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细菌Ⅳ型分泌系统的研究进展
革兰阴性细菌的分泌系统有Ⅰ～Ⅵ型,其中Ⅳ型分泌系统(Type Ⅳ Secretion System,T4SS)不但可以介导DNA的水平转移,还可以转运蛋白质及核糖核蛋白复合物等大分子物质.T4SS通过介导抗性基因或毒力基因水平转移有利于细菌进化或直接将效应蛋白分子转运至宿主细胞,参与细菌致病.本文除介绍T4SS的类型、结构、生物学功能等方面的研究进展外,还介绍了基于蛋白相互作用及生物信息学方法的T4SS分泌效应蛋白的识别方法.
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布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白BspB的原核表达及布鲁氏菌免疫逃逸分析
目的 克隆并表达布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白 BspB并推测其免疫逃逸机制. 方法 以羊种布鲁氏菌16M基因组为模板,利用PCR扩增布鲁氏菌分泌蛋白 BspB(BAB1-0712)基因,连接pMD19-T载体后测序,将测序正确的基因片段经双酶切后克隆至pET-30a载体中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物. 结果 成功克隆了BspB基因,片段大小为564 bp;SDS-PAGE检测,BspB蛋白分子质量单位约为27.5 ku;Western blot分析显示,BspB蛋白均可被布鲁氏菌阳性血清识别.该蛋白测序后与先天性免疫分子IL-1R、MyD88、TLR-2、TLR-4、SIGIRR比对,具有一定的同源性. 结论 重组蛋白BspB具有免疫反应原性,可作为候选诊断抗原;由于其序列与IL-1R、MyD88、TLR-2、TLR-4及SIGIRR有一定同源性,BspB可能存布鲁氏菌感染宿主过程中发挥免疫逃逸的作用.
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嗜肺军团菌Ⅳ型分泌系统及其致病性研究进展
革兰阴性菌侵袭真核细胞,将毒力因子运送至菌体表面或宿主细胞内,这类转运过程需要细菌分泌系统的参与.目前已知革兰阴性菌有Ⅰ～Ⅳ型分泌系统.其中Ⅰ、Ⅱ型可将蛋白直接排泌于菌体外环境;但Ⅲ、Ⅳ型较为特殊,通过细菌的菌毛样结构与宿主细胞紧密结合形成一个孔道,将蛋白直接注入宿主细胞内.Ⅳ型分泌系统是革兰阴性菌常见的分泌机制,可将蛋白毒素和其他致病因子运输到宿主细胞内[1].例如,根癌土壤杆菌VirB/VirD分泌系统是目前研究为透彻的Ⅳ型分泌系统,其能够运输DNA蛋白复合体到宿主细胞;百日咳鲍特杆菌利用PtlⅣ型分泌系统可将百日咳毒素转运出细菌外膜;嗜肺军团菌(Legionella pneumophila,LP)可通过Dot/IcmⅣ型分泌系统运输毒力蛋白到宿主细胞内.
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布氏菌致病因子的研究进展
布氏菌是引起人和动物布鲁菌病的病原体.这类兼性胞内寄生菌表达一系列的致病因子,包括脂多糖、外膜蛋白和Ⅳ型分泌系统等以保持其毒力.有些致病因子是侵袭宿主所必需的,有些致病因子对逃脱宿主免疫系统的清除是必需的,它们保证了布氏菌在胞内的生存和增殖,逃脱宿主免疫系统的攻击.了解其致病因子和作用机制可为疫苗研制提供依据,也可促使新的抗生素研制.现就布氏菌致病因子的研究进展予以综述.
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幽门螺杆菌cagL基因缺失株的建立
目的:构建幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagL基因缺失株,为研究cagL基因的功能奠定基础.方法:利用同源重组原理,PCR扩增该基因编码区两侧序列,作为同源臂,构建出带卡那霉素抗性标志的载体,采用电穿孔法将其转化入受体菌中,并经PCR验证后获得了cagL基因缺失株;突变株和野生株分别与胃上皮细胞GES-1共培养后,检测其对CagA蛋白转运的影响.结果:构建cagL基因缺失的自杀质粒,并获得一株cagL基因缺失株;CagA转运实验表明,cagL基因缺失后,导致幽门螺杆菌CagA转运功能的丧失.结论:成功获得了幽门螺杆菌cagL基因缺失株,该基因参与CagA蛋白的转运,是该菌IV型分泌系统中重要组成成分之一.
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幽门螺杆菌Cag致病岛hp0527基因的缺失株构建和鉴定
目的:构建幽门螺杆菌(H.pylori)Cag致病岛编码hp0527基因的突变株.为Cag致病岛致病机制及H.priori功能研究奠定基础.方法:利用基因同源重组方法将卡那霉素抗性基因(KanR)连接到PCR扩增hp0527两端区域产生的2个目的基因片段之间,构建hp0527基因缺失的自杀质粒pBlueKM40-△hp0527;将带有卡那霉素抗性标志的缺失突变载体,通过抗生素卡那霉素筛选出缺失hp0527基因的突变株,并经PCR方法鉴定后,采用野生株和突变株的幽门螺杆菌分别与胃癌上皮细胞BGC-823共培养后,分析它们对细胞毒素相关蛋白CagA转运能力的影响.结果:成功构建出幽门螺杆菌hp0527基因突变的自杀质粒,突变载体经内切酶酶切分析显示:产生的条带与设计结果完全一致;抗生素筛选并经PCR鉴定后,获得了hp0527基因缺失株;CagA蛋白转运分析表明基因hp0527缺失前后,可以导致细菌转运CagA蛋白能力的丧失.结论:成功构建出1株缺失hp0527基因的H.pylori突变株,对于阐明该基因的功能及其在H.pylori致病中的地位及作用具有重要的研究价值.
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布鲁菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白BspA、BspF的原核表达及布鲁菌免疫逃逸分析
目的 克隆并表达布鲁菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白BspA、BspF并推测其免疫逃逸机制.方法 以羊种布鲁菌16M基因组为模板,利用PCR扩增布鲁菌分泌蛋白BspA(BAB1-0678)、BspF(BAB1-1948)基因,连接质粒pMD19-T后测序,将测序正确的基因片段经双酶切后克隆至pET-30a(+)载体中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹(Western blot)分析鉴定表达产物;并与先天性免疫分子的蛋白序列进行比对分析.结果 成功克隆了BspA、BspF基因,片段大小分别为576、1 287 bp;SDS-PAGE显示,BspA、BspF蛋白相对分子质量分别约为28 × 103、55×103;Western blot分析显示,BspA、BspF蛋白均可与布鲁菌阳性血清发生特异性反应,并且与先天性免疫分子白细胞介素1R(IL-1R)、髓样细胞分化因子88 (MyD88)、Toll样受体2(TLR-2)、Toll样受体4(TLR-4)、单免疫球蛋白白介素1相关受体(SIGIRR)有同源性.结论 成功获得了布鲁菌BspA、BspF蛋白,通过同源性分析,证明BspA、BspF蛋白在布鲁菌感染宿主过程中具有免疫逃逸的作用.研究结果为进一步研究布鲁菌的致病机制和揭示布鲁菌免疫逃逸机制提供了理论依据.
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布鲁杆菌Ⅳ型分泌系统蛋白VirB9免疫原性检测
目的 检测布鲁杆菌Ⅳ型分泌系统蛋白VirB9的免疫原性,寻找潜在的、新的布鲁杆菌亚单位疫苗靶标.方法 采用双酶切的方法,将布鲁埃希菌VirB9基因全长克隆至原核表达载体pET32a上,将克隆后载有VirB9基因的pET32a质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组VirB9蛋白在大肠埃希菌中的表达.利用重组VirB9蛋白所携带的His标签,通过Ni-NAT层析,纯化在大肠杆菌中重组表达的VirB9蛋白,再通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳和二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒对纯化的蛋白进行纯度及浓度检测.用布鲁杆菌疫苗株S19株免疫BAL B/c小鼠,并以磷酸盐缓冲液(PBS)为对照.在免疫4周后,鼠尾取血,血清虎红平板凝集试验、试管凝集试验检查小鼠血清抗体；酶联免疫吸附试验(ELISA)检测S19株免疫小鼠体内抗VirB9抗体滴度.在免疫后第35天,取小鼠脾脏,分离脾细胞,利用Elispot技术,检测VirB9蛋白体外再刺激后分泌细胞因子(干扰素-γ,IFN-γ)的脾细胞数,酶联斑点图像仪计数斑点,每个斑点代表1个抗原特异性T淋巴细胞,分析VirB9刺激机体产生细胞免疫反应的情况.结果 通过酶切克隆的方法成功地将VirB9全长基因741 bp克隆至pET32a载体上.SDS-PAGE显示,VirB9蛋白的相对分子质量约43×103,纯度超过97％；BCA法检测,蛋白浓度为1.6 g/L.免疫组小鼠血清虎红平板凝集试验阳性,试管凝集试验小鼠血清抗体滴度＞ 1∶800;对照组小鼠血清虎红平板凝集试验阴性,试管凝集试验小鼠血清抗体滴度阴性.免疫组检测到抗VirB9蛋白抗体,抗体滴度均＞1:3200,对照组小鼠体内未检测到抗VirB9蛋白抗体的存在.酶联斑点图像分析显示,用VirB9蛋白体外刺激,免疫组小鼠5×105个脾细胞中有147个细胞可以分泌IFN-γ,对照组仅有38个细胞.结论 在布鲁杆菌感染过程中,Ⅳ型分泌系统蛋白VirB9具有免疫原性,能够刺激小鼠产生体液免疫反应与细胞免疫反应.
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幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统 cagQ 基因缺失株的构建与鉴定
目的：构建幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H．pylori）Ⅳ型分泌系统 cagQ 基因缺失株。方法：通过 PCR 扩增出 cagQ 基因编码区侧翼同源臂序列，经 TA 克隆后进行双酶切，并将纯化后上下游同源臂连接至两端含有卡那霉素抗生素基因的载体 pBluscriptSK II（-），构建为 cagQ 基因自杀质粒。利用电穿孔法将自杀质粒导入 H．pylori，进行同源重组。培养后通过卡那霉素抗生素筛选出基因缺失株，并经 PCR 及核酸序列分析进一步确定基因缺失株。结果：H．pylori 的 cagQ 基因自杀质粒 pBlueKM40-△cagQ 经酶切验证无误，进行电转化后经 PCR 及核酸序列分析结果正确。结论：成功获得 H．pylori cagQ 基因缺失株，命名为 Hp26695-△cagQ。
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幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagM基因的克隆、表达及抗体制备
目的:构建表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H.pylori) NCTC 11637 IV型分泌系统cagM(HP0537)全长编码基因的原核表达载体,分析其抗原性并制备抗体.方法:应用PCR技术从H.pylori基因组扩增 cagM基因片段,TA克隆后测序分析,并构建表达载体pET-28a(+)-cagM,转化 E.coli BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE及鉴定表达蛋白,表达蛋白以 Ni2+-NTA 柱进行纯化,用软件分析其抗原性后,免疫家兔制备多克隆抗体,ELISA检测多克隆抗体效价.结果:测序结果表明cagM基因全长1 131 bp(基因库登录号为GU269568),编码376个氨基酸,与基因库中已知菌株J99,26695和G27的氨基酸同源性为98%～99%;诱导表达后经SDS-PAGE检测表明,在43 700处发现一条新生条带,Ni2+-NTA柱纯化后为单一条带,软件分析表明其抗原性较强,免疫家兔制备的多克隆抗体效价为1∶ 1.6×105.结论:首次成功克隆并表达了H.pylori pNCTC 11637 cagM基因,并制备了其抗体,为以后进一步研究其生物学功能以及H.pylori相关疾病的检测与治疗奠定了基础.
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幽门螺杆菌细胞毒导致胃癌发生的作用机制
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染导致胃癌的重要原因之一是它的细胞毒作用.细胞毒素相关基因致病岛 (cytotoxin-associated gene pathogenicity island,cagPAI) 和空泡毒素A (vacuolatingcytotoxin A,vacA) 是Hp典型的细胞毒代表.cagPAI可诱发促炎因子的释放及增强促上皮细胞增殖信号的兴奋程度;vacA则导致上皮空泡化和病原体黏附.明确cagPAI和vacA在胃癌发生发展过程中的作用,将有利于全面理解Hp感染对机体造成的危害以及根治Hp感染的重要意义.
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淋病奈瑟菌毒力岛的研究进展
2001年,Dillard等首次从淋病奈瑟菌(简称淋球菌)中鉴定出毒力岛.淋球菌毒力岛编码多个毒力因子,携带Ⅳ型分泌系统,多见于播散性淋病分离株.目前在淋球菌中发现的毒力岛基因主要有: atlA、traH、traG、cspA、exp1、exp2、orf7和orf8等.研究淋球菌毒力岛及其相关产物,对于揭示毒力与耐药性的关系、寻找抗生素新的作用靶位、制备疫苗和细菌的快速诊断具有重要的意义.
