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登革2型病毒ZS01/01株E蛋白在真核细胞中的分泌表达研究
目的 对登革2型病毒(DENV-2)ZS01/01株E蛋白在哺乳动物细胞及昆虫细胞中的分泌表达进行研究.方法 RT-PCR扩增DENV-2 prM/E基因,通过融合PCR在prM基因前添加来自乙型脑炎病毒的信号肽序列,并将E基因羧基末端20%区域缺失或替换为乙型脑炎病毒SA14-14-2株E基因相应序列,将上述基因元件分别克隆入哺乳动物细胞表达载体pcDNA5/FRT及昆虫细胞表达载体pAcUW51-M中,将重组质粒转染293T细胞或S19细胞,利用间接免疫荧光(Immunofluoreseence assay,IFA)及Western Blot检测E蛋白的表达与分泌.结果 各重组质粒分别转染293T细胞或Sf9细胞后,E蛋白在细胞内均有效表达,而仅有携带乙脑信号肽且缺失或替换E基因羧基末端20%区域的重组质粒转染293T细胞后,上清中可检测到明显的E蛋白分泌.结论 信号肽及E基因羧基末端20%区域对登革病毒E蛋白的分泌至关重要,宿主细胞对其亦有一定影响.
关键词： 登革热病毒 病毒结构蛋白质类 表达的序列标记/分泌 -
HIV-1B/C重组病毒感染者Gag特异性T淋巴细胞免疫应答的研究
目的 研究中国主要流行的HIV-1 B/C重组毒株感染者Gag特异性T淋巴细胞反应特征.方法 本研究以10例感染时间＜1年和25例感染时间＞3年未接受抗病毒治疗的HIV-1 B/C重组毒株感染者为研究对象,以10例HIV-1阴性健康人作为对照,用Elispot方法检测其针对HIV-1B/C同义B Gag重叠多肽产生γ干扰素的特异性T淋巴细胞反应.结果 8例(8/10)感染时间＜1年的HIV-1 B/C重组毒株感染者产生Gag特异性分泌γ干扰素的T淋巴细胞反应,主要识别散在分布的五条多肽;17例(68％)感染时间＞3年的感染者产生反应,主要识别p17区域内的一条和p24区域内六条多肽.感染时间＞3年组产生IFN-γ的特异性T淋巴细胞反应强度与病毒载量呈明显正相关(P =0.0318,r=0.519),感染时间＜1年的感染者反应强度明显高于感染时间＞3年的感染者(P=0.021).健康人对照组无阳性反应.结论 HIV-1 B/C重组病毒感染者在疾病进程不同阶段识别Gag的不同区域.
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细胞适应株狂犬病病毒反向遗传系统辅助质粒的构建
目的 构建细胞适应株狂犬病病毒反向遗传系统中所需的4个结构蛋白辅助质粒.方法 利用RT-PCR方法扩增细胞适应株狂犬病毒的核蛋白(N)、磷酸化蛋白(P)、糖蛋白(G)、转录大蛋白(L)基因,测序结果正确后,分别连接表达载体,构建反向遗传所需的4个功能性蛋白辅助质粒.结果成功扩增4个结构基因,经测序完全正确,并成功构建反向遗传体系中N蛋白、P蛋白、G蛋白、L蛋白的辅助表达质粒,酶切鉴定完全正确.结论 成功构建狂犬病病毒拯救系统的4个辅助质粒,为此细胞适应株狂犬病病毒的拯救奠定基础.
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丙型肝炎病毒5'端非编码区结构域Ⅱ在其翻译启动活性中的作用
目的 分析丙型肝炎病毒(HCV)5'端非编码区(NCR)的结构域Ⅱ序列(nt44-118)在其翻译启动活性中的作用.方法 用PCR扩增技术获得缺失5'端118 nt的截短型HCV 5'NCR片段,并以之替换萤火虫荧光素酶(Flue)真核表达质粒pCMVNCRluc中的完整HCV 5'NCR,构建截短型HCV 5'NCR调控Fluc基因表达的真核表达质粒pCN1-d3.将pCN1-d3、pCMVNCRluc和pCMVNCRhc缺失HCV5'NCR nt1-43后的重组质粒pCN1-d2以脂质体方法 分别转染人肝癌细胞株HepG2,用双荧光素酶报告基因检测系统检测Fluc相对表达活性,RT-PCR检测Flue mRNA的相对表达水平.结果 酶切和测序结果 表明,重组质粒构建成功.各质粒转染细胞后Fluc mRNA的相对表达水平差异无统计学意义(P0.05);pCN1-d2表达的荧光素酶活性与pCMVNCRluc差异无统计学意义(P0.05),pCN1-d3的Fluc活性显著低于pCMVNCRIuc(P<0.01).结论 HCV 5'NCR的结构域Ⅱ(nt44-118)含有其发挥翻译启动功能的重要序列.
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我国输入性寨卡病毒的分子特征分析
2015年，在巴西等24个美洲国家和地区发生寨卡病毒病［1－3］，随着与疫情国家或地区人员交流的日益密切，我国面临着寨卡病毒输入的风险。截止2016年3月3日，国内共出现9例输入性寨卡病毒感染者，其中广东5例，浙江4例，近期均到过疫区。寨卡病毒病（Zika virus disease）是由寨卡病毒引起并通过蚊媒传播的一种自限性的急性病毒性传染病，其中主要通过感染该病毒的埃及伊蚊叮咬来传播［1－2］。寨卡病毒属黄病毒科黄病毒属，呈球形，有包膜，基因组为单股正链 RNA，包含约1．08万个核苷酸，编码约3419个氨基酸，分为两个基因型：亚洲型和非洲型［2］。寨卡病毒 E 蛋白是其重要的结构蛋白，与病毒活性，如嗜细胞性、毒力和血清特异性等功能密切相关，是引起宿主免疫应答的主要抗原；非编码结构蛋白 NS5含有重要的 RNA 依赖 RNA 聚合酶（RdRP）［4－5］。本研究分析寨卡病毒 E 和 NS5的核苷酸遗传变异和分子特征，为研究该病毒的溯源和进化特征提供重要依据，并用于指导诊断试剂、疫苗和药物的研发，为寨卡病毒传播及暴发的防控提供保障。
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病毒蛋白22增强单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦基因治疗系统杀伤卵巢癌细胞的体内研究
目的探讨病毒蛋白22(VP22)的细胞间传递作用,以及其促进单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK )/更昔洛韦(GCV)基因治疗系统对卵巢癌移植瘤细胞的体内杀伤效应.方法用慢病毒感染卵巢癌3AO细胞,形成携带HSV-TK基因的3AO细胞(3AO/TK)及携带HSV-VP22-TK融合基因的3AO细胞(3AO/VP22-TK).分别在裸鼠皮下接种10%含卵巢癌3AO/TK(3AO/TK组)或3AO/VP22-TK(3AO/VP22-TK组)的混合细胞,并以接种单纯3AO细胞裸鼠为对照(3AO组),每组裸鼠10只.当肿瘤体积达150 mm3后,分别于腹腔注射GCV 10 mg/kg、50 mg/kg.结果注射10 mg/kg GCV后,3AO/TK组与3AO/VP22-TK组肿瘤体积、重量比较,差异有极显著性(P<0.01),3AO/VP22-TK组肿瘤生长明显受到抑制;注射50 mg/kg GCV后,两组肿瘤体积、重量比较,差异无显著性(P>0.05).注射GCV 10 mg/kg后,3AO/TK组肿瘤抑制率为37.7%,3AO/VP22-TK组肿瘤抑制率为91.5%,两组比较,差异有极显著性(P<0.01);注射GCV 50 mg/kg后,3AO/TK组肿瘤抑制率为81.8%,3AO/VP22-TK组肿瘤抑制率为96.7%,两组比较,差异无显著性(P>0.05).结论 VP22介导的自杀基因产物细胞间扩散作用,可明显加强对体内肿瘤细胞的杀伤效应.
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北京地区人群中人Boca病毒血清抗体的分析
目的 通过对血清中人Boca病毒(HBoV)主要衣壳蛋白VP2特异性IgG抗体进行检测,初步了解北京地区人群中这种新发现的病毒的感染状况.方法 以大肠杆菌表达的HBoV主要衣壳蛋白VP2为抗原,应用Western-blot方法,对1996年4月至1997年3月取自首都儿科研究所附属儿童医院健康查体者及北京宣武医院非呼吸道感染患者的血清标本共677份进行HBoV VP2蛋白特异性IgG抗体检测.设抗组氨酸抗体及兔抗HBoV-VP2多肽特异性免疫血清为阳性血清对照.结果 (1)677份血清标本中,抗HBoV VP2蛋白的IgG抗体阳性400份,总检出率为59.1%.(2)被检对象中,＜1个月的婴儿抗体阳性率为45.3%,1个月～的婴儿抗体阳性率为41.4%,2个月～的婴儿抗体阳性率低(31.3%),6个月～至7岁龄抗体阳性检出率在45.6%～69.7%,7岁后直至40岁,抗体阳性检出率维持在70%左右;50岁后则为61.8%～62.8%.结论 早在1996年北京地区的人群中就有59.1%曾经感染过HBoV,说明这种病毒是一种新发现的病毒而不是新出现的病毒,北京地区人群中该病毒的感染较常见.6个月龄以前的婴儿为易感人群.
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丙型肝炎病毒结构蛋白真核表达载体的构建及其在哺乳动物细胞中的表达
目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)结构蛋白的真核表达载体.方法:用RT-PCR方法扩增HCV结构基因,并将其克隆入真核表达载体pcDNA3中,用磷酸钙转染法将其转入Sp2/0细胞,用免疫组化法检测细胞中瞬时表达的目的蛋白.结果:克隆的基因片段全长约1.9kb,包括C及E2的全长和E1的部分.免疫组化显示表达蛋白位于细胞浆中.结论:构建的丙型肝炎病毒结构蛋白的真核表达载体能够在哺乳动物细胞中得到表达,为进一步研究HCV结构蛋白的性质及各结构蛋白相互作用下的基因免疫效果奠定了基础.
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广州地区2011年肠道病毒71型基因特征分析
目的 研究广州地区2011年手足口病病原流行特点及EV71的基因特征.方法 收集2011年1～11月广州市妇女儿童研究中心63份不同患者来源的肛拭子、咽拭子以及血液样本,选择12份EV71阳性标本进行病毒分离,扩增EV71VP1区,测序并与EV71各血清型代表株序列比对,进行进化分析.结果 2011年广州地区12个临床分离株同A、B亚型的亲缘性较远,核苷酸同源性都不足85％,氨基酸同源性不足96.5％.其同C亚型的亲缘型较近,核苷酸、氨基酸同源性超过88.5％和97.5％,尤其与C4亚型的亲缘性近,核苷酸和氨基酸的同源性分别为92.9％～ 94.6％和97.9％ ～ 98.9％.结论 2011年广州地区的12株EV71分离株都属于C4a亚型进化分支,并处于选择进化过程中.
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中蜂囊状幼虫病毒LN-QY株VP1蛋白的空间结构与B细胞抗原表位预测
目的 预测中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)LN-QY株VP1蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位.方法 以CSBV LN-QY株RNA为模板,RT-PCR扩增结构蛋白VP1基因,与pMD18-T载体连接后,转化感受态大肠杆菌DH5α,对经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对,获得LN-QY株VPl的核苷酸序列和推导的氨基酸序列,建立VPl结构蛋白的3D模型,在此基础上,应用DNAStar软件中的Protean模块综合分析结构蛋白的柔性区域,亲水性,表面可能性以及抗原指数等参数.结果 VP1结构蛋白的空间构象比较规则,其可能的B细胞抗原表位区域位于47-53,139-145,273-284氨基酸区段.结论 本研究为CSBV LN-QY株VP1蛋白表位疫苗的设计以及血清诊断试剂盒的研制奠定了理论基础.
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中蜂囊状幼虫病病毒结构蛋白的表达及其抗血清的制备
目的 原核表达中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sarbood virus,CSBV)结构蛋白,并制备其抗血清.方法 采用RT-PCR法扩增CSBV结构蛋白基因片段,克隆至pGEX-4T-1载体中,转化大肠杆菌BL21 (DE3),IPTG诱导表达.表达的重组蛋白经Gluthathione-Sepharose 4B亲和层析纯化后,免疫小鼠,制备抗血清,并进行Western blot鉴定.结果 重组表达质粒经菌落PCR鉴定证明构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约52 000,以可溶性形式表达；纯化后纯度可达95％以上；制备的抗血清可识别天然CSBV结构蛋白.结论 成功在大肠杆菌中表达了CSBV结构蛋白,并制备了其抗血清,为进一步研究囊状幼虫病病毒与宿主的相互作用及开发血清学诊断方法奠定了基础.
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轮状病毒结构蛋白VP6的原核表达及其作为检测抗原在病毒检测中的应用
目的 原核表达轮状病毒(Rotavirus,RV)结构蛋白VP6,并初步应用于以VP6为检测抗原检测RV血清抗体的ELISA方法,用于不同型RV免疫后抗体水平的检测.方法 提取TB-Chen株RV基因组RNA,采用RT-PCR法扩增VP6基因,插入表达载体pETL中,构建重组表达质粒pET-VP6,转化E coli BL21(DE3),表达rVP6.表达的rVP6经纯化后,与TB-Chen株(G2P[4]型)、Wa株(G1P[8]型)和SA11株(G3P[2]型)RV分别免疫豚鼠,制备血清抗体,以SA11株血清抗体,经Western blot 鉴定纯化的rVP6,以纯化的rVP6为检测抗原,采用ELISA法检测不同型RV免疫血清抗体.结果 重组表达质粒pET-VP6经双酶切和测序鉴定证明构建正确;表达的rVP6相对分子质量约为45 000,表达量占菌体总蛋白的34.7％:纯化的rVP6纯度达90％以上,蛋白浓度为8.304 μg／μl,可与豚鼠抗RV SA11株血清抗体发生特异性反应;以纯化的rVP6为检测抗原,可检测TB-Chen、Wa、SA11株和抗rVP6的豚鼠免疫血清抗体.结论 成功地在大肠杆菌中表达了rVP6,以具有共同组／亚组抗原特异性的rVP6作为检测抗原,可检测同一组／亚组内不同型的RV血清抗体,为研制以VP6为检测抗原检测RV感染的ELISA试剂盒奠定了基础.
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肠道病毒71型结构蛋白和非结构蛋白的分子生物学特性
肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)和柯萨奇病毒A组16型感染导致的手足口病已在世界范围内引起数次大规模暴发和流行,成为婴幼儿健康的重大威胁.对EV71结构的分子生物学特征的研究有助于为EV71疫苗的研发提供重要依据,此文就EV71的几种重要结构蛋白和非结构蛋白在病毒感染过程中作用的研究现状做一综述.
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脊髓灰质炎病毒VP1区的基因变化及疫苗衍生脊髓灰质炎病毒的流行情况
脊髓灰质炎(脊灰)病毒有3个血清型.VP1是脊灰病毒衣壳蛋白之一,它有4个抗原决定簇,可以诱导中和抗体,具有血清型特异性.脊灰病毒由于其RNA依赖性RNA聚合酶缺乏严密的自我校正功能,在自身复制过程中精确性下降,因此,会产生很多点突变,出现一些VP1区核苷酸突变热点.口服脊灰减毒活疫苗(OPV)的应用,有效地控制了脊灰,但因OPV病毒在人体肠道内复制过程中发生碱基突变,导致其神经毒力回升,引起疫苗相关麻痹型脊灰和出现疫苗衍生脊灰病毒(VDPV),使全球多次发生循环VDPV事件,对消灭脊灰带来新的挑战.为此,有关学者建议停止使用OPV,改用脊灰灭活疫苗或两种疫苗相结合的序贯免疫程序.
关键词： 脊髓灰质炎病毒疫苗 口服 疫苗衍生脊髓灰质炎病毒 病毒结构蛋白质类 突变 -
呼吸道合胞病毒反向遗传系统中辅助质粒的构建
目的 构建可用于表达呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)反向遗传操作中所需的4个功能性结构蛋白的辅助质粒.方法 利用RT-PCR扩增RSV Long株的核蛋白(N)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)及转录延长/终止抑制因子M2-1基因.将N、P、M2-1基因PCR产物双酶切后连接表达载体pCI;L基因分两段扩增并分别与pMD 19-T simple载体连接,再先后切下与pCI连接.将构建得到的4个辅助质粒测序并转染Veto细胞,通过间接免疫荧光法检测相应蛋白的表达.结果 扩增得到N、P、M2-1和L4个结构蛋白基因,相应构建的辅助质粒经序列测定,与GenBank公布的RSV Long株序列完全一致;间接免疫荧光法检测表明,N、P、M2-1能在Vero细胞中表达.结论 在分子水平构建了RSV反向遗传学研究中所需的4个辅助质粒,并成功表达出3个结构蛋白.
