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免疫基因CD1d和绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建
目的:构建人免疫基因CD1d与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒载体.方法:实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得CD1d的全外显子片段,使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿梭质粒转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定.取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞,荧光显微镜观察荧光表达.结果:电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的CD1d基因序列完全一致.重组慢病毒质粒可高效转染293T细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光.结论:成功构建了CD1d与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究CD1d基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体.
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CD1d基因敲除小鼠拮抗DSS诱导结肠炎
目的 以葡聚糖硫酸钠 (dextran sulphate sodium, DSS) 诱导的CD1d-/-小鼠实验性结肠炎模型为研究对象, 探究CD1d分子在小鼠结肠炎进程中的作用.方法 取SPF级C57BL/6小鼠和CD1d-/-(C57BL/6背景) 小鼠, 每天给予2.5％DSS喂养, 连续6 d, 每天记录小鼠的体质量变化、粪便性状、活动情况等, 评估小鼠的疾病活动指数 (DAI), 记录小鼠的生存情况.第6天用FITC-dextran灌胃检测肠通透性, 测量结肠长度, 并用HE染色法观察结肠组织病理学变化, 免疫组化法与免疫荧光法检测肠上皮增殖情况, 免疫印迹 (Western blot) 检测小鼠结肠组织细胞炎性因子的表达.结果 与C57/BL6小鼠相比, CD1d-/-小鼠生存率高 (P＜0.05), 体质量减轻缓慢、疾病活动指数 (DAI) 低 (P＜0.05), 结肠长度长、肠通透性低 (P＜0.01), 肠黏膜损伤轻, 结肠上皮细胞增殖明显 (P＜0.05), 肠组织IL-1beta及IL-18表达高 (P＜0.05) .结论 CD1d基因敲除小鼠拮抗DSS诱导的结肠炎, 可能是通过促进结肠表达NLRP3炎性小体及其底物IL-1beta及IL-18.
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慢病毒载体介导CD1d和GFP融合基因转染PANC-1细胞的实验研究
目的 构建人免疫基因CD1d与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)融合基因慢病毒载体并转染人胰腺癌细胞(PANC-1).方法 实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得CD1d的全外显子片段,使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿梭质粒转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定.通过慢病毒转染预实验确定MOI,进行人CD1d重组慢病毒载体转染胰腺癌PANC-1细胞株.结果 电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的CD1d基因序列完全一致.重组慢病毒质粒可高效转染PANC-1细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光.结论 成功构建了CD1d与GFP融合基因慢病毒表达载体并转染人胰腺癌细胞.
