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大鼠自体嗅成鞘细胞移植治疗脊髓损伤的实验研究
目的探讨自体外周嗅成鞘细胞对脊髓损伤修复的可能作用和促进受损轴突再生的能力,为临床应用自体OECs修复脊髓损伤进行可行性研究.方法以改良的Allen法建立脊髓(T9～10节段)损伤模型后,将动物分为自体OECs悬液组和Hanks液对照组,分别移植含自体OECs的细胞悬液和Hanks液,以神经丝蛋白(NF)和神经生长因子受体蛋白(NGFR p75)免疫荧光双标染色,激光共聚焦显微镜检测移植效果;通过BBB行为学评分记录两组动物后肢恢复功能.结果镜下观察可见自体OECs悬液组动物脊髓损伤处的空洞较对照组明显缩小.而自体OECs悬液组免疫荧光标记纤维中夹有NGFRp75标记的OECs,且随标记的NF纤维走行方向排列.行为学观察可见自体OECs悬液组的大鼠后肢运动功能较对照组有显著恢复.结论自体OECs悬液多点注射有助于脊髓损伤部位神经纤维的再生.
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自体嗅黏膜移植修复大鼠脊髓损伤的实验研究
目的观察自体嗅黏膜植入大鼠脊髓后的变化及其对轴突再生的修复作用.探索临床自体嗅黏膜移植修复脊髓损伤的可能性. 方法成年雄性Wistar大鼠随机分为嗅黏膜移植组和对照组各20只.嗅黏膜移植组取鼻中隔后部的嗅黏膜组织(1mm2)植入自体大鼠脊髓颈1节段后索内的皮质脊髓束缺损处(2mm×1.5mm);对照组取鼻腔呼吸区黏膜植入脊髓同样的损伤处.4～6周处死动物,移植区冰冻水平切面,免疫荧光双标神经丝蛋白(NF)和神经生长因子受体蛋白(NGFRp75),Confocal显微镜下观察,另行免疫组织化学染色观察移植嗅黏膜与周围组织的生长情况. 结果对照组大鼠的损伤处有明显空洞,呼吸区黏膜内未见p75染色;嗅黏膜移植组可见p75标记的植入的嗅黏膜与周围组织愈合良好,空洞明显减少,被标记的嗅成鞘细胞向神经组织浸润生长,在移植物内有大量被标记的纤细的不分叉的NF纤维穿过. 结论自体嗅黏膜有可能成为临床嗅成鞘细胞修复脊髓损伤的供体.
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嗅成鞘细胞条件培养基对PC12细胞促分化作用及对分化后细胞损伤的保护作用
目的研究嗅成鞘细胞条件培养基(OECCM)对PC12细胞促分化作用及其对-OH自由基损伤分化后细胞的保护作用.方法采用原代分离培养的方法培养和纯化嗅成鞘细胞,收集其培养上清作为OECCM,然后用其培养PC12细胞,培养3 d后,进行细胞形态学观察及β-tubulin免疫细胞化学染色,同时在同一批细胞中加入100μmol/L FeSO4和50μmol/L H2O2作用20 min,再用OECCM继续培养48 h,然后进行MTT对细胞活性进行检测和存活细胞计数.结果用OECCM培养的PC12细胞长有突起,形态酷似神经元,并且β-tubulin免疫细胞化学染色呈阳性,而对照组细胞在同样培养时间里,没有明显的形态变化,β-tubulin染色呈阴性.用FeSO4和H2O2产生的-OH自由基对分化后的PC12细胞进行损伤,发现继续用OECCM培养后,反映细胞活性的A值为0.346 5±0.032,对照组0.201 8±0.034(P＜0.01);同时两组细胞存活数目的百分比分别为:实验组为(56.7±5.9)%,对照组为(23.8±7.4)%(P＜0.01).结论嗅成鞘细胞可以分泌有促PC12细胞分化作用的分子和对分化后的细胞在损伤时有保护作用的分子.
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成人、成年狗鼻腔嗅黏膜成鞘细胞的纯化、培养与鉴定
目的研究成人和成年狗嗅黏膜成鞘细胞(OECs)的分离与培养的方法,为探索在人体和大型动物模型的自体嗅黏膜OECs移植修复脊髓损伤奠定基础.方法采用差速贴壁方法分别从成人和成年比格狗的嗅黏膜分离出OECs,分别培养25 d,在第6 d、10 d和25 d进行形态学观察,后进行OECs特异标记物NGFRp75的免疫细胞化学染色,鉴定成鞘细胞.结果原代培养的成人和成年狗嗅黏膜OECs在培养10 d后明显增多,25 d的OECs成熟,具有很长的突起,其形态多为双极和三极,NGFRp75的免疫组织化学染色呈阳性.本实验条件下,狗嗅黏膜OECs的生长状态比成人的好.而未进行差速贴壁的培养细胞则几乎均呈成纤维样细胞.结论差速贴壁的方法可以分离出较为纯化的成人、成年狗鼻腔嗅黏膜OECs.
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嗅成鞘细胞的移植和迁移对脑梗死大鼠神经功能恢复的作用
目的 探讨对脑梗死大鼠移植嗅成鞘细胞(OEC)促进神经功能恢复的作用及OEC迁移规律.方法 从2.5个月龄SD大鼠嗅球取材,利用差异贴壁方法纯化OEC.移植前,用Hoechst 33342标记OEC.按双肾双夹方法制备易卒中型肾血管性高血压大鼠模型,模型制备成功后10周,电凝大脑中动脉制作大脑中动脉梗死(MCAO)模型.MCAO大鼠63只,按随机数字法随机分为梗死侧移植组、健侧移植组及双侧移植组,每组21只大鼠.于移植术前,移植术后第2和6周行大鼠神经运动功能、感觉功能检查;免疫组化法观察脑组织神经生长相关蛋白-43(GAP-43)及神经丝蛋白(NF)的表达情况.移植后6周取移植部位脑组织行冷冻切片,荧光显微镜下观察OEC迁移情况.结果 [1]梗死侧移植组、健侧移植组及双侧移植组移植前运动评分中位数评分均为2,移植后第2周分别为5、4、7,第6周分别为6,7、9;移植前感觉功能评价中位数3组均为6.67%,移植后第2周3组分别为20.00%、13.33%和33.33%,移植后第6周分别为26.67%、33.33%和46.67%.以上指标各时间点梗死侧移植组、健侧移植组比较差异无统计学意义;双侧移植组与其他两组比较差异均有统计学意义(P<0.05, P<0.01).[2]免疫组化染色显示,各时间点梗死侧移植组、健侧移植组梗死灶边缘区GAP-43、 NF阳性表达差异无统计学意义;双侧移植组与其他两组比较表达均增强,差异均有统计学意义(P<0.05, P<0.01).[3]移植OEC后6周3组均观察到OEC向梗死灶及对侧的皮质迁移.结论 脑梗死大鼠OEC健侧移植能够起到与患侧移植同样的促进神经功能恢复的作用,这种作用与PEC促进神经纤维再生及较强的自我迁移能力有关.
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大鼠嗅成鞘细胞培养不同分离方法对纯度的影响
目的 通过对多种分离方法的比较获得较为理想的嗅成鞘细胞的分离措施.方法 应用3种不同分离方法各取12份样本,对同一条件下培养10d的细胞纯度进行p75NGFR免疫细胞化学测定及统计分析;结果(1)3种不同分离方法取材平均活细胞率:传统分离法(组)为84.52%,直接挤压法(组)为97.33%,机械过滤法(组)为83.97%,直接挤压(组)法分散后的OECs活细胞数量多(P<0.05);(2)3种分离方法取材、培养所获得的OECs纯度:传统分离法(组)为67.58%,直接挤压法(组)为91.23%,机械过滤法(组)为63.51%;直接挤压法(组)培养细胞纯度高(P<0.05).结论 嗅成鞘细胞佳分离措施为直接挤压法,应用直接挤压法可收获大量嗅成鞘细胞,对OECs进一步的基础研究以及将来的临床应用奠定了基础.
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嗅成鞘细胞与神经干细胞共移植对阿尔茨海默病大鼠海马生长相关蛋白-43表达的影响
目的 探讨嗅成鞘细胞(OECs)与神经干细胞(NSCs)共移植对阿尔茨海默病(AD)大鼠海马生长相关蛋白(GAP)-43表达的影响.方法 雄性SD大鼠双侧穹隆-海马伞切断,建立AD大鼠模型.实验动物分为4组:NSCs移植组、NSCs与OECs共移植组、AD模型组、正常对照组,每组30只.从SD胎鼠(孕16～18 d)取材,在体外分别培养和共培养OECs与NSCs,并将共培养的OECs与NSCs移植于AD大鼠大脑侧脑室;观察各组大鼠行为学、宿主脑海马GAP-43和NOS阳性神经元表达的变化.结果 ①NSCs与OECs共移植组潜伏期明显缩短、通过平台次数明显增加,与NSCs移植组、AD模型组差异有统计学意义(P<0.05).②反转录聚合酶链反应(RT-PCR)与Western Blot分析,NSCs与OECs共移植组宿主脑海马GAP-43 mRNA和GAP-43蛋白的表达量高于NSCs移植组、AD模型组(P<0.05).③NSCs与OECs共移植组NOS阳性细胞(22.2±1.7)较NSCs移植组(13.1±1.9)、AD模型组(7.1±0.9)明显增多(P<0.05).结论 嗅成鞘细胞与神经干细胞共移植能促进宿主脑海马GAP-43的表达,其可能在AD大鼠中枢神经系统损伤时具有促进神经再生和修复的作用.
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嗅成鞘细胞与神经干细胞共移植对阿尔茨海默病大鼠海马生长相关蛋白-43表达的影响
目的 探讨嗅成鞘细胞(OECs)与神经干细胞(NSCs)共移植对阿尔茨海默病(AD)大鼠海马生长相关蛋白(GAP)-43表达的影响.方法 雄性SD大鼠双侧穹隆-海马伞切断,建立AD大鼠模型.实验动物分为4组:NSCs移植组、NSCs与OECs共移植组、AD模型组、正常对照组,每组30只.从SD胎鼠(孕16～18 d)取材,在体外分别培养和共培养OECs与NSCs,并将共培养的OECs与NSCs移植于AD大鼠大脑侧脑室;观察各组大鼠行为学、宿主脑海马GAP-43和NOS阳性神经元表达的变化.结果 ①NSCs与OECs共移植组潜伏期明显缩短、通过平台次数明显增加,与NSCs移植组、AD模型组差异有统计学意义(P<0.05).②反转录聚合酶链反应(RT-PCR)与Western Blot分析,NSCs与OECs共移植组宿主脑海马GAP-43 mRNA和GAP-43蛋白的表达量高于NSCs移植组、AD模型组(P<0.05).③NSCs与OECs共移植组NOS阳性细胞(22.2±1.7)较NSCs移植组(13.1±1.9)、AD模型组(7.1±0.9)明显增多(P<0.05).结论 嗅成鞘细胞与神经干细胞共移植能促进宿主脑海马GAP-43的表达,其可能在AD大鼠中枢神经系统损伤时具有促进神经再生和修复的作用.
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嗅成鞘细胞与神经干细胞共移植对阿尔茨海默病大鼠的治疗作用
目的 探讨嗅成鞘细胞(OECs)对神经干细胞(NSCs)移植治疗大鼠阿尔茨海默病(AD)的影响.方法 SD大鼠双侧海马注射Aβ1-40,建立AD大鼠模型.实验动物分为4组；NSCs移植组、NSCs与OECs移植组、AD模型组、正常对照组,每组30只.从SD胎鼠(孕16-18 d)取材,在体外分别培养和共培养OECs与NSCs,并将共培养的OECs与NSCs移植于AD大鼠大脑；观察各组大鼠行为学、移植细胞存活、迁移和分化以及宿主脑海马突触素表达的变化.结果 ①行为学测试:NSCs与OECs移植组潜伏期明显缩短、过平台次数明显增加,与NSCs移植组、AD模型组有显著性差异(P＜0.05).②根据标记跟踪,植入的NSCs乌OECs大量存活,从注射部位分别向两侧海马区及其周围皮质迁移.③免疫荧光检测:植入NSCs能在AD脑内分化为神经元、神经胶质细胞以及少量胆碱能神经元,NSCs与OECs移植组分化为神经元的分化率13.97％,与NSCs移植组8.35％差异显著(P＜0.05).④海马突触素表达:NSCs与OECs移植组IA值高,与NSCs移植组、AD模型组有显著性差异(P＜0.05).结论 嗅成鞘细胞通过改善植入神经干细胞在AD脑内的存活、迁移和分化能力以及与宿主脑的联系,提高NSCs移植治疗大鼠AD的效果.
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嗅成鞘细胞提取液对阿尔茨海默病脑移植的影响
目的 探讨嗅成鞘细胞提取液对阿尔茨海默病(AD)脑移植的影响.方法 SD大鼠双侧海马注射Aβ1-40,建立AD大鼠模型.实验动物分为四组:正常对照组、空白对照组、人工脑脊液移植组、嗅成鞘细胞OECs提取液移植组,每组10只.两移植组分别加用人工脑脊液、OECs提取液培养胆碱能神经元,并移植到AD模型大鼠.运用行为学测试、NADPH-d组化、刚果红组织学染色结合积分吸光度测定等技术,观察、比较各组AD模型大鼠移植2个月后学习记忆能力、一氧化氮合酶(NOS)阳性神经元数以及老年斑的变化.结果 ①行为学测试:人工脑脊液移植组、OECs提取液移植组大鼠达到学会标准所需训练次数(TN)、错误反应次数(EN)、潜伏期(D)、全天总反应时间(TRT)少且短于空白对照组(P＜0.05);OECs提取液移植组更为明显,与人工脑脊液移植组之间有显著差异(P＜0.05).②NADPH-d组化反应:人工脑脊液移植组、OECs提取液移植组NOS阳性神经元数较空白对照组明显增多(P＜0.05),且前两组之间有显著性差异.③刚果红染色:SP积分吸光度测定,三组间均有显著性差异(P＜0.05),OECs提取液移植组SP-IA值小.结论 OECs提取液能明显提高AD脑移植的效果.
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嗅成鞘细胞移植与甲基强的松龙联合应用对急性脊髓损伤大鼠功能恢复和Nogo-A表达的影响
呈明显下调;但其下调Nogo-A效应低于OECs+MP组.结论:OECs移植联合应用MP可明显改善大鼠急性脊髓损伤后神经功能恢复,其机制部分与下调Nogo-A表达有关;OECs移植与MP联合应用在促进SCI后神经功能恢复方面要优于单独使用OECs或MP,两者之间可能存在协同效应.
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成年大鼠嗅黏膜嗅成鞘细胞的纯化
嗅成鞘细胞(OECs)是一种独特的中枢神经胶质细胞,分布于嗅球和鼻腔嗅黏膜,可分泌多种生物活性物质,现已证明来自嗅球的OECs与来自鼻腔嗅黏膜的OECs形态学特征与免疫组织化学性质是一致的,且都具有促进中枢神经系统轴突再生的作用\[1\].目前用于移植的OECs多数取材于嗅球,由于嗅黏膜OECs在自体取材上有着方便、快捷和安全性的特点,故我们对成年大鼠鼻腔嗅黏膜的OECs进行了不同方法的纯化,经过长期摸索建立了一种简便易行、经济实惠的培养纯化方法.现将不同方法的优缺点总结如下,以期能更早的应用于临床,造福患者.
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嗅成鞘细胞在新生大鼠嗅球的分布
中枢神经系统(CNS)内的胶质微环境是导致再生失败的重要因素.嗅觉神经元(olfactory sensory neurons, OSNs)具有终生再生的能力,因此嗅觉系统成为研究神经发生和轴突生长迁移的良好模型.嗅成鞘细胞(olfactory ensheathing cells, OECs)是决定OSNs轴突能够终生再生的关键因素[1,2].周长满等[2]对成年大鼠嗅成鞘细胞的分布进行了研究.目前有关新生期OECs分布的形态学研究国内未有报道.本文研究了新生大鼠嗅成鞘细胞的分布和形态学特征,为探索发育早期OECs分布与OSNs轴突生长的关系以及为选取移植OECs的取材部位奠定了形态学基础.
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嗅成鞘细胞提取液脑室内注射对大鼠阿尔茨海默病的治疗作用
目的 探讨嗅成鞘细胞(OECs)提取液脑室内注射对大鼠阿尔茨海默病的治疗作用.方法 SD大鼠双侧海马注射Aβ1-40,建立AD大鼠模型.实验动物分为4组:正常对照组、AD模型组、人工脑脊液注射组、OECs提取液注射组,每组8只.运用行为学测试、NADPH-d组化、刚果红组织学染色结合积分吸光度测定等技术.观察、比较各组AD模型大鼠注射4周后学习记忆能力、一氧化氮合酶(NOS)阳性神经元数以及老年斑的变化.结果 ①行为学测试:OECs提取液注射组大鼠达到学会标准所需训练次数(TN)、错误反应次数(EN)、潜伏期(D)、全天总反应时间(TRT)分别为(18.82±2.64)次、(4.81±1.85)次、(5.18±4.86)s、(1236.78±97.26)s,均明显少于和短于AD模型组[(48.33±5.10)次、(10.83±2.98)次、(11.32±12.23)s、(2264.32±244.60)s(P=0.000)].②NADPH-d组化反应:OECs提取液注射组NOS阳性神经元数为(16.08±2.51)个/视野,比AD模型组(5.08±0.89)个/视野明显增多(P=0.000).③刚果红染色及其吸光度(SP-IA)测定:OECs提取液注射组为(74.39±9.14),比AD模型组(481.15±144.18)明显减少(P=0.000).④人工脑脊液注射组与AD模型组间上述指标均差异无显著性.结论 嗅成鞘细胞提取液脑室内注射对大鼠阿尔茨海默病具有明显的治疗作用.
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嗅成鞘细胞移植治疗脑梗塞大鼠的实验研究
目的探讨嗅成鞘细胞移植在皮层梗塞灶中的治疗价值.方法从成年SD大鼠嗅球取材,差异贴壁法纯化培养,移植时Hoechst 33342标记;按双肾双夹方法复制RHRSP模型,RHRSP术后10周,移植组和对照组制作MCAO模型,假手术组不电凝大脑中动脉.选择皮层梗塞10 d后的大鼠,在立体定向架上将Hoechst标记的嗅成鞘细胞植入皮层梗塞灶周围,对照治疗组则注入达乐伯克改良培养基,于移植前及移植术后第2周、第6周进行行为、触觉功能检查并从各组随机抽取7只大鼠处死,取大脑,制作冰冻切片用于荧光观察及生长相关蛋白-43及神经中丝免疫组化染色.结果移植后的OECs沿着胼胝体大量向梗塞灶及对侧皮层迁移;移植组和对照组大鼠均出现功能恢复,移植组大鼠运动、感觉功能恢复优于对照组(P＜0.05);移植组和对照组都有神经纤维向梗塞中心区生长,移植组的神经纤维数量明显多于对照组(P＜0.01);在移植后的第2周、第6周,移植组胼胝体区及梗塞灶相应的对侧皮层区出现GAP-43表达局部升高,其阳性信号值明显高于对照组(P＜0.01);梗塞灶周围再生神经纤维的数量与运动功能评分之间存在正相关(r=0.93),P＜0.01.结论OECs植入体内可以长时间存活,并有自我迁移能力;OECs移植具有明显促进脑梗塞后神经纤维再生和功能恢复的作用,胼胝体及梗塞灶对侧层的轴突再生也是移植组大鼠功能恢复的可能机制.
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嗅成鞘细胞提取液对胆碱能神经元移植治疗大鼠阿尔茨海默病的影响
目的 探讨嗅成鞘细胞(OECs)提取液对胆碱能神经元移植治疗阿尔茨海默病(AD)大鼠的影响.方法 SD大鼠双侧海马注射Aβ-40,建立AD大鼠模型.实验动物32只分为4组:正常对照组、空白对照组、人工脑脊液移植组、OECs提取液移植组,每组8只.运用行为学测试、NADPH-d组化、刚果红组织学染色结合积分吸光度测定等技术,观察、比较各组AD模型大鼠移植2个月后学习记忆能力、一氧化氮合酶(NOS)阳性神经元数以及老年斑的变化.结果 ①行为学测试:人工脑脊液移植组、OECs提取液移植组大鼠达到学会标准所需训练次数(TN),错误反应次数(EN),全天总反应时间(TRT)少和潜伏期(D),短于空白对照组(P<0.05);以OECs提取液移植组更为显著(P<0.05).②NADPH-d组化反应:人工脑脊液移植组、OECs提取液移植组NOS阳性神经元数较空白对照组明显增多(P<0.05),且前两组之间差异有显著性(P<0.05).③刚果红染色:移植组及空白对照组三组间差异均有显著性(P<0.05),以OECs提取液移植组SP-IA值小.结论 嗅成鞘细胞提取液能明显提高胆碱能神经元移植治疗阿尔茨海默病大鼠的效果.
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新生大鼠嗅球纤维层组织移植促进受损视网膜节细胞存活和再生的研究
许多研究表明,改善局部微环境可促进受损中枢神经的再生.本研究对SD大鼠进行眶内视神经切断术作为中枢神经损伤模型,将新生鼠嗅球纤维层组织植入视神经断端,动物术后分别存活1、2、3、4周取眼球作水平冰冻切片,用Nissl染色和生长相关蛋白(GAP-43)免疫组化方法观察视网膜节细胞的存活数量和蛋白的变化;并观察移植物中嗅成鞘细胞的存活状况.结果显示:植入嗅组织后可见视网膜节细胞的存活数量和存活率明显增加(P＜0.05);视网膜节细胞层GAP-43持续表达;嗅成鞘细胞可以在视神经断端存活.本研究结果提示,移植嗅球纤维层有促进视网膜节细胞的存活和再生的作用.
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嗅成鞘细胞海马内注射对阿尔茨海默病模型大鼠的作用
目的 探讨嗅成鞘细胞(OECs)海马内注射对阿尔茨海默病模型大鼠的作用.方法 SD大鼠双侧海马注射Aβ1-40,建立AD大鼠模型.实验动物分为4组:健康对照组、AD模型组、OECs移植组、人工脑脊液注射组,每组10只.体外原代培养嗅成鞘细胞并将其移植至AD大鼠海马内.运用行为学测试、组织化学、原位杂交,结合图像分析以及电镜等技术,观察、比较各组大鼠学习记忆能力、海马CA1区线粒体细胞色素氧化酶(COX)活性、细胞色素氧化酶Ⅱ型亚基(COⅡ)mRNA表达、一氧化氮合酶(NOS)阳性神经元数,以及CA1区神经元线粒体超微结构等指标的变化.结果 与健康对照组比较,AD模型组大鼠空间学习记忆能力、海马CA1区线粒体COX活性及COⅡmRNA表达、NOS阳性神经元数明显降低或减少(P<0.05),线粒体数量减少、结构不清、肿胀、空泡样变、嵴断裂;OECs移植明显上调上述指标(P<0.05),并对神经元线粒体超微结构有明显的保护作用.结论 OECs移植通过改善AD大鼠学习记忆能力、提高海马COX活性和COⅡmRNA、NOS阳性神经元表达以及保护神经元线粒体等作用,对大鼠阿尔茨海默病具有明显的治疗作用.
