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人骨肉瘤组织血管特异性亲和肽的筛选和测序分析
噬菌体呈现技术是一种高效的筛选体系.本研究旨在以人骨肉瘤组织血管为靶,对噬菌体随机肽库进行淘筛,阳性克隆经过测序分析,得到保守短肽序列,为骨肉瘤的靶向化疗打下基础.
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运用噬菌体随机肽库分析系统性红斑狼疮的Sm抗原模拟表位
目的:应用噬菌体呈现技术分析系统性红斑狼疮(SLE)Sm抗原的模拟表位.方法:以鼠单克隆抗Sm抗体为筛选配基,对噬菌体随机12肽库进行3轮亲和筛选.分离10个噬菌体克隆进行Dot-ELISA和双抗体夹心ELISA鉴定.将阳性克隆进行DNA序列测定,并将混合阳性克隆与患者血清反应.结果:经3轮筛选,每轮筛选的投入与产出比逐轮升高,显示良好的富集效果.两种ELISA鉴定9个噬菌体克隆具有特异性.经过DNA测序得到6个不同的序列,推导出保守的氨基酸序列为RR/PR/IS.混合克隆诊断SLE血清的敏感性是51.72%,特异性是100.00%.结论:噬菌体呈现技术能够分析Sm抗原的模拟表位,将有利于研制表位水平的诊断试剂.
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鼻咽癌人源抗独特型单链抗体的制备及筛选
背景与目的:抗独特型抗体作为肿瘤抗原替代物可用于肿瘤治疗,这已在临床试验中得到证实.但由于目前所使用的抗独特型抗体多为鼠源性,用于人体可产生人抗鼠抗体反应,从而影响疗效.本实验拟构建噬菌体人源抗独特型抗体库,并从中筛选出能模拟鼻咽癌相关抗原的β型抗独特型单链抗体scFv(Ab2βscFv),以解决鼠源性抗独特型抗体用于临床所产生的人抗鼠抗体反应.方法:体外致敏并用EB病毒(Epstein-Barr vims,EBV)转化鼻咽癌患者的外周血单个核细胞(peripheralblood mononuclear cell,PBMC),用RT-PCR分别扩增VH和VL基因并连接成scFv基因,将scFv基因与载体fUSE5连接后,转化大肠杆菌MC1061,构建噬菌体呈现型scFv库.在用单抗FC2对文库进行4轮筛选后,用SandwichELISA和结合抑制法从中筛选出β型Ab2 scFv.结果:用单抗FC2体外致敏并经EBV转化的10例鼻咽癌患者的PBMC中,8例有鼻咽癌抗独特型抗体产生.经PCR分别扩增出5种VH(γ、μ)和7种VL(κ、λ)基因,经连接组成14种scFv基因.在与载体连接后,导入大肠杆菌MC1061,得到库容为1.5×108的初级噬菌体抗独特型抗体库.经富集筛选后,从中随机挑取270个克隆进行ELISA筛选,得到91个Ab2 scFv单克隆,阳性率为33.7%.再用结合抑制法从中初步筛选出5个可能为β型的Ab2 scFv.结论:联合应用体外致敏、EBV转化及噬菌体呈现技术构建噬菌体抗独特型抗体库,并从中筛选p型Ab2 scFv是可行的,这为进一步用Ab2β scFv制备肿瘤疫苗奠定了基础.
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结肠癌单抗MC5的噬菌体呈现型单链可变区片段的制备
背景与目的:MC5是一种特异性良好的针对人结肠癌的鼠源性单克隆抗体,而将鼠源性抗体小型化可使其用于在体研究时引起人抗鼠抗体反应的可能性大大降低.本研究的目的是制备MC5的噬菌体呈现型单链可变区片段(ScFv).方法:从分泌MC5的杂交瘤细胞分离mRNA,RTPCR分别扩增抗体的重、轻链可变区DNA(VH和VLDNA),两者经linkerDNA连接形成ScFvDNA.将ScFvDNA与噬粒载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经M13KO7辅助噬菌体感染后,获得重组噬菌体抗体ScFv.以高表达MC5结合抗原的细胞株SW480对重组噬菌体抗体ScFv进行两轮筛选后,随机挑取克隆经ELISA筛选呈现MC5ScFv的噬菌体单克隆,经竞争ELISA对阳性克隆结合抗原的能力进行鉴定.结果:VH、VL和ScFvDNA分别约为340bp、320bp和750bp.在随机筛检的25个克隆中得到10个呈现MC5ScFv的噬菌体单克隆,其中结合抗原能力强的克隆有3个.结论:用噬菌体呈现技术成功地制备了单抗MC5的ScFv,为拓展该抗体的应用范围奠定了基础.
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针对单克隆抗体MGb1的重组抗独特型抗体的筛选与鉴定
目的利用噬菌体呈现技术筛选针对抗胃癌单克隆抗体(简称单抗)MGb1的重组抗独特型抗体(抗-Id),为研制胃癌重组抗-Id瘤苗提供候选分子.方法以单克隆抗体MGb1免疫Balb/c小鼠,取脾分离mRNA.RT-PCR分别扩增抗体VL和VHcDNA,经linker DNA连接形成ScFv DNA.将ScFv DNA与载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经M13KO7感染后,获得重组噬菌体抗体ScFv文库.以单抗MGb1对文库进行4轮淘选后,随机挑取克隆经ELISA筛选呈现抗-Id ScFv的噬菌体单克隆,进而经竞争ELISA对其所属抗-Id类型进行初步鉴定.结果VL和VHcDNA分别约为320和340bp,ScFv DNA约为750bp.抗体ScFv文库经四轮淘选后,在随机筛检的50个克隆中得到18个呈现抗-Id ScFv的噬菌体单克隆.在18个克隆中,有4个呈现β或γ型抗-Id ScFv.结论经重组噬菌体抗体技术成功地筛选到了针对单抗MGb1的噬菌体呈现型抗-IdScFv,从而为进一步获得能诱导抗胃癌免疫的抗-Id ScFv奠定了基础.
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噬菌体呈现技术在肿瘤研究中的应用
随着噬菌体呈现技术的日益广泛应用,其在肿瘤的研究中也发挥了越来越大的作用.用于生物淘筛的靶标包括肿瘤相关抗原、各种肿瘤相关生长因子、受体、酶类及肿瘤细胞、肿瘤组织血管等.通过此技术也发现了一些肿瘤组织特有的分子标识物,从而为肿瘤的靶向化疗及发现新的生物分子打下了良好的基础.
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用体外致敏的鼻咽癌患者B细胞构建噬菌体抗独特型抗体库
目的: 构建噬菌体人源抗独特型抗体库.方法: 体外致敏并用EBV转化鼻咽癌患者的PBMC.用PCR分别扩增VH和VL基因并组成ScFv基因.将ScFv基因与载体连接后, 转化大肠杆菌MC1061, 构建噬菌体呈现型ScFv库.结果: 经EBV转化的10例鼻咽癌患者的PBMC中, 8例有鼻咽癌抗独特型抗体产生.经多次PCR, 扩增出5种VH(γ、μ)和7种VL(κ、λ)基因, 经连接组成14种ScFv基因.将ScFv基因与载体连接后, 导入大肠杆菌MC1061.经四环素抗性筛选, 得到库容为1.1×107的初级噬菌体抗独特型抗体库, 噬菌体DNA中全长ScFv基因的插入率为70%.结论: 用体外致敏法结合噬菌体抗体库技术, 制备人源抗独特型单链抗体(Ab2β ScFv)的策略是可行的.
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利用噬菌体呈现技术筛选单抗MG7 ScFv片段
动物源性全抗体应用于人体往往会引起人抗动物抗体反应及过敏反应[1],将其小型化可显著降低这些不良免疫反应.目前,主要依赖基因工程技术来实现动物源性抗体的小型化,其中近10年来发展和逐渐成熟起来的噬菌体呈现技术是抗体小型化的佳方式[2,3].单抗(mAb)MG7是我所研制的一种特异性较高的鼠抗人胃癌的mAb,其针对的抗原在临床病例中的阳性率达90%,因此将其用于胃癌的靶向治疗具有一定的临床前景[4].为降低MG7全抗体用于体内研究时出现的强抗原性,我们以MG7杂交瘤为材料,利用噬菌体呈现技术,制备并筛选了mAb MG7ScFv,为进一步加强该mAb的应用研究奠定了基础.
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人源性噬菌体抗体库的构建及抗HFRS病毒抗体的筛选
目的:构建人源性Fab噬菌体抗体基因库并筛选可表达与肾综合征出血热(HFRS)病毒抗原特异结合之Fab抗体的重组克隆. 方法:利用逆转录、聚合酶链反应(PCR)等技术从HFRS恢复期患者外周血淋巴细胞(PBL)中扩增出人IgG抗体重链Fd基因及κ轻链基因,将之克隆入噬菌体载体pComb3,构建人源性Fab噬菌体抗体基因库. 并利用噬菌体表面呈现技术,对此抗体库进行淘筛、富集. 结果:①成功地构建了人源性Fab抗体基因库,库容量为3×106. ②从噬菌体抗体库中淘筛得到了能表达人源性抗HFRS病毒Fab抗体的重组克隆. 结论:利用噬菌体抗体库技术,可以获得能表达人源性抗HFRS病毒抗体的重组克隆.
