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乙型肝炎病毒C基因重组逆转录病毒的构建和在真核细胞的表达
目的构建含HBV C基因的重组逆转录病毒以用于慢性乙型肝炎的免疫治疗.方法用PCR法扩增HBV的C基因片段,定向插入逆转录病毒质粒载体pLXSN中,重组质粒用脂质体转染包装细胞PT67,G418筛选抗性细胞,用抗性细胞培养上清液中的重组病毒感染NIH3T3、EL4和鼠骨髓来源的树突状细胞(DC),用PCR检测目的基因的插入,用间接免疫荧光和流式细胞仪检测目的基因的表达,基因修饰的DC免疫C57BL/6鼠观察其诱导细胞免疫的能力.结果含HBV C基因重组质粒载体经PCR、酶切和序列分析鉴定为阳性,转染PT67后经G418筛选获得抗性细胞,抗性细胞培养上清液中含有重组逆转录病毒,病毒效价达3×105 CFU/ml,感染NIH3T3和EL4细胞后PCR鉴定含目的基因,间接免疫荧光、流式细胞仪鉴定有HBcAg表达,基因修饰后的DC免疫C57BL/6鼠能诱导特异性CTL应答.结论构建的HBV C基因重组逆转录病毒可将目的基因转移至真核细胞并得到有效表达.
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重组逆转录病毒载体携带乙型肝炎病毒载体的构建与表达
目的探索利用逆转录病毒载体表达HBV载体的可能性及复制缺损性HBV能否被正确包装.方法在逆转录病毒载体中插入表达显性阴性突变体的HBV基因复制单元,制备重组逆转录病毒后分别用以感染Hep G2和2.2.15细胞,免疫荧光法检测细胞内HBV核心抗原的表达,PCR检测上清液中重组HBV颗粒.结果在包装细胞系PA317中能形成较高滴度的重组逆转录病毒,用以感染Hep G2细胞后,可检出核心抗原的表达.感染2.2.15细胞后,在培养上清液中能检测出突变型HBV颗粒.结论重组逆转录病毒能携带HBV载体在细胞内表达,并在有野生型HBV提供结构蛋白的前提下,发挥HBV载体的功能,可望用于抗HBV基因治疗.
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逆转录病毒介导DNA修复蛋白在人骨髓细胞中的表达和抗性研究
目的增强造血细胞对化疗药物的耐药表型,探讨逆转录病毒介导的基因转移效率及耐药基因的特性和在造血细胞保护性基因治疗中的作用和意义.方法应用RT-PCR从人肝组织中获得编码六氧甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)cDNA,将其克隆于pGEM-T质粒载体并构建了逆转录病毒载体G1Na-MGMT,应用脂质体Lipofect AMINE基因转移法将后者导入GP+E86和PA317病毒包装细胞,以BCNU加压筛选后的阳性克隆上清经乒乓效应后继而感染K562细胞和人造血细胞.应用PCR,Southern blot,RT-PCR,Western blot及MTT法检测人MGMT基因在细胞中的转移和表达.结果酶切鉴定及DNA测序证实其MGMT cDNA克隆的正确性,脂质体介导方法成功将其导入病毒包装细胞,BCNU加压筛选和乒乓感染法使病毒效价达8.6×106 CFU/ml,逆转录病毒载体介导的MGMT基因在K562细胞及人造血细胞中获得有效转移和表达.结论 MGMT耐药基因的成功克隆并导入骨髓造血细胞且获高效表达对开展肿瘤基因治疗的临床研究奠定了实验基础.
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逆转录病毒载体介导的HSVtk基因表达及提高重组逆转录病毒滴度的研究
目的探讨逆转录病毒载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)基因表达及提高逆转录病毒滴度的措施.方法将HSVtk基因插入逆转录病毒载体pReyTRE中,构建重组逆转录病毒载体.通过微乒乓感染法导入包装细胞PA317中,以潮霉素B筛选克隆细胞,浓缩克隆细胞上清制备重组逆转录病毒.在不同时间及不同丁酸钠浓度下,检测分析经筛选获得阳性克隆靶细胞中有无HSVtk基因的表达及如何获得高滴度的重组病毒液.结果成功构建了重组逆转录病毒载体RevTRE/tk,制备的重组病毒感染靶细胞后有HSVtk基因的表达.结论通过微乒乓感染法在包装细胞PA317培养30 h和10 mmol/L丁酸钠浓度下,经冷冻超速离心能获得携HSVtk基因的高滴度逆转录病毒颗粒,为其基因治疗的应用及研究奠定了基础.
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逆转录病毒载体介导人类G6PD基因在人红白血病细胞中的表达
目的探讨逆转录病毒载体介导人类G6PD基因在人白血病细胞中的表达.方法构建G6PD cDNA的逆转录病毒表达载体pLG6PDSN,转染包装细胞PA317,病毒上清感染人红白血病细胞K562,以PCR方法检测病毒载体是否整合于细胞基因组,定量法测定G6PD表达.t检验比较转染组与对照组间的表达差异.结果酶切鉴定表明,G6PD cDNA准确插入pLXSN相应位点,载体构建成功.转染后PCR扩增NeoR基因,证明细胞DNA整合有逆转录病毒载体.转染组与对照组酶活性测定差异有显著性(P<0.01).结论本试验所构建的重组载体pLG6PDSN为严重G6PD缺陷症的基因治疗提供了表达载体.
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抗肝癌单链双功能抗体基因逆转录病毒表达载体的构建及病毒包装细胞系的建立
人类基因治疗技术的迅速发展使越来越多针对先天性和获得性疾病的基因治疗方案进入临床试验,同时,逆转录病毒作为介导基因转染的载体也是目前基础和临床应用研究中广泛使用的基因转移方法[1-3].迄今所掌握的研究资料表明,接受逆转录病毒介导基因治疗的患者中尚未发现因病毒感染导致的不良反应.因此,我们选择改造的缺陷型逆转录病毒载体pLXSN,将分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因(sFv-TNF-α)克隆至该载体,进行病毒包装并筛选具有高滴度感染性重组病毒产生细胞系的研究.
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逆转录病毒介导HSVtk基因转导体外抗结肠癌的作用
原发性大肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一[1],传统的手术、放疗和化疗等措施对提高生存率和生活质量取得了一定的成绩[2-5],但对于中晚期癌特别是伴有局部复发和远处转移者的治疗效果仍不能令人满意[6,7].基因治疗为其提供了新的治疗途径[8-13].单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSVtk)/丙氧鸟苷(GCV)系统疗法已广泛用于胶质瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、黑素瘤及淋巴肉瘤等多种恶性肿瘤的试验性治疗研究[14-19],在基础实验和临床试验中取得了肯定疗效[ 8,20.该疗法是通过病毒载体将HSVtk基因导入肿瘤细胞,其表达产物可将无毒性的药物前体(GCV)代谢为三磷酸化产物,取代鸟苷酸掺入DNA,并抑制DNA聚合酶而杀伤肿瘤细胞[21].我们用逆转录病毒载体携带HSVtk基因转染人大肠癌LoVo细胞,研究HSVtk/GCV系统体外治疗大肠癌的作用.
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胰腺癌正反义K-ras基因片段的分离和定向克隆
目的分离及克隆胰腺癌基因组中K-ras基因片段,构建重组正反义K-ras基因逆转录病毒载体并探讨其临床意义.方法设计两对PCR引物,分别在上下游引物中引进BamH1和EcoR1位点,以胰腺癌细胞基因组DNA为模板扩增K-ras基因外显子4B及侧翼序列,并采用重组DNA技术将目的基因分别定向插入逆转录病毒载体LZRSpBMN-Z中.重组克隆通过菌液PCR和重组质粒限制性内切酶酶切鉴定.结果正反义K-ras基因外显子4B及侧翼序列成功地克隆入LZRSpBMN-Z中.结论LZRSpBMN-Z是胰腺癌反义基因治疗中新型候选载体之一.应用PCR方法获取反义K-ras基因方便可行,可用于重组反义K-ras基因逆转录病毒载体的构建.
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多效蛋白在大肠癌恶性化过程中的作用
目的了解多效蛋白在大肠癌中的表达情况,以及对大肠癌恶性化的影响.方法采用RT-PCR和免疫组化染色,对24例大肠癌组织和19例大肠癌癌旁组织的多效蛋白mRNA表达情况进行分析.结果24例大肠癌组织和19例癌旁正常组织中表达多效蛋白mRNA的各有18例.多效蛋白不但表达在肿瘤细胞,还表达在其他间质细胞中.大肠癌组织中多效蛋白的表达明显高于癌旁正常组织(34%vs.9%,P＜O.05).(94%)大肠癌多效蛋白mRNA主要由内源性多效蛋白转录,且表达在肿瘤的4个分期中,而人类内源性逆转录病毒-多效蛋白仅融合转录在Ⅲ、Ⅳ期肿瘤上(31%).结论多效蛋白尤其是人类内源性逆转录病毒-多效蛋白与大肠癌的恶性化有关.
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逆转录病毒介导人血管内皮抑制素基因对人肝癌细胞体内生长的抑制作用
目的探讨宿主细胞表达的人血管内皮抑制素(endostatin)对人肝癌细胞在体内生长的影响. 方法利用逆转录病毒载体pLncx,将人endostatin基因导入人肝癌细胞SMMC7721内建立转基因肝癌细胞株.应用PCR、免疫组化及Western blot检测人endostatin的转染、表达和分泌.血管内皮细胞增殖试验检测表达的endostatin生物学活性.同时对转染细胞株在体外及在裸鼠体内的生长情况进行观察. 结果 PCR证实,转endostatin基因的肝癌细胞基因组中存在有550 bp人特异性endostatin片段,免疫组化及Western blot印迹分析示人endostatin在转染肝癌细胞株中获得稳定表达和分泌.转染细胞表达的endostatin能显著抑制人血管内皮生长,抑制率达48%(P<0.01).与对照组相比,转染人endostatin基因的肝癌细胞在体外的生长速度无明显改变,但在接种裸鼠皮下后,肿瘤生长明显受到抑制,在22 d时,肿瘤缩小率达94.5%(P<0.01). 结论逆转录病毒介导的人endostatin基因疗法对人肝癌SMMC7721在裸鼠体内的生长有显著抑制作用.
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转染病毒白细胞介素10基因对同种小鼠心脏移植生存的影响
目的了解病毒白细胞介素10(vIL-10)基因对同种小鼠移植心脏的影响.方法用小鼠干细胞病毒(MSCVneo)逆转录病毒表达系统和vIL-10 cDNA构建MSCVneo-vIL-10重组体,在体外转导CBA(H-2K)小鼠的造血干细胞,输入经致死量照射(900 rad)的同基因CBA(H-2K)小鼠体内,8周后以vIL-10表达阳性的CBA(H-2K)小鼠(12只,实验组)作为受体,C57BL/6(H-2b)小鼠为供体,进行同种腹部异位心脏移植,以未处理、移植无病毒转染的造血干细胞(HSCs)、移植空MSCVneo转染的HSCs鼠(均为10只)为对照组.在移植后第8天,每组受体动物各杀死5只,取出移植心脏行组织病理学、CD+4与CD+8 T淋巴细胞浸润(免疫荧光抗体法)检查,IL-2、 IL-4 、IL-6、小鼠IL-10(mIL-10)、γ干扰素(IFN-γ)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、B7-1 、B7-2 mRNA表达的测定[逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法],余下的动物观察移植心脏存活时间.结果 (1)实验组移植心脏存活时间(80.0±33.3)d,其他对照组分别为(10.4±1.0),(11.6±1.1)与(11.2±1.7)d(P<0.01);(2)实验组心肌炎性细胞浸润稀少、心肌结构完整、无明显血管炎,急性排斥反应Ⅰ级,而其他对照组则出现严重的炎性细胞浸润、心肌灶性坏死、心内膜炎、血管炎和心肌出血,急性排斥反应均为Ⅲ级;(3)实验组移植物内 IL-2、IFN-γ、B7-1、和B7-2和iNOS的mRNA表达明显下调,而其他对照组显著上调(P<0.01);(4)实验组移植物内CD+4、CD+8 T淋巴细胞浸润明显减少,与其他对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 vIL-10能保护同种异体移植心脏,推迟和减轻移植心脏急性排斥反应的发生,延长移植心脏动物的生存时间.
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逆转录病毒介导的双自杀基因对K562细胞杀伤作用的实验研究
目的:观察逆转录病毒介导的双自杀基因对K562细胞的杀伤作用,探讨慢性粒细胞白血病的基因治疗方法.方法:通过脂质体将含有双自杀基因的逆转录病毒载体PWZLneoCDglytk导入包装细胞PA317,经G418筛选后大量培养产病毒的阳性克隆PA317/CD+tk细胞株,收集病毒上清,浓缩后转染K562细胞,再次经G418筛选,获得稳定表达双自杀基因的K562/CD+tk细胞株.用RT-PCR检测双自杀基因的表达.给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-flourocytosine,5-FC)和/或无环鸟苷(Ganciciovir,GCV)后MTT法测定转基因组及未转基因组K562细胞的存活率.结果:双自杀基因在K562细胞中可稳定表达,联合使用5-FC和GCV对细胞增殖的杀伤作用及旁杀伤效应高于单独使用5-FC或GCV.结论:逆转录病毒介导自杀基因可有效杀死K562细胞,双自杀基因较单一自杀基因具有更强的抗肿瘤作用.
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逆转录病毒介导的胸苷激酶基因治疗难治性卵巢癌裸鼠模型的观察
目的:运用HSV-TK/GCV系统治疗卵巢癌裸鼠移植肿瘤模型,比较不同治疗方式的疗效.方法:常规培养包装细胞PA317,PA317细胞含有携带HSV-TK基因的逆转录病毒,测定病毒滴度.在移植瘤内多点注射PA317细胞以及浓缩病毒,现察GCV治疗后的肿瘤体积变化,对移植肿瘤进行组织病理分析,PCR检测TK基因在移植肿瘤组织的转导情况.比较两种不同治疗方式的疗效.结果:常规细胞培养上清重组逆转录病毒滴度为6×104 cfu/mL;注射PA317细胞后肿瘤生长受到抑制,P<0.05;注射浓缩病毒后肿瘤生长抑制不明显,P>0.05;PCR检测证实TK基因在肿瘤组织中的转导;病理检测见中、重度治疗反应.结论:HSV-TK/GCV系统对人难治性卵巢癌裸鼠移植肿瘤有治疗作用,不同治疗方式疗效不同.
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逆转录肿瘤病毒在细胞增殖和凋亡中的双向机制
目的:研究逆转录肿瘤病毒在L615小鼠T细胞白血病增殖和凋亡中的机理.方法:615近交系小鼠20只,随机分为病毒感染组和正常对照组.感染组动物皮下接种携带小鼠逆转录病毒的L615白血病肿瘤株,检测外周血白细胞总数,观察肿瘤细胞凋亡形态特征及DNA电泳图谱,并检测肿瘤细胞中c-myc和ras基因的表达.结果:感染组在接种肿瘤细胞株后第8天外周血中的肿瘤细胞急剧增高[(0.219 9±0.109 9)×109/L],与正常对照组比较差异有极显著性(P＜0.01).肿瘤细胞中c-myc和ras基因的表达率分别为(76.00±3.231 8)%和(56±2.0138)%.在肿瘤细胞中还能观察到典型的细胞凋亡小体,凋亡率为(4.60±0.97)%,外周血淋巴细胞DNA电泳也显示典型的梯形电泳带.结论:L615小鼠逆转录肿瘤病毒在引发T细胞白血病过程中,可导致肿瘤细胞c-myc和ras基因异常表达,同时还激活宿主对肿瘤细胞的凋亡路径.
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绿色荧光蛋白逆转录病毒及其介导的视网膜色素上皮细胞基因转移研究
目的制备携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的逆转录病毒,感染原代与建株的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞,评价逆转录病毒对人RPE细胞的感染能力,为视网膜病变的基因治疗奠定基础.方法分离编码GFP的cDNA片段并插入逆转录病毒载体pLNCX,借助脂质体将重组逆转录病毒载体pLNCX-GFP转入单嗜性及双嗜性包装细胞,G418筛选抗性克隆,分离GFP表达水平高的克隆,收集含病毒颗粒的上清液感染NIH3T3及体外培养的人原代与建株的RPE细胞.结果重组逆转录病毒载体pLNCX-GFP转染各种包装细胞后,可产生GFP逆转录病毒.由双嗜性包装细胞产生的GFP逆转录病毒能够感染原代与建株的人RPE细胞,GFP基因可持续在RPE细胞内表达.结论逆转录病毒能够简便、快速、稳定将目的基因转入RPE细胞,可作为眼底病变基因治疗介导目的基因转移的重要工具.
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复制缺陷型逆转录病毒载体介导基因工程化视网膜色素上皮细胞的制备
目的制备稳定高表达生物活性神经生长因子（nerve growth factor, NGF）工程视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)细胞，拟将转基因基因治疗与视网膜移植技术结合，用于视网膜变性疾病的治疗。方法首先经亚克隆和克隆构建复制缺陷性逆转录病毒质粒重组体pLXSN-NGF, 然后经包装细胞pT67包装，获得含有NGF基因的复制缺陷性逆转录病毒重组体；NIH3T3细胞测定其滴度，然后转导培养RPE细胞；反转录聚合酶链反应和Western blot分析NGF基因在RPE细胞中的表达；PC12细胞测定表达产物的生物活性。结果复制缺陷性逆转录病毒滴度为1.2×107 cfu/ml,在转导RPE细胞及其条件培养液中，可检测出NGF mRNA和蛋白的存在，PC12细胞经转导RPE细胞条件培养液刺激长出轴突样突触。结论 RPE细胞能高效地被复制缺陷性逆转录病毒转导，高水平分泌表达了生物活性NGF, RPE细胞能成为一种理想的工程细胞。
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抗原致敏IL-27基因修饰的树突细胞活化的细胞毒性T淋巴细胞对食管癌裸鼠移植瘤生长的影响
目的 研究白细胞介素27(IL-27)基因转染树突细胞(DC)体内诱导免疫杀伤食管癌细胞的效能及其机制.方法 采用基因转染的方法建立表达IL-27基因的树突细胞(DCIL-27),构建人食管癌裸鼠移植瘤模型,皮下注射食管癌细胞抗原致敏、IL-27基因修饰的DC(DCIL-27+Ag)活化的特异细胞毒性T淋巴细胞(CTL).30只裸鼠分为PBS组、Tnaive组、DC+Tnaive组、DCIL-27+Tnaive组和DCIL-27+Ag+Tnaive组,每组6只.观察荷瘤裸鼠的肿瘤体积、瘤重和抑瘤率,流式细胞术检测移植瘤细胞的细胞周期、凋亡率及凋亡相关蛋白Fas和caspase-3的表达.结果 RT-PCR结果显示,DCIL-27细胞中有IL-27 p28和EBI3亚基基因表达,提示转染成功.DCIL-27+Ag+Tnaive组裸鼠移植瘤的体积和重量明显下降,抑瘤率为58.28％,明显大于其他各组(P＜0.01).流式细胞术分析显示,DCIL-27+Ag+Tnaive组裸鼠肿瘤组织内细胞增殖指数为23.92±1.60,显著低于其他各组,细胞凋亡率为32.78％±0.83％,明显高于其他各组(P＜0.01).DCIL-27+Ag+Tnaive组Fas和casPase-3蛋白表达水平均明显高于其他各组(P＜0.01).结论 食管癌细胞抗原致敏、IL-27基因修饰DC可活化特异性CTL,且在荷瘤小鼠体内对食管癌细胞具有明显的细胞毒作用,其机制可能是通过Fas/FasL途径抑制食管癌细胞的体内增殖并促进其凋亡.
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携带人Flt3-ligand基因逆转录病毒载体的构建及其在小鼠骨髓基质细胞中的表达
Flt3-ligand(FL)是近年来新发现的一种细胞因子,属于I型穿膜糖蛋白,具有膜结合型和分泌型两种不同的表达形式.FL与IL-3、IL-6、SCF及GM-CSF等细胞因子协同刺激造血干/祖细胞增殖,因而在造血干/祖细胞的体外培养中获得了广泛应用.FL及G-CSF协同作用能够动员造血干/祖细胞进入外周血,另外,FL还具有抗肿瘤的作用.
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人B7-1、IFN-γ双顺反子逆转录病毒载体的构建和表达
目的:制备免疫基因修饰的卵巢癌肿瘤疫苗.方法:利用口蹄疫病毒的内在性核糖体插入位点(internal ribosome entry sites,IRES),通过基因克隆技术构建人B7-1、IFN-γ双顺反子逆转录病毒载体PLXSN/B7-1 IFN-γ.结果:将PLXSN/B7-1 IFN-γ转染逆转录病毒包装细胞,包装成病毒,经滴度测定后,转导卵巢上皮癌细胞系3AO,筛选稳定表达克隆,RT-PCR和免疫流式细胞测定均可证实B7-1、IFN-γ在同一转导细胞的共表达.结论:口蹄疫病毒的IRES可提供B7-1、IFN-γ的共表达.
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逆转录病毒介导的标记基因neo导入恒河猴原代肌肉母细胞的实验研究
目的:探索逆转录病毒介导的neo基因导入恒河猴原代肌肉母细胞的转染条件和方法.方法:逆转录病毒上清在不同条件下与肌肉母细胞共同培养,观察肌肉母细胞体外增殖情况;用免疫荧光染色和流式细胞仪分析在转染过程中肌肉母细胞的表型Thy-1, NCAM和Desmin的变化;克隆PCR分析不同情况下导入基因的转染率和评价导入靶细胞标记基因的稳定性.结果:含有20%FCS,5%鸡胚液的F10细胞培养液培养肌肉来源的干细胞能获得高纯度的肌肉母细胞Thy-1 (85.0±5.0)%, NCAM (96.7±5.8)%, Desmin (95.7±2.1)%,而且这些表型不受转染的影响;持续暴露于病毒载体上清抑制肌肉母细胞的体外增殖;每天肌肉母细胞暴露于病毒载体上清 6 h,可获得(63.9±7.3)%的转染率,而且细胞体外增殖不受影响,转染后继续体外培养 2 个月,转染率不下降.结论:逆转录病毒介导的neo基因能高效率的导入肌肉母细胞,而且能稳定地整合到细胞DNA内,为在大体动物中肌肉母细胞可塑性的研究提供了工具.
