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干扰素λ1在CHO细胞中的表达
目的 构建干扰素λ1表达载体PCI-dhfr-λ1和连接增强子SP163的表达载体PCI-dhfr-SP163-λ1,并在CHO(dhfr-)细胞中表达.方法 在合成的干扰素λ1基因中引入相应酶切位点,并通过融合PCR获得连接增强子SP163-λ1基因,测序正确后将该基因插入表达载体PCI-dhfr,构建重组表达载体PCI-dhfr-λ1和PCI-dhfr-SP163-λ1.将所构建的重组表达载体用脂质体法转入CHO(dhfr-)细胞,通过间接免疫荧光法和Western Blot鉴定了λ1蛋白的表达,应用细胞病变抑制法初步鉴定了λ1蛋白的抗病毒活性.结果 成功构建了干扰素λ1真核表达载体PCI-dhff-λ1和PCI-dhfr-SP163-λ1.免疫荧光结果显示分别转染了两种表达载体的CHO(dhfr-)细胞均能表达干扰素λ1蛋白,SP163增强子明显增强了干扰素λ1蛋白的表达,Western Blot结果显示转染SP163的CHO(dhfr-)细胞表达干扰素λ1蛋白.通过细胞病变抑制实验,在转染细胞48h后的细胞培养液中检测到了干扰素λ1的抗病毒活性.结论 本研究成功的在CHO(dhfr-)细胞中表达了干扰素λ1,表达的蛋白具有抗病毒活性,为进一步建立稳定表达干扰素λ1的细胞系提供了条件.
关键词： 干扰素类 细胞 培训的 增强子元件(遗传学) -
乙型肝炎病毒增强子Ⅰ/X基因启动子变异与HBV慢性感染疾病谱的关系
目的 探讨乙型肝炎病毒增强子Ⅰ (HBV Enh Ⅰ)/X基因启动子变异与乙型肝炎病毒慢性化感染疾病谱的关系.方法 随机收集275例HBV感染者的血清标本,包括慢性乙型肝炎( CHB) 100例,肝硬化(LC)74例,肝细胞癌(HCC) 101例.以入选病例的基因型为分组,采用半巢式PCR的方法扩增HBV Enh Ⅰ/X基因启动子并测序,测序结果与HBV参照序列比对,确定变异位点,使用x2检验和多变量logistic回归进行数据分析.结果 ①HBV基因分型结果:HBV B基因型患者158例(61.48％),包括CHB 70例,LC 36例,HCC 52例;HBV C基因型患者117例(38.52％),包括CHB 30例,LC 38例,HCC 49例.②HBV B基因型A1123Y变异在LC组明显高于CHB组(30.56％vs.8.58％,x2=8.533,P=0.005,A=4.693,95％ CI[1.567～14.056]),HCC组明显高于CHB组(28.85％ vs.8.58％,x2 =8.607,P=0.003,OR=4.324,95％ CI[1.544 ～ 12.109]);A1317G变异在HCC组明显高于CHB组(30.77％ vs.7.14％,x2=11.687,P=0.001,A=5.778,95％ CI[1.955～17.076]).HBV C基因型T1323C变异在HCC组明显高于CHB组(30.61％ vs.6.67％,x2 =6.318,P=0.012,A=6.176,95％ CI[1.301～29.331]).③多变量logistic回归分析发现A1317G(A =5.706,95％ CI[1.770 ～ 18.837],P =0.004)和T1323C (A =5.810,95％ CI[1.114 ～30.306],P =0.037)变异是HCC发生的独立危险因素.结论 乙型肝炎病毒增强子Ⅰ/x基因启动子突变与肝硬化、肝癌的发生有关,对变异位点的检测有助于预测肝硬化和肝癌的发生.
关键词： 肝炎病毒 乙型 增强子元件(遗传学) 突变 -
用原核增强子提高hTERT启动子介导的基因表达
目的:探讨原核增强子能否提高hTERT启动子的转录活性及对其肿瘤特异性的影响.方法:将增强子SV40、CMV分别或组合构建一系列GFP和荧光素酶报告基因载体,转染人肝癌、鼻咽癌、宫颈癌、结直肠癌细胞、成纤维肉瘤和正常成纤维细胞,流式细胞仪计数和双荧光酶分析系统检测基因的表达效率.结果:在正常成纤维细胞中这些载体均不能有效表达;而在肿瘤细胞中hTERT启动子能介导基因表达但效率不高,增强子能使基因表达增强3～26倍,特别是单独CMV增强子和SV40-CMV双增强子使荧光素酶表达提高20～26倍,是常用的CMV增强子/启动子的2～7倍;完整CMV增强子/启动子对hTERT启动子的活性影响因不同细胞而异.结论:增强子能显著增强hTERT启动子的转录活性并对其肿瘤特异性没有影响,CMV增强子或SV40-CMV双增强子/hTERT启动子是高效特异的通用调控元件,用于靶向性肿瘤基因治疗具有巨大潜力.
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前列腺特异性抗原启动子增强子调控重组质粒的构建及鉴定
目的:利用前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen,PSA)组织特异性表达的特点,克隆出其上游增强子(prostate-specific antigen enhancer,PSAE)和启动子(prostate-specific antigen promoter,PSAP)片断,并对其表达效率和组织特异性表达进行初步研究.方法:从前列腺癌组织提取基因组DNA,并采用PCR方法分别扩增PSA增强子和启动子序列;利用报告基因pEGFP-1,分别构建含不同调控序列的表达载体;脂质体介导基因转染不同细胞并观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况.结果:成功构建质粒pPSAE-EGFP、pPSAP-EGFP和pPSAE-PSAP-EGFP;转染结果显示,pPSAE-PSAP-EGFP在前列腺癌细胞PC-3中的荧光强度明显高于pPSAP-EGFP,pPSAE-EGFP同样观察到荧光表达,说明PSA增强子能显著提高PSA启动子的转录能力,并具有单独调控基因表达的能力.结论:PSA增强子和启动子的共同调控可以提高基因表达的有效性和细胞特异性,为前列腺癌的临床基因治疗提供实验依据.
关键词： 前列腺特异抗原/遗传学 基因表达 启动区(遗传学) 增强子元件(遗传学) 脂质体 质粒 转录 遗传 转染 -
人Toll样受体4基因5'远端增强子样区定位及反式作用因子鉴定
目的 对人Toll样受体4(TLR4)基因5′远端增强子样区进行定位,并鉴定参与其转录调控的反式作用因子.方法 采用PCR克隆方法,将TLR4基因5′旁侧-1337～-683序列及其缺失片段与荧光索酶报告基因载体pGL-3-promoter进行重组,构建pGL-3 -1337～- 683-promoter重组质粒及其系列缺失质粒.将构建成功的质粒转染人人白血病K562细胞,检测各质粒的荧光素酶活性,根据缺失序列对荧光素酶活性的影响来确定TLR4基因5′远端增强子样区的位置.采用转录因子数据库检索和电泳迁移率实验(EMSA)两种方法对TLR4基因5′远端增强子样区反式作用因子进行鉴定.结果 TLR4基因5′远端增强子样区位于-923 ～-679的245bp范围内,并再细化为-923 ～ -742和-721 ～-679两个功能单元.EMSA和转录因子数据库检索证实激活蛋白-1(AP1)是与-721 ～-679功能单元结合的转录因子,淋巴增强因子-1(LEF-1)可能是与该功能单元结合的另一个转录因子.结论 TLR4基因5′远端增强子样区中的一个功能单元定位在-721～ -679的43bp片段中,AP1是与该区域结合的反式作用因子,可能与LEF-1共同起到转录增强作用.
关键词： Toll样受体4 反式激活因子类 增强子元件(遗传学) 脓毒症 -
超级增强子的发现与研究进展
超级增强子(super enhancers,SEs)是一种由连续排列的调控元件串联形成的超长增强子,可以强力驱动细胞相关基因的表达,细胞中的数百个SEs控制着关键基因,决定细胞命运走向.在肿瘤发生、老年痴呆、糖尿病及许多自身免疫疾病中,均发现致病基因的表达与部分超级增强子的异常活化高度相关.现概述SEs的发现历程与基本概念,阐明超级增强子的鉴定方法,并介绍目前SEs的相关数据库.随后对SEs在胚胎干细胞、多系统恶性肿瘤、免疫相关性疾病中的研究进展进行综述,并对其在妇科疾病临床治疗中的应用前景进行展望.
关键词： 增强子元件(遗传学) 转录 遗传 调节元件 超级增强子 -
乙型肝炎病毒复制调控元件对HBV DNA疫苗诱导的免疫应答
目的 研究乙型肝炎病毒(HBV)复制调控元件增强子Ⅰ(ENH Ⅰ)及前S2(Pre-S2)抗原基因对HBV DNA疫苗诱导的免疫应答的影响.方法 采用常规聚合酶链反应(PCR)从HBV adr亚型全基因DNA序列中分别扩增HBsAg、PreS2-HBsAg、HBsAg-ENH Ⅰ和PreS2-HBsAg-ENH Ⅰ基因片段,重组到VR1012载体中,构建4种HBV DNA疫苗,转染HepG2细胞并免疫Balb/C小鼠.通过细胞免疫化学、酶联免疫分析(ELISA)、酶联免疫斑点试验(ELISPOT)等方法检测其在HepG2细胞内的表达及小鼠的体液及细胞免疫应答.结果 转染的HepG2细胞表达相应的目的蛋白,ENH Ⅰ及Pre-S2抗原基因均可增强HBV DNA疫苗转染HepG2细胞表达HBsAg;免疫接种小鼠后第2周产生抗-HBs及HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL),Pre-S2抗原基因可增强HBV DNA疫苗免疫Balb/C小鼠诱导的抗-HBs及HBsAg特异性CTL的产生,ENH Ⅰ基因对免疫应答无影响.结论 ENHⅠ及Pre-S2抗原基因均可增强HBV DNA疫苗转染HepG2细胞表达HBsAg,Pre-S2抗原基因可增强HBV DNA疫苗免疫Balb/C小鼠引起的免疫应答.
关键词： 肝炎 乙型 疫苗 DNA肝炎抗原 增强子元件(遗传学) -
嗜肺军团菌环介导等温扩增检测法的建立
目的:建立一种快速简便的嗜肺军团菌分子检测方法.方法:运用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),设计一套引物特异性识别嗜肺军团菌毒力基因--mip基因的6个特殊区域,在恒温条件下,对8株嗜肺军团菌和5株其它细菌进行检测,并与普通PCR方法进行比对,验证该方法的特异性和灵敏度.结果:所有嗜肺军团菌扩增产物均产生肉眼可见的白色沉淀,而其它不同菌株均不产生沉淀;加入荧光染料smart green后,嗜肺军团菌扩增产物均产生强绿色荧光,其它菌株呈弱荧光.与普通PCR(检出限约为57.6 pg,)比,LAMP扩增反应的灵敏度大100倍左右,基因组DNA检出限为576 fg,阳性水样检出限为8 cfu/ml.结论:LAMP技术可在简易的实验环境中快速、特异、灵敏地检测嗜肺军团菌.
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大肠癌相关基因ST13转录启动区的增强子研究
目的:探讨大肠癌相关基因ST13上游5'近端调控区(-595～+74)中增强子碱基序列.方法:设计系列缺失PCR引物,扩增ST13基因5'近端碱基序列片段,pGEMT-EASY克隆、测序,再亚克隆到pGL2系列瞬间报告载体上,等量转染SW620细胞,检测荧光酶活性.结果:系列扩增碱基序列片段669 bp、263 bp、163 bp对pGL2-Basic中的荧光素酶基因均具有较强的启动表达作用,片段101 bp、47 bp则几乎没有启动下游基因表达的作用.而101 bp片段与系列报告载体pGL2重组的分子,在其中含有启动子的报告基因表达载体中具有明显的增强作用(P＜0.01),但作用强度小于阳性对照pGL2-Control(P＜0.05).结论:位于ST13基因上游5'近端调控区的碱基序列101 bp片段(-595～-494),是一个基因转录调控增强子.
关键词： ST13基因 增强子元件(遗传学) 碱基序列 -
增强子对基因表达调控的研究进展
增强子是能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列,生物信息学的诞生为其研究带来了极大的便利.利用增强子修饰的肿瘤特异性启动子使治疗或效应基因在特定的组织、细胞或器官中表达,实现对肿瘤靶向性治疗,是一种非常有意义的基因治疗途径.
关键词： 增强子元件(遗传学) 基因表达调控 肿瘤 计算生物学 -
GHS-R基因5'侧翼区萤火虫荧光素酶报告基因增强子载体的构建和鉴定
目的 构建生长激素释放剂受体(GHS-R)基因5'侧翼区萤火虫荧光素酶报告基因增强子载体.方法 以原代培养的人生长激素(GH)腺瘤细胞基因组DNA为模板,PCR扩增GHS-R基因5'侧翼转录调控区不同长度片段(A～F)克隆,再定向克隆到pGL3-Enhancer载体中.结果 通过酶切鉴定和基因测序,证明成功地构建了pGL3-Enhancer A～F克隆重组体.结论 本载体的成功构建为体外研究GHS-R基因的转录调节提供了新的手段,为下一步在人垂体GH腺瘤中GHS-R基因启动子的干预研究奠定了基础.
关键词： 生长激素促分泌素受体 基因 报告 增强子元件(遗传学) 垂体肿瘤 -
一个新的人NFBD1启动子的鉴定与分析
目的:鉴定分析NFBD1启动子,为进一步研究其转录调控奠定基础.方法:综合应用生物信息学分析和异构体特异性的巢式RT-PCR技术鉴定NFBD1转录起始位点和转录变异体;高保真PCR方法扩增NFBD1基因启动子区域并分别定向克隆入pGL3-basic和pGL3-enhancer载体,构建NFBD1启动子荧光素酶报告基因重组体;荧光素酶分析检测启动子活性;生物信息学方法预测转录因子结合位点.结果:鉴定了一个新的NFBD1转录起始位点和转录变异体,构建了2个含有长度分别为2.5和1.2 kb的NFBD1启动子序列的荧光素酶报告基因重组体以及2个相应的含有外源增强子的NFBD1启动子荧光素酶报告基因重组体.启动子活性分析表明,该启动子区域具有启动子活性,且能被外源增强子有效驱动,是一个新的人NFBD1启动子.转录因子结合位点预测分析表明,该启动子区域缺乏典型的CCAAT盒和GC盒,但含有TATA盒以及STAT1,MZF1和MAZ等潜在的转录因子结合位点.结论:鉴定了一个新的NFBD1启动子.
关键词： NFBD1 启动区(遗传学) 增强子元件(遗传学) 转录调控
