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人AChR-Fc融合蛋白真核表达载体的构建和表达
目的 构建含人AChRαl亚单位胞外段(Hαl-210)-IgGlFc融合基因的真核表达载体,表达人AChR-Fc融合蛋白.方法 扩增Hαl-210基因,插入含有CMV启动子、小鼠Kappa链先导序列以及人IgGl从铰链区到CH3基因片段的真核表达载体pAN1782中,构建重组表达载体pAN-Hαl-210,并经酶切、测序鉴定;采用脂质体法将重组载体转染CHO-K1细胞,经G418加压筛选、ELISA检测.挑选高表达融合蛋白的阳性转化子扩大培养;表达的AChR-Fc融合蛋白经Protein A亲和层析柱纯化,SDS-PAGE、Western blot鉴定.结果 酶切及测序结果证实Hαl-210基因序列正确,真核表达载体pAN-Hαl-210构建成功;ELISA检测证实AChR-Fc融合蛋白在细胞培养上清中呈分泌表达;SDS-PAGE结果显示该融合蛋白的相对分子质量约为51 000;Western blot结果显示该融合蛋白能被特异性单克隆抗体mAb198所识别.结论 成功构建pAN-Hαl-210真核表达载体.并获得具有生物活性的AChR-Fc融合蛋白,为进一步开展融合蛋白靶向B细胞治疗重症肌无力的研究奠定了基础.
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流式细胞术检测体外微核方法的验证
目的:采用不同作用强度、不同作用机制的遗传毒性化合物及非遗传毒性化合物验证已建立的96孔板流式细胞术体外微核自动化检测方法.方法:试验分为+S9短时处理组(4 h)和-S9持续处理组(24 h),加样后24 h(5-氟尿嘧啶为48 h)收获细胞.验证的化合物分别选择3个不同浓度处理CHO-K1细胞,设置环磷酰胺(+S9组)或丝裂霉素C(-S9组)的阳性对照和溶剂对照.采用EMA和SYTOX green双色标记,流式细胞仪分析96孔板的微核率,并与常规平皿培养、人工阅片的细胞分裂阻滞法的双核微核结果进行比较.结果:人工阅片和流式细胞术检测验证化合物诱导CHO-K1细胞微核的结果一致.在有或无S9处理条件下,甲基磺酸甲酯、秋水仙素、依托泊苷和4-硝基喹啉-1-氧化物体外微核试验结果均为阳性;5-氟尿嘧啶和己烯雌酚仅在无代谢活化系统条件下,试验结果为阳性;苯并芘仅在代谢活化系统的情况下,试验结果为阳性;氯化钠、蔗糖和2-氨基蒽体外微核试验结果为阴性.结论:本试验进一步证实流式体外微核检测方法灵敏度高、特异性好,可代替人工阅片的双核微核方法,用于化合物遗传毒性早期筛选和遗传毒性评价.
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BPIm23-Fcγ1重组抗菌蛋白在CHO细胞中的表达及其对耐药菌的作用
目的在CHO细胞中表达功能性BPIm23-Fcγ1重组抗菌蛋白,检测该种抗菌蛋白对临床常见耐药性革兰阴性菌(G-菌)(大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌)的抑杀作用.方法用pSNAV-signal-syn BPIm500-Fcγ1 700转染CHO-K1细胞,通过Dot blot筛选获得高表达BPIm23-Fcγ1目的蛋白的阳性细胞克隆,经PF-CHO培养基扩大培养,获得分泌表达的BPIm23-Fcγ1重组抗菌蛋白.采用离子交换层析、Western blot和ELISA方法纯化、鉴定目的重组蛋白.采用微量细菌定量药敏试验法检测目的抗菌蛋白对耐药性大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌的抑杀作用.结果获得了高表达BPIm23-Fcγ1目的重组蛋白的阳性细胞克隆,目的蛋白表达量约为25～50 mg/L.目的蛋白经Western blot和ELISA方法检测证实确为BPIm23-Fcγ1重组蛋白.该重组抗菌蛋白对耐药和非耐药性大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌具有同等抑杀作用.结论获得了功能性BPIm23-Fcγ1重组抗菌蛋白,该重组蛋白(0.4 mg/L)能有效抑杀耐药性大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌.
关键词： BPIm23-Fcγ1重组抗菌蛋白 CHO-K1细胞 耐药菌 -
去除信号肽有利鸡白细胞介素-10在哺乳动物细胞胞浆的表达
目的 分析鸡白细胞介素10(chicken interleukin-10,chIL-10)的信号肽对体外表达的影响,以获得稳定表达ehIL-10的细胞系.方法 采用RT-PCR方法从经脂多糖(LPS)体外刺激的鸡外周血淋巴细胞中分别扩增含信号肽(euchI L-10F)和去信号肽(euchIL-10M)的chIL-10编码基因,克降入含有报告基因eGFP和新霉素抗性基因(neo)的真核表达载体pEGFP-N1中,获得重组质粒N1-euchIL-10F和N1-euchIL-10M.分别转染中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-K1),经G418加压筛选、纯化,获得稳定表达chIL-10蛋白的CHO-K1细胞系,利用激光共聚焦试验观察外源蛋白的细胞定位.结果 通过RT-PCR、间接免疫荧光试验和免疫印迹试验,表明euchIL-10F和euchIL-10M均整合入细胞基因组中,且N1-euchIL-10M在胞浆大量表达较强的绿色荧光,而N1-euehIL-10F表达的荧光较弱,且胞浆内含量很低.结论 去除信号肽利于chIL-10基因在体外真核细胞胞浆的表达.
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60Coγ-射线辐照新生牛血清对细胞培养的影响
目的 研究新生牛血清(newborn calf serum,NBCS)经60Co γ-射线辐照后对细胞培养的影响.方法 用20 kGy60Co γ-射线辐照NBCS后,培养Vero和CHO-K1细胞,通过连续传代培养及绘制低密度生长曲线,比较辐照前后的促细胞生长效果.结果 Vero细胞的传代培养结果与未辐照前接近,生长曲线峰值略低于未辐照组,辐照前后细胞的大增殖密度为73.38×104和65.33×104个/ml (P＞0.05),倍增时间为24.38和25.33 h (P＞0.05);CHO-K1细胞传代培养无未辐照组致密,生长曲线较未辐照组平缓,辐照前后细胞的大增殖密度为80.03 × 104和79.3×104个/ml (P＞0.05),倍增时间为19.73和23.62 h (P＜0.05).结论 NBCS经20 kGy60Co γ-射线辐照后,对Vero细胞影响不明显,使CHO-K1细胞生长速度变慢.
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白细胞介素-7基因慢病毒表达载体的构建及在CHO-K1细胞中的稳定表达
目的 构建白细胞介素-7(interleukin-7,IL-7)基因慢病毒表达载体,并在CHO-K1细胞中稳定表达,为生产试剂级的IL-7奠定基础.方法 参照GenBank中公布的人IL-7基因核苷酸序列(J04156.1),人工合成该条基因,亚克隆至表达载体pLV-CMV-EF1-GP上,构建重组慢病毒表达质粒pLV-CMV-EF1-GP-rIL-7,在HEK293T细胞中进行病毒包装,检测病毒滴度后,收获细胞毒液,感染CHO-Kl细胞,经嘌呤霉素筛选,获得稳定表达IL-7的CHO-KI-rIL-7细胞.荧光显微镜观察感染细胞绿色荧光蛋白的表达;RT-PCR法检测IL-7基因mRNA的转录;EHSA法检测IL-7的含量;Western blot法检测I1-7的表达.结果 重组慢病毒表达质粒pLV-CMV-EF1-GP-rIL-7经双酶切及测序结果证明构建正确.慢病毒的滴度为3×108 TU/ml.慢病毒感染CHO-K1细胞24、48和72 h后,均可见特异性绿色荧光蛋白表达,且随着培养时间的延长,荧光强度明显增强;CHO-K1-rIL-7细胞可扩增出约540 bp的IL-7基因片段;经ELISA检测,样品中IL-7含量为0.6ng/ml;表达产物主要存在于CHO-K1-dL-7细胞上清中,且具有良好的反应原性.结论 成功构建了IL-7基因慢病毒重组表达质粒,并实现了IL-7在CHO-K1细胞上的稳定表达.
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人凝血因子Ⅶ在CHO-K1细胞中的表达与鉴定
目的 在CHO-K1细胞中表达人凝血因子Ⅶ(human coagulation factorⅦ,hFⅦ).方法 利用脂质体转染法,将表达质粒pcDNA3.1-FⅦ和空载体pcDNA3.1分别转染CHO-K1细胞,经900 μg/ml G418筛选抗性细胞株.收集细胞培养上清,采用ELISA法检测细胞培养上清中rhFⅦ的水平；PT法检测细胞培养上清的凝血时间；Western blot法检测细胞培养上清中rhFⅦ的表达.结果 共获得3株抗性细胞,分别命名为CHO-FⅦ01 ～ 03,空载体转染的细胞命名为CHO-CK；CHO-FⅦ01～ 03细胞培养上清中均检测到了rhFⅦ,但含量均低于阳性对照；CHO-CK细胞培养上清的凝血时间分别为CHO-FⅦ01～03细胞培养上清的2.4、2.1和3.1倍；CHO-FⅦ01～ 03细胞培养上清中含目的蛋白rhFⅦ,相对分子质量约为50 000.结论 成功在CHO-K1细胞中表达了hFⅦ,为下一步hFⅦ的深入研究及应用奠定了基础.
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无血清悬浮培养CHO-K1-SFS细胞系的建立及其生物学特性
目的 建立无血清悬浮培养CHO-K1-SFS细胞系,并检测其生物学特性.方法 将CHO-K1贴壁细胞通过逐步降低血清浓度,获得低血清CHO-K1贴壁细胞,以3 × 105个/ml接种于含无血清培养基SFM4CHO的150 ml三角瓶中,摇床无血清适应培养,获得CHO-K1-SFS细胞.对该细胞进行生长曲线绘制、微生物污染检测、代谢分析及外源基因表达检测.结果 所获得的CHO-K1-SFS细胞系可无血清悬浮培养,以3×105个/rnl的初始密度接种,大增殖浓度可达3.8× 106个/ml,平均倍增时间为29.7 h;无细菌、真菌、病毒和支原体污染;对葡萄糖利用率较高,乳酸产生较多;能较好地表达外源基因.结论 成功建立了无血清悬浮培养CHO-K1-SFS细胞系,为建立高效的外源基因表达平台奠定了基础.
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CHO-K1细胞簇集法检测百日咳毒素毒性的优化及验证
目的 对CHO-K1细胞簇集法检测百日咳毒素(pertussis toxin,PT)毒性进行优化及验证.方法 以国家PT标准品为参考品,将PT标准品倍比稀释后与CHO-K1细胞混合培养,显微镜观察PT能引起CHO-K1细胞簇集的程度.对细胞浓度、孵育时间进行优化,并对方法的特异性、敏感度、重复性进行验证.结果 方法的佳细胞浓度为2.5×105个/ml,佳孵育时间为24 h.只有PT活性成分能使CHO-K1细胞发生簇集,低检测限为10 pg/ml;2名试验员6次检测结果表明,该方法重复性良好.结论 CHO-K1细胞簇集法可及时、准确地检测出生产过程中PT含量,适用于百日咳发酵过程监测.
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CHO-K1细胞中基因瞬时转染的条件优化
目的:以CHO-K1细胞为宿主基因瞬时转染条件的优化.方法:以GFP(Green Fluorescence Protein)为报告基因,考察了DNA∶PEI比例、DNA用量及血清的加入对CHO-K1细胞的转染效率和细胞数目的影响.结果:DNA∶PEI=1∶2(w/w)、2 gDNA/106 cells时,转染结果优;血清的加入可降低细胞转染效率.结论:在CHO-K1细胞中进行瞬时转染的佳条件为DNA∶PEI=1∶2(w/w)、2 gDNA/106 cells,及血清的加入抑制细胞转染.
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一种人内皮素受体B受体-配体结合检测体系的建立
为寻找ETBR特异性激动剂/拮抗剂,需建立一种灵敏度高、操作简单的受体-配体结合检测体系.从人肺腺癌细胞系A549中克隆人ETBR基因,将其连接至pTag-liteTM-SNAP质粒内,成功构建真核表达载体pTag-hteTM-SNAP-ETBR,并将其转染至CHO-K1细胞内,加入SNAP-tag荧光底物后,通过荧光显微镜检测发现SNAP-ETBR融合蛋白在细胞中有效表达,使得运用Tag-lite技术进行受体-配体结合检测并发现ETBR激动剂/拮抗剂得以实现,为后期研究奠定基础.
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猪细小病毒VP2蛋白主要抗原表位基因真核表达载体的构建及表达
猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一[1],可引起母猪流产、胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化及不孕等,还可引起仔猪的皮炎和腹泻.PPV在我国污染非常严重,部分地区阳性率达90%以上[2].PPV能在大多数哺乳动物传代细胞系内长期潜伏感染,而且量少时不易检出,当细胞连续传代时可能引起细胞病变至细胞死亡,有可能给实验室带来较多麻烦.VP2蛋白是该病毒的主要结构蛋白之一,本研究构建含VP2蛋白的主要抗原表位基因的真核表达载体并获得其稳定表达的细胞株.
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重组猪单链IL-12的构建及真核表达
目的 克隆猪IL-12 (pIL-12)p35和p40亚单位cDNA,构建含有重组猪单链IL- 12(pscIL-12)融合基因的真核表达质粒并进行表达.方法 分别从正常成年肉猪的外周血单个核细胞(PBMCs)和脾淋巴细胞中提取总RNA,经RT-PCR分别获得pIL-12 p35和p40亚单位编码序列的cDNA,应用重叠延伸PCR技术通过一柔性接头(linker)(Gly4Ser)3串联这两个亚基构建融合基因pscIL-12,将融合基因pscIL- 12插入pcDNA3.1(+)真核表达载体,通过阳离子聚合物介导转染CHO-K1细胞进行表达,RT-PCR鉴定pscIL-12融合基因在真核细胞中的表达.结果 所克隆的pIL-12 p35亚基和p40亚基的编码基因序列和构建的融合基因pscIL-12序列均经PCR、酶切、测序得以证实；融合基因pscIL-12在CHO-K1细胞中成功转录.结论 成功构建了pcDNA3.1 (+)-pscIL- 12融合基因的真核表达质粒；pcDNA3.1 (+)-pscIL- 12在CHO-K1细胞中成功转录,为进一步探讨pscIL-12融合蛋白的生物学活性和疫苗佐剂效应奠定了基础.
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人凝血因子Ⅶ基因在CHO-K1细胞中的瞬时表达与鉴定
目的 在CHO-K1细胞中瞬时表达所克隆的人凝血因子Ⅶ(FⅦ)的cDNA序列并表达其产物.方法 首先从HepG2细胞中克隆人FⅦ cDNA序列,将克隆得到的序列连接到pMD18-T载体上经测序验证后,将其与pcDNA3.1载体连接,构建得到重组表达质粒pcDNA3.1-FⅦ.将构建得到的表达质粒瞬时转染CHO-K1细胞,72 h取样,采用ELISA、Westem blotting等方法对细胞上清液和细胞裂解物作鉴定.结果 克隆得到的序列经NCBI比对后为FⅦ转录突变体Ⅱ基因序列,克隆得到的基因未见氨基酸突变,重组表达质粒pcDNA3.1-FⅧ经PCR、双酶切、测序验证正确.ELISA法未在上清中检测到目的蛋白,而在细胞裂解液中检测到了目的蛋白；Western blotting 检测到表达产物有与FⅦ标准品类似的分子量为50 kD左右的特异性条带.结论 在转染后的CHO-K1细胞裂解液上清中成功表达了hFⅦ蛋白.
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抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体真核表达载体的构建及表达
目的:构建抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体真核表达载体,在中国仓鼠卵巢细胞( CHO-K1)中获得稳定、高效表达,并对其生物学活性进行初步鉴定.方法:利用基因重组技术将本室前期构建的含有轻、重链嵌合基因的载体PMD18-T-VH和PMD18-T-VL双酶切获得重链、轻链基因后,克隆到前期改构的高效真核表达载体pCI-neo-M中,用脂质体法转染野生型CHO-K1细胞,在G418和氨甲喋呤(MTX)双筛选压力下筛选稳定高效表达细胞株,ELISA方法检测重组蛋白的表达,用Protein A HP Spin Trap纯化目的蛋白后进行SDS-PAGE和Western blot法检测,并通过体外中和实验检测其中和活性.结果:成功构建了抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体真核表达载体,转染CHO-K1细胞后经过3轮亚克隆筛选获得稳定表达抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体的细胞系,表达量约为1 mg/L,SDS-PAGE和Western blot法检测到目的蛋白的表达,微量细胞中和实验检测其中和活性,与亲本单克隆抗体( mAb)的中和活性相近.结论:抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体在CHO-K1细胞中成功表达,并具有良好的中和活性,为该抗体进一步的实验研究和临床应用奠定了基础.
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流式细胞术检测体外微核方法的建立
目的：建立96孔板流式细胞术体外微核自动化检测的方法，并探讨其用于药物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价的可能性。方法：试验分为+S9短时处理组(4 h)和-S9持续处理组(24 h)，分别选择3个不同浓度的环磷酰胺和丝裂霉素C处理CHO-K1细胞，24 h后收获细胞。采用EMA和SYTOX Green双色标记，流式细胞仪分析96孔板的微核率，并与常规标准平皿培养、细胞分裂阻滞法的双核微核结果进行比较。结果：在有或无S9处理条件下，不同浓度的环磷酰胺、丝裂霉素C诱导产生的微核率较溶剂对照组均显著增加(P均<0.05)，剂量-效应关系明显。两种微核检测方法的Spearman相关系数( rs)为1.000。结论：流式细胞术检测环磷酰胺、丝裂霉素C作用于CHO-K1细胞的微核试验结果均为阳性，与文献报道一致，因而本试验初步建立了流式细胞术体外微核检测方法。流式细胞术检测微核的方法与人工阅片的方法相关性好，提示该方法用于化合物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价具有良好的前景。
