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丙型肝炎病毒核心蛋白在HepG2细胞中的表达及其对端粒酶活性的影响
目的建立HCV核心蛋白细胞表达模型,并探讨其对细胞端粒酶活性的影响. 方法用PCR法扩增出HCV核心基因cDNA,将其插入真核表达载体pBK-CMV的HindⅢ和BamHⅠ位点间,构建重组质粒pBK-HCVc.再将重组质粒pBK-HCVc和空载体分别导入肝癌细胞株HepG2中,G418筛选,RT-PCR、免疫组化和蛋白印迹鉴定HCV核心蛋白表达.PCR-ELISA法检测端粒酶活性. 结果构建的pBK-HCVc质粒在HepG2细胞中有稳定表达.表达HCV核心蛋白的细胞HepG2-C的端粒酶活性较转染空载体的细胞HepG2-CMV明显升高. 结论 HCV核心蛋白上调了端粒酶活性,可能是HCV诱发肝细胞癌的一种途径.
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丙型肝炎病毒核心区基因在大肠杆菌中的高效表达
肝炎病毒(HCV)是输血后及散发性非甲非乙型肝炎的主要病原,丙型肝炎易转为慢性肝炎,与肝癌及肝硬变关系密切[1].HCV核心区编码蛋白是研究重点之一.在研究过程中,首先应获得大量高效表达的HCV核心蛋白抗原.HCV基因组结构与黄病毒或瘟病毒相似,为长约9.4kb的单股正链RNA,含一个开放读码框架(open readingframe,OFR),编码含3010～3011个氨基酸残基的多蛋白前体,经宿主和病毒蛋白酶作用加工成结构蛋白(C,E1和E2/NS1)和非结构蛋白(NS2,NS3,NS4和NS5)[2].核心蛋白约含191个氨基酸,大小约19000～22000,其氨基酸序列十分保守,比较已有的HCV各分离株氨基酸序列,同源性超过95%.
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丙型肝炎病毒核心蛋白诱导人胆管上皮细胞转化及成瘤实验
目的探讨丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV-C)对人胆管上皮细胞(BEC)的转化及致癌作用.方法通过脂质体介导将含有HCV-C基因重组真核表达载体pcDNA HCV-C导入BEC细胞,G418筛选表达目的基因的细胞;聚合酶链反应(PCR)及免疫组织化学SABC法检测细胞中HCV-C 基因及蛋白的表达;细胞计数、锚着非依赖性生长实验、成瘤性检测等鉴定其生物学行为变化,免疫组织化学SABC法检测所致肿瘤组织中HCV-C蛋白表达.结果 HCV-C转染的BEC 细胞中HCV-C蛋白表达于胞质,质粒pcDNA HCV-C转染细胞的倍增时间较pcDNA3转染细胞和未转染BEC细胞明显缩短(分别为14 h,28 h,30 h).pcDNA HCV-C和pcDNA3转染细胞及未转染BEC在软琼脂中的克隆形成率分别为36.0%、2.5%和1.5% (P<0.01).3种细胞接种裸鼠后,pcDNA HCV-C转染细胞注射组出现肿瘤,病理学检查证实为胆管细胞癌,肿瘤组织有HCV-C蛋白的表达.而pcDNA3转染细胞及未转染BEC细胞注射组在注射36 d后仍未见肿瘤发生.结论 HCV-C 蛋白具有促胆管细胞转化和促进肿瘤发生的作用.
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HCV C 蛋白调控肝门部胆管癌细胞中NF-κB活性的研究
目的探讨HCV C蛋白在肝门部胆管癌细胞中对核转录因子κB(NF-κB)调控作用.方法利用稳定表达HCV C蛋白的QBC939细胞株(QBC939 HCV C+),通过NF-κB报道基因分析法、凝胶迁移率分析(EMSA)检测HCV C蛋白增强肝门部胆管癌细胞NF-κB的DNA结合活性和反式激活活性.RT-PCR、Western blot检测HCV C蛋白对核转录因子κB抑制蛋白α(IκBα)mRNA及p50、p65、IκBα蛋白表达及IκBα蛋白磷酸化的影响.结果①EMSA结果显示QBC939HCV C+细胞系中NF-κB相对信号密度明显比QBC939细胞高.②将pNF-κB-lun表达质粒转染稳定表达HCV C蛋白胆管癌细胞系中,通过单光子检测仪检测荧光素酶活性,结果显示QBC939HCV C+细胞中活化NF-κB为12.8倍,而QBC939细胞中NF-κB为2.6倍.③RT-PCR显示IκBα mRNA在QBC939 HCV C+细胞和QBC939细胞中的表达无明显差异;Western blot结果显示稳定表达HCV C蛋白的QBC939 HCV C+细胞株的胞核中的p50、p65蛋白高水平表达,而未转染HCV C蛋白的QBC939细胞仅检测出极低水平的p50、p65蛋白.在QBC939HCV C+细胞胞浆中IκBα蛋白低水平表达,QBC939细胞高水平表达,但IκBα蛋白磷酸化水平则相反.结论HCV C蛋白通过增加IκBα降解激活的NF-κB在肝门部胆管癌的发生中起重要作用.
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HBV X基因-HCV C基因cDNA融合基因真核表达载体的构建及其表达
目的构建HBVX-HCVC融合基因真核表达载体,并获得稳定表达该基因的HepG2细胞株.方法双酶切质粒pXT1-X,得到完整的HBV X基因片段后,将其插入到质粒PBK-CMV和PBK-HCV C的相应酶切位点,得到重组质粒PBK-X和PBK-X-C;再将质粒RBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C分别导入肝癌细胞株HepG2中,G418筛选,RT-PCR、蛋白印迹鉴定HBV X和HCV C蛋白表达.结果质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C在HepG2细胞中有稳定表达.结论成功构建HBV X-HCVC融合基因真核表达载体,并获得稳定表达该基因的HepG2细胞株.
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HCV 5′非编码区和核心区重组真核表达质粒的构建及其细胞内定位
目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)重组真核表达载体,为HCV感染基因免疫和基因治疗的研究奠定基础.方法:构建含HCV 5′非编码区(NCR)及编码核心蛋白C区基因片段的重组真核表达质粒pBBS212-HCV,通过脂质体介导转染入人肝癌细胞株HepG2中,应用RT-PCR及免疫组织化学方法鉴定HCV核心蛋白的表达及其在细胞内的定位.结果:重组真核表达质粒在HepG2细胞中有稳定表达,HCV核心蛋白以胞浆内表达为主.结论:成功构建了含HCV 5′NCR和核心C区基因片段的真核表达载体,明确核心抗原的细胞内定位主要在细胞胞浆内.
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乙型肝炎病毒X基因-丙型肝炎病毒C基因共表达对血管内皮细胞生长因子的影响
目的建立乙型肝炎病毒X基因-丙型肝炎病毒C基因(HBV X-HCV C)共表达HepG2细胞模型,并探讨其对血管内皮细胞生长因子表达的影响.方法双酶切质粒pXT1-X,得到完整的HBV X基因片段后,将其插入到质粒PBK-CMV和PBK-HCV C的相应酶切位点,得到重组质粒PBK-X和PBK-X-C;再将质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C分别导入肝癌细胞株HepG2中,G418筛选,逆转录聚合酶链反应、Western blot鉴定HBVX和HCV C蛋白表达;免疫组织化学、Western blot检测血管内皮细胞生长因子蛋白质表达.结果质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C在HepG2细胞中有稳定表达.共表达HBV X-HCV C蛋白的细胞血管内皮细胞生长因子蛋白质表达较转染空载体的细胞及单独表达HBV X、HCV C蛋白的细胞明显升高.结论HBV X-HCV C共表达能显著上调血管内皮细胞生长因子蛋白质表达,提示HBV、HCV可能具有协同致癌作用.
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丙型肝炎病毒核心蛋白DNA结合区的测定
目的阐明丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的DNA结合特性及其意义.方法在大肠杆菌中表达谷甘肽转移酶(GST)融合HCV核心蛋白不同长度片段,并进行纯化.经聚丙烯酰胺凝胶电泳后,通过更换缓冲液的方法将这些蛋白片段相对固定在凝胶中,用Y-32P[4667-00091]ATP标记人工合成的DNA进行2次电泳,通过放射日显影检测核心蛋白的DNA结合区.结果 HCV核心蛋白N端第10～16位氨基酸残基和第46～70位氨基酸残基可独立地结台DNA.核心蛋白既能和单链DNA结台又能和双链DNA结合.对单双链DNA的结合域相同;对所结合的DNA序列无选择性.结论 HCV核心蛋白的N端含有两个DNA结合区.结合区序列与核内转移信号的部分重迭以及对结台靶DNA序列的非选择性可能是HCV核心蛋白具有多功能的基础.
关键词： 肝炎病毒.丙型:DNA结合蛋白 病毒核心蛋白 -
丙型肝炎病毒核心蛋白激活肝癌细胞血管内皮生长因子的表达
目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白对肝瘤细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表达的影响。方法将HCV核心基因cDNA插入真核表达载体PBK-CMV的HindⅢ和BamHⅠ位点间，构建重组质粒PBK-HCVc。再将重组质粒PBK-HCVc和空载体分别导入肝癌细胞株HepG2中，G418筛选，RT-PCR、蛋白印迹鉴定HCV核心蛋白表达。免疫组织化学，蛋白印迹检测VEGF蛋白表达；原位杂交，RT-PCR检测VEGF mRNA。结果重组质粒PBK-HCVc在HepG2细胞中有稳定表达；表达HCV核心蛋白的细胞HepG2-C的VEGF在蛋白水平和mRNA水平较转染空载体的细胞HepG2-CMV明显升高。结论 HCV核心蛋白能激活VEGF表达，可能对肝细胞癌的生长具有促进作用。
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丙型肝炎病毒核心蛋白人源单链可变区抗体的筛选与鉴定
目的筛选、鉴定抗丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的人源单链可变区抗体(ScFv)。方法采用噬菌体表面展示技术，以重组的HCV核心蛋白为包被抗原，从噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程，获得抗原结合活性较强的HCV核心蛋白特异性人源单链可变区抗体片段阳性克隆，并对其进行免疫学及核苷酸序列测定。结果筛选得到的ScFv 片段具有抗HCV核心蛋白的特异性，基因序列分析结果表明符合人源单链可变区抗体基因序列的结构特征。结论利用噬菌体抗体库技术，成功获得HCV核心蛋白的特异性人源单链可变区抗体的编码基因。
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丙型肝炎病毒核心蛋白抑制肝癌细胞P16、P27的表达
目的探讨HCV核心蛋白对肝瘤细胞P16、P27表达的影响.方法将HCV核心基因cDNA插入真核表达载体PBK-CMV的HindⅢ和BamHⅠ位点间,构建重组质粒PBK-HCVc.再将重组质粒PBK-HCVc和空载体分别导入肝癌细胞株HepG2中,G418筛选,RT-PCR、蛋白印迹鉴定HCV核心蛋白表达.免疫组化,蛋白印迹检测P16、P27蛋白表达; RT-PCR检测P16、P27mRNA.结果重组质粒PBK-HCVc在HepG2细胞中有稳定表达;表达HCV核心蛋白的细胞HepG2-C的P16、P27在蛋白水平和mRNA水平较转染空载体的细胞HepG2-CMV明显下降.结论 HCV核心蛋白能抑制P16、P27表达,可能与肝细胞的癌变有关.
