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幽门螺杆菌临床株cagA基因克隆及序列分析
目的 分离鉴定临床分离株幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp),分析其CagA蛋白的磷酸化基序EPIYA,探讨东亚株Hp CagA序列的结构特点. 方法 选取胃相关疾病患者的胃黏膜组织,剪碎后接种于哥伦比亚血琼脂平板,微需氧培养,菌落生长后通过尿素酶试验、革兰染色及显微镜检查对Hp进行初步鉴定.提取菌落基因组,PCR扩增Hp 16S rRNA基因并进行测序鉴定;扩增cagA基因全长序列,连接入pMD18-T载体.将重组质粒转入感受态E.coliDH5α,测序鉴定重组质粒,利用DNAStar和MEGA 6软件对cagA序列进行比对及聚类分析. 结果 成功分离Hp共26株.构建pMD18-T/cagA克隆载体后对26株Hp的cagA基因全长测序,序列比对分析显示有6株为西方型,20株为东亚型.东亚型CagA第815～834位点存在13个氨基酸的缺失、部分缺失或变异,西方型中有3株丢失磷酸化位点EPIYA-C;聚类分析显示Hp分离株分别聚类为东亚群、西方型东亚群以及西方群3群. 结论 Hp分离株以东亚株为主,但也存在西方株感染;东、西方型CagA在EPIYA基序及侧翼序列显著差异,菌株之间存在聚类关系.
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镇江地区H pylori的cagA基因及其3'可变区结构的变化
目的:评估镇江地区H pylori临床株的cagA基因阳性率、了解菌株CagA蛋白的可能分型、其羧端可变区EPIYA的数目以及与临床结果之间有无关联.方法:培养分离来自临床胃十二指肠疾病患者的H pylori,提取基因组DNA,通过PCR方法检测H pylori cagA基因的状况.随机选择不同病种的cagA基因阳性(cagA+)的PCR产物,通过转化质粒,进行cagA+PCR产物测序,通过ExPASY-Tranlation软件获得cagA基因相应的CagA蛋白的氨基酸序列.国际标准株NCTC11637的cagA基因以及CagA蛋白序列通过搜索NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库获得.结果:60株H pylori临床株中,56例为cagA+,阳性率达93.3%.20例测序的结果表明,CagA蛋白结构可分为2种类型,19株东亚型和1株西方型.所有19株东亚型均为Yamaoka分型的A型,所有20例菌株的EPIYA的数目均为3个,与临床结果无关联.结论:cagA基因阳性率在不同病种之间无差异.镇江地区H pylori临床株的CagA蛋白的一级结构,与日本、韩国菌株一样,主要为东亚型,其CagA蛋白羧端可变区EPIYA数目均为3个,与临床结果无关联.
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幽门螺杆菌cagL基因缺失株的建立
目的:构建幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagL基因缺失株,为研究cagL基因的功能奠定基础.方法:利用同源重组原理,PCR扩增该基因编码区两侧序列,作为同源臂,构建出带卡那霉素抗性标志的载体,采用电穿孔法将其转化入受体菌中,并经PCR验证后获得了cagL基因缺失株;突变株和野生株分别与胃上皮细胞GES-1共培养后,检测其对CagA蛋白转运的影响.结果:构建cagL基因缺失的自杀质粒,并获得一株cagL基因缺失株;CagA转运实验表明,cagL基因缺失后,导致幽门螺杆菌CagA转运功能的丧失.结论:成功获得了幽门螺杆菌cagL基因缺失株,该基因参与CagA蛋白的转运,是该菌IV型分泌系统中重要组成成分之一.
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幽门螺杆菌感染与原发性不孕症的相关性
目的 探讨H.pylori的感染状态是否与原发性不孕症相关,H.pylori感染是否能够造成原发性不孕症患者外周血促炎因子的异常升高,细胞毒素相关基因A(CagA)蛋白是否在其中发挥关键作用.方法 选取2015年9月至2016年8月就诊的原发性不孕症(不孕组)患者213例和健康对照者97名.将原发性不孕症患者按照常见病因分为单一因素、合并2种以上因素和不明原因.使用H.pylori抗体分型检测试纸检测血清H.pylori IgG抗体和CagA抗体,ProcartaPlex多细胞因子检测系统检测细胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、IL-18、IL-1β、粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IFN-γ、TNF-α、IL-12p70.采用卡方检验和独立样本t检验进行统计学分析,并进行风险评估.结果 不明原因不孕组患者的血清H.pylori IgG抗体阳性率高于健康对照组[74.0％(37/50)比56.7％(55/97)],差异有统计学意义(OR=2.173,95％CI 1.028～4.595,X2=4.216,P=0.040).不孕组与健康对照组H.pylori阳性感染患者中的CagA抗体阳性率比较[71.7％(91/127)比74.5％(41/55)]差异无统计学意义(OR=0.863,95％CI 0.421～1.772,P＞0.05).H.pylori阳性不孕组患者血清IL-8、IL-18和IFN-γ水平分别为(35.14±12.16)、(11.83±4.01)和(11.05±3.17) ng/L,均高于H.pylori阳性健康对照组[分别为(21.44±12.35)、(9.89±2.23)和(8.90±1.45) ng/L]和H.pylori阴性不孕组[分别为(11.45±8.63)、(7.90±0.99)和(8.18±1.10) ng/L],差异均有统计学意义(t=6.947、3.366、4.811和15.596、8.900、8.068,P均＜0.05).不明原因H.pylori阳性不孕组血清IL-8、IL-18、IFN-γ水平分别为(39.97±11.52)、(13.12±4.61)、(13.06±3.70) ng/L,均分别高于单一因素者的(31.65±11.20)、(11.12±3.46)、(10.14±2.41) ng/L,以及合并2种以上因素者的(30.47±8.49)、(11.13±3.79)、(10.07±2.50) ng/L,差异均有统计学意义(t=4.217、2.942、5.738,5.138、2.562、5.218,P均＜0.05).H.pylori阳性不孕组中,CagA阳性患者血清IL-8、IL-18和IFN-γ水平分别为(40.42±13.80)、(13.04±4.19)和(11.51±3.41) ng/L,均高于CagA阴性患者[分别为(23.49±11.57)、(9.08±1.43)和(10.04±2.29) ng/L]和健康对照组中CagA阳性者[分别为(21.85±12.14)、(10.20±2.29)、(9.31±2.38) ng/L],差异均有统计学意义(t=6.507、5.533、2.380和7.417、4.069、3.738,P均＜0.05). 结论 CagA阳性的H.pylori感染导致血清促炎因子的升高可能是女性原发性不孕的一个危险因素,尤其对于不明原因的原发性不孕症患者,这可能是导致其不孕的原因.
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幽门螺杆菌提取液诱导AGS细胞内活性氧类物质水平的变化
目的 探讨幽门螺杆菌(Hp)感染与AGS细胞内活性氧类物质(ROS)的关系.方法 将Hp11638(CagA~+,VacA~+)菌株及其突变株Hp11638M(CagA~+,VacA~-)提取液与AGS细胞共同孵育,收集细胞及培养上清液.流式细胞术检测细胞内ROS水平,分光光度计550 nm处检测培养上清液中细胞色素C含量.结果 AGS细胞内ROS水平与2株Hp提取液呈浓度及时间依赖关系,经Hp11638提取液刺激的AGS细胞内ROS水平高于Hp11638M提取液.细胞色素C减少证实了这一结果 .结论 AGS细胞内ROS升高是Hp多种蛋白共同作用的结果 ,VacA蛋白参与了这一过程.
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浙江地区小儿幽门螺杆菌cagA基因变异性研究
目的研究浙江地区儿童感染的幽门螺杆菌(Hp)cagA基因的变异性.方法应用3对不同引物对66例Hp感染患儿胃粘膜Hp菌株通过聚合酶链反应(PCR)技术,分别扩增cagA基因不同DNA片段,检测cagA基因阳性(cagA+)检出率;用免疫印迹法检测患儿血清CagA抗体.结果Hp菌株cagA基因DNA 404 bp、349 bp、298bp片段分别经3对引物扩增后,cagA+检出率分别为56.1%、39.4%、72.7%,三者之间差别有显著性意义(X2=14.63,P＜0.01),总阳性检出率为90.9%.66例患儿血清CagA抗体阳性率为97.0%.结论浙江地区儿童感染的Hp菌株cagA基因存在变异性和多态性,增加引物对数量进行检测可以提高Hp菌株cagA+检出率.
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幽门螺杆菌cagA基因全长克隆及序列分析
目的探索扩增cagA基因全长的PCR方法,克隆中国2株胃癌幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)分离株和1株十二指肠溃疡分离株及国际标准株SS1的cagA基因,初步探讨cagA序列和磷酸化位点变异及其临床意义.方法针对已知cagA基因两侧及cag致病岛右侧反转重复序列设计PCR引物,扩增cagA基因并克隆测序,分析已知cagA序列同源性及其酪氨酸磷酸化位点.结果3株中国Hp分离株cagA氨基酸序列的同源性约为94%(93.9%、94%、94.5%),并都有pY117/118/122和EPIYA-A、B、D 4个酪氨酸磷酸化位点.SS1株cagA与西方菌株同源性大于85%,而与中国菌株的同源性小于80%,具有pY117/118/122和EPIYA-A、B、C 4个酪氨酸磷酸化位点.结论建立的PCR方法可扩增cagA基因全长.CagA序列变异和磷酸化位点具有地区聚类特征,但与Hp感染临床结局无特殊关联.
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成人特发性血小板减少性紫癜与幽门螺杆菌CagA蛋白的关系
目的了解成人特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)与幽门螺杆菌(helicobacter pylori,Hp)CagA蛋白的关系.方法 采用14C尿素呼吸试验对正常成人和ITP患者进行Hp检测后,对Hp阳性的ITP患者进行CagA蛋白抗体检测.依据急性ITP,慢性ITP,难治性ITP对ITP患者进行分类.结果 223例正常患者中123例Hp阳性,感染率为55.2%,而CagA蛋白抗体阳性为42例,占34.1%.278例ITP患者中Hp阳性176例,感染率63.3%,其中CagA蛋白抗体阳性83例,占47.2%,ITP患者的Hp感染率与正常人相似,但CagA蛋白抗体阳性率显著高于正常人(P<0.05).Hp感染率及CagA蛋白抗体阳性率在急性ITP患者中分别为62.2%和46.4%,慢性ITP为63.2%和47.0%,难治性ITP为64.7%和48.5%,比较显示不同类型的ITP患者Hp感染率及CagA抗体阳性率差异无统计学意义(P>0.05).结论 纳入研究的ITP患者的Hp感染率与正常人相似,但CagA蛋白抗体阳性率明显高于正常人,提示CagA蛋白在成人ITP的发生发展中具有一定作用.进一步分析也显示不同类型的ITP患者Hp感染率及CagA蛋白阳性率差异无统计学意义.
关键词： 特发性血小板减少性紫癜 幽门螺杆菌 CagA蛋白 14C呼吸实验 -
幽门螺杆菌与肝脏疾病的相关性研究进展
幽门螺杆菌(helicobacterpylori,Hp)是世界各地常见的感染性病原之一,世界卫生组织将其归为一类致癌因子.Hp感染与人类胃肠疾病的关系中免疫机制为关键,并可能参与多种胃肠外疾病的发生发展,本文简介Hp与肝脏疾病的相关性研究进展,为Hp致病机制的研究及相关疾病的防治提供新的思路.
