牛泡沫病毒BFV3026细胞感染性的确立及包装细胞系的建立

分别将牛泡沫病毒BFV3026接种于胎牛肺细胞(FBL)、牛肺细胞系(BL12)、新生牛肾细胞(NBK)、兔肺细胞(RL)、人乳腺癌上皮细胞(MCF)、293T、HeLa、CV-1、CHO等9种细胞,通过对它们及其传代细胞的病变观察与RT-PCR检测,确立BFV3026 对这9种细胞的感染.并以BFV3026原病毒DNA为模板,通过PCR 构建以pcDNA3.1(-)为载体的gag-pol、env真核表达质粒共转染BL12细胞,经G418持续筛选,获得8个NeoR细胞克隆. RT-PCR及包装实验证实:其中7个细胞克隆能有效行使包装辅助功能.

人胰岛素原突变体重组逆转录病毒及稳定包装细胞系的构建和鉴定

目的构建携带人胰岛素原突变体的逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系.方法采用PCR重叠延伸定点突变技术,将普通细胞内Furin蛋白酶的识别和切割位点Arg-X-Lys-Arg-样序列,引入人胰岛素原C肽两端,同时加上信号肽、Kozak序列和酶切位点并克隆至逆转录病毒载体pLXSN中,测序正确后转染包装细胞PA317,经G418筛选后挑选稳定生产病毒的细胞株,用NIH3T3细胞测定病毒滴度.结果测序证明胰岛素原cDNA的5个预定位点成功突变,其上游加上了信号肽和增强表达的Kozak序列;G418筛选重组pL-mPIN-SN转染PA317细胞抗性克隆,其病毒滴度为2.6×105 CFU/ml,而且基因组PCR和病毒液的RT-PCR都显示有286 bp的条带,提示构建携带人胰岛素原突变体的逆转录病毒载体以及稳定的包装细胞系成功.结论成功构建了携带人胰岛素原突变体的逆转录病毒载体及包装细胞系,为进一步胰岛素基因治疗糖尿病的实验研究奠定了基础.

重组人生长激素基因细胞移植

目的通过重组人生长激素基因细胞移植为生长激素缺乏病(GHD) 基因治疗的生物学表达研究奠定基础.方法构建pLXSNhGH人生长激素(hGH)逆转录病毒表达载体后 ,脂质体转染包装细胞系PA317,提取包装细胞上清的病毒后,将病毒感染原代小鼠胚胎成纤维细胞,将细胞移植于小鼠腹腔内,观察hGH的表达情况.结果 hGH体内持续表达达2个月以上,但由于高滴度抗hGH抗体的影响,表达水平呈波动性.结论重组人生长激素基因原代成纤维细胞移植体内的持续表达, 为细胞移植系统引入GHD基因治疗的研究奠定了实验基础.

乙型肝炎病毒拉米夫定耐药株的重组逆转录病毒载体及其包装细胞系的建立

目的 构建1.3拷贝乙型肝炎病毒(HBV)拉米夫定耐药株的重组逆转录病毒载体及其包装细胞系.方法 在野毒株1.3拷贝HBV载体的基础上采用定点突变的方法将rtL180M,rtM204V位点突变,构建拉米夫定耐药病毒株,并通过PCR、限制性内切酶酶切,分别以正向和反向将野毒株和耐药株分别连接于逆转录病毒载体pLNCX2的相应酶切位点,构建成重组逆转录病毒载体,经双酶切及PCR扩增鉴定.重组载体转染包装细胞,筛选培养细胞克隆并进行病毒滴定.结果 通过双酶切、PCR扩增、测序鉴定证实成功构建了1.3拷贝HBV拉米夫定耐药株的逆转录病毒载体.成功建立包装细胞系并测得病毒滴度均为1×105 cuf/ml.结论 含正向及反向1.3拷贝HBV拉米夫定耐药的重组逆转录病毒载体及其包装细胞系构建成功,可以用于拉米夫定耐药细胞模型研究.

影响293细胞体外生长因素初步探讨

细胞培养是细胞免疫学和细胞分子生物学研究的基础.体外培养的细胞需要合适的环境和必要的条件才能生存、繁殖.细胞培养所需营养条件、温湿度、气相和pH、渗透压等已在多本著作中阐明,但不同原代细胞或建株细胞的培养仍有其特殊性.293细胞是基因治疗中常用的缺陷型腺病毒扩增所必需的包装细胞系,我们在泌尿系肿瘤的基因治疗研究中,因需长期培养293细胞,发现其培养条件和生长特点与一般细胞有所不同.本文就293细胞培养的相关影响因素进行探讨.

大鼠前脑啡肽原基因逆转录病毒表达载体及产毒细胞系的建立

目的:构建大鼠前脑啡肽原基因(pENK)逆转录病毒载体,获得携带该基因的高滴度产毒细胞系.方法:应用RT-PCR方法获得大鼠pENK基因,HindⅢ、Cla Ⅰ双酶切后,同相应双酶切的pLNCX2载体大片段连接,构建成pENK基因逆转录病毒载体pLNCX2-pENK.然后用脂质体法将该载体转染PT67细胞,G418筛选,并进行滴度测定.结果与结论:成功地构建了pLNCX2-pENK载体,获得8×108CFU/L的产毒细胞系.成功建立了携带pENK的高滴度逆转录病毒产毒细胞系.

人p58.2重组逆转录病毒载体的构建及稳定包装细胞系的鉴定

基因重组HBV联合表达反义RNA和显性阴性突变体抗HBV作用及HBV包装细胞系的构建

目的探讨HBV作为基因治疗载体的可能性并检验其联合表达反义RNA和显性阴性突变体抗HBV的作用.方法在表达完整HBV颗粒的质粒上,经基因修饰后联合表达S区反义RNA和核心-p蛋白的融合蛋白,整合于具有HBV复制的2.2.15细胞,形成细胞克隆,ELISA法检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg,斑点杂交法检测细胞内HBV核壳中HBV DNA,PCR检测上清液中重组HBV颗粒.HBV全基因经删除包装信号ε区后,插入到G418抗性pCI-neo载体,转染HepG2细胞系,用G418筛选形成细胞克隆,检测表达HBsAg及HBcAg较多者作为HBV包装细胞系,进一步转染表达复制缺损型HBV的质粒,经两种抗生素同时筛选,PCR方法观察上清液中的病毒.结果2.2.15-pMEP4组、2.2.15-CP组、2.2.15-SAS组和2.2.15-CPAS组,对HBsAg平均抑制率分别为2.74%±3.83%、40.08%±2.05%(t=35.5,P＜0.01)、66.54%±4.45%(t=42.3,P＜0.01)和73.68%±5.07%(t=51.9,P＜0.01);对HBeAg平均抑制率分别为4.46%±4.25%、52.86%±1.32%(t=36.2,P＜0.01)、26.36%±1.69%(t=22.3,P＜0.01)和59.28%±2.10%(t=39.0,P＜0.01);对HBV复制的抑制率分别为0、82.0%、59.9%和96.6%.在各治疗组培养上清液中均能检测出重组HBV颗粒.证明包装细胞系具有HBsAg和HBcAg表达,pMEP-CPAS质粒转染G418抗性包装细胞系,在细胞培养上清液中检出重组HBV,未检出野生型HBV.结论在同一载体上联合表达S区反义RNA及核心蛋白与部分P蛋白的融合蛋白,具有较单一机制更强的抗HBV作用;经修饰后的HBV基因组在野生型HBV辅助下,仍能包装并分泌完整的HBV样颗粒.包装细胞系能为复制缺损型HBV提供包装,但效率较低.

抗肝癌sFv-TNF-α基因逆转录病毒包装细胞系的建立

目的:将分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因(sFv-TNF-α)克隆至逆转录病毒载体pLXSN,包装并筛选具有高滴度感染性重组病毒产生细胞系.方法:用平-粘末端连接方法将sFv-TNF-α克隆至pLXSN, 磷酸钙共沉淀法转染PA317包装细胞并测定病毒滴度, 用PCR及免疫组化方法分析鉴定重组逆转录病毒细胞系.结果:成功构建了表达载体pLXSN-sFv-TNF-α,筛选出一株 cfu＞1×109*L-1的感染性重组病毒产生细胞系C22.结论:外源基因整合到转染细胞DNA中并表达,证实了重组病毒的活性及其转导靶细胞的可行性.