胞,分为空白组、空病毒组、病毒组3组,选择在佳缺氧时间点检测sema3a及p-connexin 43(Ser 279/282)的蛋白水平变化.结果:(1)1 h为检测佳缺氧时间点,p-connexin 43(Ser 279/282)在1h缺氧组达到高峰(P<0.05),sema3a缺氧12 h急剧下降(P<0.05),(2)高表达sema3a,p-connexin 43(Ser 279/282)降低;抑制表达sema3a,p-con-nexin 43(Ser 279/282)升高.结论:在缺氧条件下,sema3a可以负向调节p-connexin 43(Ser 279/282),影响缝隙连接功能,提示其在影响细胞间电传导、诱发室性心律失常中有重要作用.
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低氧抑制乳腺癌细胞中信号素3A表达并调控成骨前体细胞分化
目的:通过低氧刺激乳腺癌MCF-7细胞,比较常氧与低氧条件下获取的MCF-7细胞条件培养液对成骨前体细胞MC3T3-E1分化能力的影响,并初步探讨信号素3A (semaphorin 3A,Sema3A)表达对低氧调控乳腺癌骨转移中成骨细胞分化的作用.方法:收集乳腺癌MCF-7细胞在常氧和低氧条件下培养48 h后的条件培养液,用其培养成骨前体细胞MC3T3-E1.采用BCIP/NBT碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)显色试剂盒和ALP活性检测试剂盒检测MC3T3-E1细胞中ALP的含量及活性,茜素红S(alizarin red S,ARS)染色法检测MC3T3-E1细胞的矿化情况.同时,采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测常氧和低氧条件培养0、12、24和48 h后MCF-7细胞中Sema3A的表达变化.将重组人Sema3A蛋白加入到MCF-7低氧条件培养液处理的MC3T3-E1细胞中,实时荧光定量PCR法检测各组细胞中成骨分化相关蛋白ALP、Runt相关转录因子2(Runt-relatedtranscription factor 2,RUNX2)、骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)和转录因子Osterix (Osx)的mRNA表达水平.结果:相比于常氧条件培养获得的MCF-7条件培养液组,低氧条件培养获得的MCF-7条件培养液可以使MC3T3-E1细胞中ALP的活性明显减弱(P＜0.05),且ARS染色钙化面积明显减小(P＜0.05).低氧处理24和48 h后,MCF-7细胞中Sema3A的表达水平明显低于常氧条件下相同时间点的表达水平(P值均＜0.05).向低氧条件培养液培养的MC3T3-E1细胞中加入重组人Sema3A蛋白处理后,MC3T3-E1细胞中ALP、RUNX2、OCN和Osx mRNA的表达水平均较未加重组人Sema3A处理组明显升高(P值均＜ 0.05).结论:体外低氧环境可下调乳腺癌MCF-7细胞中Sema3A的表达,进而抑制成骨细胞的分化.提示Sema3A可能是低氧环境下乳腺癌条件培养液抑制成骨细胞分化的重要因素之一.
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信号素3A与肾脏疾病
信号素3A(Sema3A)属于轴突导向因子家族中一种分泌型蛋白,在足细胞分化、肾小球滤过屏障形成和血管内皮细胞迁移过程中起重要调节作用.研究发现,Sema3A过表达可诱导肾足细胞足突消失或发育延迟,抑制输尿管芽分支和肾小球血管正常形成,导致肾小球发育不良和蛋白尿.而且,Sema 3A还是急性肾损伤、糖尿病肾病和狼疮性肾炎的生物标志物和潜在治疗靶点,本文对近年来Sema 3A在肾脏病发生中作用研究进展作一阐述.
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信号素3A诱导培养大鼠皮质神经元凋亡与PI3K/Akt通路有关
目的 探讨外源性信号素3A(semaphorin 3A,Sema3A)对原代培养大鼠皮质神经元凋亡的影响和磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine kinase,Akt)通路在Sema3A诱导凋亡中的作用.方法 体外培养新生Sprague-Dawley大鼠皮质神经元,并用微管相关蛋白-2免疫荧光染色鉴定.培养大鼠皮质神经元随机分为正常对照组和不同浓度Sema3A(500、1 000和2 000 μg/ml)组.CCK8法检测神经元存活率,Hoechst33342染色和TUNEL染色观察神经元凋亡,蛋白质印迹法检测P-Akt、Akt和Bcl-2表达.结果 培养的皮质神经元纯度达95％以上.CCK8检测显示,500、1 000、2 000 μg/ml Sema3A组细胞存活率分另为对照组的(80.9±5.3)％、(67.5±3.9)％和(50.2±4.4)％(F=165.042,P=0.000).Hoechst33342染色显示,正常对照组及500、1 000、2 000μg/ml Sema3A组神经元凋亡率分别为(22.4±1.2)％、(34.0±1.2)％、(39.3±1.4)％和(47.3 ±2.3)％ (F=103.237,P=0.ooo).TUNEL染色显示,正常对照组及500、1 000、2 000 μg/ml Sema3A组神经元凋亡率分别为(23.9±1.1)％、(31.9±1.0)％、(40.1±1.5)％和(51.4±3.4)％ (F=103.118,P=0.000).蛋白质印迹法显示,随着Sema3A浓度的增高,P-Akt(F=15.959,P=0.001)和Bcl-2(F=18.776,P=0.001)表达逐渐下调;而Akt表达无显著改变(F=0.590,P=0.639).结论 Sema3A主要通过诱导神经元凋亡而降低培养皮质神经元存活率,其机制可能与下调P-Akt和Bcl-2表达有关.
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新生血管性青光眼患者房水中信号素3A表达水平的研究
目的 检测新生血管性青光眼(nonvascular glaucoma,NVG)患者房水中信号素3A(Semaphorin3A,Sema3A)的水平,探讨Sema3A在NVG发生发展中的作用.方法 选取在我院眼科2014年1月至2015年2月诊断为NVG行抗青光眼手术患者42例(43眼)作为NVG组,并根据病因分为糖尿病组11眼、静脉阻塞组11眼、青光眼组8眼及原因不明组13眼;选取同期收治行单纯白内障手术患者16例(16眼)作为对照组.分别于术前抽取房水样本,利用双抗体夹心酶联免疫吸附试验测定房水中Sema3A含量,对比分析NVG组和对照组在Sema3A浓度上的统计学差异.分析检测NVG组房水中Sema3A水平与眼压水平的相关性.结果 NVG组患者的眼压为(32.63±11.16)mmHg(1 kPa =7.5 mmHg),较对照组(15.56±1.93) mmHg明显升高(=23.96,P ＜0.000 1).NVG组患者房水中Sema3A浓度为(2.13±1.94)ng· mL-1,明显高于对照组(0.66±0.58)ng· mL-1,差异有显著统计学意义(t=2.985,P＜0.000 1).但NVG组房水中Sema3A与眼压水平无明显相关性(r=-0.216 4,P=0.118 5).根据引起NVG的原发病进行分组比较,糖尿病组Sema3A浓度为(2.14± 1.44)ng · mL-1、静脉阻塞组Sema3A浓度为(1.67±0.98)ng·mL-1及青光眼组Sema3A浓度为(1.87±1.80)ng· mL-1,与对照组房水中Sema3A浓度相比均明显升高,差异均有统计学意义(P =0.001、0.002、0.021).结论 Sema3A在NVG患者房水中明显升高,推测其表达增加可能参与了NVG患者虹膜新生血管形成及眼部损伤性改变.
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信号素3A对肺癌A549细胞上皮-间充质转化的调节作用
目的 观察外源性信号素3A (SEMA3A)对转化生长因子-β1(TGF-β1)介导的肺癌A549细胞发生上皮-间充质转化(EMT)的调节作用.方法 常规培养肺癌A549细胞并分为3组:对照组、TGF-β1诱导组、SEMA3A干预组,观察细胞形态,采用划痕实验检测细胞迁移能力,免疫细胞化学染色检测波形蛋白(Vimentin)的表达,Western blot法检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)和Vimentin的蛋白表达水平.结果 予以5 μg/L TGF-β1诱导48h后,可见A549细胞由原有的铺路石样,转化成纺锤体形或长梭形,细胞间连接消失,细胞间隔变大,呈离散状态.划痕实验结果显示,TGF-β1能够显著促进A549细胞迁移,迁移率为(75.67 ±4.51)％,是对照组[(33.00±7.00)％]的2.29倍(P＜0.01);免疫细胞化学染色结果显示,对照组无Vimentin阳性表达,而予以TGF-β1诱导后,可见Vimentin阳性表达,胞质内出现棕黄色丝状排列结构;Western blot结果显示TGF-β1诱导48 h后,Vimentin蛋白表达明显上调,是对照组的6.86倍,E-cadherin蛋白表达明显下调,是对照组的5.70％.而予以SEMA3A预处理后,A549细胞基本保持原有的铺路石样状态,细胞迁移能力降低,Vimentin表达下调,E-cadherin表达上调.结论 SEMA3A能够通过上调E-cadherin蛋白的表达,抑制Vimentin蛋白的表达,显著抑制TGF-β1介导的A549细胞发生的EMT,同时抑制TGF-β1诱导的细胞迁移能力的提高,从而发挥抗非小细胞肺癌发生、发展的作用.
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信号素3A对成牙骨质细胞系OCCM-30增殖和矿化功能影响的实验研究
目的:初步探讨信号素3A(Semaphorin3A,Sema3A)对成牙骨质细胞增殖、矿化的影响.方法:采用不同浓度的重组人Sema3A(0、0.5、1 mg/L)处理成牙骨质细胞OCCM-30.MTT法检测Sema3A对成牙骨质细胞增殖的影响,酶比活性法检测细胞碱性磷酸酶(ALP)活性的变化,实时荧光定量PCR法检测骨钙素(OCN),骨桥蛋白(OPN)和Runx2基因的表达,茜素红染色法检测矿化结节的形成.结果:Sema3A对成牙骨质细胞的增殖和ALP活性无明显影响.Sema3A抑制OCN和Runx2基因的表达(P＜0.05),并抑制矿化结节的形成.结论:Se-ma3A对成牙骨质细胞的增殖无明显影响,但对细胞的矿化功能起到抑制作用.
