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硫化氢——新的心脏保护因子
硫化氢(H2S)是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后,被发现的第三种内源性气体信号分子.哺乳动物心血管组织表达胱硫醚γ裂解酶和3巯基丙酮酸转硫酶,内源性生成H2S.内源性或适当浓度的外源性H2S可开放ATP敏感性K+通道(KATP),阻断L型Ca2+通道,调控蛋白激酶C(PKC)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)和磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)等信号转导分子,进而在心脏受缺血缺氧等刺激时,通过抗炎症、抗凋亡、抗氧化应激、促进血管生成等病生理机制,发挥重要的保护作用.H2S是一种新的拮抗心脏损伤的保护物质.
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脂肪内源性硫化氢-功能、调节与疾病
硫化氢是新的气体信号分子,在多种疾病中有重要的保护作用.脂肪组织表达胱硫醚 β合酶、胱硫醚 γ裂解酶以及 β-巯基丙酮酸转硫酶并产生释放硫化氢.脂肪组织内源性硫化氢可调节脂肪糖摄取和利用、脂肪分解、脂肪细胞分化以及脂肪内分泌,从而参与肥胖、糖尿病以及心血管疾病的调节.硫化氢可激活胰岛素受体信号、激活过氧化物增殖体活化受体 γ、调控钾离子通道参与调节过程.硫化氢可能作为能量代谢的"开关",参与代谢性疾病的调节.
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敏感硫电极法在测定心血管组织细胞及血浆胱硫醚-γ-裂解酶/硫化氢的应用
目的:建立测定微量硫化氢(Hydrogen sulfide, H2S)的敏感硫电极法.方法:根据硫化氢的理化特性,应用化学反应将溶液中物理溶解和化学形式存在的硫化氢转变成硫离子(S2-),应用敏感硫电极检测微量S2-,换算出溶液中H2S,构建了敏感硫电极检测H2S的方法.并检测了大鼠及人血浆中H2S的浓度、大鼠心血管组织中内源性H2S的含量以及大鼠心血管组织和细胞胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase, CSE)的活性.结果:敏感硫电极检测1～80 μmol/L的S2-有较好的指数相关关系,应用该方法检测到雄性和雌性大鼠血浆H2S的浓度分别为(40±4)和(41±5) μmol/L,差异无统计学意义,人类男性和女性静脉血血浆H2S浓度分别为(33±4) μmol/L 和(35±5) μmol/L,差异无统计学意义.雌、雄大鼠主动脉组织H2S的含量分别为每毫克蛋白(24±6)和(25±5) nmol,心肌组织含量分别为每毫克蛋白(19±4) 和(19±6) nmol,差异无统计学意义.采用敏感硫电极法测量主动脉组织CSE活性与传统方法测量结果差异无统计学意义,但可精确测量出血管平滑肌细胞CSE的活性.结论:敏感硫电极法可以应用于CSE/H2S信号通路的检测.
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活细胞硫化氢检测新方法
目的:建立测定活细胞释放微量硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)的简易方法.方法:在细胞培养板盖上方黏附滤膜,细胞释放的硫化氢与滤膜上的醋酸锌反应产生硫化锌,采用亚甲基蓝分光光度法测定并计算细胞释放的硫化氢的量.应用该方法分别检测了HepG2细胞和人脐静脉内皮细胞硫化氢的释放量.结果:HepG2细胞添加L-半胱氨酸以及辅酶磷酸吡哆醛后,继续培养12 h,H2S释放量为(859.39±19.12) nmol/(min·106cells)；给予胱硫醚-γ-裂解酶抑制剂炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine,PAG)后,H2S产率下降到(341.34±105.90) nmol/(min·106cells)；胱硫醚-β-合酶抑制剂间羟胺处理后,H2S产率下降到(375.05±174.50) nmol/(min·106cells)；两种酶抑制剂联合使用后H2S释放量显著抑制,为(204.47±97.14) nmol/(min·106cells).人脐静脉内皮细胞也可内源性产生H2S,HUVEC细胞H2S的释放量为(26.23±3.24) nmol/(min·106 cells),约为HepG2细胞产量的1/30.台盼蓝检测细胞活性大于95％,细胞生长状态良好,表明该方法无细胞毒作用,细胞可根据实验需要继续培养.结论:滤膜吸附法简便易行、实用可靠,可应用于活细胞释放硫化氢的测定.
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去势大鼠阴茎海绵体胱硫醚γ裂解酶与硫化氢的表达
目的 观察去势大鼠阴茎海绵体胱硫醚γ裂解酶(Cystathionine-γ-lyase,CSE)/硫化氢(Hydrogen sulphide,H2S)的变化,进一步探讨勃起功能障碍的发病机制.方法 雄性SD大鼠72只分4组:对照组、假手术组,去势组和去势炔丙基甘氨酸(PAG,CSE阻断剂)组,检测基础条件下和阿扑吗啡(Apomorphine,APO)刺激后的海绵体内压(Intracavernous pressure,ICP)及勃起率;激光共聚焦显微镜检测CSE在大鼠勃起不同时期阴茎海绵体组织中的表达,敏感硫电极测定H2S在勃起不同时期的含量.结果 与假手术组比较,去势组和去势PAG组ICP与勃起率下降(P＜0.01);且去势PAG组较去势组ICP明显下降(P＜0.01);阿朴吗啡刺激后,与假手术组比较,勃起前去势组和去势PAG组CSE蛋白表达降低(P＜0.01),勃起中去势各组较假手术组CSE蛋白表达降低(P＜0.01),且去势PAG组较去势组CSE蛋白表达明显降低(P＜0.01);勃起后各组间CSE蛋白表达变化无差异.勃起前和勃起中去势各组较假手术组H2S含量下降(P＜0.05),且勃起中去势PAG组较去势组H2S含量明显下降(P＜0.01):勃起后去势组和去势PAG组较假手术组H2S含量下降(P＜0.01).结论 去势大鼠勃起功能障碍与CSE和H2S表达下降有关.
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硫化氢及其合成酶在膀胱癌细胞株中的表达及其作用
目的：探讨正常膀胱和膀胱癌细胞株中硫化氢（H2 S）及其合成酶胱硫醚β合成酶（CBS）和胱硫醚γ裂解酶（CSE）的表达，阐明其在膀胱癌发生发展中的作用。方法：选取膀胱癌5637、T24、EJ、UM-UC-3细胞株和人膀胱永生化上皮 SV-HUC-1细胞株，Western blotting 检测 CBS 和 CSE 蛋白酶表达水平，敏感硫电极法检测 H2 S 产率；选取 EJ 细胞株进行药物处理，实验分组为，①10μmol· L－1硫酸氢钠（NaHS）组、50μmol·L－1 NaHS 组、100μmol· L－1 NaHS 组和对照组，MTT 法检测24和48 h 细胞生存率；②顺铂组（5μg·L－1）、顺铂（5μg·L－1）＋ NaHS （100μmol·L－1）组，另设无药物处理为对照组，药物处理48 h， MTT 法和流式细胞术分别检测各组细胞增殖活性和凋亡率。结果：与 SV-HUC-1细胞株比较，膀胱癌5637、T24、EJ 和 UM-UC-3细胞中 CBS 和 CSE 表达及 H2 S 产率均明显增加（P ＜0.05或 P ＜0.01）；外源性 H2 S 可促进 EJ 细胞增殖，细胞增殖活性随药物剂量增加而升高（P ＜0.05），且随着药物作用时间的延长而增加（P ＜0.05）。与顺铂组比较，顺铂联合 NaHS 组细胞增殖活性明显升高（P ＜0.05），细胞凋亡率明显下降（P ＜0.05）。结论：H2 S 及其合成酶 CBS 和 CSE 在膀胱癌细胞株中有表达且高于膀胱正常上皮细胞，H2 S 促进膀胱癌细胞增殖并降低顺铂的促细胞凋亡作用。
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CSEsiRNA对EAhy926细胞的CSE及H2S的表达影响
目的 观察胱硫醚γ裂解酶(CSE)siRNA转染人脐静脉内皮EAhy926细胞后CSE的表达及对H2S的影响.方法 体外培养EAhy926细胞,经siRNA转染以沉默CSE基因表达,分为5组进行培养:正常对照组(A组):只加入转染试剂;阴性对照组(B组):转染Neg-siRNA;转染CSEsiRNA1组(C组);转染CSEsiRNA2组(D组);转染CSEsiRNA3组(E组).采用Lipofectamine 2000介导转染EAhy926细胞,在荧光显微镜下观察细胞以检测转染效率;Western blot法检测CSE蛋白表达;收集细胞检测H2S含量.结果 观察转染效率为60%左右;A组CSE蛋白表达为(153.41±23.43),B组24 h CSE蛋白表达为(150.22±17.56),而D组24 h CSE蛋白表达降至(59.43±21.81),差异有统计学意义(P<0.01);并且A组H2S含量为(0.96±0.05),B组24 h H2S含量为(0.95±0.06),D组24 h H2S含量降至(0.54±0.08),差异有统计学意义(P<0.01).结论 CSEsiRNA能够有效地抑制EAhy926中CSE的表达,并且CSEsiRNA2沉默作用强.
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CSE/H2S通过KLF6拮抗ox-LDL诱导的内皮细胞炎症反应
目的 氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导内皮细胞炎症反应,促进单核巨噬细胞黏附是动脉粥样硬化发生的重要病理生理机制.硫化氢(H2S)是新型气体信号分子,可拮抗动脉粥样硬化并抑制内皮细胞炎症反应.本研究以Krüppel样因子(KLF)家族为切入点,探究KLF6在H2S拮抗ox-LDL诱导内皮细胞炎症反应中的调节机制.方法 以人主动脉内皮细胞(HAEC)为研究对象,观察ox-LDL对HAEC内源性胱硫醚γ裂解酶(CSE)/H2S系统及内皮细胞炎症反应的影响.实时定量PCR检测外源性给予H2S供体或过表达CSE对KLF家族及炎症因子表达的改变,进一步采用siRNA干扰KLF6观察其对内皮细胞炎症反应、单核细胞黏附的影响.同时采用染色质免疫共沉淀(ChIP)技术观察H2S供体对KLF6转录活性的影响.结果 Western blot检测及H2S荧光探针细胞内染色发现,ox-LDL可以呈时间及剂量依赖性下调CSE表达以及内皮细胞H2S的产生.实时定量PCR检测发现,ox-LDL抑制KLF6表达而上调KLF10表达,H2S处理后则上调KLF6表达,抑制KLF10表达.Western blot证实NaHS或过表达CSE均可显著上调KLF6蛋白表达.NaHS处理显著抑制ox-LDL诱导的内皮细胞炎症因子ICAM-1、VCAM-1的表达水平和单核细胞对内皮细胞的黏附,敲低KLF6则阻断NaHS的抑炎效应.ChIP结果也显示,ox-LDL促进KLF6与CXCL2、IL-8以及自噬基因ATG7启动子区的结合,NaHS处理或过表达CSE均可显著抑制KLF6的DNA结合活性.结论 ox-LDL下调内皮细胞CSE/H2S系统,H2S供体或增加内源性CSE可通过KLF6这一转录因子拮抗ox-LDL诱导的内皮细胞炎症反应.
关键词： 氧化型低密度脂蛋白 内皮细胞 胱硫醚γ裂解酶 硫化氢 Kruppel样因子6 -
心血管疾病中硫化氢/胱硫醚γ裂解酶系统与一氧化氮/一氧化氮合酶系统的相互作用研究进展
一氧化氮(NO)和硫化氢(H2S)是人体内非常重要的2种气体信号分子,两者在心血管系统生理病理进程中均发挥着重要的调节作用.随着研究的不断深入,发现NO和H2S2种气体信号之间的相互作用在心血管疾病发生发展中起着重要的介导和调节作用.该文对心血管疾病中NO和H2S两种气体信号分子系统之间的相互作用进行了总结和阐述,旨在为更深入研究心血管疾病的发病机制和研发潜在的防治心血管疾病药物提供参考.
