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倒千里光碱对小鼠体外培养胚胎的发育毒性研究
目的 探讨倒千里光碱的胚胎发育毒性.方法 采用小鼠全胚胎培养模型,将8.5d小鼠胚胎在含有倒千里光碱的即刻离心血清中培养48 h(倒千里光碱的终浓度分别为12.5,25,50,100 mg·L-1),观察倒千里光碱对胚胎生长发育(卵黄囊直径、颅臀长、头长、体节数)和组织器官形态分化(卵黄囊循环、尿囊、翻转、心、脑、尾神经管、视听嗅系统、腮弓、颌突、肢芽)的影响.结果 倒千里光碱对胚胎的生长发育和形态分化均具有明显的毒性影响.随倒千里光碱浓度的增加,胚胎的生长发育和组织器官形态分化指标影响越来越严重,其中听嗅系统、腮弓、上下颌突、前后肢芽的影响为明显.结论 倒千里光碱对体外培养的小鼠胚胎有明显的毒性作用,提示妊娠期暴露于该化合物对胎儿具有潜在的毒性.
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L02细胞在倒千里光碱处理大鼠肝中的增殖
目的:应用倒千里光碱(retrorsine,Rts),研究正常人L02肝细胞移植到具有正常免疫活性的大鼠肝内的存活与增殖情况.方法:SD大鼠出生前宫内ip人L02肝细胞,诱导胎鼠对人L02肝细胞产生免疫耐受,出生3 wk后分别ip Rts或生理盐水,再经脾移植DiI(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)染色后的人L02肝细胞,建立人鼠嵌合肝动物模型.采用免疫荧光、逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RTPCR)、免疫组化、DiI荧光示踪等方法,在不同时相分别检测人白蛋白、人白蛋白mRNA、特异性人增殖细胞核抗原(PCNA)以及在荧光显微镜下观察人L02肝细胞在鼠肝内的分布,并采用计算机图像分析系统分析不同时相PCNA阳性细胞的数密度和面积密度.结果:实验组于移植后1 wk-6 mo,在荧光显微镜下观察到人L02肝细胞在鼠肝内的动态分布,而对照组为移植后1-10 wk;实验组移植后2 wk-6 mo,大鼠检测出人白蛋白、人白蛋白mRNA及特异性人增殖细胞核抗原PCNA,而对照组分别于移植后2-8 wk检测出白蛋白及人白蛋白mRNA,移植后2 wk-6 mo检测出特异性人PCNA.以上各组阳性细胞的出现均以移植4 wk多.PCNA阳性细胞的数密度和面积密度均显示,特异性人PCNA组与其对照组比较有统计学差异(P＜0.05).结论:Rts对移植L02细胞有明显的增殖作用,L02细胞在人鼠嵌合肝动物模型中存活并增殖6mo以上.
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倒千里光碱对肝大部分切除小鼠肝脏损伤后再生修复的影响
背景:目前大多数应用倒千里光碱造成肝损伤模型都是以大鼠为实验对象,有研究报道倒千里光碱并不能抑制小鼠肝细胞增殖,也有报道倒千里光碱对小鼠的肝细胞具有增殖抑制作用.目的:观察单纯肝脏大部分切除及其联合应用倒千里光碱致小白鼠对肝损伤后再生修复的影响.方法:40只C57BL/6J小鼠随机数字表法分为2组,每组20只.倒千里光碱/肝脏部分切除组:腹腔注射倒千里光碱溶液70 mg/kg,注射2次,每次间隔2周,4周后肝脏2/3切除.肝脏部分切除组:腹腔注射生理盐水70 mg/kg,注射2次,每次间隔2周,4周后行肝脏2/3切除.观察术后14 d肝脏大体结构恢复情况;苏木精-伊红染色观察术后第3,7天肝细胞损伤情况;BrdU染色观察术后第3天成熟肝细胞增殖情况;CK19和C-kit免疫组织化学方法观察术后第3,7,14天肝脏卵圆细胞增生情况.结果与结论:肝脏部分切除组14 d肝大体结构基本恢复正常,而倒千里光碱/肝脏部分切除组肝脏大小没有明显的恢复.苏木精-伊红染色可见倒千里光碱/肝脏部分切除组明显的肝细胞变性改变;BrdU染色肝脏部分切除组术后第3天有明显肝细胞增殖,而倒千里光碱/肝脏部分切除组肝细胞增殖很少.CK19和C-kit免疫组织化学结果显示倒千里光碱/肝脏部分切除组术后第3天开始肝脏主要通过肝卵圆细胞增生并逐渐向肝细胞和小胆管分化,从汇管区开始向肝小叶内延伸以修复损伤.提示倒千里光碱可抑制小鼠肝脏损伤后肝细胞增殖再生.建立倒千里光碱/肝脏部分切除小鼠模型可诱导肝脏卵圆干细胞增生.
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Retrorsine对小鼠肝损伤后肝细胞增殖的影响
目的:比较倒千里光碱(retrorsine)对小鼠与大鼠肝损伤后肝细胞增殖的影响,探讨应用retrorsine建立小鼠肝细胞移植模型的可行性.方法:雄性小鼠和大鼠均各自分为retrorsine处理组和生理盐水注射组(未处理组),每组30只.Retrorsine处理组动物分别接受2次(间隔2周)retrorsine注射(小鼠剂量为70 mg/kg,大鼠剂量为30 mg/kg);未处理组用生理盐水代替retrorsine.末次注射4周后,所有的动物均予CCl4注射(0.5 mg/kg),分别在CCl4注射前即刻(记为0时)、注射后第1、2、3、4、6和15天取动物肝组织样本.H-E染色检查动物肝组织病理学变化,Ki-67染色检测动物肝细胞增殖情况.结果:H-E染色发现retrorsine处理组大鼠肝组织出现明显的巨细胞增多、小胆管增生和小肝细胞增生并形成结节,而未处理组大鼠未出现这些表现,两组间有显著差异;然而,retrorsine处理组及未处理组小鼠肝组织均表现为肝细胞变性、肝小叶中央静脉周围区坏死,未出现巨细胞增生,两组表现类似.Retrorsine处理组大鼠Ki-67染色阳性肝细胞主要出现在小肝细胞结节中,CCl4注射后第3天Ki-67染色阳性肝细胞数明显少于未处理组(P<0.05);而retrorsine处理组小鼠Ki-67阳性细胞计数几乎在各时间点均高于未处理组,尤其在CCl4注射后第4天(P<0.001),两组变化趋势一致.结论:应用retrorsine可明显抑制大鼠肝损伤后肝细胞增殖,适用于建立大鼠肝细胞移植模型;retrorsine对小鼠肝损伤后肝细胞增殖无明显抑制作用,不适用于建立小鼠肝细胞移植模型.
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移植肝细胞在倒千里光碱处理大鼠肝脏中增殖状态的研究
目的 探讨移植肝细胞在倒千里光碱(RS)处理的大鼠肝脏中的增殖情况.方法 将5-溴脱氧尿苷(BrdU)标记的肝细胞通过门静脉途径移植至RS或肝切除处理的大鼠肝脏中,通过免疫组织化学方法检测移植肝细胞数量及流式细胞仪检测S期细胞比率,从而了解供肝细胞在受体内的增殖.结果 在接受RS和肝切除处理的大鼠肝脏中,移植的肝细胞数术后3、7、14、28 d分别是41±4、67±4、154±10、248±23/1000个细胞,S期细胞比率分别是(4.37±0.21)%、(5.33±0.32)%、(9.55±0.72)%、(17.65±1.76)%,呈上升趋势.结论 RS能够为移植肝细胞在受体内的增殖制造足够的增殖空间,在肝损伤造成的肝再生环境中,移植肝细胞的增殖更加显著.
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倒千里光碱处理SD大鼠永生化肝细胞同种脾内移植增殖实验研究
目的探讨倒千里光碱(Retrorsine,Rts)处理对SD大鼠永生化肝细胞同种脾内移植增殖效率的影响.方法SV40T抗原转染法制备永生化肝细胞.成熟SD大鼠24只,随机分为A、B、C 3组,A组为Rts处理SD大鼠永生化肝细胞移植组;B组为Rts处理SD大鼠正常肝细胞移植组;C组为正常SD大鼠永生化肝细胞移植组.A、B两组SD大鼠分2次腹腔注射Rts,间隔2周,第2次注射Rts4周后备用.20%肝叶切除后,3组SD大鼠分别行永生化肝细胞移植或肝细胞移植,常规病理切片检查脾内移植永生化肝细胞增殖效率,免疫组化检测脾脏内移植永生化肝细胞白蛋白表达,透射电镜检测移植永生化肝细胞形态.结果病理检查显示,肝细胞移植后3周内,3组SD大鼠脾脏内均可见移植肝细胞:免疫组化结果显示,3组SD大鼠脾脏实质内均可见散在棕黄色白蛋白颗粒,A组大鼠脾脏内肝细胞面数密度与B组比较无显著差异,但与C组有显著差异;透射电镜检测结果显示,脾内移植永生化肝细胞具有正常肝细胞的超微结构.结论脾内移植永生化肝细胞具有正常肝细胞的形态、结构及白蛋白表达功能;Rts可促进永生化肝细胞SD大鼠脾脏内移植的增殖效率.
