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组织激肽释放酶、绿色荧光蛋白双基因共表达载体的构建及其对平滑肌细胞增殖的影响
目的 构建人组织激肽释放酶(HK1)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的逆转录病毒双基因共表达载体并探讨其对血管平滑肌细胞(SMCs)增殖的影响.方法 采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增人HK1基因,通过基因重组构建HK1和EGFP逆转录病毒双基因共表达载体,经酶切及测序鉴定正确后,包装成为重组逆转录病毒rRV-HK1-IRES-EGFP,病毒感染SMCs细胞后,荧光显微镜和Western blot检测HK1基因的表达情况.结果 成功构建了带有EGFP的HK1基因的逆转录病毒表达载体,并将其转入SMCs细胞,感染后SMCs增殖受到抑制.结论 构建的HK1基因逆转录病毒可在体外高效表达,为HK1基因治疗的研究奠定了基础.
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人白细胞介素-10基因的克隆与逆转录病毒载体的构建
目的 克隆、测序人白细胞介素(hIL)-10基因片段,构建逆转录病毒载体(MSCV-hIL-10).方法 采用刀豆蛋白A活化的人外周血单个核细胞培养提取总RNA,设计随机引物并逆转录反应合成hIL-10 cDNA第1链,并以hIL-10特异性引物行PCR扩增,获得hIL-10克隆基因片段,将hIL-10克隆基因片段,经双酶切后定向插入到逆转录病毒载体(MSCV)中,用脂质体法转染PT67包装细胞,以G418筛选阳性克隆.结果 聚合酶链反应(PCR)扩增出534 bp特异性片段,测序结果表明同源性与GenBank报道完全一致,hIL-10基因片段插入MSCV载体中经转染包装后得到2×107CFU/ml的分泌hIL-10的病毒悬液,hIL-10的分泌量为1 220 ng/106细胞·d-1.结论 成功克隆hIL-10开放阅读框架,成功构建MSCV-hIL-10重组质粒,获得高滴度的分泌hIL-10的病毒悬液,hIL-10的表达可以应用于移植排斥的基因治疗.
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反转录病毒载体介导猪MHCⅡ分子在猪骨髓细胞中的表达
目的构建猪MHCⅡ分子的反转录病毒表达载体,建立产生病毒颗粒的包装细胞株,体外转导小型猪骨髓细胞并观察目的基因的表达情况,为研究小型猪转导同种异体MHCⅡ分子对于肝脏移植特异性免疫耐受的诱导提供实验基础和实验材料.方法利用基因重组技术将目的基因SLA-DRBdd、SLA-DQAdd和SLA-DQBdd克隆到反转录病毒载体pLNCX2上,通过脂质体转染包装细胞AmphoPackTM-293细胞,从G418筛选阳性克隆细胞培养上清中获得了有感染性的病毒颗粒;并对体外培养的猪骨髓细胞进行了感染,采用Nothem杂交和逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)等方法检测了目的基因在骨髓细胞中的表达.结果经过酶切和测序验证已成功构建了MHCⅡ分子的反转录病毒表达载体,在转染AmphoPackTM-293细胞后可以产生有感染性的重组病毒颗粒,稳定的CFM-GFG418抗性率为6%～11%,RT结果显示抗性细胞中有目的基因的RNA转录产物存在,而转染空载体的对照组没有.结论重组有目的基因的逆转录病毒载体pLNCX2经过包装细胞AmphoPackTM-293产生的病毒颗粒可以有效地将猪MHCⅡ分子转导入猪的骨髓细胞并获得长期稳定的表达.
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小鼠胚胎干细胞转基因治疗甲状旁腺功能低下症的实验研究
目的探讨小鼠胚胎干细胞(TC-1)转基因治疗甲状旁腺功能低下症(HPT).方法包装出重组人甲状旁腺素(PTH)基因的小鼠干细胞病毒(MSCV),以其感染小鼠ESCs,检测基因转导效率,PTH分泌情况;观察体内外分化情况,以及注入模型鼠体内各组小鼠血PTH和血钙变化情况.结果获得滴度为2×107集落形成单位(CFU)/ml的重组逆转录病毒,经聚合酶链反应(PCR)扩增未检测到有野生型病毒存在,可以安全应用.感染TC-1的效率为70%,每106未分化TC-1每48 h分泌PTH约10 ng.重组有PTH基因的TC-1在体内外均可分化出三胚层组织,注入模型鼠体内,在观察期间实验组动物未再出现甲旁低表现,而且血PTH和血钙均保持在接近正常值范围内.结论 MSCV介导外源PTH基因可高效转导TC-1并持续分泌PTH;体内外分化实验证明TC-1具有全能性,而且内环境并不是决定TC-1分化的唯一因素.经基因转导的TC-1可较好的改善模型鼠的症状,是未来细胞移植的一种潜在来源.
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转基因肝星状细胞株的建立及生物学特性
目的建立稳定表达肝细胞生长因子(HGF) 的肝星状细胞株CFSC/HGF.方法构建携带hgf基因全长序列的重组逆转录病毒pMSCV-HGF,反复感染肝星状细胞系CFSC建立转基因肝星状细胞株.对建立的CFSC/HGF用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)分别从基因和蛋白水平进行鉴定,并通过免疫细胞化学检测、细胞增殖活性测定,以及对人肝癌细胞HepG2的扩散试验等对其生物学特性进行初步研究.结果构建了重组逆转录病毒质粒pMSCV-HGF及包装细胞株PT/HGF,建立并筛选出HGF表达水平分别为0.15、2.23、5.48、9.76 μg/L的4个细胞株CFSC/HGF,细胞表达结蛋白和α-平滑肌肌动蛋白;随HGF表达水平不同,CFSC/HGF细胞增殖活性显示出明显的差别;CFSC/HGF培养上清可使HepG2细胞扩散,生长受抑.结论建立了稳定表达hHGF的肝星状细胞株CFSC/HGF,并对其生物学行为进行了初步鉴定.
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柯萨奇腺病毒受体抑制膀胱肿瘤细胞T24体外迁移的实验研究
我们通过构建重组柯萨奇腺病毒受体(CAR)的逆转录病毒载体,将CAR转导入膀胱肿瘤细胞T24中,建立了稳定表达株,利用体外迁移实验检测CAR高表达对于膀胱肿瘤细胞迁移能力的影响.
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携带反义甲胎蛋白增强子/单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的产病毒细胞系的建立及对肝癌细胞的靶向杀伤效应
目的建立对肝癌细胞具有靶向调控的高感染性和高分泌性产病毒细胞系.方法将重组反义甲胎蛋白增强子/单纯疱疹病毒胸苷激酶基因逆转录病毒载体(pL/TK/AFE/SN)转染至PA317包装细胞,经G418(400 mg/L)筛选、病毒滴度测定.以病毒上清感染培养的Hep3B肝癌细胞和Hela宫颈癌细胞,并抽提细胞基因组DNA作Southern blot分析;观察GCV(100 mg/L)对细胞生长的影响.结果转染pL/TK/AFE/SN的PA317细胞经G418筛选2周获阳性克隆;病毒滴度为5.4×104～3.8×105 CFU/ml.Southern杂交证实前病毒已完整整合于PA317细胞,并稳定整合于Hep3B肝癌细胞和Hela宫颈癌细胞中.导入AFE/TK基因的Hep3B肝癌细胞经GCV作用后的存活率在2、4、6 d时分别降低35%、87%、95%,生长明显受抑制(F=7.23,P<0.01).结论携带AFE/TK基因的产病毒细胞系能够成功地将AFE/TK基因转移到感染细胞中.
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绿色荧光蛋白基因逆转录病毒载体转染人骨髓间充质干细胞及表达的研究
目的绿色荧光蛋白( EGFP)基因的逆转录病毒载体转染人骨髓间充质干细胞(MSCs)及其表达情况.方法 pEGFP与逆转录病毒载体经过酶切、连接等构建重组的EGFP-逆转录病毒载体,转染PA317细胞,用G418筛选出抗性克隆,获病毒上清(滴度达到8.5×105cfu/ml)并感染人MSCs.流式细胞仪测定转染效率后加入成骨细胞分化培养夜(地塞米松 (10-7mol/L)、β-甘油磷酸钠(10 mmol/L)、维生素C(50 mg/L )),2周后观察转染细胞的分化情况.结果 48 h后细胞转染效率为7%,G418筛选2周后约97%细胞出现抗性克隆,表达维持4周.基因转染细胞能够分化为成骨细胞.结论重组EGFP逆转录病毒载体能转染MSCs,且不影响细胞的功能.
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胶质母细胞瘤的体细胞基因治疗
多形性胶质母细胞瘤是广泛浸润脑组织的脑内高度恶性肿瘤,其平均生存期不超过1年.标准治疗方案是;尽可能全切除肿瘤,之后辅以放疗.然而肿瘤仍然复发,而且化疗无明显疗效.近几十年,也促使人们寻找新的辅助治疗恶性胶质瘤的方法.胶质母细胞瘤不同于有丝分裂不活跃的神经细胞,其细胞增殖速度快,这一增殖特性是通过逆转录病毒载体进行转基因治疗的先决条件.根据脑肿瘤动物模型研究结果,于90年代初开始了人脑肿瘤的基因治疗研究.在GTI/Novartis公司赞助下从1995年12月～1996年6月进行前瞻性国际多中心Ⅱ期临床研究,对48例复发胶质母细胞瘤进行了辅助基因治疗.
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siRNA靶向Her-2逆转录病毒载体构建及其在SKOV3中的表达
目的 构建并鉴定Her-2特异性siRNA逆转录病毒载体,将其导入SKOV3卵巢癌细胞中,并初步筛选有效抑制Her-2表达的细胞株.方法 体外合成含针对Her-2特异基因序列的寡核苷酸并定向克隆入逆转录病毒载体RNAi-Ready pSIREN-RetroQ,构建的载体通过测序、酶切鉴定后,脂质体介导下转染到包装病毒细胞株PT67中,嘌呤霉素筛选并挑选细胞克隆,收获病毒上清,将病毒上清转染SKOV3中,经过嘌呤霉素筛选得到稳定抑制Her-2表达的SKOV3细胞株,并分别通过RT-PCR和免疫组化方法鉴定抑制Her-2表达的效果.结果 成功构建了重组逆转录病毒载体,转染包装病毒细胞株获得的病毒上清成功转染了SKOV3, 并且抑制了Her-2的表达.结论 抑制Her-2表达的SKOV3细胞株的建立,为观察转染siRNA的逆转录病毒表达载体的肿瘤细胞恶性生物学行为变化奠定了实验基础.
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HSV-TK/GCV自杀基因系统治疗乳腺癌的研究
目的探讨HSV-TK/GCV自杀基因系统对小鼠乳腺癌细胞系MA782/5S-8102体外及体内杀伤作用及其产生的旁观者效应.方法采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317.取病毒上清液感染小鼠乳腺癌细胞MA782/5S-8102,得到带有HSV-TK基因的MA782/5S-8102/TK细胞,并将其分别用于体外和体内实验.结果载体HSV-TK导入了PA317细胞.体外实验结果显示,当MA782/5S-8102/TK细胞数占混合细胞10%时,低浓度(10μg/ml)的GCV就可将50%左右的肿瘤细胞杀死.体内实验结果显示GCV可明显抑制MA782/5S-8102/TK细胞在BALB/C小鼠体内的肿瘤形成.实验组肿瘤组织与对照组相比存在明显的病理学改变.结论逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入小鼠乳腺癌细胞MA782/5S-8102并获稳定表达,HSV-TK/GCV自杀基因系统在体内外对乳腺癌细胞均有杀伤作用,且存在明显的旁观者效应.
关键词： 单纯疱疹病毒胸苷激酶 旁观者效应 逆转录病毒载体 小鼠乳腺癌 -
小鼠microRNA302a逆转录病毒载体的构建及鉴定
目的:为进一步研究microRNA在细胞重编程机制中的作用,构建microRNA302a(miR-302a)逆转录病毒载体.方法:从小鼠基因组DNA扩增pri-miR302a,克隆至pMx-IRES-GFP逆转录病毒载体上,测序鉴定,转染PLAT-E细胞包装逆转录病毒颗粒,并进行病毒滴度测定.结果:成功构建表达miR-302a的逆转录病毒载体pMx-miR302a-IRES-GFP,阳性克隆测序结果与目标基因序列完全一致.结论:pMx-miRNA302a-IRES-GFP载体构建成功.
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膀胱灌注逆转录病毒载体HSV-TK基因治疗大鼠膀胱癌
目的:研究膀胱内灌注逆转录病毒载体单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(HSVtk)基因治疗膀胱癌的作用.方法:用N-甲基-亚硝基脲(MNU)膀胱灌注诱导建立大鼠原位膀胱肿瘤模型,该肿瘤与人类膀胱肿瘤病理特点非常相似.随后经尿道膀胱灌注逆转录病毒载体HSV-TK基因,腹腔内注射羟基无环鸟苷(ganciclovir,GCV),连续6天.结果:经尿道膀胱灌注逆转录病毒HSV-TK基因后48小时,RT-PCR检测出膀胱肿瘤中HSV-TK基因表达.GCV处理后,肿瘤体积以及膀胱总重量检测表明膀胱肿瘤的生长被显著抑制.肿瘤细胞DNA电泳显示诱导凋亡可能是HSV-TK/GCV系统治疗肿瘤的重要机制. 结论:经尿道膀胱灌注重组逆转录病毒载体可以向肿瘤转导HSV-TK基因.HSV-TK/GCV系统能抑制鼠原位膀胱肿瘤的生长.
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表达人CD4分子的逆转录病毒基因转移体系的建立
目的 构建表达人CD4(hCD4)分子pLXIN-hCD4载体的基因转移体系,使hCD4分子在小鼠T淋巴细胞白血病细胞系L615中长久、稳定地表达.方法 将目的基因hCD4亚克隆到真核细胞表达载体pLXIN上,构建重组质粒pLXIN-hCD4.将该质粒用PloyFect脂质体转染到PT67包装细胞,获得病毒颗粒;用病毒颗粒感染体外培养的小鼠T淋巴细胞白血病细胞系L615.收集筛选后的细胞(L615-hCD4),以抗CD4单抗标记后用流式细胞术(FCM)检测其细胞膜hCD4分子的表达情况.PbFCM法检测L615细胞和L615-hCD4细胞的细胞周期.结果 菌落PCR鉴定及酶切鉴定显示hCD4基因成功地插入pLXIN载体中;hCD4分子可在L615-hCD4细胞膜表面稳定表达,而野生型L615细胞膜 表面无hCD4分子表达.L615-hCD4与野生型L615的细胞周期比较无差异.结论 成功构建了能在真核细胞上表达hCD4分子的重组质粒pLXIN-hCD4.L615-hCD4细胞能长期稳定表达hCD4分子,其细胞周期无改变.
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表达mFasL的新型双顺反子逆转录病毒基因转移体系的建立
为建立表达小鼠Fas配体(mFasL)的内部核糖体进入位点(IRES)串联的双顺反子新型逆转录病毒基因转移体系,用基因重组技术将mFasL cDNA基因构建到IRES双顺反子逆转录病毒载体(PLXIN)中,脂质体法将此重组质粒PLFIN和空载体PLXIN分别转染包装细胞(PA317),经G418筛选出抗性包装细胞克隆,基因组DNA PCR测定基因整合情况.并将抗性PA317克隆培养上清感染小鼠成纤维细胞系(NIH3T3),筛选出高滴度的PA31 7细胞系;用流式细胞术测定筛选的NIH3T3细胞目的基因表达状况;以抗性NIH3T3和Fas+Yac-1细胞共培养法检测目的基因的生物学活性.筛选出12个PLFIN转染的PA317细胞克隆中,高产毒效价为8.5×105CFU(colony-forming-umt);经此上清感染、筛选出的NIH3T3细胞,高表达mFasL(阳性率高于对照组52.54%);且能显著诱导Fas+Yac-1细胞凋亡(凋亡率高于对照组49% 说明成功建立了表达mFasL的双顺反子逆转录病毒基因转移体系.
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逆转录病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因转染标记间充质干细胞
目的:为使间充质干细胞(MSCs) 被绿色荧光蛋白(GFP)稳定标记,探讨通过逆转录病毒载体介导的GFP基因高效转染MSCs的方法,以便为研究在体干细胞分化奠定基础.方法:全骨髓法分离培养纯化大鼠MSCs,利用携带GFP基因的复制缺陷性逆转录病毒(Rt-GFP)转染MSCs,荧光显微镜观察GFP阳性的MSCs.结果:Rt-GFP 转染后,80%～90% MSCs可激发出明亮的绿色荧光,且荧光不随培养时间延长和传代次数增加而衰减.结论:Rt-GFP可以使MSCs获得长效稳定标记.
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逆转录病毒载体介导的RNAi技术稳定抑制前列腺癌细胞株β-catenin的表达
目的:建立稳定抑制β-catenin基因表达的前列腺癌细胞株,为探讨Wnt/β-catenin信号在前列腺癌发生中的作用提供合适的细胞模型.方法:在β-catenin基因编码区选择3个RNAi作用的靶位点,体外合成前体DNA链,复性后连入逆转录病毒载体pSUPER-retro,转染包装细胞PA317,收集含病毒颗粒的培养上清感染DU145细胞,经嘌呤霉素筛选并扩大培养后得到克隆,继续培养2个月形成稳定克隆.免疫印迹检测癌细胞内β-catenin及受其调控的靶基因c-myc和cyclinD1的表达;四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测β-catenin基因表达抑制的细胞和对照组细胞的增殖.结果:免疫印迹和RT-PCR结果显示,筛选得到的2个克隆中细胞内β-catenin表达水平下降;且克隆内c-myc,cyclinD1基因的表达下调;MTT检测显示,β-catenin表达抑制的细胞克隆吸光度值下降,这表明克隆内细胞数量减少,细胞增殖受到了抑制.结论:成功建立稳定抑制β-catenin基因表达的前列腺癌细胞株.
关键词： Wnt/β-catenin RNAi 前列腺癌 逆转录病毒载体 稳定抑制 -
新抑癌基因PIG11高表达HepG2细胞株的建立
目的 构建人PIG11逆转录病毒载体,建立高表达PIG11基因的HepG2细胞,为进一步研究PIG11基因在肝癌细胞中的功能提供一个理想的试验平台.方法 将已有的peDNA3.1/NT-GFP-PIG11质粒用PCR法扩增出PIG11片段,构建含人PIG11 cDNA的重组质粒pLXSN-PIG11.重组载体经PCR鉴定和DNA测序分析.将该重组质粒用lipofeetamineTM2000转染包装细胞PA317,获得pLXSN-PIG11逆转录病毒.用病毒感染HepG2细胞,获得PIG11高表达的HepG2细胞株.结果 获得384 bp人PIG11基因,测序证明PIG11cDNA编码序列与Genbank中报道的一致,转染PA317细胞后用病毒上清感染HepG2细胞,经RT-PCR检测发现HepG2细胞中PIG11 mRNA表达明显升高.结论 成功构建了高表达PIG11基因的HepG2细胞株,为进一步研究其生物学行为奠定了基础.
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逆转录病毒转染后骨髓间充质干细胞中人Dmp-1表达的变化
目的 探讨构建的pLNCX2-Dmp-1逆转录病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)后,外源性基因牙本质基质蛋白-1 (Dmp-1)表达的变化.方法 含人Dmp-1基因的逆转录病毒液pLNCX2-Dmp-1转染原代培养后扩增的第5代BMSCs,用免疫荧光、RT-PCR和Western blotting检测Dmp-1的表达.结果 用逆转录病毒液pLNCX2-Dmp-1转染BMSCs后,免疫荧光检测发现,在大多数细胞内Dmp-1都有明显的表达,而没有用pLNCX2-Dmp-1病毒液处理的BMSCs则无明显表达,RT-PCR和Westem blotting的检测也支持免疫细胞化学的结果.结论 构建含人Dmp-1基因的逆转录病毒载体pLNCX2-Dmp-1转染BMSCs后可上调目的 基因的表达.
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逆转录病毒介导ARLTS1基因表达抑制肝癌细胞HepG2的增殖
目的 构建高表达ARLTS1基因的逆转录病毒栽体(PLEGFP-IRES-ARLTS1),探讨外源性ARLTS1基因对人肝癌细胞HepG2增殖的影响.方法 RT-PCR扩增ARLTS1 cDNA,克隆至重组逆转录病毒载体PLEGFP-IRES.重组质粒转染病毒包装细胞PT67,产生病毒后感染HepG2细胞,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白表达,Western Blot检测细胞内ARLTS1蛋白表达,并对感染后细胞的增殖状况进行分析.结果 酶切及基因测序证实重组质粒PLEGFP-IRES-ARLTS1构建成功;荧光显微镜观察到70%左右靶细胞内有绿色荧光蛋白表达;Westem Blot证实,ARLTS1蛋白在HepG2-ARLTS1内表达显著升高;MTT实验显示,HepG-2-ARLTS1细胞组体外增殖率较各对照组明显降低(P<0.05).结论 获得了稳定表达外源性ARLTS1蛋白的HepG2细胞株,外源性ARLTS1抑制HepG2细胞增殖,为后续研究ARLTS1抗肿瘤机制奠定了基础.
