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恶性疟原虫GLURP基因的体外扩增,克隆及序列分析
通过体外扩增,克隆恶性疟原虫海南(FCCl/HN)株GLURP基因,测定其基因序列,了解该基因的结构及在FCCl/HN株与其它分离株间的序列差异.根据GLURP基因已知序列设计合成3对引物,用PCR技术从FCCl/HN株基因组DNA中扩增3个部分序列重叠的GLURP基因片段;并分别克隆入测序用PMD-18T载体.用双脱氧链末端终止法测定GLURP基因序列,应用软件辅助分析基因结构及进行同源性比较.恶性疟原虫FCCl/HN株GLURP基因全长3711bp,编码l 236个氨基酸.FCCl/HN株与F32株GLURP基因核苷酸序列同源性为96.27%;编码氨基酸序列同源性为95.78%.本文为继续进行FCCl/HN株GLURP抗原的免疫原性和保护性研究奠定基础.
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人源miR-185通过靶向恶性疟原虫var基因减弱感染红细胞粘附作用的研究
为了探讨人源miR-185对恶性疟原虫var(pfl1955w)基因表达调控并观察感染红细胞粘附所受到的影响,体外培养293T细胞和恶性疟原虫3D7,构建双荧光素酶报告质粒和表达质粒,再分别利用Lipofectamine 2000转染293T细胞和Cytomix电转恶性疟原虫3D7,流式细胞仪检测转染效率,用双荧光素酶报告验证人源miR-185对var(pfl1955w)的dbl区域直接调控作用,Q-PCR检测var(pfl1955w)mRNA的表达,细胞粘附实验检测感染红细胞的粘附.结果显示,293T细胞和3D7的转染效率在50％以上,过表达人源miR-185可显著抑制含var(pfl1955w)dbl的荧光素酶基因的表达;在293T细胞和3D7中,人源miR-185能够减少var(pfl1955w)mRNA的含量,并使感染红细胞粘附作用下降了39％.结果表明,人源miR-185对疟原虫var(pfl1955w)基因表达有下调作用,进而影响恶性疟原虫的粘附.
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红内期恶性疟原虫转运系统研究进展
恶性疟原虫在终末分化的红细胞中发育生长,虽然可以有效的逃避宿主免疫系统的攻击,但同时也面临没有现成的转运系统可供利用等方面的挑战.事实上,红内期疟原虫发展了一套新的转运系统用于其自身蛋白在宿主红细胞中的转运.本文将综述近几年来红内期恶性疟原虫有关转运信号、蛋白分选和转运等机制方面的新进展.
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影响恶性疟原虫显微镜检查的因素
恶性疟疾现在依然是死亡率较高的一种疾病,由于其临床症状复杂多变,往往易被贻误诊断和治疗,显微镜检查仍然是目前常用的诊断方法.采用调节常规Wright's染色的缓冲液pH,结合外周血BPC的改变,分步读片的方法,发现对恶性疟原虫检出率有较大提高.
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青蒿琥酯敏感与抗性株恶性疟原虫对本芴醇、蒿甲醚、双氢青蒿素的体外敏感性
为了解抗青蒿琥酯恶性疟原虫对本芴醇、蒿甲醚、双氢青蒿素是否存在交叉抗性,本芴醇与青蒿琥酯伍用是否有增效作用,运用Rieckmann体外微量法测定.结果上述3种药物对青蒿琥酯敏感株恶性疟原虫的ID50分别为72.3、14.6及13.4 nmol/L;对抗性株的ID50依次为66.8、80.5及72.6 nmol/L.蒿甲醚、双氢青蒿琥酯对抗性株的ID50分别较敏感株高出4.5及4.4倍,本芴醇对敏感株的ID50与抗性株相似.在本芴醇与青蒿琥酯伍用中,两者对抗性株的ID50分别为44.8及39.6 nmol/L,为单用组的1/1.54(44.7/66.8)和1/2.2(39.6/85.1).结果提示抗青蒿琥酯恶性疟原虫对本芴醇无交叉抗性,青蒿琥酯与本芴醇伍用在体外测定中具有一定增效作用;抗青蒿琥酯恶性疟原虫对蒿甲醚、双氢青蒿素有明显的交叉抗性.
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PCR检测蚊体内恶性疟原虫子孢子方法的建立
为建立能检测蚊体内恶性疟原虫的聚合酶链反应技术,根据恶性疟原虫 CSP基因序列,设计合成1对引物,以Chelex-100煮沸法制备DNA模板,采用PCR方法,恶性疟原虫子孢子模板预期被扩增出245 bp的DNA条带,并将该法与蚊虫解剖镜检子孢子方法相比较. 结果经人工感染恶性疟原虫的31只大劣按蚊中14只PCR阳性,被扩增出预期大小的DNA 片段,其余17 只PCR阴性;以该技术检测野外捕捉的98只按蚊,结果均为阴性.PCR法与解剖镜检法相比较,检测结果完全符合;相当于1/10个阳性蚊子的模板即可满足PCR检测. 该检测体系灵敏、特异,对于蚊体内恶性疟原虫的检测具有一定的应用价值.
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咯萘啶分别与甲氟喹等5种药物伍用的体外抗疟作用
为比较咯萘啶单用及其分别与甲氟喹、奎宁、阿莫地喹、甲硝唑及诺氟沙星伍用的体外抗疟作用，采用Rieckmann体外微量法测定恶性疟原虫对上述6种药物单用及其伍用的敏感性。在单一用药组中，咯萘啶、甲氟喹、奎宁、阿莫地喹、甲硝唑与诺氟沙星对疟原虫的半数抑制量（ID50）分别为48.6、78.7、142.8、83.2、1 301.5及1 205.2 nmol/L。伍用中咯萘啶的ID50依次13.0、21.5、83.2、176.7及68.6 nmol/L，其它5种药物依次为61.6、344.2、80.2、564.3及489.8 nmol/L。结果提示，咯萘啶分别与奎宁、阿莫地喹、甲硝唑及诺氟沙星伍用在体外无明显增效作用；咯萘啶与甲氟喹伍用似有一定增效作用。
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恶性疟原虫多次部分换血猕猴模型的建立及在疫苗宿主保护性试验中的初步应用
本实验以多次部分换血的方法,使恶性疟原虫在猕猴体内进行短期的生长发育;并以此模型进行了抗疟疫苗保护性试验,以探索此猴模在疟原虫研究中的应用.结果显示,恶性疟原虫在多次部分换血猕猴模型中生长良好;在猴模外周血中可以见到除疟原虫配子体外的各种虫体形态;原虫生存期为13～14 d;3只实验猴高感染率分别达到8.6%、6.5%和5.4%;接种了恶性疟原虫复合多价疫苗-痘苗病毒的猕猴,在疟原虫的攻击试验中受到了保护.结果表明,通过多次部分换血的方法可建立起供短期实验的恶性疟原虫-猕猴模型;该动物模型可以适用于恶性疟原虫红内期疫苗宿主保护性试验.
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单克隆抗体M26-32靶抗原基因片断融合蛋白的表达和特性分析
用温度诱导方法获得了M26-32靶抗原基因片断表达的融合蛋白.Western -blot分析显示,该融合蛋白能与单克隆抗体M26-32反应,证实了获得的基因序列是单克隆抗体M26-32 的靶抗原基因片断.该融合蛋白能与抗间日疟原虫和抗恶性疟原虫血清反应,且抗该融合蛋白抗体和纯化融合蛋白的抗血清还能与间日疟原虫和恶性疟原虫的胞浆抗原反应,表明该靶抗原基因片断内含有间日疟原虫和恶性疟原虫的共同基因序列,且这一共同基因表达的蛋白存在于间日疟原虫和恶性疟原虫抗原之中.
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生物素探针在疟疾基因监测中的应用研究
本文报道了用光敏生物素标记恶性疟原虫特异克隆pBF2 DNA片断作探针,以斑点杂交试验检测不同疟区疟疾病人血样和蚊体内的疟原虫.探针检测蚊媒时,在20只蚊虫中有1只感染蚊虫即可被检出,也可将单个蚊虫直接压在硝酸纤维素膜上进行检测;探针检测血样亦取得良好结果,与镜检的符合率,恶性疟96.6%,正常人对照99.7%,检测的敏感度为90个原虫/μl血.表明该探针在疟防后期的监测中具有较好的实用性.
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云南省恶性疟原虫抗青蒿琥酯株的体外培养育
为建立抗青蒿琥酯恶性疟原虫虫株,将采自恶性疟病人血,用Trager法进行体外连续培养,待其正常生长后,在培养基中加不同浓度的青蒿琥酯进行培育,并在培育前及用药后不同时间用Rieckmann体外微量法测定青蒿琥酯半数抑制量(ID50).用药前及用药后68 d、129 d及停药后67 d的ID50分别为9.6、30.6、85.1及52.9 nmol/L.结果表明可用人工方法建立高度抗青蒿琥酯恶性疟原虫虫株,停药后抗性程度有所下降.
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抗恶性疟原虫重组HRP-Ⅱ单克隆抗体的制备与鉴定
采用恶性疟原虫重组富组氨酸蛋白Ⅱ(HRP-Ⅱ)融合表达蛋白免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,经3次ELISA筛选,共获得6株分泌抗恶性疟原虫重组HRP-Ⅱ单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1B11、1D10、2E7、3A3、3F9、4G5),用有限稀释法进行克隆、亚克隆及扩大培养,并用杂交瘤细胞经腹腔接种BALB/c小鼠制备腹水.6株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体 (McAb)经琼脂双扩散鉴定均为IgG1亚类,Dot-ELISA及Western blot分析显示6株McAb都能与重组HRP-Ⅱ抗原发生特异性反应,但其中只有2E7和3A3在Dipstick免疫胶体金反应中能与恶性疟原虫培养上清中的天然HRP-Ⅱ结合.
关键词： 恶性疟原虫 富组氨酸蛋白Ⅱ(HRP-Ⅱ) 单克隆抗体 -
云南东南部地区恶性疟原虫对氯喹敏感性纵向观察
目的 了解恶性疟原虫对氯喹的敏感性变化趋势,指导合理用药. 方法 采用WHO推荐的恶性疟原虫对抗疟药敏感性体内临床观察法,进行纵向监测. 结果 1981～1983年共观察恶性疟病人78例,其中对氯喹敏感(S)2例,抗性(R)76例,包括Ⅰ级抗性(RⅠ)34例、Ⅱ级抗性(RⅡ)12例、Ⅲ级抗性(RⅢ)30例,抗性率为97.44%.2005～2006年共观察32例,其中S 19例,S或RⅠ2例,抗性11例(RⅠ8例、RⅡ1例、RⅢ2例),抗性率为36.67%(11/30).两组病例对氯喹的抗性率和抗性程度差异均有统计学意义(P＜0.01). 结论 云南省南部地区恶性疟原虫对氯喹的抗性较1983年明显下降,但仍有34.38%(11/32)的抗性病例,且存在着RⅢ抗性病例,提示当前氯喹仍不能用于当地恶性疟现症病人的治疗.
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我国恶性疟原虫对青蒿素类药物的敏感性监测
目的 监测恶性疟原虫对青蒿素类药物的敏感性,为合理使用抗疟药提供参考. 方法 在研制成功涂药板和便于现场使用的培养基后,采用世界卫生组织(WHO)推荐的体外微量法,开展了恶性疟原虫对青蒿琥酯、双氢青蒿素、蒿甲醚及蒿乙醚等药物的敏感性监测. 结果 海南省乐东县监测的完全抑制疟原虫裂殖体形成的平均药浓度,1986年为0.028 pmol/μl,2002年上升至0.135 pmol/μl(P＜0.01);≥4 pmol/μl完全抑制裂殖体形成例数所占百分比,由1986年的5.5％上升至2002年为21.8％(0.025＜P＜0.01).云南省勐腊县、中—缅边境和中—老边境地区测得的完全抑制疟原虫裂殖体形成的平均药浓度,分别为6.8 nmol/L～11.1 nmol/L、32 nmol/L和46 nmol/L;≥4 pmol/μl完全抑制裂殖体形成例数所占百分比,分别为4.5％、16.7％和12.1％. 结论 海南省和云南省的中—缅边境和中—老边境地区恶性疟原虫对青蒿素类药物的敏感性在逐渐下降.
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广西恶性疟防治效果调查报告
20世纪50年代,广西47个县(市)有恶性疟流行,1956～1958年在山地丘陵、岩溶丘陵和平原不同地形区进行居民血检,恶性疟原虫占虫种的构成分别为44.4%、35.7%、 79.4%[1].20世纪60年代调查发现72个县(市)有恶性疟分布.经过反复查治,至20世纪90年代初期,恶性疟流行区范围明显缩小,恶性疟病人数大为减少,1995年全区未再查出当地感染的恶性疟病例.为了考核恶性疟的防治效果,1996年10月选择原恶性疟重度流行区的隆林、那坡、凌云、宁明、大新、田东、南丹、乐业县和轻度流行的凭祥、靖西等10个县进行调查,同时,1996～2001年在全区开展疟疾监测,观察恶性疟的流行动态.现将结果报道如下.
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间接荧光抗体试验在上海疟疾监测中的应用
以体外培养的恶性疟原虫(Plasmodium falciparum, P.f)为抗原,代替以食蟹猴疟原虫(Plasmodium cynomolgi, P.c)作为检测人体间日疟的替代抗原,用间接荧光抗体试验(Indirect luorescent antibody test, IFAT)在间日疟流行地区的人群中,进行疟疾血清学调查,其特异性与敏感性均较高,且节约人力、物力、财力[1].1987～1998年,作者以IFAT对当地人群(包括15岁以下儿童)和外来人口进行疟疾监测,以期说明应用IFAT的效果,并以此推算人群中的疟疾年感染率.
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聚合酶链反应改良技术及其用途
80年代中期出现了一种新技术,称为聚合酶链反应(Polymerase chain reation,PCR),其基本原理是在目的基因的两端人工合成两段寡核苷酸引物,在提取于水生嗜热菌中的DNA聚合酶TaqI作用下,以溶液中4种脱氧核苷酸为原料,以待测的目的基因为模板,在人工控制的变性温度、复性温度及延伸温度条件下，于短期内完成目的基因的体外扩增。PCR技术诞生之初基本的用途之一是基因诊断。近随着分子生物学及分子遗传学的进步，针对PCR系统中模板取材、引物设计的改良及PCR产物的不同运用，PCR技术及其用途被多层面、全方位地发展了，从而也显示了PCR技术在生命科学不同领域中运用的强大功能。本文首先就普通PCR技术在各环节的革新方式作一简介，再例举不同PCR改良技术在各研究领域的运用。1 针对PCR技术各环节的革新措施1.1 引物的改良 引物的设计和选择是PCR技术的重要部分，直接关系到PCR的敏感性和特异性，通常需要了解基因背景信息而设计合成引物。随着所合成引物可裁信息量的增加，引物的职能也在不断增加，除了引导脱氧核糖核酸按模板限定聚合外，还可制造出特定的结构以便PCR产物进一步用于基因片段克隆及或基因突变位点的鉴定。如对裂殖子表面蛋白1的17区基因片段（MSP1-17）的PCR扩增，其引物设计时，在正向引物上设计有SalⅠ限制性内切酶位点及起始码，反向引物上设计有BamHⅠ限制性内切酶位点及终止码，由这对引物引导合成的DNA片段属于MSP-17基因，经SalⅠ和BamHⅠ双酶切后的回收片段能与被同样双限制性内切酶切的puc18质粒载体重组［1］。此处的引物的所含的4个功能序列为终得到MSP1-17基因片段的克隆提供了便利。又如，对恶性疟原虫二氢叶酸还原酶（DHFR）基因进行多态研究时，所用PCR引物F/3′末端以个别碱基替换的机制生成了DraⅠ限制性内切酶位点，通过相应限制性内切酶切后能灵敏地检测出该164号密码子为编码异亮氨基酸多态［2］。又如，为了能直接从PCR扩增产物的指纹图鉴定恶性疟原虫多药抗性基因（Pfmdr1）片段的多态性，使DCW3引物3′末端的碱基以替换方式产生TAT序列，带该3′末端序列的引物只能扩增可与该引物产生全面互补、且含酪氨酸编码序列多态的Pmdr1基因，从而对PCR产物的电泳分析就能鉴别酪氨酸编码的存在［3］。另外，在PCR引物末端带上某种配体，以便PCR通过配体结合机制与别的系统联结，如扩增恶性疟原虫SSUrRNA基因序列中疟原虫种特异保守序列的引物5′末端结合有生物素，带有生物素的PCR产物与包被在聚乙氯烯板上的亲和素结合,结合体可在荧光素标记的寡核苷酸探针介导下与ELISA系统相接［4］。这种对引物的改良所建立的有PCR参予的系统其敏感性、特异性均高于一般PCR。
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恶性疟原虫青蒿素类药物抗性检测研究进展
疟疾是严重危害人类健康,目前由于青蒿素类药物高效,速效,低毒,并且与其他抗疟药无交叉抗药等特点而成为抗恶性疟的首选药,但随着其广泛的使用,已经有研究显示出现了疟原虫对青蒿素的抗药性.为了有效减缓青蒿素类药物抗药性的产生及传播,青蒿素类药物抗药性的研究迫在眉睫.本文就青蒿素类药物抗性检测方法做一综述.
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氯喹的抗疟作用方式及其抗药性的产生机制
氯喹（CQ）在30年代合成后即作为安全、有效而价廉的一线抗疟药物被迅速广泛使用，直至 50年代末60年代初在亚洲和南美证实了有抗性产生，非洲在70年代末亦报道了恶性疟原虫（ P. falciparum）对氯喹的抗性(CQR)。然而，氯喹作为抗疟药的作用机制研究了数十年，但仍有许多未阐明之处，而这一现状又为CQR产生机制的阐明带来困难。本综述对氯喹的抗疟机制及CQR的产生机制进行了讨论。
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恶性疟原虫对双氢青蒿素-哌喹敏感性研究进展
疟疾严重威胁人类的生命健康,双氢青蒿素-哌喹(科泰复)是世界卫生组织推荐的治疗无并发症恶性疟疾的首选药物,在减少其相关的发病率和死亡率方面发挥了不可或缺的作用.但随着其广泛使用后,已有研究表明在大湄公河次区域(GMS)恶性疟原虫对科泰复产生了抗药性.这严重威胁着全球疟疾防治和消除计划的实施.本文将针对恶性疟原虫对科泰复的抗药性研究以及抗药性的检测方法、抗性相关的分子标记做一综述.
