首页 > 文献资料
-
癌基因LMO3的原核表达及多克隆抗体的制备及应用
目的:制备抗神经特异性表达的癌基因LMO3的多克隆抗体,进行LMO3分子检测和功能研究.方法:采用RT-PCR方法扩增LMO3的基因序列,构建其原核表达载体pET32a-LMO3.在大肠埃希菌中诱导融合蛋白表达,SDS-PAGE分离纯化原核表达的融合蛋白,PBS溶解聚丙烯酰胺凝胶颗粒中的融合蛋白,乳化后免疫新西兰兔制备多克隆抗体.采用免疫印迹、免疫组化等对该抗体的特异性进行鉴定.结果:构建的重组质粒经酶切鉴定和测序证实序列正确.经诱导表达在相对分子质量为37×103处有一条明显的蛋白条带,与预期值一致;免疫动物所得抗血清效价为1∶16 000,该抗体能够识别原核表达的LMO3蛋白及细胞内源性表达的LMO3蛋白;免疫组化显示,LMO3在SHG44胶质瘤细胞株及脑胶质瘤组织中均有表达. 结论:制备了能识别天然LMO3分子的抗LMO3的多克隆抗体,为检测LMO3分子的表达和进一步研究其功能提供了有力的工具.
-
多巴胺对C8胶质细胞生长及LMO3和CIB1表达的影响
目的 了解多巴胺对C8胶质细胞生长的影响、可能受体途径以及对CIB1、LMO3表达的影响. 方法 采用MTT方法检测多巴胺、多巴胺受体激动剂、多巴胺受体拮抗剂对C8胶质细胞生长增殖的作用,同时采用免疫荧光组化法检测不同浓度多巴胺对C8胶质细胞中LMO3、CIB1表达及定位的影响. 结果 多巴胺对C8胶质细胞的作用与浓度相关,低浓度(10 μmol/L)对C8胶质细胞生长无明显影响,中浓度(100 μmol/L)可明显促进C8胶质细胞的增殖(P<0. 05,P<0. 01),而高浓度(500 μmol/L)则抑制C8胶质细胞生长(P<0. 05);多巴胺处理组比多巴胺D1激动剂组促C8胶质细胞生长作用明显,同时加入多巴胺及D2受体拮抗剂组比多巴胺处理组C8胶质细胞显著增加( P<0. 01). 低浓度(10 μmol/L)多巴胺显著增加C8胶质细胞LMO3的表达水平(P<0. 05);高浓度(500 μmol/L)多巴胺则降低CIB1蛋白的表达(P<0. 05). 结论 多巴胺主要通过多巴胺D2受体对C8胶质细胞生长增殖起作用,并呈浓度相关性,多巴胺D2受体拮抗剂对C8胶质细胞促增殖作用有协同性,不同浓度多巴胺对C8胶质细胞中CIB1及LMO3的表达影响不同,具体作用机制还有待进一步研究.
-
LMO3与肿瘤关系研究进展
LIM蛋白是以新杆状线虫LIN 11、ISL 1和MEC 3蛋白命名的含有LIM结构域的蛋白,其作为一种转录调节因子在胚胎发育、肿瘤发生等过程中发挥作用[1]. LIM结构域的典型特征为含有高度保守的半胱氨酸组成的锌指结构,且存在 CX2 CX17-19 HX2 CX2 CX16-20 CX2 C/H/D的高度保守序列,主要作用是参与蛋白质之间的相互作用,在生物调节过程中,多种蛋白质通过LIM蛋白的表面形成蛋白复合体参与胚胎发育、细胞分化等生理活动[2-3].由于LMO蛋白序列中缺乏可供DNA结合的同源序列,其功能的发挥主要依靠2个LIM结构域与DNA结合蛋白或其他转录因子形成多蛋白复合体,在不同的发育通路决定细胞的发育及分化[1,3-5]. 该家族有 4 个结构高度保守、功能相似的成员组成( LMO1 ~ LMO4 ). LMO 家族发现较晚,但随着LMO1、LMO2在白血病发生、发展过程中的重要作用被发现,对该家族的功能研究成为近年来的研究热点. LMO1参与T淋巴细胞的分化和成熟,异常表达与急性T 淋巴细胞白血病( T-ALL )的发生有关,并且是神经母细胞瘤发生的癌基因[6-7]. LMO2是血细胞发生的关键调控因子,蛋白的异常高表达可导致异常的转录因子复合物形成,诱发白血病、弥散性大B 细胞淋巴瘤( DLBCL)、乳腺癌[8-10]等,其表达水平是判断DLBCL或胰腺癌患者存活率的重要指标. LMO4是乳腺癌不良预后的重要指标,过度表达的LMO4可以抑制BRCA1 活性而促进乳腺癌的发生发展[11-14]. LMO3初是通过与LMO1的序列相似性经同源克隆而获得的.
-
LMO3逆转录病毒表达载体的构建及其对SK-N-AS细胞增殖的影响
目的 构建包含LMO3 ( LIM-only 3,LMO3)全长基因的逆转录病毒表达载体,感染人神经母细胞瘤SK-N-AS,检测LMO3对SK-N-AS细胞增殖的影响.方法 将质粒pEGFP-C1-LMO3经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建重组逆转录病毒表达载体pLXSN-LMO3,导入包装细胞pA317,获得逆转录病毒颗粒,感染SK-N-AS细胞,用RT-PCR及Western 印迹鉴定,检测LMO3感染后细胞的增殖及细胞周期分布情况.结果 获得了能正确表达LMO3基因的重组逆转录病毒表达载体pLXSN-LMO3;LMO3基因被逆转录病毒成功导入SK-N-AS细胞后,与对照组细胞相比,LMO3感染组G0/G1期细胞减少,S期细胞增加,感染48 h后,LMO3感染组细胞的增殖能力显著高于空载体对照组及SK-N-AS组(P＜0.05).结论 成功构建了LMO3基因的逆转录病毒表达载体,LMO3可以通过促进SK-N-AS细胞由G0/G1期进入S期,从而促进细胞的增殖.
-
LMO3 mRNA在小鼠中枢神经系统的表达定位
目的观察神经特异性转录因子LMO3 mRNA在小鼠中枢神经系统中的定位.方法原位杂交组织化学染色.结果 LMO3 mRNA阳性神经元可见于大脑、小脑、丘脑、脑干、脊髓,在小鼠中枢神经系统中,LMO3 mRNA阳性反应产物主要位于细胞质和突起内.强阳性信号主要出现于大脑皮质的Ⅱ～Ⅵ层、梨状皮质、内嗅皮质、海马的CA1区、齿状回、中脑的黑质致密部、红核、室旁核、巨细胞网状核、外侧网状核、三叉神经脑桥核、面神经核、三叉神经运动核、舌下神经核等部位;中等强度着色主要分布于扣带前皮质、嗅球、海马的CA2区、梨状内核、杏仁核等部位;海马的CA3区、尾壳核、苍白球、杏仁复合体、丘脑、三叉神经脊束核、疑核、中缝核团、小脑间置核及外侧核、浦肯野细胞可见弱的阳性细胞.结论 LMO3基因在CNS的广泛分布提示它除了在多巴胺神经递质的活动中起作用外,还参与了机体的学习记忆、嗅觉的调节.
-
LMO3 mRNA在小鼠脑发育过程中的表达
目的:研究不同发育时期小鼠脑内LMO3的表达.方法:采用以SYBR Green I为荧光染料的定量RT-PCR及以地高辛标记的cRNA为探针的原位杂交组织化学法检测LMO3基因在小鼠脑发育过程中的表达.结果:FQ RT-PCR结果表明,LMO3在出生前高表达,P7d后表达水平急剧下降,至成年都维持在一个较低的水平. LMO3 mRNA在小鼠胚胎期E10.5d即有表达,但仅限于整个脑泡组织内,胚体其他区域均为阴性;E11.5d脑区信号逐渐加强,无核团及脑区的特异性,胚体其他部分仍为阴性;E15.5～P0d期LMO3阳性信号在几乎所有观察的脑区均有广泛而较强的着色;P7d LMO3阳性信号较出生前变弱,分布逐渐集中;P14～P60d LMO3 mRNA表达范围较P7d逐渐缩小,但仍有广泛表达,阳性信号主要集中于不同核团,表达有强弱之分.结论:LMO3基因可能与小鼠出生前脑的发育以及出生后特定脑区神经元的特化及特性维持有关.
