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运用免疫荧光法检测温热对于硼化合物细胞微分布影响
目的 硼中子俘获疗法(BNCT)的有效性主要取决于硼-10元素在肿瘤细胞内的聚集.目前的硼检测手段仅限于分析肿瘤组织中硼的平均浓度,不能准确地评价硼化合物(BPA)在组织中的详细分布.先前研究证实温热处理可以提高放疗疗效,本研究通过免疫荧光法检测温热是否对BPA细胞内的微分布有影响.方法 通过免疫荧光法分析硼化合物在肿瘤细胞中的分布以及温热对BPA分布的影响.在体外对人肺癌细胞株A549和人头颈部鳞状细胞癌细胞株SAS进行培养,并且加入BPA共培养1 h.另外,A549细胞经温热处理1 h后,利用抗BPA抗体通过免疫荧光法进行检测.免疫荧光强度通过图像分析软件进行分析.结果 检测发现BPA主要聚集于细胞核周围,BPA免疫荧光的强度随着培养基中BPA浓度的增加而增强.尽管在26 μg/ml浓度和13 μg/ml浓度时,细胞免疫荧光的平均强度相近,但直方图分析发现26 μg/ml时细胞主要向高荧光强度区域移动.经温热处理后,BPA在细胞中的分布没有明显增加.结论 本研究利用免疫荧光法对BPA在细胞内的分布进行了分析,以上结果暗示温热对肿瘤细胞硼摄取的影响可能主要需要通过改善肿瘤循环、增加肿瘤内BPA的输送来实现.
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硼中子俘获疗法进展和展望
硼中子俘获疗法(boron neutron capture therapy,BNCT)的基本原理是基于核裂变反应.当非放射性硼(10B)元素受到低能量中子照射后即发生核裂变,从而产生高能量α粒子(4He),其本身衰变为锂(7Li)核[10B(n,α)7Li].7Li核和α粒子的射程大约只有1个细胞的直径(10μm),所以其引起的损伤范围也仅局限于带有1oB的细胞.因此,无论从生物学或生理学角度上来看,BNCT是新的一种靶向性放疗[1].BNCT要取得成功,首先必须选择性地运送足量10B到肿瘤细胞内,同时保持周围正常细胞不含或仅含极低浓度10B.
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硼中子俘获疗法诱导U87胶质瘤细胞凋亡
目的 探讨硼中子俘获疗法(BNCT)对人脑胶质瘤细胞株U87的增殖抑制和诱导凋亡的作用及可能机制.方法 实验分为未照射组(0 Gy)、γ射线对照组(4、8 Gy)、反应堆组(3.5 Gy)、BNCT组(4、8 Gy).采用形态观察、流式细胞仪Annexin V/PI荧光染色、四甲基偶氮唑蓝(MTT)法等方法观察BNCT对U87细胞的增殖抑制和诱导凋亡的作用,以免疫组织化学技术检测P53蛋白的表达,应用western blot检测BCL-2、BAX蛋白表达的变化.结果 硼中子照射后细胞出现典型的凋亡形态改变.BNCT 4、8 Gy组处理后48 h细胞的凋亡率分别为65.1%、85.9%.BNCT 4、8 Gy组细胞生长抑制作用显著高于同等剂量的γ射线照射组(P＜0.01).未照射的U87细胞P53蛋白表达阴性,BNCT4、8 Gy照射后P53蛋白表达阳性.BNCT4、8 Gy照射后BCL-2蛋白表达下降,BAX蛋白上升.结论 BNCT对U87细胞具有显著的增殖抑制作用,并有剂量、时间依赖性特点.
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硼中子俘获疗法对胶质瘤干细胞增殖和细胞周期的影响
目的 研究硼中子俘获疗法(BNCT)对体外培养人胶质瘤干细胞(GSCs)周期进程的影响及机制,比较GSCs和胶质瘤细胞株SHG-44对BNCT敏感性的差异.方法 首先检测人GSCsSU2和人胶质瘤细胞株SHG-44吸收含硼化合物二羟基苯丙氨酸硼(BPA)的情况,然后采用医院中子照射器(IHNI-1)对含硼(10B)细胞进行照射,克隆存活实验检测细胞的放射敏感性,MTT法检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞周期进程,Westem blot检测cyclin B1、CDK1和P21[WAF1]蛋白表达情况.结果 5 mmol/L BPA孵育SU2和SHG-44细胞24h,10B浓度分别可达(1.76±0.28)和(2.50±0.12)μg/107细胞,富含10B的细胞经IHNI-1照射后生存率和增殖率与不含10B的细胞比均明显下降(P＜ 0.05或P＜0.01),SU2细胞经IHNI-1照射4 min时BNCT敏感性低于SHG-44细胞(P＜0.05).与未加BPA而仅用中子照射组比较,经BNCT后G2/M期SU2和SHG-44细胞比例增高(P＜0.05),cyclin B1和CDK1蛋白表达降低(P＜0.01),P21[WAF1蛋白表达增加(P＜0.01).结论 GSCs的BNCT敏感性低于胶质瘤细胞,BNCT可通过抑制细胞周期蛋白形成将细胞阻滞于G2/M期来抑制细胞更新和增殖.
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硼中子俘获疗法进展及治疗脉络膜黑色素瘤展望
本文介绍利用选择性聚集在肿瘤细胞中的硼原子俘获中子核反应生成α粒子和锂核,杀死癌细胞治疗恶性肿瘤的硼中子俘获疗法(boron neutron capture therapy,BNCT)的进展情况.BNCT是一种治疗恶性肿瘤的有效疗法,目前主要用于原发性或复发性恶性颅脑肿瘤的治疗,但对其他恶性肿瘤的临床治疗也在不断探索中,特别是在皮肤黑色素瘤的治疗上取得了长足的进展.葡萄膜黑色素瘤是常见的成年人眼内恶性肿瘤,随着高效硼载体的发展,对葡萄膜黑色素瘤的相关实验研究也在进行中,有望今后拓展应用于葡萄膜黑色素瘤的临床治疗中.
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星形胶质瘤细胞摄取BPA的时间及细胞周期相关性研究
目的研究两种星形胶质瘤细胞系C6和SHG-44摄取BPA(p-boronophenylalanine)的孵育时间与细胞周期的相关性,探讨BPA的选择性作用机制.方法细胞计数法测定C6和SHG-44胶质瘤细胞和星形胶质细胞的生长曲线;将三种细胞分别培养在含BPA的培养液中(BPA浓度为5mmol/L,10B浓度相当于 50μg/ml),4、8、12、16、20和24h后采用感应耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)法测定细胞内硼的含量,绘制硼含量-时间曲线;含硼培养液孵育24h后,流式细胞术分离G0/G1和G2/M期细胞,ICP-AES法测定不同周期细胞硼的含量.结果 C6和SHG-44的倍增时间均为18.5h,星形胶质细胞的倍增时间为28h.相同时间下两种胶质瘤细胞硼含量均高于对照组的胶质细胞,差异有统计学意义(P<0.01).两种胶质瘤细胞G2/M期比G0/G1期硼含量明显增高,差异有统计学意义(P<0.01),而星形胶质细胞两期硼浓度差异无统计学意义(P>0.05).两种胶质瘤细胞G2/M期硼浓度均高于星形胶质细胞,差异有统计学意义(P<0.01).在G0/G1期,C6和SHG-44与星形胶质细胞硼浓度比值分别为1.46和1.51,而在G2/M期该比值则分别为3.65和3.96.结论实验中合成的BPA具备了应有的生物学活性,即对胶质瘤细胞的高选择性;有丝分裂周期中的瘤细胞对BPA的吸收增强,这一过程可能与胶质瘤细胞对BPA的主动运输有关;主动运输可能是BPA对胶质瘤选择性作用的基础.
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硼中子俘获疗法诱导SHG44胶质瘤细胞凋亡
目的 探讨硼中子俘获疗法(BNCT)是否抑制人脑胶质瘤细胞SHG44增殖及其作用机制.方法 BNCT作用后,应用四甲基偶氮唑蓝比色法检测SHG44细胞的增殖抑制,采用光镜、电镜、荧光显微镜观察细胞的形态学变化.应用流式细胞仪检测SHG44细胞的凋亡率,以 Western blot检测细胞表达Bcl-2、Bax蛋白的变化.结果 BNCT对SHG44细胞的增殖抑制作用呈剂量依赖性.BNCT 4和8 Gy后48 h流式细胞仪检测凋亡率分别为63.2%和88.3%.BNCT作用后,Bax蛋白表达增高,Bcl-2蛋白表达下降.结论 BNCT对胶质瘤细胞SHG44具有明显的增殖抑制及诱导凋亡作用,并使Bax蛋白表达上调、Bcl-2蛋白表达下调.
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硼中子俘获疗法促人黑色素瘤细胞凋亡
目的 研究硼中子俘获疗法(BNCT)体外杀伤人黑色素瘤细胞的效应及机制.方法 首先检测黑色素瘤细胞A375吸收含硼化合物二羟基苯丙氨酸硼(BPA)的情况,然后采用医院中子照射器(IHNI-1)对含硼(10B)细胞进行照射.克隆存活实验检测细胞的放射敏感性,MTT法检测细胞增殖率,流式细胞术检测凋亡,Western blot检测胞质内细胞色素C表达和caspase-9的激活.结果 BPA孵育24 h,A375细胞10B浓度为(2.884±0.148)μg/107个细胞,达到了BNCT杀伤细胞的要求.富含10B的细胞经中子照射2.1 min后存活分数降低为对照组的58％(t=2.964,P＜0.05),细胞经中子照射后24 h增殖率下降为对照组的83％(t=3.286,P＜0.05),BNCT组细胞凋亡率达(55.2±7.9)％,明显高于对照组(t =9.754,P＜0.05),胞质内细胞色素C水平上升且caspase-9激活程度增加(t=7.625、8.307,P＜0.05).结论 BNCT能够杀伤黑色素瘤细胞,其机制可能通过线粒体途径诱导细胞凋亡.
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硼中子俘获治疗恶性肿瘤进展
本文介绍利用被选择性吸附在肿瘤细胞中的硼俘获中子核反应生成α粒子和Li离子杀死癌细胞治疗恶性肿瘤的进展情况,以及该方法的三大要素:热中子或超热中子、硼携带剂药物及治疗剂量有关问题.它是一种治疗恶性肿瘤特别是脑胶质瘤潜在的有效治疗方法.
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硼中子俘获疗法治疗中枢神经系统肿瘤的研究进展
硼中子俘获疗法是一种选择性生物靶向核素治疗方法,初于20世纪30年代提出,相较于肿瘤治疗的其他传统方法,具有靶向性好,对周围正常组织损伤小等特点,一直被认为是可以成为治疗各种肿瘤的理想方法之一.但由于缺乏理想的硼携带剂以及适合医院使用的中子源等问题,硼中子俘获疗法一直未能成为肿瘤治疗的一线选择.随着新型硼携带剂的研发,对不同给药方式的探索以及小型基于回旋加速器的中子源的使用,硼中子俘获疗法在肿瘤治疗方面已取得许多令人瞩目的成果.
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应用清华开放池反应堆的硼中子俘获疗法 治疗复发性头颈部癌的临床试验
头颈部(head and neck,HN)癌是台湾地区的一种地方性疾病.全量照射后局部复发的HN癌是一个治疗挑战,而硼中子俘获疗法(boron neutron capture therapy,BNCT)是一种能够提供持久局部控制且毒性可耐受的解决方案.位于新竹清华大学的清华开放池反应堆(Tsing-Hua Open Pool Reactor,THOR)为基础和临床BNCT研究提供了一个高质量的超热中子源.我们于2010年至2013年间开展了名为"在THOR应用硼中子俘获疗法治疗复发性头颈癌的I/II期临床试验"的首项临床试验.17例患者被招募至该研究,共有23个复发性HN肿瘤接受了高剂量光子照射.以L-硼苯丙氨酸的果糖复合物为硼载体,每例患者进行了间隔28天的2次分割BNCT治疗.结果其毒性可以耐受,虽然反应率高(12/17),但常见放射部位或附近区再次复发.为了获得更好的局部控制,2014年启动了另一项临床试验,名为"硼中子俘获疗法联合影像引导的调强放疗(image-guided intensity-modulated radiotherapy,IG-IMRT)治疗局部复发性HN癌的I/II期临床试验".按照我们之前的方案首先进行BNCT,在BNCT后28天开始进行IG-IMRT.截至2017年5月,已有7例患者接受了这种联合治疗.治疗相关毒性与之前两次使用BNCT时观察到的毒性相似.3例患者实现完全缓解,但尽管初期反应良好,局部复发仍是治疗失败的主要原因.未来将在THOR开展局部或全身治疗与BNCT联合应用来治疗复发性HN癌患者的其他临床试验.
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硼中子俘获治疗外阴黑色素瘤和生殖器乳腺外Paget病的疗效
背景与目的 尽管目前对生殖器区的黑色素瘤和乳腺外Paget病(extramammary Paget's disease,EMPD)常推荐的治疗方法是广泛性手术切除病变,但该方法侵害性极高并可导致功能性和性方面的问题.当扩大局部切除术不可行的情况下,替代疗法已被用于进行局部控制.本研究描述了4例接受硼中子俘获治疗(boron neutron capture therapy,BNCT)的生殖器恶性肿瘤患者.方法 4例患者中包括1例外阴黑色素瘤(vulvar melanoma,VM)和3例生殖器EMPD患者.他们于2005至2014年间在Kyoto大学研究堆接受了对二羟基硼酰苯丙氨酸作为硼携带剂的BNCT治疗.他们接受了介于治愈性肿瘤剂量和可耐受的皮肤/黏膜剂量之间的超热中子束照射.结果 所有患者在BNCT治疗后均表现出相似的肿瘤和正常组织反应,并在6个月内达到完全缓解.严重的正常组织反应前2个月内出现,随后逐渐减弱的中度皮肤糜烂,排尿困难或接触性疼痛持续2个月,完全解决需4个月.结论 BNCT治疗VM和EMPD后局部肿瘤得到完全控制.根据我们的临床经验,我们认为BNCT是治疗生殖器区原发性VM和EMPD的一种有前景的方法.
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硼中子俘获疗法治疗小鼠颅内G422胶质细胞瘤
目的 探讨硼中子俘获疗法(BNCT)治疗G422胶质细胞瘤的效果.方法 建立小鼠颅内G422胶质细胞瘤模型,以ICP-AES法测定荷瘤小鼠不同组织中的10B浓度.将荷瘤小鼠随机分为未照射组(0Gy)、γ射线对照组(5、10 Gy)、反应堆组(5、10 Gy)、BNCT组(5、10 Gy).采用生存时间的中位数、平均生存时间、生存时间延长率作为评价指标,观察各组的治疗效果.结果 荷瘤小鼠腹腔注射对二羟苯丙氨酸硼溶液后1.5 h,瘤组织内的10B浓度达到峰值[(43.78±3.02)μg/g].BNCT 5、10 Gy照射后,移植G422胶质细胞瘤小鼠的生存时间延长率分别为235%(233%)、329%(342%).BNCT 5 Gy组的生存率与未照射组、γ射线5 Gy组和反应堆5 Gy组相比差异有统计学意义(P＜0.05).BNCT 10 Gy组的生存率与未照射组、γ射线5 Gy组、γ射线l0 Gy组、反应堆5Gy组、反应堆10Gy组、BNCT 5 Gy组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 BNCT可以显著提高荷G422胶质细胞瘤小鼠的生存率,并具有剂量依赖性的特点;同时BNCT具有较高的相对生物学效应,优于同剂量γ射线的治疗效果.
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硼中子俘获疗法诱导U251胶质瘤细胞凋亡
目的 研究硼中子俘获疗法(BNCT)能否诱导体外培养的U251细胞发生凋亡,并探讨其诱导细胞凋亡的机制.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法绘制细胞生长曲线,应用光镜、荧光显微镜、透射电子显微镜观察BNCT后细胞形态改变; 使用流式细胞仪检测细胞凋亡率;利用细胞克隆形成实验分析细胞存活分数;用免疫组织化学方法检测相关蛋白表达的变化.结果 在体外试验中BNCT对U251细胞的杀伤力强,并观察到了典型的细胞凋亡改变,4、8 Gy照射后48 h流式细胞仪检测,细胞凋亡率分别为60.2%、80.6%.在凋亡过程中,p53蛋白表达明显增高,而bc1-2蛋白表达下调.结论 BNCT可诱导U251细胞发生凋亡,其机制可能与p53基因表达上调及bcl-2基因表达下调有关.
