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4'-甲醚-黄芩素诱导绒毛膜癌JAR细胞凋亡的实验研究
目的 探讨4'-甲醚-黄芩素(4-MS)对人绒毛膜癌JAR细胞的增殖抑制作用及诱导凋亡的相关机制.方法 应用MTT法、激光共聚焦扫描显微镜、流式细胞术和实时定量PCR法,体外观察4-MS对JAR细胞的影响.结果 不同质量浓度(10、20、40 mg/L)的4-MS对JAR细胞均有增殖抑制作用,呈剂量依赖,作用72 h后其增殖抑制率分别为(14.14±0.75)%、(34.34±2.99)%、(61.11±2.99)%(P＜0.01);4-MS作用72 h后细胞内Ca2+浓度分别为81.3±6.7、103.3±5.9、120.7±11.0,与对照组相比差异有显著性(P＜0.05).40 mg/L 4-MS作用12、24、36 h后其早期凋亡率分别为(2.36±0.19)%、(4.22±2.44)%、(7.34±0.56)%,明显高于对照组(P＜0.01).20、40 mg/L 4-MS作用48 h后hTERT mRNA的表达量为0.05±0.01和0.02±0.01,明显低于对照组(P＜0.01).结论 4-MS能抑制人绒毛膜癌JAR细胞的增殖,诱导凋亡,其机制与提高细胞内Ca2+浓度、降低hTERT mRNA的表达有关.
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T淋巴细胞端粒及端粒酶与肿瘤免疫
端粒是真核生物染色体末端特异的核苷酸结构,主要由重复的“TTAGGG”序列组成并随着细胞分裂逐渐缩短.端粒酶能够防止端粒缩短、丢失、重排或者终端与终端的融合.人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)现已被认为是端粒酶活性调控的重要组成部分.研究表明,过表达hTERT基因能够增强T细胞增殖能力,转入hTERT基因的T细胞增殖能力大大增强,这将成为肿瘤过继免疫治疗良好的细胞资源,从而为肿瘤生物治疗提供一种新的治疗方法.本文中,主要讨论T细胞端粒功能和端粒酶活性、端粒酶活性调控、过表达hTERT基因的T细胞增殖特征及转导hTERT基因的T细胞在肿瘤过继免疫治疗中的应用.
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hTERT转录调控区克隆及在人癌细胞的转录特异性分析
目的通过克隆人癌细胞中端粒酶逆转录酶(hTERT)基因上游转录调控区并观察其在不同人癌细胞和正常细胞中的转录活性,探讨人hTERT基因在细胞癌变中的激活机制.方法用PCR方法克隆HeLa和PG癌细胞hTERT基因转录调控区,并进行DNA序列测定;将转录调控区重组于荧光酶报告载体,瞬时转染人癌细胞HeLa、PG、293和正常人二倍体细胞2BS后,测定荧光酶活性以确定调控区转录活性.结果于人HeLa和PG癌细胞分别克隆hTERT基因转录起始点附近636bp(-531～+90)和950bp(-531～+404)的转录调节区,其序列与GenBank人hTERT启动子序列相同.将两转录调控区分别重组于荧光酶报告载体pGL2,得到pGL2-636和pGL2-950,并同时构建了pGL2-X(-531～-272)和pGL2-S(第一内含子区).瞬时转染细胞后发现:pGL2-636和pGL2-950在癌细胞中的转录活性明显增高,而在人二倍体2BS细胞中几无转录活性.重组体pGL2-S和pGL2-X在端粒酶阳性肿瘤细胞中的转录活性明显降低,pGL2-S的转录活性略高于pGL2-X.结论人HeLa和PG癌细胞中hTERT转录调控区无基因突变并高度保存;hTERT调控区具有癌细胞特异性转录调节活性,表明hTERT转录水平的激活与端粒酶阳性及细胞癌变密切相关;hTERT上游-272为其核心调控区,第一内含子仅有弱的转录活性.在端粒酶表达不同的癌细胞中,hTERT调控区的转录活性有差异.
关键词： 人端粒酶逆转录酶(hTERT) 表达调控 荧光酶分析法 -
hTERT-逆转录病毒载体构建及其在脐血间质干细胞中的表达
目的:构建hTERT-逆转录病毒载体,向脐血间质干细胞(UCBMSCs)中导入hTERT基因,观察该基因的表达.方法:PCR法扩增出hTERT全部片断,定向克隆入pLNCX2载体.将病毒质粒导入包装细胞内,筛选阳性产毒细胞,测定病毒滴度.取病毒上清感染脐血MSCs,筛选转基因细胞,检测转染前后hTERT在mRNA水平的表达.结果:用BglⅡ和NotⅠ双酶切构建质粒,证明PLNCX2-hTERT构建成功,转基因细胞的hTERT基因在mRNA水平得到表达.结论:hTERT-逆转录病毒载体构建成功,在逆转录病毒介导下,外源性hTERT基因转入脐血MSCs后得到表达.
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溶瘤腺病毒介导RNA干扰人端粒酶逆转录酶抑制HeLa细胞生长
目的 观察表达人端粒酶逆转录酶siRNA(hTERT-siRNA)的溶瘤腺病毒ZD55-TERT-siRNA对体外培养人宫颈癌HeLa细胞生长及hTERT基因表达的影响.方法 以溶瘤腺病毒ZD55-EGFP、表达hTERT-siRNA的增殖缺陷腺病毒AD-TERT-siRNA和增殖缺陷腺病毒AD-EGFP作为对照组.不同滴度四种病毒分别感染HeLa细胞,结晶紫法检测细胞毒作用,MTV法测定细胞生长抑制率;RT-PCR、Western blot、免疫细胞化学(ICC)法分别检测hTERT的mRNA、蛋白质及抗原表达,Western blot和ICC法分别测定腺病毒E1A蛋白及抗原表达.结果 对HeLa细胞的生长抑制作用和细胞毒作用ZD55-TERT-siRNA>AD-TERT-siRNA和ZD55-EGFP>AD-EGFP;ZD55-TERT-siRNA和ZD55-EG-FP感染的HeLa细胞表达E1A;抑制hTERT表达作用依次为ZD55-TERT-siRNA>AD-TERT-siRNA>ZD55-EGFP、AD-EGFP.结论 溶瘤腺病毒介导RNA干扰hTERT能有效抑制HeLa细胞生长及hTERT基因表达.
关键词： 宫颈癌 溶瘤腺病毒 RNA干扰 人端粒酶逆转录酶(hTERT)
