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人端粒酶逆转录酶启动子调控下胞嘧啶脱氨酶-胸苷激酶融合基因治疗卵巢癌的体外研究
目的探讨人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控下的融合双自杀基因--胞嘧啶脱氨酶-胸苷激酶/5-氟胞嘧啶+更昔洛韦(CD-TK/5-FC+GCV)系统对人卵巢癌细胞及正常细胞的体外杀伤作用.方法应用脂质体转染法将hTERT核心启动子报告质粒pBTdel-279转染人卵巢癌细胞系3AO、正常卵巢上皮细胞(NOEC)和人胚肺成纤维细胞株HELF,用荧光素酶分析检测hTERT启动子活性;应用RT-PCR技术检测hTERT mRNA的表达水平.应用基因克隆技术分别构建hTERT启动子和巨细胞病毒(CMV)启动子调控下的 CD-TK基因真核表达载体pBTdel-279-CD-TK和pcDNA3-CD-TK,以及hTERT启动子调控下的TK基因表达载体pBTdel-279-TK.用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和流式细胞术检测pBTdel-279-CD-TK/5-FC+GCV系统和pcDNA3-CD-TK/5-FC+GCV系统对上述3 种细胞不同的杀伤作用;应用RT-PCR技术检测pBTdel-279-CD-TK 和 pcDNA3-CD-TK转染前后3AO和NOEC细胞中CD和TK基因的表达情况.用扫描电子显微镜观察pBTdel-279-CD-TK/5-FC+GCV作用后3AO细胞的形态变化.结果卵巢癌细胞系3AO中hTERT启动子活性增高,为24.1%, RT-PCR 检测hTERT mRNA为阳性,而在正常细胞NOEC和HELF中,hTERT启动子活性仅为0.3%和0.7%,hTERT mRNA为阴性.与pBTdel-279-TK/GCV系统作用相比,pBTdel-279-CD-TK/5-FC+GCV系统对端粒酶阳性的卵巢癌细胞系3AO的杀伤作用显著增强,5-FC 浓度为2 ol/L、GCV 浓度为10 mg/L时,细胞杀伤率为74.5%,而对端粒酶阴性的正常细胞NOEC和HELF则无杀伤作用;hTERT启动子系统诱导卵巢癌细胞系的细胞凋亡效能与CMV启动子系统相似,差异无显著性 (P>0.05). pcDNA3-CD-TK转染后,3种细胞中均可检测到CD和TK基因;而pBTdel-279-TK转染后,3种细胞中只有3AO可检测到CD和TK基因,正常细胞中则呈阴性;扫描电子显微镜观察pBTdel-279-CD-TK/5-FC+GCV系统所致3AO细胞的死亡形式以细胞凋亡为主.结论 hTERT启动子调控下的融合双自杀基因治疗是一种高效、靶向的卵巢癌基因治疗策略.
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胞嘧啶脱氨酶基因联合5-氟胞嘧啶对卵巢癌裸鼠移植瘤的抑制作用
目的了解胞嘧啶脱氨酶(CD)基因联合5-氟胞嘧啶(5-FC)对卵巢癌裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用.方法应用胚肾293细胞扩增整合有CD基因的复制缺陷的腺病毒,并将其分离、提纯.以卵巢癌裸鼠模型作为研究对象.实验组(5只):将整合有CD基因的复制缺陷的腺病毒0.1 ml[1×1010菌斑形成单位(pfu)/ml]注入瘤体内,隔日1次,共3次;同时将5-FC按每次400 mg/kg注入裸鼠腹腔内,每日2次,共7 d.对照组(5只):以同样方法将同体积生理盐水注入裸鼠体内.观察两组裸鼠的肿瘤生长速度及倍增时间.结果 (1)整合有CD基因的腺病毒滴度为1.07×1010 pfu/ml.(2)实验组裸鼠肿瘤生长明显受抑制,肿瘤体积由9 mm3增加到855 mm3,而对照组肿瘤体积由7 mm3增加到2 014 mm3,两组比较,差异有显著性( P <0.05),这种显著性差异在用药结束后约20 d才表现出来,并维持约30 d.(3)实验组与对照组肿瘤倍增时间分别为(8.1±0.7) d和(6.4±0.7) d,两组比较,差异有显著性( P <0.05).结论应用CD基因联合5-FC对卵巢癌裸鼠移植瘤具有良好的抑制作用.
