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Akt/mTOR在高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化中的表达及对核心结合因子的调节
目的 观察蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Akt/mTOR)在高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)钙化模型中的表达及其对核心结合因子α1(Cbfα1)表达的调节.方法 体外培养的大鼠VSMC,分为正常磷组(1.3 mmol/L)和高磷组(2.6 mmol/L),培养7d后,观察细胞形态及茜素红染色细胞钙盐沉积,实时定量PCR检测Cbfα1、骨桥蛋白(OPN) mRNA水平,Western印迹检测磷酸化Akt(p-Akt)(ser473)、磷酸化mTOR(p-mTOR)(S2448)、Cbfα1和OPN蛋白的表达.检测到Akt、mTOR活化表达后,给予不同浓度的渥曼青霉素(5、10、30、50和100 nmol/L)和雷帕霉素(1、10和100 ng/ml)干预24、48 h后,检测Cbfα1、OPN、p-Akt和p-mTOR基因和蛋白表达,7d后观察VSMC钙盐沉积变化.结果 VSMC高磷干预7d后,与正常磷组相比,高磷组钙盐沉积明显,Cbfα1、OPN mRNA表达增高(均P＜0.05),p-Akt、p-mTOR、Cbfα1和OPN蛋白表达增高(均P＜0.05).渥曼青霉素、雷帕霉素干预24 h后,相对于高磷组,高磷+渥曼青霉素30、50、100 nmol/L组Cbfα1、OPNmRNA表达明显下调(均P＜0.05);高磷+雷帕霉素1、10和100 ng/ml组Cbfα1、OPN mRNA表达下调(均P＜0.05).渥曼青霉素、雷帕霉素干预48 h后,与高磷组比较,高磷+渥曼青霉素30、50、100 nmol/L)组p-Akt、Cbfα1和OPN蛋白表达明显下调(均P＜0.05);高磷+雷帕霉素1、10、100 ng/ml组,p-mTOR、Cbfα1和OPN蛋白表达呈剂量依赖性下调(均P＜0.05).VSMC培养7d后,与高磷组相比,高磷+渥曼青霉素和高磷+雷帕霉素组钙盐沉积明显减轻.结论 高磷可体外诱导大鼠VSMC钙化,Akt、mTOR参与了高磷诱导的大鼠VSMC钙化,并可能通过调控Cbfα1因子而起作用.
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氧化型低密度脂蛋白通过Akt/mTOR/p70S6K通路诱导血管内皮细胞自噬
目的 探讨氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, oxLDL)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)自噬和Akt/mTOR/p70S6K信号通路的影响.方法 将培养的HUVECs分为oxLDL组和对照组,分别用100 μg/ml oxLDL和等体积磷酸盐缓冲液处理.在培养6 h和12 h后收集细胞.应用透射电子显微镜观察自噬小体,实时荧光定量聚合酶链反应检测微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)和p62 mRNA表达,应用蛋白质印迹法检测LC3、p62、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR和p-p70S6K/p70S6K蛋白表达.结果 与对照组相比,oxLDL处理组细胞内的自噬小体数量明显增多(P<0.05),LC3 mRNA及蛋白表达水平均显著增高(P均<0.05),而p62 mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P均<0.05).此外,oxLDL处理组Akt、mTOR、p70S6K磷酸化蛋白表达水平均较对照组显著降低(P均<0.01),但Akt、mTOR和p70S6K总蛋白表达水平与对照组无显著差异.结论 oxLDL可通过抑制Akt/mTOR/p70S6K信号通路诱导HUVECs自噬.
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结肠癌组织及转移淋巴结中磷酸化mTOR的表达及其预后作用
目的探讨p-mFOR在结肠癌组织及转移淋巴结中的表达及其对预后的影响方法收集136例结肠癌根治术病例,根据淋巴结转移情况分为3组,应用免疫组织化学方法检测各组结肠癌组织及转移淋巴结组织中p-mTOR的表达,结合临床病理资料进行统计分析.结果免疫组化结果显示p-mTOR广泛表达于结肠癌组织及转移淋巴结中结肠癌组织表达阳性率为47.1％,其中L N3组的表达阳性率(64.3％)显著高于LN1组和LN2组(37.8％和40.8％),结肠癌组织p-mTOR的表达率与淋巴转移程度呈线性相P=(P=0.026).转移淋巴结巾p-mTOR的表达阳性率为67.0％,其中LN3组阳性率(85.7％)显著高于LN2组(51.0％,P=0.001).结肠癌组织与转移淋巴结巾p-mTOR表达阳性率呈显著相关(P =0.014).生存分析显示结肠癌组织p-mTOR 阳性表达对于各组病例生存率影响不大.而转移淋巴结p-mTOR 阳性表达病例5年生存率均显著低于阴性组(P=0.042/P=0.027),转移淋巴结p-mTOR阳性表达患者预后较差.结论mTOR信号通路在结肠癌发生发展中发挥了重要作用,结肠癌组织p-mTOR的表达与淋巴结转移程度密切相关,转移淋巴结p-mTOR表达可作为中晚期结肠癌的预后标志,mTOR是结肠癌淋巴转移的重要治疗靶点之一.
