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模式识别受体Dectin-1与天然免疫反应
在免疫反应早期,抗原递呈细胞表达的模式识别受体通过识别内、外源配体在清除衰老宿主细胞、分子以及防御感染中发挥重要作用.新近发现的树突状细胞相关性C型植物血凝素-1(dendritic cell-associated C-type lectin-1, Dectin-1)作为β-葡聚糖的主要受体,广泛分布于单核巨噬细胞系统、树突状细胞(dendritic cell,DC)及中性粒细胞等. 本文对Dectin-1分子结构、细胞组织分布及其在诱导、调控局部和全身免疫、炎症反应中的作用进行概述.
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不同免疫状态小鼠烟曲霉感染后肺组织dectin-1 mRNA表达
目的 研究不同免疫状态小鼠感染烟曲霉后肺组织dectin-1 mRNA表达变化.探讨免疫抑制剂对dectin-1表达的影响与疾病发展的相互关系.方法 小鼠分4组:正常对照组、免疫抑制组、免疫抑制种菌组及免疫正常种菌组.采用实时荧光定量PCR法检测各组小鼠不同时间点肺组织dectin-1 mRNA表达.同时进行肺组织真菌载量测定观察疾病发展情况.结果 小鼠感染烟曲霉后第3天,免疫抑制种菌组菌载量明显高于正常种菌组.在感染后第1天及第3天,免疫抑制组小鼠肺组织dectin-1表达较正常对照组明显降低;第3天,免疫正常种菌组表达较正常对照组及免疫抑制种菌组明显升高(P<0.05).结论 对于免疫正常宿主,dectin-1可能在防御烟曲霉感染中起重要作用.环磷酰胺可降低肺组织dectin-1 mRNA表达,可能与其促发侵袭性肺曲霉病有关.
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G 试验阳性血清通过干扰 Dectin-1的内在化表达抑制 ROS 依赖性杀伤白念珠菌
目的：探讨G试验阳性血清中游离β-1，3-D-葡聚糖干扰人嗜中性粒细胞Dectin-1所介导的氧依赖性杀伤白念珠菌的机制。方法激光共聚焦显微镜检测经β-1，3-D-葡聚糖酶预处理前后的白念珠菌孢子作用下，人嗜中性粒细胞内Dectin-1表达分布的变化及与活性氧簇（ reactive oxy-gen species， ROS）的共定位关系；进一步分析Dectin-1的阻断对白念珠菌诱导下胞内ROS生成的影响；流式细胞术检测G试验阳性血清中游离的β-1，3-D-葡聚糖对白念珠菌诱导下人嗜中性粒细胞内Dectin-1和ROS表达水平的影响。结果在白念珠菌作用下，人嗜中性粒细胞内诱导性表达的Dec-tin-1主要被募集到内吞的孢子表面，且与ROS的产生具有一定的共定位关系。然而，经β-1，3-D-葡聚糖酶预处理后，胞内则未见Dectin-1的明显表达；当Dectin-1被其功能性抗体（5μg/ml）阻断后，白念珠菌诱导胞内ROS的表达与阻断前相比显著降低（LSD-t检验，P＜0．01）；经G试验阳性血清预处理的人嗜中性粒细胞中，白念珠菌诱导下胞内Dectin-1和ROS的表达水平均显著低于单一的白念珠菌作用组（LSD-t检验， P＜0．01）；线性回归分析提示G试验阳性血清中游离β-1，3-D-葡聚糖浓度分别与Dectin-1及ROS表达水平的抑制部分呈显著的剂量依存关系（ Dectin-1，R2＝0．702，P＜0．01；ROS，R2＝0．588，P＜0．01）。结论 G试验阳性血清中的游离β-1，3-D-葡聚糖可通过干扰人嗜中性粒细胞Dectin-1内在化表达的方式抑制ROS依赖性杀伤内吞的白念珠菌孢子。
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Dectin-1内在化表达介导氧依赖性方式杀伤白色念珠菌
目的 探讨Dectin-1介导人嗜中性粒细胞以氧依赖性方式杀伤调理吞噬后白色念珠菌孢子的机制.方法 在白色念珠菌孢子作用前后,流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测人嗜中性粒细胞中Dectin-1的表达率及表达部位；并通过Dectin-1阻断试验分析嗜中性粒细胞中Dectin-1的表达与胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的产生及对白色念珠菌孢子杀伤的相关性.结果 在白色念珠菌孢子刺激30或60 min后,细胞内Dectin-1的表达率明显上调(0min,8.32％；30 min,16.82％;60 min,23.88％.与0min相比,P均＜0.01),且Dectin-1与ROS在胞内的表达均被募集到吞噬的白色念珠菌孢子表面.Dectin-1的阻断分别与ROS峰值的抑制(R2=0.306,P＜0.01)及白色念珠菌杀伤率的降低(R2=0.251,P＜0.01)呈剂量依存关系.结论 Dectin-1可通过内在化的表达模式介导人嗜中性粒细胞以ROS依赖性方式杀伤调理吞噬的白色念珠菌孢子.
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小鼠Dectin-1胞外区的融合表达及其识别白念珠菌β-葡聚糖的研究
目的 克隆、表达并纯化小鼠腹腔巨噬细胞Dectin-1基因胞外区,探讨其识别并结合真菌β-葡聚糖的能力.方法 应用RT-PCR方法从小鼠腹腔巨噬细胞RNA中扩增Dectin-1基因胞外区,构建原核重组表达载体pET28-CRD,进行融合表达、纯化和复性.将融合蛋白与白念珠菌酵母相共同孵育,检测其识别、结合白念珠菌细胞壁β-葡聚糖的功能.结果 成功克隆并构建原核重组表达质粒pET28-CRD,表达并纯化了融合蛋白,该蛋白能识别、结合白念珠菌酵母细胞壁β-葡聚糖.结论 构建的原核重组表达载体能够在原核细胞内表达,表达产物有识别、结合真菌胞壁β-葡聚糖的功能,为进一步研究相应的真菌检测方法奠定了基础.
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Dectin-1在鼻窦抗真菌免疫中的作用
真菌性鼻窦炎(fungal rhinosinusitis,FR)是耳鼻咽喉头颈外科较为常见的一种特异性感染性疾病,其主要致病菌为曲霉菌,占80%以上,其他有念珠菌等.C型相关性植物血凝素-1(dendritic cell-associated C-type lectin-1,Dectin-1)是β-葡聚糖主要受体之一,而所有真菌细胞壁组成中β-葡聚糖占50%左右,从而可以推断,Dectin-1在机体抗真菌免疫反应中起着极为重要的作用.
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TLR2对曲霉感染支气管上皮细胞时Dectin-1表达的影响
目的 探讨烟曲霉感染人支气管上皮(HBE)细胞时Toll样受体2(TLR2)对树突状细胞植物血凝素-1 (Dectin-1)表达的影响.方法 建立烟曲霉感染HBE细胞模型,通过PCR、Western blot方法分别在mRNA、蛋白水平检测Dectin-1和TLR2的表达情况;沉默TLR2,复制感染模型,应用Western blot及流式细胞技术评价Dectin-1的表达变化.结果 ①烟曲霉感染后HBE细胞TLR2表达水平虽然有所升高,并在感染18h达到峰值,但与静息状态表达水平的差异无统计学意义(P＞0.05).②沉默TLR2,在烟曲霉感染HBE细胞后18 h时Dectiin1的蛋白表达受到显著抑制(P＜0.05).结论 HBE细胞静息状态下能够表达TLR2,在烟曲霉感染早期,随着时间的延长其表达有逐步增高的趋势;HBE细胞启动Dectin-1的表达可能是建立在TLR2对烟曲霉早期识别的基础上,通过下游信号通路的激活来实现的.
关键词： Dectin-1 Toll样受体2 TLR2 siRNA 烟曲霉 -
烟曲霉感染时内在化Dectin-1介导巨噬细胞自噬活化
目的 探究在烟曲霉感染时Dectin-1是否内在化表达并介导了巨噬细胞的自噬活化,初步明确其作用机制.方法 采用Western blot法和免疫荧光技术,观察经β-1,3-D-葡聚糖酶消化前后的烟曲霉孢子刺激下,RAW264.7细胞内Dectin-1与LC3Ⅱ的表达与定位,通过DCFH DA探针检测消化β-葡聚糖对活性氧(ROS)生成的影响.结果 烟曲霉孢子刺激后RAW264.7细胞的Dectin-1与LC3Ⅱ表达水平显著升高,同时二者呈斑点状聚集并共定位于烟曲霉孢子表面;消化β-葡聚糖后Dectin-1与LC3Ⅱ表达量降低,荧光斑点消失,并且ROS的生成受到抑制.结论 烟曲霉感染时Dectin-1提高自身内在化表达并诱导了巨噬细胞自噬功能的活化.
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蜡螟抗白假丝酵母菌自噬机制的初步研究
目的 探究白假丝酵母菌感染蜡螟时蜡螟的自噬相关通路蛋白的表达情况.方法 用一定量的白假丝酵母菌的活化孢子感染蜡螟,经过12 h,解剖蜡螟收集蜡螟细胞并裂解细胞,用真菌活性检测试剂盒检测孢子活性;解剖蜡螟取肠道组织并用PI染死细胞.取不同感染时间段的淋巴细胞,用裂解液裂解,离心取上清,用Western blot法检测上清液中的Dectin-1、ROS、LC3 Ⅰ/Ⅱ的表达水平.结果 活化的孢子注射至蜡螟体内后,其活性受到抑制;蜡螟的肠道细胞被定位在上面的菌丝损伤并且孢子活性受到抑制.随着蜡螟感染白假丝酵母菌时间的递增,其自身的Dectin-1、ROS、LC3 Ⅰ/Ⅱ的表达水平在不断增高且在感染24 h高.结论 白假丝酵母菌感染蜡螟后,蜡螟的淋巴细胞和肠道细胞通过升高Dectin-1、ROS、LC3 Ⅰ/Ⅱ的表达水平发挥杀伤孢子的作用.
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模式识别受体Dectin-1的免疫学研究进展
Dectin-1是C型凝集素家族中重要的受体,它能诱导自身胞内信号传导触发一系列细胞反应,在抗真菌免疫中发挥着重要的作用.该文对Dectin-1的信号传导途径、在抗微生物免疫中的作用、与其他受体的相互作用、在自身免疫及疾病中的作用、在β-葡聚糖诱导的免疫调节中的作用、潜在的临床应用予以综述.
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免疫抑制剂对巨噬细胞Dectin-1和TLR2表达的影响
目的:研究地塞米松、环磷酰胺、环孢素A和霉酚酸酯对小鼠RAW264.7巨噬细胞Dectin-1和TLR2受体表达的影响.方法:体外培养RAW264.7巨噬细胞,分别给予不同浓度的地塞米松、环磷酰胺、环孢素A和霉酚酸酯刺激细胞24 h,CCK-8检测RAW264.7细胞毒性作用,RT-PCR检测细胞Dectin-1和TLR2 mRNA表达情况,流式细胞术检测Dectin-1和TLR2蛋白水平变化.结果:不同剂量的地塞米松、环磷酰胺、环孢素A和霉酚酸酯作用细胞24 h后均对细胞表现出一定的毒性作用(P<0.05),且随着药物浓度增加毒性作用越大.地塞米松降低Dectin-1 mRNA和蛋白水平的表达,上调TLR2受体转录和翻译(P<0.05);环磷酰胺对巨噬细胞Dectin-1和TLR2的转录翻译无明显影响(P>0.05);霉酚酸酯和环孢素A能够同时下调Dectin-1、TLR2 mRNA和蛋白水平表达(P<0.05).结论:不同免疫抑制剂对模式识别受体表达的调节作用具有差异性,通过选择性调节各自靶点PRRs的表达抑制机体对各种真菌病原体的免疫识别过程,同时也能够抑制巨噬细胞的生长增殖,共同介导免疫抑制功能.
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北部湾人群Dectin-1的基因多态性与马尔尼菲青霉菌病易感性的相关性研究
目的:探讨北部湾人群C型凝集素-1(Dectin-1)基因多态性与马尔尼菲青霉菌病易感性的相关性.方法:选取北部湾地区的马尔尼菲青霉菌(PM)病患者71例为病例组,另选北部湾地区的71例体检正常者为对照组,直接测序检测rs16910526、rs16910527位点的基因型及等位基因频率,并分析其与马尔尼菲青霉菌病易感性的相关性.结果:(1)对照组和病例组之间rs16910526有三种基因型GG、GT、TT,两组之间基因型和等位基因频率比较差异不显著(P＞0.05).(2)对照组和病例组之间rs16910527有三种基因型AA、AC、CC,且病例组AC的基因型频率显著高于对照组(P＜0.05).(3)局限性、播散性PM患者rs16910526、rs16910527基因型和等位基因频率比较差异不显著(P＞0.05).(4)rs16910526、rs16910527的4种单倍型:GT、AC、AT、TT,位于同一连锁不平衡区域内,且对照组和病例组A/C的分布频率比较差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:北部湾人群Dectin-1的rs16910527位点与马尔尼菲青霉菌病易感性相关,且A/C能提高马尔尼菲青霉菌病的易感性.
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热灭活白念珠菌通过Dectin-1诱导外周血单个核细胞表达IL-12和IFN-γ
为研究Dectin-1在热灭活白念珠菌刺激外周血单个核细胞(PBMC)免疫应答中的作用.我们用不同浓度昆布多糖(Dectin-1封闭剂)与PBMC共培养1 h后,再用热灭活白念珠菌刺激PBMC 4 d;同时用不同剂量的Dectin-1激活剂酵母聚糖(zymosan)刺激PBMC 4 d,收集培养液上清,经ELISA检测IL-12和IFN-γ水平.结果发现,昆布多糖可以部分抑制热灭活白念珠菌刺激PBMC合成IL-12和IFN-γ的能力,酵母聚糖可以诱导PBMC合成IL-12和IFN-γ.因此,Dectin-1是介导热灭活白念珠菌诱导PBMC产生IL-12和IFN-γ的受体之一.
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C型凝集素样受体Dectin-1在溃疡性结肠炎肠道黏膜免疫中的作用
目的:探讨C型凝集素样受体Dectin-1及相关信号通路在溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)肠道黏膜免疫中的作用.方法:选取30例活动期UC患者和20名正常对照者,在内镜下于直肠乙状结肠交界处取4块标本进行研究,UC患者的活检标本取自内镜下可见的炎症活动部位.采用实时PCR、蛋白印迹检法及免疫组织化学法检测标本肠上皮中Deetin-1、IL-23p19和核转录因子-κB (NF-κB)途径相关蛋白激酶磷酸化的表达水平.结果:UC患者结肠黏膜中Dectin-l mRNA及其蛋白的表达水平均明显高于正常对照者(3.75±1.98比1.94±1.37,P＜0.05;2.26±1.49比1.28±0.93,P＜0.01);而UC患者结肠黏膜中IL-23p19 mRNA表达水平明显高于正常对照者(6.01 ±2.48比1.36±1.08,P＜0.01);且IκB和NF-κBp65蛋白磷酸化亦较正常对照者明显增加.UC患者的Dectin-l表达水平与其C反应蛋白的表达量呈正相关.结论:Dectin-1、炎症因子IL-23p19的表达及NF-κB通路活性在UC患者中明显增强,且UC患者的Dectin-1表达水平与其炎症程度呈正相关,提示Dectin-l可能在UC患者肠道黏膜免疫中发挥重要作用.
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非粒细胞缺乏肺曲霉病患者血清Dectin-1的检测
目的：探讨非粒细胞缺乏肺曲霉病患者血清Dectin-1检测的临床意义。方法收集非粒细胞缺乏的曲霉病患者22例（肺曲霉病组），健康体检者54例（对照组），留取血清，ELISA方法检测两组血清 Dectin-1水平。分析 Dectin-1水平与血清1，3-D葡聚糖抗原检测（G试验）、半乳甘露聚糖抗原检测（GM试验）和血白细胞计数的关系。结果肺曲霉病组血清 Dectin-1水平为（427．2±42．6）pg/mL，对照组为（280．8±39．4）pg/mL，差异有统计学意义（P＜0．05）；Dectin-1水平与血白细胞计数、G试验、GM试验无相关性。结论在非粒细胞缺乏曲霉病患者血清中，Dectin-1水平明显增高，提示Dectin-1是重要的抗曲霉免疫分子。
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非粒细胞缺乏侵袭性肺曲霉病患者血清IL-17、Dectin-1的变化
目的：探讨非粒细胞缺乏侵袭性肺曲霉病（IPA）患者血清中 IL-17、Dectin-1水平的变化及其意义。方法分别收集23例确诊及临床诊断为 IPA 的非粒细胞缺乏患者（IPA 组）、31例临床诊断为肺炎患者（肺炎组）和51例健康体检者（对照组）的资料，应用 ELISA 法测定血清 IL-17含量；同时检测 IPA 组及对照组血清 Dectin-1含量，并测定 IPA 组患者血清 G 试验、GM 试验、外周血白细胞计数和血清 CRP 的水平，随访患者预后，分析血清 IL-17与其相关性。结果IPA 组患者血清 IL-17含量明显高于对照组（P ＜0．05）；肺炎组患者血清 IL-17水平与对照组差异无统计学意义（P ＞0．05）；IPA 组血清 Dectin-1含量明显高于对照组（P ＜0．05）；IPA 组血清 IL-17与 Dectin-1水平呈正相关（r＝0．81，P ＜0．05）；IPA 组血清 IL-17、Dectin-1水平与 G 试验、GM 试验、白细胞、CRP 及患者的预后无相关性（P ＞0．05）。结论非粒细胞缺乏宿主曲霉感染时刺激 Dec-tin-1产生，激活 Th17细胞免疫反应，且两者间存在相关性。
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人C型凝集素受体dectin-1单克隆抗体的制备
目的:克隆获得并原核表达人dectin-1基因的胞外段,以其作为抗原,制备人C型凝集素受体dectin-1的单克隆抗体.方法和结果:利用RT-PCR技术从人的外周血中克隆获得人dectin-1基因,克隆到pCDNA 3.0(+)载体中,获得pCDNA3.0(+)-dectin-1质粒.将dectin-1胞外段[dectin-1(202 bp-744 bp)]克隆到pET28a(+)载体,构建原核表达质粒pET28a(+)-dectin-1(202 bp-744 bp),转到大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)中,IPTG诱导目的片段原核表达,得到高效表达的dectin-1(202 bp-744 bp),镍柱亲和层析纯化后免疫BALB/c小鼠,取抗体滴度高的小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,获得1 5株阳性杂交瘤细胞株,利用有限稀释法进行单克隆杂交瘤细胞株的筛选,获得5株单克隆细胞株.用单克隆细胞株制备小鼠腹水模型,经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化获得dectin-1的单克隆抗体.经蛋白质印迹法验证,此单克隆抗体能有效地识别人和小鼠的dectin-1蛋白.结论:成功制备获得dectin-1蛋白的特异、高效的单克隆抗体.
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Dectin-1介导人急性单核细胞白血病细胞巨噬细胞样细胞吞噬白念珠菌的作用研究
目的 探讨Dectin-1受体在源于人急性单核细胞白血病细胞(THP-1)的巨噬细胞样细胞吞噬白念珠菌中的作用.方法 以THP-1巨噬细胞样细胞为靶细胞,siRNA靶向下调Dectin-1受体表达,并与热灭活白念珠菌共培养,通过荧光显微镜计数、流式细胞仪检测其对白念珠菌的吞噬作用.应用SPSS19.0统计软件,采用单因素方差分析及t检验进行统计分析.结果 细胞转染siRNA-Dectin-1后,Dectin-1 mRNA相对表达量及蛋白表达水平明显降低(t=26.163,P＜0.001).显微镜观察转染siRNA-Dectin-1和siRNA无义片段(NC)的THP-1巨噬细胞样细胞与白念珠菌共培养1、2、4h吞噬率分别为17.5％和22.1％、18.6％和24.3％、39.2％和59.1％,两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05);吞噬≥3个菌的细胞百分比分别为2.2％比4.7％、2.5％比5.4％、5.1％比8.3％,两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05).流式细胞仪检测显示,THP-1巨噬细胞样细胞与带有荧光的白念珠菌共培养30 min、1h、2h、4h后,转染siRNA-Dectin-1组较转染siRNA-NC组平均荧光强度明显降低,分别为36.8和45.7、54.3和62.4、72.1和84.9、93.6和116.7,两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 Dectin-1受体在巨噬细胞吞噬白念珠菌的效应中发挥重要作用.
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Toll样受体在真菌性角膜炎中的调控作用
真菌性角膜炎(FK)是一种严重的致盲眼病,而Toll样受体(TLRs)在哺乳动物识别真菌的过程中发挥重要作用.大量证据表明,TLRs启动FK的天然免疫,也参与机体针对真菌的获得性免疫反应.本文探讨了TLRs与非TLRs信号通路的相互作用、TLRs信号通路的负性调节因子及TLRs在角膜真菌感染中的作用,以期为角膜真菌感染的治疗提供新的策略.
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地塞米松对 F．monophora 感染巨噬细胞模式识别受体及炎症因子表达的影响
目的：探讨F．monophora体外感染模型中地塞米松（ DEX）对模式识别受体及免疫炎症因子表达的影响。方法：实验分为四组：F．monophora与加入 DEX的巨噬细胞共培养组、F．monophora与巨噬细胞共培养组、单纯加入DEX的巨噬细胞组及巨噬细胞空白对照组。定量PCR检测各组中模式识别受体Dectin-1、TLR-2、TLR-4的表达；ELISA法测定培养上清中TNF-α的表达量。结果：F．monophora与巨噬细胞共培养组相对于空白对照组及单纯加入 DEX 组的 Dectin-1表达显著升高，在加入 DEX 后Dectin-1表达明显受到抑制（t ＝121900， P ＜0．05）；加入 DEX 的共培养组中 TLR-2表达增加，但与F．monophora和巨噬细胞共培养组相比，差异无统计学意义（ t＝3022， P＞0.05）；F．monophora感染引起TLR-4显著下调，加入DEX对TLR-4表达无影响（t＝2021，P＞0.05）。相对于F．monophora与巨噬细胞共培养组，DEX共培养组中巨噬细胞分泌TNF-α的量显著下调（t＝1514000， P＜0.05）。结论：DEX可抑制巨噬细胞Dectin-1的表达，并下调 TNF-α的表达量，进而使机体处于免疫耐受状态，但对TLR-2、TLR-4表达无明显影响。
关键词： 地塞米松 F.monophora 模式识别受体 Dectin-1 TLR-2
