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百日咳毒素脱毒的研究进展
百日咳毒素(pertussis toxin,PT)是百日咳博德氏杆菌(Borrelia pertussis)的主要致病因子之一,也是组分百日咳疫苗的主要成分.由于PT具有多种毒性作用,因此需要脱毒后才可作为疫苗有效成分.本文对PT的结构特性、脱毒方式以及脱毒PT制备疫苗的安全性及免疫原性逐一进行了综述.
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无细胞百日咳疫苗小鼠中和抗体法的建立及效力评价验证
目的 建立一种无细胞百日咳疫苗的功能性抗体检测方法 ,为无细胞百日咳疫苗原液及成品的生产一致性评价和效力评价提供一种便捷有效的解决方案.方法优化并使用CHO细胞簇集试验方法检测小鼠免疫血清的百日咳毒素中和抗体滴度.结果 确定疫苗样品以1/5人用剂量腹腔免疫20～24 g、5周龄的雌性NIH小鼠10只,4周后采血分离血清,倍比稀释血清用0.1 IU/ml的百日咳毒素国家参考品中和2 h,加入到预先培养的CHO细胞孔中孵育48 h后判定簇集结果,终不簇集孔的血清稀释倍数的几何均值即为样品中和抗体滴度.不同工艺无细胞百日咳疫苗的中和抗体滴度有显著性差异;不同工艺无细胞百日咳疫苗改良脑腔攻击试验结果通过与不通过的产品中和抗体有明显区分度.结论 百日咳毒素中和抗体法大幅减少动物使用量,CHO细胞簇集试验具备一定的重复性和精密性,可以满足不同工艺无细胞百日咳疫苗成品及原液的生产一致性和效力的监测和初步评价.
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Gαi2对脑缺血-再灌注后神经细胞凋亡的影响
目的 探讨分析抑制性G蛋白α2亚单位(Gαi2)在大鼠脑缺血-再灌注损伤模型海马中的表达及其对神经细胞内钙离子浓度和凋亡的影响.方法 将90只SD大鼠随机(随机数字法)分为假手术组(SS组,n=30)、脑缺血-再灌注损伤组(IR组,n=30).脑缺血-再灌注且脑室内微量灌注Gαi2活性抑制剂百日咳毒素(PT)组(PT组,n=30)；用免疫组化、Western blotting分别测定大鼠脑缺血-再灌注后6h、12 h、24 h各组中海马神经内Gαi2的表达,采用流式细胞术测定各组中海马细胞内游离Ca2+浓度的平均荧光值,TUNEL法检测神经元细胞的凋亡.结果 不同时间点,IR组Gαi2含量和Ca2+浓度较SS组明显增高(P＜0.01),PT组Ca2+浓度较IR组升高(P＜0.01),PT组神经细胞凋亡率较IR组升高(P＜0.05).结论 Gαi2在大鼠脑缺血-再灌注损伤中表达明显增高,并可降低缺血神经细胞内的钙离子浓度,减少神经细胞的凋亡,对缺血神经细胞具有保护作用.
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嗜肺军团菌Ⅳ型分泌系统及其致病性研究进展
革兰阴性菌侵袭真核细胞,将毒力因子运送至菌体表面或宿主细胞内,这类转运过程需要细菌分泌系统的参与.目前已知革兰阴性菌有Ⅰ～Ⅳ型分泌系统.其中Ⅰ、Ⅱ型可将蛋白直接排泌于菌体外环境;但Ⅲ、Ⅳ型较为特殊,通过细菌的菌毛样结构与宿主细胞紧密结合形成一个孔道,将蛋白直接注入宿主细胞内.Ⅳ型分泌系统是革兰阴性菌常见的分泌机制,可将蛋白毒素和其他致病因子运输到宿主细胞内[1].例如,根癌土壤杆菌VirB/VirD分泌系统是目前研究为透彻的Ⅳ型分泌系统,其能够运输DNA蛋白复合体到宿主细胞;百日咳鲍特杆菌利用PtlⅣ型分泌系统可将百日咳毒素转运出细菌外膜;嗜肺军团菌(Legionella pneumophila,LP)可通过Dot/IcmⅣ型分泌系统运输毒力蛋白到宿主细胞内.
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PTX对GPER介导的雌激素激活的子宫内膜癌细胞中PI3K/Akt信号通路的影响
目的 研究百日咳毒素(PTX)对G蛋白偶联ER(GPER)介导的雌激素激活的子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1A细胞中磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路的影响.方法 采用免疫组化SP法检测Ishikawa和HEC-1A细胞中GPER蛋白的表达.将不同浓度(0、0.1、0.5、1.0 μg/ml)的PTX分别处理Ishikawa和HEC-1A细胞30 min后,再予上述浓度的PTX分别联合17β雌二醇(17β-E2；1×10-6molL)共同处理HEC-1A细胞15 min、Ishikawa细胞30 min,采用蛋白印迹法检测Ishikawa和HEC-1A细胞中GPER、ERα、ERβ蛋白的表达及Akt的活化状态[Akt的活化状态以磷酸化Akt(p-Akt)/Akt表示].结果(1)免疫组化法检测显示,在Ishikawa和HEC-1A细胞中GPER蛋白均在细胞质中呈棕黄色阳性表达.(2)蛋白印迹法检测显示,不同浓度(0、0.1、0.5、1.0μg/ml)的PTX联合17β-E2(1×10-6 mol/L)处理后,在Ishikawa细胞中,p-Akt/Akt分别为0.74±0.54、0.34 ±0.06、0.18±0.03、0.07±0.15,GPER蛋白的表达水平分别为0.872±0.490、0.395 ±0.054、0.145 ±0.014、0.034±0.008,随着PTX浓度的增加,p-Akt/Akt、GPER蛋白的表达水平均明显下降(P＜0.05),且当PTX浓度为1.0μg/ml时下降显著(F=63.729,P=0.0001;F ＝160.284,P=0.0001)；而ERα和ERβ蛋白的表达水平均无明显变化(P＞0.05).在HEC-1A细胞中,p-Akt/Akt分别为0.73 ±0.09、0.26±0.14、0.11 ±0.03、0,GPER蛋白的表达水平分别为0.927±0.134、0.485±0.022、0.194±0.004、0,随着PTX浓度的增加,p-Akt/Akt、GPER蛋白的表达水平均明显下降(P＜0.05),且当PTX浓度为1.0 μg/ml时均降至0(F=1039.321,P=0.0001；F=109.646,P=0.0001)；而ERα蛋白的表达水平无明显变化(P＞0.05),ERβ蛋白呈阴性表达.结论 在子宫内膜癌HEC-1A和Ishikawa细胞中,FTX阻断GPER后,可抑制雌激素对子宫内膜癌细胞PI3K/Akt信号通路的活化作用.
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第2代WHO百日咳毒素国际标准品的协作标定
目的:建立第2代WHO百日咳毒素国际标准品.方法:以第1代WHO百日咳毒素国际标准品为协作标定的标准品,对英国国家生物制品检定所提供的待标品和中国食品药品检定研究院内部参考品进行国际单位值测定和稳定性测定.测定方法为组胺致敏试验、CHO细胞簇集试验以及3项生化试验方法.结果:中国食品药品检定研究院完成了组胺致敏、CHO细胞簇集2项试验以及1项生化试验.结论:NIBSC经过对来自12个国家的14个实验室的结果进行统计学处理后,赋值第2代WHO百日咳毒素国际标准品组胺致敏活性为每支1 813 IU、CHO细胞簇集活性为每支680 IU,储存和运输稳定性符合要求.
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组分无细胞百日咳疫苗纯化新工艺的建立
目的:建立适合大规模生产的组分无细胞百日咳疫苗(acellular component pertussis vaccine,ACPV)纯化新工艺,从百日咳杆菌发酵液中分离纯化百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)和百日咳黏附素(pertactin,PRN)3种抗原组分.方法:百日咳杆菌发酵液经离心分离上清和菌体,上清通过超滤浓缩后,经多模式阳离子交换介质Eshmuno(R) HCX和阳离子交换介质Capto SP ImpRes两步层析获得PT;菌体经高盐缓冲液浸提后离心,浸提上清经阳离子交换介质Capto SP ImpRes和羟基磷灰石介质CHT两步层析获得FHA;浸提沉淀采用尿素抽提和硫酸铵盐析后,经复合型阴离子交换介质Capto Adhere和阳离子交换介质Capto SP ImpRes两步层析获得PRN.采用该工艺连续生产3批ACPV,检测各项指标,验证该工艺的重复性.结果:经该工艺得到的3种抗原组分完整性好且纯度均在95％以上,层析工艺平均回收率可达60％以上,FHA和PRN抗原均可通过特异性毒性检查;建立的纯化新工艺具有良好的重复性.结论:采用柱层析方法从百日咳杆菌培养物中分离纯化出了3种高纯度的百日咳抗原成分(PT,FHA和PRN),该方法适用于大规模生产,为以组分百白破疫苗为基础的联合疫苗的研发奠定基础.
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实电解质钙可诱发人肥大细胞组胺和类胰蛋白酶分泌
目的: 利用人大肠组织的肥大细胞和肥大细胞激活的体外研究系统,评价实电解质钙(calcium ionophore A23187, CI)诱导肥大细胞释放类胰蛋白酶和组胺的能力和机制.方法: 经酶悬浮的人大肠肥大细胞与CI共同培养后收集上清液,并用酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法检测类胰蛋白酶分泌量,用以玻璃纤维为基础的荧光比色法检测组胺释放量.结果: 经过15 min的培养,CI可引起浓度相关性的组胺和类胰蛋白酶释放.其中组胺的大分泌量比基础分泌量超出了5.3倍以上,而类胰蛋白酶的大分泌量则比基础分泌量超出了2.8倍以上.CI在浓度高于1.0 μmol/L时引起的组胺释放量明显多于类胰蛋白酶释放量.时间关系曲线显示,CI的作用从加样后10 s开始,6 min后达高峰并至少持续15 min.百日咳毒素和代谢抑制剂均能抑制CI引起的组胺和类胰蛋白酶释放.结论: 人大肠肥大细胞在受到CI刺激时具有释放类胰蛋白酶和组胺的能力,这个过程与肥大细胞膜G蛋白偶联受体的激活有关,并消耗能量.
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减毒百日咳杆菌对实验性变态反应性脑脊髓炎大鼠模型诱导的影响
目的:探讨在不同部位加用减毒百日咳杆菌对EAE非敏感品系Wistar大鼠EAE模型诱导影响.方法:免疫组除常规免疫外在足背皮下或腹腔注射减毒百日咳杆菌0.05 ml/只(含5.0×1010个菌体).结果:足背皮下注射百日咳组发病率为87.5%,发病时间为免疫后(10.25±1.67)d,而腹腔组分别为35.7%和(14.8士1.79)d.结论:足背皮下注射百日咳毒素诱导EAE模型适合在国内开展.
关键词： 实验性变态反应性脑脊髓炎 百日咳毒素 影响 -
CD24分子调节百日咳毒素诱导小鼠急性肝损伤的实验研究
目的:探讨CD24分子对百日咳毒素诱导急性肝损伤的影响及其可能的分子机制.方法:建立百日咳毒素诱导小鼠急性肝损伤的实验模型,观察anti-CD24中和抗体(200 μg/mouse)和百日咳毒素(200 ng/mouse)联合注射组小鼠的生存率,H&E染色观察小鼠肝组织损伤,血清化学方法检测小鼠谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)等肝功能的生化指标,ELISA方法检测小鼠血清中TNF-α的含量,流式细胞仪分析anti-CD24中和抗体对百日咳毒素诱导小鼠kupffer细胞(存在于肝脏中的巨噬细胞,KC)凋亡率的影响.结果:一定剂量的anti-CD24中和抗体和百日咳毒素联合注射组(实验组)生存率显著低于对照组;H&E染色观察实验组小鼠肝出血程度明显高于对照组,实验组小鼠ALT、AST等肝功能生化指标显著高于对照组(P＜0.05);ELISA检测实验组小鼠血清中TNF-α明显升高(P＜0.05);流式细胞术分析表明:anti-CD24中和抗体导致小鼠kupffer细胞坏死百分数增加.结论:CD24分子抑制百日咳毒素诱导的小鼠急性肝损伤.
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百日咳毒素S1亚单位缺失分子的构建及其在重组杆状病毒中的表达
目的:为探明羧基端疏水区对百日咳毒素S1亚单位分泌性的影响,试图构建缺失羧基端疏水区的S1亚单位.方法:应用PCR技术构建了6种不同信号序列修饰的缺失羧基端疏水区的S1亚单位编码基因,并使用重组杆状病毒(rBV)技术实现了这些缺失S1亚单位(tS1)在昆虫细胞中的高水平表达.结果:这些缺失S1亚单位的表达量为每万个昆虫细胞1.01～2.25 μg.细菌信号肽和流感病毒HA信号肽均能完整表达和正确剪切,但HA信号肽在昆虫细胞中的处理效率更高.结论:tS1亚单位缺失羧基端疏水区后在昆虫细胞中的表达量明显提高,这些tS1亚单位的异源性表达是由于信号肽剪切不全所导致,tS1分子表观分子量的漂移并不意味着信号肽剪切不正确.
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百日咳毒素S1亚单位突变体在大肠杆菌中的表达及纯化
目的 克隆百日咳毒素S1亚单位,获得其突变体(S1/9K-129G,rS1),构建原核表达系统,并鉴定融合蛋白的特异性.方法 采用PCR和重叠延伸扩增得到突变体,将其与pMD18-T连接,转化至大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性重组克隆载体pMD18-T-rS1,经双酶切得到rS1活性结构域编码片段.将其插入pQE-30载体中,转化大肠杆菌M15株,经IPTG诱导表达.表达产物经镍离子柱纯化,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 PCR及重叠延伸获得了约700 bp的目的 基因片段,并获得阳性重组表达载体克隆,表达产物为相对分子质量27 000左右的蛋白,Western blot检测能与兔抗百日咳毒素多价抗血清发生反应.结论 成功表达并纯化了百日咳毒素S1亚单位突变体,为研制百日咳疫苗候补抗原的相关分子免疫学研究奠定了基础.
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培养基中氯化钠对百日咳杆菌CS株生长及百日咳毒素表达的影响
目的 探讨培养基中氯化钠(NaCl)对百日咳杆菌CS株生长及百日咳毒素(pertussis toxin, PT)表达的影响,确定适PT表达的NaCl加入方式.方法 以MSS为起始培养基,补加不同浓度的NaCl溶液,接种生产用百日咳杆菌Ⅰ相CMCC58003(CS株)后,分别于不同时间取样;分别于接种菌种后不同时间补加NaCl至7.5 g/L,于培养结束时(39 h)取样;分别于接种菌种后0和25 h时补加NaCl至7.5 g/L,培养不同时间取样.上述样品分别测定菌浓度及PT表达量.结果 起始培养基中NaCl浓度越高,细菌生长越缓慢,菌浓度增加时间也越长,起始培养基中NaCl浓度为7.5 g/L时,培养上清中PT表达量高,达6.61 μg/ml,比对照培养基(MSS)提高了15.6％.培养过程中在25 h时补加NaCl,培养结束时PT表达量高,为8.64 μg/ml,比对照培养基(MSS)提高了43.28％,比0h时补加NaCl提高了26.13％.在25 h时补加NaCl后,细菌的菌浓度增长期比MSS培养基培养延长了2～3h,比0h时补加NaCl缩短了1-2h,菌浓度在培养的中后期明显高于0h时补加NaCl,PT表达周期与生长曲线基本平行,当细菌生长进入衰退期时,PT也随之开始逐步降解.结论 在培养前期,可采用含2.5 g/L NaCl的MSS培养基使菌体快速生长,当进入抗原PT表达期后,可通过补加NaCl来提高PT转录活性,从而提高PT的产量.
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百日咳毒素S1亚基片段在大肠杆菌中的表达
目的 构建百日咳毒素(PT)S1亚基片段原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达重组蛋白.方法 根据GenBank中登录的百日咳毒素S1亚基基因序列,人工合成密码子优化的S1基因,利用重叠PCR技术将S1基因上的两段DNA序列拼接在一起,形成-个新的基因序列S1'.将该序列与7ZTS表达载体连接,构建重组原核表达质粒7ZTS-S1',转化大肠杆菌JM109(DE3),IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.结果 S1'基因经PCR鉴定及测序证明与预期相符;重组表达质粒经双酶切鉴定证明构建止确;表达蛋白的相对分子质量约17 400,表达量约占菌体总蛋白的8%,且具有良好的反应原性.结论 已成功构建百日咳毒素S1亚基片段重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了重组蛋白,为PT单抗及其检测试剂盒的研制奠定了基础.
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百日咳毒素S1亚单位截短片段的表达、纯化及初步应用
目的 表达并纯化百日咳毒素(PT)S1亚单位截短片段S146,以其制备抗体,初步建市榆测PT的双抗体夹心ELISA法.方法 PCR扩增S146基因,亚克隆至载体pUC18,鉴定正确后,插入表达载体pET16b,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用镍离子亲和层析柱纯化,复性后的蛋白免疫家兔,制备抗血清,纯化后作为包被抗体,建立检测PT的双抗体夹心ELISA法,并检测其特异性.结果 表达的重组蛋白相对分子质量约为19 000,主要存在于破菌沉淀中,表达量占菌体总蛋白的44%;纯化后蛋白纯度为94.5%;家兔抗血清可特异性识别天然PTSI;建立的双抗体夹心ELISA法特异性良好.结论 已成功表达、纯化了PTS1亚单位截短片段S146,并以纯化的抗S146抗体作为包被抗体,初步建立了检测PT的双抗体夹心ELISA法,为研制特异性检测试剂和提供一种疫苗的质量控制方法奠定了基础.
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CHO-K1细胞簇集法检测百日咳毒素毒性的优化及验证
目的 对CHO-K1细胞簇集法检测百日咳毒素(pertussis toxin,PT)毒性进行优化及验证.方法 以国家PT标准品为参考品,将PT标准品倍比稀释后与CHO-K1细胞混合培养,显微镜观察PT能引起CHO-K1细胞簇集的程度.对细胞浓度、孵育时间进行优化,并对方法的特异性、敏感度、重复性进行验证.结果 方法的佳细胞浓度为2.5×105个/ml,佳孵育时间为24 h.只有PT活性成分能使CHO-K1细胞发生簇集,低检测限为10 pg/ml;2名试验员6次检测结果表明,该方法重复性良好.结论 CHO-K1细胞簇集法可及时、准确地检测出生产过程中PT含量,适用于百日咳发酵过程监测.
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去除百日咳毒素、丝状血凝素中内毒素的工艺探索
目的 探讨无细胞百日咳疫苗纯化工艺中百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)的内毒素去除问题.方法 选用Triton法和离子交换层析法,分别对百日咳杆菌发酵液上清和经CaptoSP InpRes柱纯化的发酵液进行内毒素去除,按《中国药典》三部(2015版)相关方法检测纯化样品的蛋白含量、内毒素含量、抗原含量,并进行SDS-PAGE分析.结果 使用Triton法和离子交换层析法均可以将FHA和PT这两种成分的内毒素在脱毒前阶段降低至200 EU/mg以下.在合适的纯化条件下使用离子层析去除内毒素的能力高于Triton法,而在对抗原的回收率上Triton法又稍占优势.结论 使用Triton法和离子交换层析法均可解决FHA和PT去除内毒素的问题,两类工艺下对目的蛋白活性的影响有待进一步研究.
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百日咳毒素、丝状血凝素和黏附素的纯化
目的 采用新型层析介质对无细胞百日咳疫苗百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamen-tous hemagglutinin,FHA)和黏附素(pertactin,PRN)3组分进行分离纯化.方法 调整PT和FHA发酵液上清的pH值和电导后,PT经Capto SP ImpRes和Capto MMC进行两步层析,FHA经Capto SP ImpRes进行一步层析；PRN热处理原液经Capto Adhere和Capto SP ImpRes进行两步层析.纯化产物经4％～12％ NuPAGE进行鉴定,ImageQ分析纯度；LC-MASS(Thermo LTQ Velas)进行蛋白质的质谱检测；PT和FHA经BiaCore T200进行定量分析,并计算各步回收率.结果 纯化后,无细胞百日咳疫苗3组分纯度均达95％以上；PT和FHA的总回收率均在30％左右；电泳图谱上的各组分条带经LC-MASS鉴定,均与Uniprot Bordetella pertussis数据库数据高度同源.结论 采用新型层析介质有效纯化了无细胞百日咳疫苗PT、FHA和PRN,提高了抗原纯度,大大缩短了生产时间.
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百日咳毒素S1亚单位的表达及其免疫原性研究
目的研究百日咳毒素S1(Pertussistoxin S1 subunit)亚单位在大肠杆菌中的表达及其免疫学特性.方法采用PCR法从百日咳杆菌染色体中获得S1亚单位的结构基因并克隆到质粒pCR2.1-TOPO中,转化宿主菌DH5α和TOP010.用抗S1的单抗1B7检测表达产物.用粗制的重组S1(rS1)免疫小鼠,做主动免疫保护实验.rS1免疫家兔,检测rS1的免疫原性.并以家兔免疫血清在小鼠进行被动免疫保护实验.结果rS1可在大肠杆菌中稳定高效表达,表达量分别占细胞总蛋白量的14%(DH5α)和24.2%(TOPO10).rS1能被1B7识别,在小鼠主动免疫实验中,保护率可达56.3%.家兔免疫血清ELISA效价为1:32 000.抗rS1血清对小鼠被动的免疫保护率为100%.结论rS1具有良好免疫原性,为百日咳基因工程疫苗或亚单位疫苗研制及百日咳免疫机理研究提供了依据.
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无细胞百日咳疫苗中活性PT的保护作用
目的比较经基因工程方法脱毒的无细胞百日咳疫苗(APV)中不同含量活性PT的保护作用.方法用小鼠保护性试验(AMPT)评价不同含量活性PT疫苗样品的百日咳效力,组织胺致敏试验(HST)检测不同含量PT样品中PT活性.结果含5ng活性PT的疫苗与不含PT的疫苗效力差异无显著意义;含50 ng活性PT疫苗与不含和含5ng活性PT的疫苗效力差异有显著意义.用HST肛温测定法可以检测到含50ng活性PT的样品中PT活性.结论AMPT适用于高度脱毒或基因工程脱毒的APV的效力检定,HST肛温测定法可以证实APV中PT的活性.
