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IFN-γ对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体诱导正常人骨髓单个核细胞凋亡的影响
目的：以正常人骨髓单个核细胞（BMMNC）为细胞模型，探讨 IFN-γ对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）诱导BMMNC凋亡的影响，并探讨其作用机制。方法流式细胞仪检测对照组、TRAIL组、IFN-γ组、IFN-γ＋TRAIL组细胞的凋亡率及IFN-γ作用0、6、12和24 h后，细胞表面膜结合型TRAIL及其受体DR5蛋白的表达。结果对照组、TRAIL组、IFN-γ组、IFN-γ＋TRAIL组，流式细胞仪检测BMMNC的凋亡率分别为（23.50±2.170）%，（23.85±1.44）%，（29.97±1.16）%，（38.00±2.21）%，差异有统计学意义（ P＜0.05）；IFN-γ作用0、6、12和24 h后，流式细胞仪检测BMMNC表面TRAIL的平均荧光强度分别是20.29±1.07、24.91±0.40、28.55±0.81、33.26±2.00，及其受体DR5的平均荧光强度分别是14.51±0.82、17.59±1.31、24.61±0.88、32.49±2.61，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 IFN-γ和TRAIL联合作用能显著提高BMMNC的凋亡率，其机制可能与IFN-γ能上调TRAIL及其受体DR5蛋白的表达有关。
关键词： TNF相关凋亡诱导配体 干扰素Ⅱ型 细胞凋亡 DR5 骨髓单个核细胞 -
重组新城疫病毒rClone30-hDR5联合TRAIL对人肝癌细胞的协同作用及其机制探讨
为研究重组新城疫病毒rClone30-hDR5联合TRAIL蛋白对人肝癌细胞株HepG2的杀伤作用及其机制,首先将pee12.4-hDR5转染HepG2细胞,利用流式细胞仪筛选,建立了细胞表面稳定高效表达DR5的HepG2细胞系.利用MTT法检测TRAIL对该细胞和对照HepG2细胞的抑制率,表明TRAIL对该细胞的抑制率显著高于对照HepG2细胞(P＜0.01),证明了克隆的hDR5具有生物学活性;与rClone30-hDR5组和TRAIL组相比,rClone30-hDR5联合TRAIL在体外能更好地抑制HepG2细胞的生长.Annexin V-FITC/PI染色和Quantitative Real-time PCR结果表明,与其他组相比,rClone30-hDR5联合TRAIL显著提高caspase 3和caspase 8的mRNA 表达水平并协同诱导细胞凋亡.以1 MOI感染HepG2细胞,流式细胞仪检测证明,与rClone30相比,rClone30-hDR5能显著诱导hDR5的表达上调,从而增加肿瘤细胞对TRAIL的敏感性.综上所述,rClone30-hDR5联合TRAIL在肿瘤治疗方面存在潜在的应用价值.
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TRAIL联合顺铂体外杀伤前列腺癌PC-3细胞株的实验研究
目的 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)联合化疗药物顺铂(DDP)对前列腺癌PC-3细胞株的体外杀伤作用. 方法 分别采用不同浓度的DDP(1.0μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml、20.0μg/ml、50.0μg/ml、100.0μg/ml)与TRAIL(10.0ng/ml、20.0ng/ml、50.0ng/ml、100.0ng/ml、200.0ng/ml)作用PC-3细胞株,24h后MTT法检测细胞的吸光度;DDP(5.0ng/m1)与TRAIL(50.0ng/ml)联合作用PC-3细胞4h、8h、12h、16h、20h、24h后,MTT法检测检测细胞的吸光度;并按细胞的抑制率(100%)=(1-实验组吸光度/阳性对照组吸光度)×100%计算DDP组、TRAIL组及两者联合应用对细胞的抑制率,比较组间细胞抑制率的差异. 结果 单独应用DDP或者TRAIL对PC-3细胞体外杀伤作用有浓度依赖性,浓度增高一定程度时对PC-3细胞的抑制作用会处于一个相对平台期;联合应用DDP+TRAIL组与单独应用同浓度的DDP及TRAIL组相比,其对PC-3细胞的体外杀伤作用明显增强,P<0.05,差异具有显著性意义;联合应用DDP与TRAIL对PC-3细胞的体外杀伤作用具有明显的时间依赖性. 结论 DDP能明显提高TRAIL对前列腺痛PC-3细胞株的杀伤作用,其机制与死亡受体DR5的表达上调有关.
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早孕绒毛TRAIL及其受体在自然流产中的作用机制研究
子相关凋亡诱导配体(TRAIL)及其受体(DR5、DcRl)的表达异常,从而可以导致细胞凋亡的异常,可能是导致自然流产的发病原因之一.
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多囊卵巢综合征大鼠卵巢颗粒细胞中DR5、DcR2的表达变化
目的 观察DR5、DcR2在多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)大鼠卵巢颗粒细胞中的表达变化,探讨PCOS大鼠卵泡发育障碍的可能发生机制.方法 大鼠皮下注射硫酸普拉睾酮钠,以构建PCOS模型,分别用免疫组织化学法、RT?qPCR分析观察并比较DR5、DcR2在PCOS组和对照组大鼠卵巢颗粒细胞的表达情况.结果 免疫组织化学结果显示,在PCOS组大鼠卵巢各级卵泡颗粒细胞中,DR5的表达较对照组均显著增强(P<0.05),在PCOS组大鼠卵巢窦前卵泡和窦状卵泡颗粒细胞中,DcR2的表达较对照组同级别卵泡显著增强(P<0.05),在始基卵泡颗粒细胞的表达差异无显著性(P>0.05).RT?qPCR分析显示,DR5 mRNA和DcR2 mRNA在两组中都有表达,且二者在PCOS组大鼠卵巢颗粒细胞中的表达较正常对照组均明显增强(P<0.05).结论DR5和DcR2在颗粒细胞中的异常表达可能对PCOS大鼠卵泡的异常发育起到了一定作用,它们可能是通过参与颗粒细胞凋亡过程而对卵泡的发育造成了一定影响.
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化疗药物增强重组可溶性TRAIL抗肿瘤作用
目的探讨化疗药物对重组可溶性TRAIL(rsTRAIL)抗肿瘤作用的影响及其分子机制.方法 13株不同肿瘤细胞经rsTRAIL处理后,采用MTS-PMS染色法和流式细胞仪技术测定细胞凋亡率,观察肿瘤细胞对rsTRAIL的敏感性;化疗药物与rsTRAIL联合作用于敏感性不同的肿瘤细胞检测细胞敏感性的变化;免疫印迹技术分析TRAIL受体DR5蛋白表达.结果 13株肿瘤细胞中约46.2%(6/13)的细胞株对rsTRAIL敏感;化疗药物CHX、CP和8-CA可显著提高肿瘤细胞株对rsTRAIL细胞毒作用的敏感性;8-CA和TRAIL联合作用可上调DR5的蛋白表达.结论化疗药物CHX、CP和8-CA可增强rsTRAIL的抗肿瘤作用.
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TRAIL受体DR5、DcR1在宫颈癌组织中的表达
目的 检测TRAIL受体DR5、DcR1在宫颈癌中的表达及意义,探讨其在诱导肿瘤细胞凋亡中的作用. 方法 采用免疫组化ElivisionTM plus法检测DR5、DcR1在正常宫颈组织、官颈上皮内瘤样病变(CIN)和官颈癌组织中的表达情况,并分析其与临床病理的关系. 结果 DR5在正常宫颈组织中阳性表达率为10.00％,显著低于CIN组(80.00％)和宫颈癌组(92.86％),差异具有统计学意义(P＜0.01)；DcR1在正常宫颈组织、CIN组织和宫颈癌组织中阳性表达率分别为90.00％、90.00％和97.62％,各组间差异无统计学意义(P＞0.05).DR5、DcR1的阳性表达率与官颈癌的临床分期、病理分型以及淋巴结转移无明显相关性. 结论 DR5和DcR1在宫颈癌中均为高表达,可能成为新的治疗靶点.
关键词： 子宫颈癌 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 DR5 DcR1 -
5-氮杂胞苷对胃癌细胞系的生长凋亡及DR4与DR5表达的影响
目的 探讨5-氮杂胞苷(5-Aza-CdR)对胃癌细胞系的生长,凋亡及DR4与DR5表达的影响.方法 反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法、Western blot方法和甲基化特异性PCR(MS-PCR)法检测5-Aza-CdR处理后的胃癌细胞株内DR4和DR5的RNA表达水平.结果 5-Aza-CdR能够逆转胃癌细胞中DR4和DR5的启动子甲基化水平,并上调DR4和DR5的表达水平.结论 5-氮杂胞苷对胃癌细胞系MKN28、AGS和SGC7901具有增殖抑制作用,且具有药物浓度和作用时间的依赖性.促进胃癌细胞系MKN28、AGS和SGC7901的凋亡且能使死亡受体DR4和DR5的表达水平增高.
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5-氮杂胞苷对胃癌细胞系的生长凋亡及DR4与DR5表达的影响
目的 探讨5-氮杂胞苷(5-Aza-CdR)对胃癌细胞系的生长,凋亡及DR4与DR5表达的影响.方法 反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法、Western blot方法和甲基化特异性PCR(MS-PCR)法检测5-Aza-CdR处理后的胃癌细胞株内DR4和DR5的RNA表达水平.结果 5-Aza-CdR能够逆转胃癌细胞中DR4和DR5的启动子甲基化水平,并上调DR4和DR5的表达水平.结论 5-氮杂胞苷对胃癌细胞系MKN28、AGS和SGC7901具有增殖抑制作用,且具有药物浓度和作用时间的依赖性.促进胃癌细胞系MKN28、AGS和SGC7901的凋亡且能使死亡受体DR4和DR5的表达水平增高.
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TIPE2过表达质粒转染大鼠佐剂型关节炎滑膜成纤维样细胞及分析
目的:通过TIPE2表达质粒转染大鼠佐剂型关节炎 (AA) 成纤维样滑膜细胞 (FLS),体外研究 AA 的发病中 TIPE2 对DR5介导细胞凋亡的作用.方法:应用 MIGR1/TIPE2+/+ 表达质粒,经脂质体法导入AA-FLS细胞中,转染72小时后,荧光显微镜检测质粒自带GFP基因的表达情况确认转染效率,以未作处理的AA-FLS为对照组,用半定量逆转录聚合酶链反应 ( RT-PCR ) 检测 TIPE2 mRNA的表达,用 Western blot 法检测TIPE2 蛋白的表达变化,MTT 法以及流式细胞术检测抗 DR5 功能性单链抗体ZF1对两组细胞生长的影响.结果:成功获得荧光强度90% 的 TIPE2过表达 AA-FLS 细胞,TIPE2 mRNA 及蛋白表达显著提高.抗 DR5 单链抗体 ZF1 对 TIPE2+/+ 的FLS组细胞具有明显生长抑制及凋亡诱导作用,与不作处理的FLS组相比差异显著.结论:TIPE2+/+表达质粒明显提升AA-FLS的TIPE2蛋白表达水平,TIPE2 对 DR5 介导细胞凋亡有重要作用.
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食管癌细胞表面DR5的表达分布与细胞铺展状态的关系
目的:探讨食管癌鳞癌EC9706 细胞系细胞表面DR5的表达分布与细胞铺展状态的关系.方法:免疫细胞化学技术分析食管癌EC9706细胞的DR5表达分布;流式细胞术检测食管癌细胞表面DR5的表达及细胞的凋亡率.结果:DR5分布在食管癌EC9706细胞的细胞质和细胞膜表面,主要在细胞质,但在细胞核没有DR5分布, 而且在悬浮的食管癌细胞表面DR5表达高于铺展者.悬浮的食管癌细胞对抗DR5功能性抗体诱导的细胞凋亡敏感性高于铺展者.结论:食管癌细胞表面DR5的表达与细胞铺展状态具有密切的关系,细胞铺展状态的变化直接影响细胞表面DR5的表达分布以及对抗DR5功能性抗体诱导的细胞凋亡敏感性.该研究结果对进一步探讨DR5表达分布的机制以及TRAIL和DR5的功能性抗体的抗肿瘤临床应用有一定的指导意义.
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抗hDR5单抗对食管癌细胞的凋亡及CDC作用观察
目的:观察抗Hdr5单抗对食管癌细胞的凋亡作用及CDC作用.方法:采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,采用MTT法及显微摄影观察McAb及补体作用后EC109的增殖及形态变化,流式细胞仪观察细胞凋亡.结果:获得了单克隆抗体,其对EC109的凋亡诱导作用呈剂量依赖性;与对照组比较,补体可显著提高单抗对EC109的细胞毒作用,二者联用其细胞生长抑制率可达83.04%,形态学观察可见凋亡小体及细胞溶解;结论:DR5单抗具有诱导EC109细胞凋亡的作用,与补体联合应用具有较强的CDC效应.
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抗人DR5单克隆抗体对白血病U937细胞凋亡的作用
目的:研究鼠抗人DR5单克隆抗体(mDRA-6)对白血病细胞U937的凋亡诱导作用.方法:光镜下观察mDRA-6作用后U937细胞的形态变化;流式细胞术检测U937细胞表面DR5表达率;MTT法检测mDRA-6对U937细胞生长的影响;AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡率;琼脂糖凝胶电泳检测U937细胞DNA的片段化降解;JC-1单染流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位改变.结果:mDRA-6作用U937细胞后呈现典型的细胞凋亡特征;MTT法检测显示mDRA-6作用U937细胞24小时死亡率为61.09%,并呈时间、浓度依赖性;流式细胞仪检测显示10 mg/L的mDRA-6作用4小时,U937细胞凋亡率为79.12%;琼脂糖凝胶电泳显示DNA呈现明显梯状带型;mDRA-6作用U937细胞后线粒体膜电位明显下降.结论:mDRA-6能够诱导白血病U937细胞凋亡,是具有诱导细胞凋亡活性的功能性抗体.
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凋亡相关蛋白死亡受体5、细胞内Fas相关死亡域样白介素1-β转换酶抑制蛋白在胃组织中的表达及临床意义
目的 探讨不同胃组织中凋亡相关蛋白死亡受体(DR5)、Fas相关死亡域样白介素1-β转换酶抑制蛋白(c-FLIP)表达的临床意义.方法 检测胃癌、正常胃黏膜及胃炎组织中DR5和c-FHP蛋白的表达,以及不同分化程度的胃癌组织中的表达差异,对两者进行相关性分析.结果 DR5在胃癌、慢性胃炎、正常胃黏膜中阳性表达率分别为76.67％、53.85％和28.13％;c-FLIP蛋白阳性率分别为85％、30.77％和18.75％,各组比较差异有显著性意义(P＜0.05).DR5蛋白在高、中、低分化腺癌中的表达率分别为38.1％、55％、78.95％,c-FLIP分别为47.62％、70％、94.74％,各组比较差异有显著性意义(P＜0.05).结论 DR5与c-FLIP蛋白在胃癌中均高表达,两者均参与了胃癌的发生.
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IFN-α对肿瘤细胞上TRAIL受体DR4和DR5表达的调节及意义
目的研究IFN-α对肿瘤细胞Colo205 TRAIL功能受体DR4和DR5表达的调节作用,以及IFN-α刺激与肿瘤细胞对rTRAIL诱导凋亡敏感性的影响.方法 Colo205细胞以IFN-α刺激0、24、48和72 h;采用RT-PCR方法检测DR4和DR5 基因表达;用间接免疫荧光染色结合流式细胞技术检测细胞表面DR4和DR5分子表达;采用annexinV和碘化丙锭双染色试剂盒检测细胞凋亡.结果 IFN-α刺激后,DR4和DR5 的mRNA在细胞表面的表达均有增加,刺激48 h,膜型DR4和DR5表达达到高峰值(16.7%和29.8%);rTRAIL凋亡诱导效应在IFN-α刺激48 h的Colo205细胞中高.结论 IFN-α上调死亡受体DR4、DR5的表达可能是其促进rTRAIL 诱导肿瘤凋亡的重要机制.
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载多烯紫杉醇靶向脂质微泡的制备及其体外寻靶能力
目的 制备一种携带肝癌DR5单克隆抗体(DR5mAb)的载多烯紫杉醇靶向脂质超声微泡(Docetaxei-loaded lipid microbubbles,DLLM),并检测其体外寻靶能力.方法 采用机械振荡法制备载多烯紫杉醇的DLLM,并制备生物素化的肝癌DR5mAb,通过生物素-亲和素连接方法,将DR5mAb连接于载多烯紫杉醇的DLLM表面,制备DR5- DLLM.检测DR5-DLLM的粒径、浓度、Zeta电位、包封率、载药量、稳定性及其体外寻靶能力.结果 DR5-DLLM的平均粒径为1 232 nm,Zeta电位为-9.86 mV,平均浓度为3.1×109个/ml,微泡的包封率为73.5％,平均载药量为25.3％.60Co射线灭菌前后以及4℃、-20℃保存14 d,微泡的形态、包封率、载药量未见明显改变.靶向微泡组的HepG2细胞周围可见DR5-DLLM微泡紧密结合,而非靶向微泡DLLM组未见特异性微泡结合.结论 成功制备了携带肝癌DR5mAb的载多烯紫杉醇靶向脂质超声微泡,该微泡能够与HepG2细胞牢固结合,有望成为一种新型、高效、可用于超声分子显像的肝癌靶向药物载体.
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抗TRAIL死亡受体抗体及其在肿瘤治疗中的研究进展
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis-inducing lig-and,TRAIL)是近几年发现的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族成员.TRAIL能与他的死亡受体(death receptor,DR)TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5)结合并特异性地诱导许多肿瘤细胞凋亡,但对大多数正常细胞没有毒性.一些抗TRAIL死亡受体抗体也能先择性杀伤肿瘤细胞,并在癌症治疗上显示了良好的治疗效果.本文就TRAIL的凋亡诱导途径以及抗TRAIL受体抗体在肿瘤治疗中的研究进展作一综述.
关键词： 癌 TRAIL DR4 DR5 抗TRAIL死亡受体抗体 -
水流动力学方法进行基因免疫制备高效价抗体
用水流动力学方法进行基因免疫,制备小鼠高效价多克隆抗体.采用水流动力学方法和肌肉注射pcDNA3.0/DR5免疫小鼠,分批在0、2、4、6周进行免疫,初次免疫8周后取鼠尾血用ELISA方法检测小鼠抗DR5抗体效价,用Western blot、免疫组化染色法检测抗体的特异性.结果表明,ELISA结果显示末次免疫后水流动力学免疫组抗体滴度高可达到为1:102 400,肌肉注射免疫组抗体滴度高可达1: 25 600.Western blot结果显示,小鼠抗DR5多克隆抗体识别Jurkat细胞的DR5蛋白条带.免疫组化结果表明,转染的DR5蛋白主要分布在食管癌细胞膜附近,与预期相符.用水流动力学的方法可以成功制备比肌肉注射更高效价的多克隆抗体.
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死亡受体5在内毒素诱导人肝细胞凋亡中的作用
探讨内毒素(LPS)在体外直接作用于L()2细胞引起凋亡及可能机制.将LO2细胞常规培养7 h贴壁后,分为对照组、内毒素处理组、抗人DR5单抗mDRA-6处理组及联合组(内毒素+mDRA-6).然后在倒置显微镜下观察LO2细胞形态变化;MTT法检测内毒素对LO2细胞生长的影响;流式细胞术检测LO2细胞表面DR5的表达率;Annexin-V和PI双染法检测细胞凋亡率.结果:经内毒素处理的LO2细胞呈现明显的凋亡形态特征,出现核固缩、染色质边缘化、凋亡小体形成.流式细胞术分析表明:对照组LO2细胞表面DR5的表达率为4.8%,用内毒素(10 mg/L)处理12 h后,DR5表达率上调为37.76%.LO2细胞12 h凋亡率:内毒素处理组、抗人DR5单抗mDRA-6处理组、内毒素联合mDRA-6组细胞凋亡率分别为37.78%(早期凋亡21.65%,晚期凋亡16.13%)、29.58%(早期凋亡18.21%,晚期凋亡11.37%)和65.81%(早期凋亡50.61%,晚期凋亡15.20%)(P<0.05).细胞凋亡率与内毒素的剂量及细胞表面DR5的表达呈相关性.结论:LPS对LO2细胞的杀伤作用主要通过诱导凋亡,细胞表面DR5受体的表达上调可促进这种凋亡作用.
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凋亡相关分子的表达上调在免疫性肝损伤中的作用探讨
检测刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)诱导的小鼠急性肝损伤模型中凋亡相关分子的表达,并探讨其意义.以小鼠尾静脉注射15 mg/kg ConA建立急性肝损伤模型;Annexin Ⅴ染色检测肝细胞的凋亡率;流式细胞术检测不同时间点肝细胞表面凋亡受体Fas、DR5的表达,以及肝浸润淋巴细胞表面凋亡配体FasL、TRAIL的表达.结果显示,与正常小鼠肝细胞凋亡率3.36%±0.69%相比,ConA诱导小鼠急性肝损伤后肝细胞的凋亡率显著上升,12 h为13.52%±0.68%,24 h达20.92%±0.66%.同时,肝细胞表面Fas、DR5的表达明显上升,肝浸润淋巴细胞表面FasL、TRAIL亦呈显著上调表达.结果表明,在ConA诱导的急性肝损伤发生发展过程中,肝细胞表面凋亡相关分子Fas、DR5与肝浸润淋巴细胞表面凋亡配体FasL、TRAIL的表达上调以及相互作用是导致肝损伤的重要因素.
