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养殖牙鲆淋巴囊肿病病原的研究
近几年我国海水养殖鱼类发生病毒性传染病,病鱼鳍、鳃及体表皮肤出现乳头瘤样赘生物.将发病牙鲆(Paralichthys olivaceus)表皮瘤组织进行超薄切片,电镜下在病变组织明显肥大的细胞胞浆内发现大量球状病毒,呈二十面体对称,具包膜,直径约210nm.根据虹彩病毒主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因中间保守区序列设计简并引物,应用PCR方法从病变组织中扩增出长636bp的片段.经DNA序列测定及同源性分析表明,该段核苷酸序列与欧洲分离的淋巴囊肿病病毒1型(lymphocystic disease virus type 1,LCDV-1)MCP基因相应序列有77%的同源性,表明该病毒属虹彩病毒科(Iridoviridae)淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus),但与欧洲分离株有一定差异.将该病毒暂命名为淋巴囊肿病病毒中国分离株(lymphocystis disease virus-Chinese isolate,LCDV-cn).
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1例中间型β-地中海贫血的临床诊断和基因检测
目的：通过回顾性分析1例中间型β-地中海贫血（地贫）的诊断及基因检测流程，总结中间型地贫的诊断策略。方法分析1例β-地贫合并α-地贫基因型患儿的临床表现，通过地贫基因多重PCR检测及DNA序列测定明确诊断，结合相关文献复习，探讨影响β-地贫表现型的基因因素。结果该地贫患儿基因型为β珠蛋白基因41/42突变的杂合子合并αααanti3．7基因杂合子。结论中间型地贫的诊断，需要临床表现与基因病变相一致，多重PCR结合DNA序列测定等方法可确诊罕见型基因突变。
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中国家族性和早发性乳腺癌BRCA1基因突变的研究
目的研究中国家族性和早发性乳腺癌患者的BRCA1基因突变情况.方法选取41例家族性和早发性乳腺癌患者的外周血单个核细胞DNA,应用PCR-SSCP和DNA序列测定方法,对BRCA1基因全序列进行突变检测和分析.结果 41例乳腺癌患者中,3例发生BRCA1疾病相关性突变,其中年龄＜35岁的患者2例,具有乳腺癌家族史的患者1例.结论中国早发性乳腺癌患者的BRCA1突变发生率与西方国家相近,而家族性乳腺癌患者的突变发生率明显低于西方国家.
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分子生物学技术鉴定药材
目的:介绍分子生物学技术鉴定中药材的研究进展,供药学工作者参考.方法:从DNA提取,DNA的RAPD分析及DNA序列测定三个方面进行综述,讨论了这些方法的优缺点.结果与结论:认为分子生物学技术解决了动物药材鉴定的难题,将是今后中药材真伪鉴定技术发展的新方向.
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人类基因组计划
1 人类基因组计划产生的背景1986年3月7日美国科学家杜尔贝科(Dulbecco)在美国<科学>(Science)杂志上发表一篇题为"癌症研究的转折点--测定人类基因组序列".他提出"癌症研究重要的成果是使我们认识到,癌症与其他疾病的发生都与基因有关"的观点.所以人们要征服癌症,要治疗疑难病就要在人体内定位基因,分离基因,研究基因的功能.这样才能预防、诊断、治疗这些疾病.
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新疆地区维吾尔族乳腺癌中BRCA1基因突变及P53蛋白的表达
目的:了解新疆地区维吾尔族乳腺癌患者BRCA1基因突变及P53蛋白的表达情况.方法:选择2000-01/2004-06石河子大学医学院第一附属医院、喀什地区第一人民医院病理科收集的70例维吾尔族乳腺癌根治标本.其中维吾尔族早发性乳腺癌(≤35岁,即定为早发性乳腺癌)22例.51例患者淋巴结转移.2例为双侧乳腺癌.另选32例维吾尔族乳腺癌旁非癌组织及乳腺良性病变(纤维腺病及纤维腺瘤)作对照;上述标本为甲醛溶液固定石蜡包埋组织及少量新鲜冰冻组织.运用聚合酶链反应-单链构象多态性分析和DNA序列测定的方法检测BRCA1基因突变及用Evision二步法检测P53蛋白的表达.结果:①70例维吾尔族乳腺癌中发现9例BRCA1突变的12个新位点.②70例维吾尔族乳腺癌中BRAC1的突变率为12.86%(9/70);其中22例维吾尔族早发性乳腺癌(≤35岁)BRCA1突变率为31.82%(7/22),高于维吾尔族晚发性乳腺癌(2/48),差异有显著性(χ2=10.295,P＜0.01).③2例双侧乳腺癌中均检测出BRCA1基因的突变.④70例维吾尔族乳腺癌中发现9例BRCA1基因核苷酸多态性位点.⑤BRCA1基因突变相关性乳腺癌中P53蛋白阳性表达率高于对照组,其淋巴结转移率高于对照组,其发病年龄小于对照组.结论:BRCA1基因突变与新疆维吾尔族早发性乳腺癌及双侧乳腺癌的发生密切相关,且BRCA1突变相关性乳腺癌具有P53阳性率高、发病年龄趋于年轻化、淋巴结转移率高的趋势,这些特点有可能为基因检测前的筛选提供参考依据.
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PCR反应体系中Mg2+浓度对从石蜡包埋组织中提取DNA进行PCR反应的影响
目的探讨PCR反应体系中Mg2+浓度对从石蜡包埋组织中提取DNA进行PCR反应的影响.方法从石蜡包埋组织中提取DNA,PCR反应扩增甲状腺髓样癌RET基因第13外显子,分析PCR反应体系中Mg2+浓度分别为1.5 mmol/L、2.0 mmol/L、2.5 mmol/L、3.0 mmol/L、4.0 mmol/L时PCR反应产物中目的基因含量及对PCR产物基因序列测定的影响.结果5种条件扩增的目的基因经纯化后DNA含量分别为4.8ng/μl(1.5 mmol/L)、26.6 ng/μl(2.0 mmol/L)、40.2 ng/μl(2.5 mmol/L)、38.5 ng/μl(3.0 mmol/L)、44.5 ng/μl(4.0 mmol/L);Mg2+浓度为4.0 mmol/L时PCR产物电泳图见到多条非特异性条带;Mg2+浓度为2.5mmol/L时PCR产物直接测序反应曲线峰图背景噪音(噪峰)减小,信噪比(信号/噪音)增高.结论从石蜡包埋组织中提取DNA行PCR反应,Mg2+浓度为2.5 mmol/L时反应特异性强,PCR产物质量高.较高的Mg2+浓度可以增加PCR反应产量,但降低反应的特异性.
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DNA测序与线性反向探针杂交法检测HBV P基因耐药突变的比较
目的 建立和优化扩增慢性乙型肝炎患者血清HBV P基因的PCR方法,比较DNA测序法与线性反向探针杂交法检测HBV基因突变情况,并对耐药相关基因突变及其意义进行分析.方法 采用巢式PCR法扩增93例慢性乙型肝炎患者血清HBV P基因反转录酶区,对PCR产物进行DNA测序,采用Bioedit6.0.5、SeqmanTM Ⅱ、EditSeq TM和Me-sAlign软件分析结果;同时随机抽取40份血清进行线性反向探针杂交,比较两者的检测结果,并对11个已知耐药相关突变位点进行分析.结果 在93份标本中DNA序列测定法检测到碱基突变113个,其中与LAM相关突变50份(53.78%),与ADV相关突变6份(6.46%),与LdT相关突变3份(3.23%),与ETV相关突变3份(3.23%);在40份血清中与线性反向探针杂交检测结果一致的突变为87.5%(35/40),氨基酸位点一致为98.0%(431/440).此外,还检测到V84I、$85C、A181S、1229W、N238T等与耐药相关的突变位点.结论 应用线性反向探针杂交检测虽然比较快捷,但其价格昂贵且只能检测已知常见的变异位点;建立在巢式PCR基础上的DNA序列测定法敏感性与线性反向探针杂交法相当,两者检测结果有较高的符合率,但似可检出更多的耐药相关突变.
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新疆多民族地区三阴性乳腺癌BRCA1基因突变分析
目的：研究新疆多民族地区三阴性乳腺癌( TNBC ) BRCA1基因的突变情况及突变者与未突变者临床、病理组织特征的差异。方法以新疆多民族地区130例TNBC患者为研究对象,从静脉血提取基因组DNA,采用PCR联合直接测序法检测BRCA1基因突变情况。结果130例TNBC患者BRCA1突变率为17．7%(23/130),其中汉族与少数民族 TNBC 患者 BRCA1突变率分别为20．5%(17/83)、12．8%(6/47),差异无统计学意义(χ2=1．856,P=0．869)。130例TNBC患者中发现23例BRCA1突变的19个位点,其中8个为新发现的位点；4个BRCA1基因突变“热点”；此外还发现了9例(6．9%,9/130)致病性突变,5例无义突变,4例移码突变。早发性 TNBC 组 BRCA1突变率28．3%(13/46)高于晚发性TNBC组11．9%(10/84),差异有统计学意义(χ2=5．460,P<0．05)。 BRCA1基因突变组与BRCA1基因未突变组相比,发病年龄早,腋窝淋巴结转移率高, TNM分期晚,差异均有统计学意义( P<0．05)。结论新疆多民族地区TNBC患者BRCA1基因突变率高；突变者与未突变者相比,存在临床病理组织差异。
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妊娠期肝内胆汁淤积症与ABCB4基因外显子8突变的相关性研究
目的:研究ABCB4基因外显子8突变的情况,以探讨其与妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)发病的关系.方法:对15例中国皖南地区妊娠期肝内胆汁淤积症患者抽外周血提取基因组DNA,采用聚合酶链式反应(PCR)结合DNA序列测定的方法对ABCB4基因外显子8的突变情况进行筛查,并确定其具体的突变性质.结果:15例标本均扩增出ABCB4基因外显子8的目的片段.对DNA序列测定结果进行分析,发现其中有5例(33.33%)存在c.711A>T杂合性突变.结论:ABCB4基因外显子8的突变可能与中国人群ICP的发病存在一定的相关性.
关键词： 妊娠期肝内胆汁淤积症 abcb4基因 聚合酶链反应 DNA序列测定 -
旋毛虫成囊前期幼虫编码31 kDa抗原基因的分子克隆及序列分析
目的克隆旋毛虫河南株成囊前期幼虫编码31kDa抗原基因(TspE1)片段,并测定其基因序列,以了解该基因序列与已报道虫株的差异.方法根据TspE1基因已知序列设计合成一对引物,采用RT-PCR技术获取旋毛虫成囊前期幼虫目的基因,PCR产物经纯化后用BamHⅠ、HindⅢ进行双酶切,定向克隆入pC18质粒,转化大肠杆菌JM109;重组质粒用BamHⅠ+HindⅢ酶切及PCR扩增鉴定.用Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定,应用DNASIS软件进行同源性比较及预测抗原表位.结果 RT-PCR扩增获得成囊前期幼虫TspE1基因(约870bp),EcoRⅠ酶切鉴定正确;筛选出7个阳性克隆,对目的基因的测序结果显示有5种类型,但都与GenBank中的TspE1基因序列及由其推测的氨基酸序列有较高同源性,尤其是Ts-HN3核苷酸及氨基酸序列同源性分别达99.6%和98.9%;TspE1基因中可能存在7个抗原表位.结论应用RT-PCR技术扩增出旋毛虫河南株成囊前期幼虫编码31kDa抗原结构基因,证实TspE1基因在成囊前期幼虫已有表达;结果还提示在旋毛虫河南株之间可能存在有遗传多态性.
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Leber遗传性视神经病变家系线粒体DNA突变检测
目的:探讨Leber遗传性视神经病变(LHON)患者的线粒体DNA(mtDNA)突变.方法:运用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)和DNA序列测定方法,设计4对引物,扩增出含11 778、14 484、3 460三个已知原发突变位点和3 394、4 136、4 160、4 216、11 696、14 459、14 482、14 498八个已知继发突变位点的4对mtDNA片段,对3个LHON家系30位母系成员的血样进行检测.32份无视力障碍的正常人血样作对照.参照mtDNA序列为剑桥标准mtDNA序列.结果:30位母系成员均含11 778位点突变,其中1人合并4 164位点突变(A→G).与剑桥标准mtDNA序列对比,30位LHON母系成员和32位正常对照均含有11 719位点突变.结论:11 778是LHON患者常见的突变位点,4 164位点突变可能是新的继发突变或正常人单核苷酸位点多态性.11 719位点突变可能是中国人存在的单核苷酸位点多态性.
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旋毛虫河南株TspE1基因克隆及多态性分析
目的:构建旋毛虫河南株成囊前期幼虫编码相对分子质量为31 000的蛋白抗原结构基因(TspE1)的重组质粒(pUC18-TspE1),测定TspE1基因序列,分析旋毛虫河南株的基因多态性.方法:根据TspE1基因已知序列设计合成一对引物,采用RT-PCR 技术获取旋毛虫成囊前期幼虫目的基因,PCR产物经纯化后用BamHI、HindⅢ进行双酶切,定向克隆入pUC18质粒,转化大肠杆菌JM109;重组质粒用BamHI+ HindⅢ酶切及PCR扩增鉴定.用Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定,应用DNASIS软件进行同源性比较.结果:RT-PCR 扩增获得成囊前期幼虫TspE1基因 (871 bp), EcoR I 酶切鉴定正确;筛选出7个阳性克隆,对目的基因的测序结果显示旋毛虫河南株TspE1基因有5种类型,但都与GenBank中的TspE1基因序列及由其推测的氨基酸序列不完全相同.结论:应用RT-PCR 技术扩增出旋毛虫河南株成囊前期幼虫编码相对分子质量为31 000的抗原结构基因,证实TspE1 基因在成囊前期幼虫已有表达,结果还提示旋毛虫河南株可能存在有基因多态性.
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HIV-1抗体阳性血浆中HIV-1病毒基因分型研究
为了解HIV抗体阳性血浆中的HIV-1病毒基因亚型的情况,应用逆转录PCR和DNA序列测定技术,对6份获自高危人群的抗HIV-1阳性血浆进行序列分析和基因亚型分型的研究,结果表明均属HIV-1B亚型.V3环氨基酸序列分析指出这些HIV-1B亚型病毒株与泰国HIV-1B亚型病毒株核苷酸和氨基酸序列相似;同时发现HIV-1 cDNA和氨基酸序列均相同,推测这6份标本可能来自同时感染同一株HIV病毒的感染者.本研究对了解高危人群中HIV-1流行的遗传变异和HIV-1亚型病毒株的分子流行病分析具有一定的意义.
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HGV广东株和香港株NS5区部分基因的克隆及序列分析
采用HGV NS5特异的2对引物,对两个香港株和一个广东株HGV-RNA进行逆转录套式PCR扩增,PCR产物克隆入pUC19,重组质粒转化DH5α和JM109菌株.PCR和酶切法鉴定阳性克隆,双脱氧链末端终止法测定核苷酸序列并进行同源性分析.结果发现核苷酸变异呈散在分布,三株间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为93.3%～94%及97%～99.2%,与已报道的中国株(CN)相比,则同源性分别为90%～91.2%和94%～96.3%,与美国株(PNF2161及R10291)相比,为87.1%～89.5%和95.2%～97%,而与西非株(GBV-C)相比,则达91.4%～93.8%和97%～97.9%.提示HGV NS5区核苷酸和氨基酸序列相对保守,不同HGV株存在一定的地区差异.
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第二代测序技术在先天性巨结肠症家系致病基因筛查中的应用
目的 筛查2个先天性巨结肠症(Hirschsprung's disease,HSCR)家系的致病基因突变.方法 对2个来自辽宁的HSCR家系(家系1和家系2)进行基因分析.在获得家系成员的同意后,采集外周静脉血,提取全基因组DNA.应用第二代测序技术(next-generation sequencing technology,NGS)对各个家系成员的全外显子组DNA进行基因突变筛选和拷贝数变异(copy number variation,CNV)分析,结合突变的危害性和致病性分析家系成员的临床表型,依据测序结果筛选可疑致病基因,运用Sanger测序法进行验证.结果 家系1中4人,子代2人均发病,母亲有类似临床症状,但未做检查诊断,父亲正常.在过滤掉常见变异及同义突变后,全外显子测序检测出633个SNP和35个InDel突变.在候选基因RET中,发现14号外显子一个新的无义突变c.2599G＞T,经突变的蛋白危害性和致病性分析并结合遗传方式及临床特征等多因素分析后高度怀疑该突变是该家系的致病突变,经Sanger法验证后认为该突变为该家系的致病突变.家系2中4人,子代2人发病,但其中1人新生儿期死亡未能得到外周血样标本,父母正常,测序结果提示609个SNP和30个InDel突变,结合突变影响、遗传方式及临床特征等多因素综合分析未能发现意义明确的致病突变.结论 第二代测序技术可以筛选出新的与先天性巨结肠相关的基因突变信息,为HSCR的病因研究提供一种新的途径和方法.
关键词： Hirschsprung病 DNA序列测定 病因学 -
95株耐多药结核分枝杆菌katG基因序列分析
目的 分析广州地区耐多药结核分枝杆菌katG基因突变的分子特征.方法 应用PCR-测序法对来自广州地区100株耐多药结核分枝杆菌株katG基因的261~330位密码子长度约210 bp目的片段进行序列测定,并与结核分枝杆菌标准株H37Rv菌株katG基因序列(GenBank:X68081.1,1-4810)进行对比,并应用DNASTAR软件推测氨基酸突变情况.在PCR和基因序列测定中,引物设计相同,上、下游引物分别为5'-GAAACAGCGGCGCTGATCGT-3和5'-GTTGTCCCATTTCGTCGGGG-3'.结果 100株耐多药结核分枝杆菌菌株中,95株成功扩增出katG基因,95株中有70株呈现katG基因突变(73.68%);基因突变类型均为点突变,突变均发生于315位点,未见插入或缺失型基因突变;氨基酸突变包括3种类型,其中:66株发生AGC(Ser)→ACC(Thr)突变即S315T(94.28%),2株发生AGC(Ser)→ATC(Ile)突变即S315I(2.86%),2株发生AGC(Ser)→AAC(Asn)突变即S315N(2.86%).结论在所测菌株范围内,广州地区耐多药结核分枝杆菌katG基因突变率和突变类型具有其特点.
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庚型肝炎病毒C26抗原基因的cDNA序列研究
目的:确定我国庚型肝炎病毒(河北株)C26抗原基因的cDNA序列.方法:采用RT-PCR方法从人血清中扩增出庚型肝炎病毒C26抗原的cDNA产物,使之与T-载体连接构建成克隆重组质粒.用PCR和限制性内切酶切割方法鉴定出阳性重组质粒,然后扩增并抽提质粒进行DNA序列测定.结果:获得的庚型肝炎病毒C26抗原基因的cDNA核苷酸序列与国外已报道的庚型肝炎病毒44402、庚型肝炎病毒45966、庚型肝炎病毒36380的相应区域进行比较,核苷酸同源性在84%以上,氨基酸同源性在90%以上.结论:庚型肝炎病毒中国河北株的C26 cDNA序列在遗传上是比较保守的.
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维吾尔族及汉族乳腺癌BRCA1基因突变检测及分析
[目的]研究新疆地区维吾尔族及汉族乳腺癌患者BRCA1基因(乳腺癌易感基因1)突变情况及突变位置.[方法]选取维吾尔族及汉族乳腺癌根治标本110例,对照组为32例维吾尔族及汉族乳腺良性病变(纤维腺病及纤维腺瘤)及乳腺癌旁非癌组织;运用PCR-SSCP和DNA序列测定的方法检测BRCA1基因的突变.[结果](1)10例维吾尔族及汉族散发性乳腺癌中BRCA1的突变率为10%;其中70例维吾尔族散发性乳腺癌BRCA1的突变率为12.86%;新疆早发性乳腺癌(≤35岁)中BRCA1基因的突变率高于新疆晚发性乳腺癌,差异有统计学意义(x2=9.429,P＜0.01).维吾尔族早发性乳腺癌BRCA1突变率高于维吾尔族晚发性乳腺癌,差异有统计学意义(x2=10.295,P＜0.01).(2)2例双侧乳腺癌中均检测出BRCA1基因的突变.(3)对照组32例维吾尔族及汉族乳腺癌旁非癌组织及乳腺良性病变中仅发现1例BRCA1基因核苷酸的多态性,110例新疆散发性乳腺癌中发现11例BRCA1基因核苷酸的多态性.[结论]BRCA1突变可能与新疆早发性乳腺癌尤其是维吾尔族早发性乳腺癌及双侧乳腺癌的发生密切相关.
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中国人中发现一例Charcot-Marie-Tooth病连接蛋白32基因新突变
目的了解中国人进行性腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease, CMT)连接蛋白32(connexin 32,Cx32)基因外显子2的突变情况.方法对6例无亲缘关系的、无重复的CMT1患者和10例无亲缘关系的CMT2患者进行SSCP分析,对有异常者进行测序,根据突变点序列设计合适的内切酶,对50名正常对照进行酶切分析.结果在1例CMT1患者发生了Gly21Asp(62G→A)错义突变.用限制性内切酶H-aeⅡ酶切50名正常对照未见异常,表明该突变为致病性突变.结论 Gly21Asp是未报道过的新型突变,中国人CMT1患者中CMTX患者可能占一定比例.
