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丙型肝炎病毒多表位基因载体的构建与表达
目的 构建编码多个丙型肝炎病毒(HCV)抗原表位的真核表达载体,建立稳定转染的细胞株,并利用小鼠移植瘤模型初步评估疫苗在动物体内的免疫反应状况.方法 合成含10条CTL细胞表位的M2基因,与含多条B细胞及T细胞表位的M1基因连接合成M1M2基因;将M2、M1M2基因分别与pcDNA3.1(+)连接,构建真核表达载体pcD-NA3.1(+)/M2及pcDNA3.1(+)/M1 M2;将上述两种载体与pcDNA3.1(+)/M1分别转入SP2/0细胞中,并检测目的蛋白表达;用3种重组质粒分别免疫BALB/c小鼠移植瘤模型,初步评估疫苗引起的免疫反应.结果 3种真核表达载体在SP2/0细胞中均能得到稳定表达,免疫荷瘤小鼠后,小鼠瘤体的大小M1M2组＜M2组＜M1组＜空质粒对照组,实验组均能观察到肿瘤组织的坏死现象.结论 成功构建了HCV多表位基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/M1 M2,用该表达载体免疫小鼠可引起较强的特异性免疫应答.
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西尼罗病毒多表位基因的融合表达及其免疫保护作用研究
目的 研究西尼罗病毒(WNV)多表位基因的融合表达及其免疫保护作用.方法 利用生物信息软件Biosun分析西尼罗全基因序列,确定表位基因片段并选择合适片段连接构成多表位基因.采用重叠PCR方法扩增该基因,构建多表位基因的原核重组表达载体pET-43a-M,进行融合表达和纯化.将表达蛋白加弗氏佐剂免疫小鼠并进行攻毒试验,观察其保护作用.结果 分子克隆和构建了原核重组表达质粒pET-43a-M,表达和纯化了融合蛋白Nus-M,该蛋白免疫后的小鼠能够部分抵御西尼罗病毒的攻击.结论 构建的西尼罗病毒多表位基因能够在原核细胞内表达,表达产物有较弱的免疫保护反应,为该病毒多表位抗原的串联及多表位疫苗研究提供了试验资料,但需要进一步改进.
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P.f多期多表位基因真核表达载体的构建和免疫学特性初步研究
目的 构建恶性疟原虫多期多表位基因的真核表达载体及其免疫学特性的研究.方法 在前期研究基础上,将测序正确的恶性疟原虫多期多表位基因克隆入真核表达载体VR1020 内并大量制备.以VR1020 重组质粒免疫HHD-2 小鼠并进行细胞和体液免疫分析.结果 成功获得重组真核表达载体,ELISA 显示该重组质粒免疫小鼠后获得了较高效价的抗体,而且显示了较好的CTL 杀伤活性,同时诱导了高水平的细胞因子.结论 本研究为新型疟疾疫苗的研制奠定一定的理论和实践基础.
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丙型肝炎病毒多表位基因核酸疫苗的构建及其免疫原性
目的 构建丙型肝炎病毒(HCV)多表位基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-CtEm,用该重组质粒免疫BALB/c小鼠,并检测其免疫原性.方法 用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切含有HCV C区、E2区模拟表位和NS3～NS5区细胞表位串联基因的原核表达载体pQE30-CtEm,克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),脂质体瞬时转染CHO细胞,并检测其表达.以100 μg重组质粒免疫BALB/c小鼠,检测其体液免疫和细胞免疫效果.结果 所构建的真核表达载体pcDNA3.1(-)-CtEm在CHO细胞中能获得有效表达.该质粒免疫小鼠后可诱导高水平的抗体,特异性淋巴细胞增殖反应、IFN-γ水平及CTL活性均明显高于空载体和生理盐水对照组.结论 已成功构建HCV多表位基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-CtEm,免疫小鼠后可诱导特异性体液免疫和细胞免疫应答.
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弓形虫多表位基因植物表达载体的构建
目的构建弓形虫多表位基因(TGMG)植物表达载体.方法①将TGMG亚克隆入pBAC55构建中间载体pB35MG,再将其中E35S/TGMG/NOS3'结构单元亚克隆人pCAMBIA2300构建植物表达载体pC35MG.②将番茄果实特异性启动子E81.1插入pB35MG构建中间载体pB35E1MG,再将其中E35SE81.1/TGMG/NOS3'结构单元亚克隆入pCAMBIA2300构建植物表达载体pC35E1MG.③将番茄果实特异性启动子E82.2插入pB35MG构建中间载体pBE2MG,再将其中E82.2/TGMG/NOS3'结构单元亚克隆人pCAMBIA2300构建植物表达载体pCE2MG.测序鉴定pB35MG、pC35E1MG、pCE2MG中的TGMG序列.④pC35MG、pC35E1MG、pCE2MG转化根癌农杆菌LBA4404.结果重组质粒用酶切鉴定均得到预期片段,pB35MG、pC35E1MG、pCE2MG测序结果正确.结论成功构建TGMG中间载体pB35MG、pB35E1MG、pBE2MG,以及植物表达载体pC35MG、pC35E1MG、pCE2MG.并将3种植物表达载体导入根癌农杆菌.
关键词： 弓形虫 多表位基因 番茄果实特异性启动子 植物表达载体 -
西尼罗病毒多表位基因免疫保护研究
目的 探讨西尼罗病毒多表位基因诱导体液及细胞免疫的可行性及其免疫攻毒保护作用.方法 将西尼罗病毒多抗原表位基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1 中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-M.通过脂质体转染法将该多表位基因导入BHK细胞中,采用RT-PCR和IFA检测其在细胞内的瞬时表达.将重组质粒通过肌肉注射免疫BALB/ c 小鼠,通过间接免疫ELISA 法、CTL 杀伤功能检测和淋巴细胞增殖试验等,检测小鼠体内特异性体液免疫和细胞免疫的水平.在此基础上进行攻毒试验,分析重组质粒DNA对西尼罗病毒攻击的免疫保护作用.结果 重组质粒pcDNA3.1-M能够在真核细胞内表达,采用IFA方法能在细胞内检测到西尼罗病毒特异性抗原.在抗原的刺激下,免疫后的小鼠脾淋巴细胞增殖显著,可诱导特异性CTL 应答反应.攻毒试验显示,重组多表位基因能够对西尼罗病毒的攻击起到一定的保护作用,达到50%,中和抗体效价达到1∶50,应用免疫佐剂或应用重组蛋白加强免疫后,其保护率为62.5%,中和抗体效价达到1∶90.结论 西尼罗病毒多表位基因可诱发特异性免疫应答,对西尼罗病毒感染具有保护作用,为其基因疫苗研制提供了一定的实验依据.
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弓形虫多表位基因重组抗原在弓形虫免疫检测中的应用
目的 评价弓形虫多表位基因重组抗原在弓形虫感染诊断中的效果,探索多表位抗原在弓形虫免疫检测中的应用前景.方法 以Ni-NTA Agarose和割胶电渗两步纯化法,获取弓彤虫多表位基因的原核表达纯化产物rMAG,以适宜浓度的rMAG包被ELISA微孔板,分别检测弓形虫急性和慢性感染血清,评价试剂盒检测的敏感性和特异性.结果 经Ni-NTA Agarose和割胶纯化,得到了纯度为95.86%的弓形虫多表位重组可溶性抗原.以3 μg/ml的抗原浓度包被ELISA微孔板,对兔和小鼠的急慢性弓形虫感染血清进行了检测.结果 检测小鼠血清141份.其中慢性感染弓形虫小鼠血清117份、正常小鼠血清24份,检测体系的敏感性为88.88%,特异性为91.67%,一致性为89.36%.检测兔血清24份,其中急性感染弓形虫兔血清18份,正常兔血清6份,阳性血清检出率为94.4%.总一致性为91.5%.结论 以弓形虫多表位重组抗原构建的ELISA试剂盒既可以检测弓形虫急性感染血清,又可以检测弓形虫慢性感染血清,具有一定的应用前景.
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HSV-2gD、HBsAg和IL18多表位基因疫苗的构建方法
目的 研究多表位串联重组核酸疫苗中IL18与HBsAg(S)抗原、P6(NP6)抗原在质粒中所处位置的差异对抗原表达是否有影响.方法 分别将IL18连接在融合蛋白P6-S(NP6-S)的氨基端和羧基端,即构建4种质粒:pc-ILI8-P6-S、pc-IL18-NP6-S、pc-S-P6-IL18和pc-S-NP6-IL 18.采用DNAstar软件分析4种质粒表达的融合蛋白的抗原性.将重组质粒分别转染CHO细胞进行瞬时表达,通过间接免疫荧光和Western blotting检测S、P6(NP6)抗原的表达情况,以确定佳的连接方式.结果 应用DNAstar软件分析可知IL18在融合蛋白的氨基端的抗原性高于在羧基端.间接免疫荧光检测结果发现IL18位于融合蛋白羧基端的质粒表达的抗原性优于氨基端,即:质粒pc-S-P6-ILI8和pc-S-NP6-ILI8的S、P6(NP6)抗原的表达情况均优于质粒pc-IL1 8-P6-S和pc-IL18-NP6-S,故选用质粒pc-S-P6-IL18和pc-S-NP6-IL18作为优势质粒.结论 成功构建了4种质粒,并确定了优势质粒,此项技术将为新一代多基因核酸疫苗的研制提供实验依据,从而为构建更加有效的多价DNA疫苗奠定了良好的基础.
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TS-Fe3O4介导丙型肝炎病毒多表位基因疫苗的研究
目的 研发能诱导有效免疫应答的丙型肝炎病毒(HCV)基因疫苗候选者及探索磁性纳米材料作为基因载体的应用前景.方法 选择5个HCV保守性T/B细胞识别的抗原表位基因,克隆入pcDNA3.1(+),鉴定重组质粒,测定其细胞水平的表达以及在小鼠体内诱导的免疫反应.同时合成壳聚糖(CTS)修饰的Fe3O4磁性纳米微粒(CTS-Fe3O4),采用MTT法检测对人胚肾细胞株HEK-293和小鼠成纤维细胞株3T3的细胞毒性作用,研究在外加磁场作用下,磁性材料作为基因投递系统的应用.结果 成功构建了HCV多表位基因疫苗pcDNA3.1(+)-MA,RT-PCR和间接免疫荧光实验证实了重组质粒在细胞内的表达,疫苗中的B表位能被81％HCV阳性血清样本所识别,磁性材料浓度在1 mmol/L内无细胞毒性.小鼠体内免疫实验初步显示出pcDNA3.1(+)-MA能有效诱导体液和细胞免疫应答反应,并且磁性纳米材料介导的免疫实验组诱导的免疫应答反应更强(P＜0.05).结论 本研究构建的HCV多表位基因疫苗可成为有前景的HCV候选疫苗之一.壳聚糖修饰的Fe3O4纳米材料可以作为一种优良的基因靶向投递载体,并有免疫佐剂的作用.
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流感病毒多表位核酸疫苗CTB-Eg的构建与细胞转染研究
目的 设计并构建含分子内佐剂的流感病毒多表位核酸疫苗CTB-Eg,初步研究其在HEK293T细胞中的转染效率.方法 通过生物信息学软件设计并合成了含分子内佐剂的流感病毒多表位基因CTB-Eg,将其插入真核载体pEGFP-C2中,获得了重组质粒pEGFP-C2/CTB-Eg;用脂质体法转染HEK293T细胞,通过荧光显微镜观察和PCR法检测其转染效率.结果 成功构建了真核表达质粒pEGFP-C2/CTB-Eg,且该重组质粒能在HEK293T细胞中瞬时转染,转染效率在50％～70％之间.结论 本研究成功设计、构建了CTB-Eg融合基因,其在HEK293T细胞中转染效率较高,为流感病毒多表位核酸疫苗CTB-Eg在小鼠体内的抗病毒作用研究奠定了坚实基础.
