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端粒酶转录酶及其调节相关蛋白与增殖细胞核抗原在卵巢上皮性肿瘤中的表达及临床意义
目的探讨端粒酶转录酶(hTERT)及端粒酶调节相关蛋白(TRAP)与增殖细胞核抗原(PCNA)在卵巢上皮性肿瘤中的表达和临床意义.方法收集106例卵巢上皮性肿瘤(恶性54例,交界性33例,良性19例)的临床资料,行hTERT、TRAP和PCNA 3种抗体的免疫组织化学标记链霉素卵白素生物素(LSAB)法染色.对87例恶性和交界性患者进行了随访,45例获结果,随访时间为2～60个月.结果 hTERT蛋白的表达在良性(4/19)和交界性(90.9%,30/33)以及良性和恶性(94.4%,51/54)间的差异均有显著性(P均<0.001),TRAP蛋白的表达在良性(4/15)和恶性(77.8%,28/36)间的差异有显著性(P<0.001);hTERT和TRAP蛋白的表达在卵巢癌Ⅰ、Ⅱ期和Ⅲ、Ⅳ期两组病例中的差异均无显著性(P>0.05,P>0.3).PCNA的表达在良性(6.9±5.9)%和交界性(26.4±17.8)%、良性和恶性(51.8±22.1)%以及交界性和恶性间的差异均有显著性(P<0.01,P<0.001,P<0.05).33例交界性患者全部存活,54例恶性患者中35例(64.8%)有转移(包括5例淋巴结转移),4例(7.4%)死亡.结论 hTERT和TRAP蛋白的表达与卵巢上皮性肿瘤的良恶性有关, 但与其临床分期无关;hTERT和TRAP蛋白的表达相似,推测TRAP可能是一个新发现的肿瘤相关基因.端粒酶活性与PCNA呈正相关.
关键词： 卵巢肿瘤 端粒 末端转移酶 RNA指导的DNA聚合酶 增殖细胞核抗原 -
siRNA靶向沉默hTERT基因对人胰腺癌Capan-2细胞增殖、凋亡和周期的影响
目的 研究hTERT-siRNA对人胰腺癌Capan-2细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响.方法 利用RNAi技术靶向沉默Capan-2的hTERT基因表达,应用细胞直接计数法和流式细胞术(FCM)检测Capan-2细胞的增殖、凋亡和细胞周期的变化.结果 在hTERT-siRNA的使用浓度为50 nm、Lipo转染浓度为3 μl/2 ml转染体积和hTERT沉默效率为100%的条件下,转染hTERT-siRNA 24 h后,细胞生长已明显减慢,抑制细胞增殖率为26.39%(P＜0.05),第2、3、5、7天抑制细胞增殖率分别为46.77%、70.61%、84.71%和85.99%(P＜0.001).随着转染细胞按常规培养时间的延长,早期凋亡细胞明显增多(P＜0.001),以24 h后更明显;活性细胞明显减少(P＜0.001),而损伤细胞明显增多(P＜0.001),以6 h后明显;死亡细胞明显增多(P＜0.001),以24 h后更明显.siRNA组与阴性对照组和Lipo对照组均有明显差异(P＜0.001).G0～G1期细胞明显增多(P＜0.01),S期细胞明显减少(P＜0.01),以24 h后明显;G2～M期细胞明显减少(P＜0.01),以48 h后明显;晚期凋亡细胞增多(P＜0.05),以48 h后明显.结论 hTERT-siRNA可抑制人胰腺癌Capan-2细胞生长,使较多的细胞停留在G0～G1期,而进入G2～M期和S期的细胞减少,可促进细胞凋亡.
关键词： 胰腺肿瘤 Capan-2细胞株 RNA指导的DNA聚合酶 RNA 小分子干扰 细胞增殖 细胞凋亡 细胞周期 -
端粒酶逆转录酶在五羟色胺诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖过程中的作用
目的 研究端粒酶逆转录酶(TERT)在五羟色胺(5-HT)诱导的肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖过程中的作用.方法 组织块法培养大鼠PASMCs.大鼠PASMCs增殖实验分别检测5-HT和反义TERT寡核苷酸对大鼠PASMCs增殖的影响.激光共聚焦显微镜检测异硫氰酸荧光素(FITC)标记的反义TERT寡核苷酸,明确反义TERT寡核苷酸在PASMCs中的分布.原位杂交实验和免疫组化实验检测反义TERT寡核苷酸和5-HT对PASMCs中TERT的mRNA和蛋白表达的影响.结果 5-HT诱导大鼠PASMCs增殖实验证实5-HT在10-9～10-5mol/L的剂量范围内,5-HT对大鼠PASMCs的促增殖作用具有剂量依赖性.原位杂交实验和免疫组化实验证实5-HT可能直接或间接促进TERT的mRNA和蛋白表达.FITC标记的反义TERT寡核苷酸在激光共聚焦显微镜下显示,反义TERT寡核苷酸主要分布于PASMCs胞质.反义TERT寡核苷酸对大鼠PASMCs增殖抑制实验证实反义TERT寡核苷酸可以抑制5-HT诱导的大鼠PASMCs增殖,而正义TERT寡核苷酸对5-HT诱导的大鼠PASMCs增殖没有作用.原位杂交实验和免疫组化实验证实反义TERT寡核苷酸可以抑制5-HT引起的TERT的mRNA和蛋白表达增强.结论 研究结果提示,TERT在5-HT诱导的PASMCs增殖过程中发挥重要作用,通过反义技术抑制TERT表达为肺动脉高压的基因治疗提供了理论基础.
关键词： 肺动脉 RNA指导的DNA聚合酶 寡核苷酸类 血清素 -
纳米羟基磷灰石介导靶向hTERT的RNA干扰可有效抑制人肺癌A549细胞增殖
目的 探讨纳米羟基磷灰石(nHAP)介导靶向端粒酶逆转录酶(hTERT)的RNA干扰对人肺癌A549细胞的影响.方法 采用均相沉淀法制备nHAP.分为nHAP-PLL组、脂质体组、nHAP组及对照组,分别配制转染复合物并转染人肺癌A549细胞.MTT法测定细胞生长活力;Western Blot检测hTERT蛋白表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 nHAP-PLL组、脂质体组与nHAP组的A549细胞增殖受到抑制,较对照组差异有统计学意义(P<0.05);nHAP-PLL组抑制细胞增殖较脂质体组及nHAP组明显,差异均有统计学意义(P<0.05).各组的hTERT蛋白表达的变化趋势与人肺癌A549细胞的增殖情况一致.流式细胞仪检测nHAP-PLL组、脂质体组及nHAP组均有不同程度的细胞凋亡,凋亡率与对照组差异有统计学意义,P<0.05.结论 nHAP本身能诱导人肺癌A549细胞凋亡,经PLL修饰后能有效地结合保护DNA并介导人肺癌A549细胞的基因转染,介导靶向hTERT的RNA干扰可有效抑制人肺癌A549细胞增殖.
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外源hTERT基因对人肝细胞增殖及CYP45019A1表达的影响
目的 探讨外源hTERT基因对体外培养的人肝细胞增殖及细胞色素P450 19A1(CYP450 19A1)表达的影响.方法 将携带有hTERT片段的重组逆转录病毒载体pLNCX2-hTERT转染至体外培养的人肝细胞；四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法观察hTERT表达对细胞增殖的影响；通过采用Western blot法检测CYP450 19A1的表达情况.结果 成功将带有hTERT逆转录病毒载体pLNCX2-hTERT转染至人肝细胞,转染后的肝细胞组较未转染组增殖明显,转染前后肝细胞在55kU处均可见有CYP450 19A1蛋白表达.结论 外源hTERT基因可促进肝细胞增殖；转染组与未转染组肝细胞均可表达CYP450 19A1.
关键词： 基因 RNA指导的DNA聚合酶 肝细胞 增殖 细胞色素P450酶系19A1 -
外源hTERT基因对大鼠肝细胞增殖的影响
目的:构建含目的基因人端粒逆转录酶(hTERT)重组逆转录病毒载体pLNCX2-hTERT,体外感染原代大鼠肝细胞,观察对大鼠肝细胞增殖的影响.方法:将hTERT插入逆转录病毒载体pLNCX2获得重组逆转录病毒载体pLNCX2-hTERT,转染包装细胞293T后可获得表达hTERT逆转录病毒,感染体外培养的原代大鼠肝细胞,通过RT-PCR及western-blot检测基因在细胞中的表达情况.结果:重组载体pLNCX2-hTERT经双酶切鉴定及序列测定,证实构建正确.转染原代大鼠肝细胞后能明显促进其增殖.结论:体外转染原代大鼠肝细胞后能有效促进其增殖,这为进一步解决人工肝细胞来源问题奠定了实验基础.
关键词： RNA指导的DNA聚合酶 肝细胞 肝 人工 细胞增殖 -
一种新乙型肝炎病毒表型耐药分析方法的建立
目的 建立一种新的、简便的HBV表型耐药分析方法,通过置换完整的反转录酶(RT)区研究药物敏感性.方法 首先全基因扩增未经核苷(酸)类似物治疗患者的HBV DNA,构建含HBV野毒株全基因组表达质粒PHY536207(B基因型)及PHY97(C基因型),继而在RT区上、下游设计限制酶切位点,改造后的质粒分别命名为mPHY536207及mPHY97.以CHB患者血清中分离到的拉米夫定(LAM)耐药变异株和阿德福韦酯(ADV)耐药变异株为骨架,分别构建LAM耐药株质粒PHY634和ADV耐药株质粒PHY6923,再用耐药株的RT区段取代mPHY536207中的RT区构建重组质粒,命名为RT634(LAM耐药)及RT6923(ADV耐药).分别用RT区置换前、后的质粒转染Huh7细胞,用ELISA法检测分泌到细胞上清液中的HBsAg水平,用实时PCR和Southern印迹法检测细胞内HBVDNA水平.结果 成功构建B型和C型野毒株表达质粒PHY536207和PHY97,经转染Huh7细胞证实有HBV复制能力,6孔细胞培养板中每孔细胞所抽提的HBV DNA均＞1×107拷贝/mL;在RT区上游设计的Pst Ⅰ酶切位点不影响HBV的表型(HBsAg的表达及HBV DNA的复制).在PHY634及RT634转染实验中,HBV DNA水平却并未随LAM浓度的升高而明显下降,50％抑制浓度(IC50)＞100 μmol/L,mPHY536207仅为0.18 μmol/L;PHY6923及RT6923转染实验中,HBV DNA对外加的ADV不敏感,IC50＞100 μmol/L,明显高于mPHY536207(1.2 μmol/L).结论 本研究建立了一种新的HBV表型耐药分析方法,可通过RT区置换来研究RT区变异对药物敏感性的影响.
关键词： 肝炎病毒 乙型 RNA指导的DNA聚合酶 抗药性 表型 -
miR-138靶基因hTERT的生物信息学预测及鉴定
目的 预测并鉴定miR-138的靶基因人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT).方法 采用生物信息学技术,预测miR-138与hTERT 3' UTR结合位点及结合后稳定性.分别采用RT-qPCR、Western blot技术检测过表达miR-138后MKN-45细胞内hTERT在mRNA与蛋白水平的变化.采用双荧光素酶实验及突变实验,验证miR-138与hTERT mRNA的结合位点.结果 生物信息学技术预测显示,miR-138可稳定结合于hTERT 3 ' UTR.miR-138过表达后可明显抑制MKN-45细胞内hTERT蛋白表达水平(P＜0.01),但对hTERT mRNA水平无显著影响(P＞0.05).双荧光素酶实验证实miR-138可稳定结合于hTERT 3'UTR相应位点.结论 miR-138通过直接结合于靶基因hTERT 3'UTR抑制hTERT蛋白表达.miR-138可能成为基于miRNA的肿瘤基因治疗的新靶标.
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肾母细胞瘤黑色素抗原基因-1mRNA的表达及临床意义
目的 探讨小儿肾母细胞瘤中黑色素抗原基因-1(MAGE-1) mRNA的表达及意义.方法 用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法 检测32例肾母细胞瘤组织、10例瘤旁组织、6例无瘤肾组织的MAGE-1 mRNA的表达情况,并分析MAGE-1 mRNA的表达与肾母细胞瘤的病理分型、临床分期之间的关系.结果 所有标本均有不同程度的MAGE-1 mRNA表达,表达程度按肿瘤组织、瘤旁组织、无瘤组织依次降低.肿瘤组织是瘤旁组织的1.40倍(t=0.853,P>0.05),是无瘤对照组的2.58倍(t =2.35,P<0.05).MAGE-1 mRNA在肾母细胞瘤组织中的表达与病理分型及临床分期均无关(P>0.05).结论 MAGE-1 mRNA在肾母细胞瘤组织中呈高表达,提示MAGE-1 mRNA可望成为肾母细胞瘤免疫治疗的靶抗原.
关键词： 基因 肾母细胞瘤 RNA指导的DNA聚合酶 -
端粒酶逆转录酶高表达新生鼠真皮细胞株的构建及其生物学功能的初步研究
目的:以逆转录病毒载体pLEGFP-N1-TERT为介导构建TERT高表达新生鼠真皮细胞株,并观察其相关生物学功能变化情况.方法:将pLEGFP-N1-TERT感染C57新生鼠真皮细胞,并用G418筛选法进行阳性克隆的筛选并培养观察,同时将空载对照.两组细胞均经MTT法检测生长情况,流式检测表面标记物CD44、CD133的表达情况,Western blot法检测TERT蛋白的表达,免疫组化检测Versican表达.结果:荧光显微镜下观察TERT高表达细胞发出绿色荧光,其生长速度较对照趋缓,其CD44、CD133、TERT蛋白、Versican表达均升高.结论:本实验获得TERT高表达新生鼠真皮细胞株,其毛发诱导能力较高,可作为毛囊细胞移植种子细胞来源之一.
关键词： RNA指导的DNA聚合酶 逆转录病毒载体 真皮细胞 毛囊细胞移植 -
负载miR-138复制缺陷型腺病毒对hTERT表达的影响
目的 探讨以复制缺陷型腺病毒为载体,上调人端粒酶逆转录酶(hTERT)调控相关miR-138表达丰度后,能否有效抑制靶基因hTERT的表达.方法 将负载hTERT调控相关miR-138的复制缺陷型腺病毒以200∶1的感染复数(MOI),感染人胃癌BGC-823细胞;采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测BGC-823细胞内miR-138和hTERT mRNA的表达丰度;Western Blot检测hTERT蛋白表达.结果 与阴性对照腺病毒相比,负载miR-138的腺病毒感染BGC-823细胞后,可显著提高miR-138表达丰度(P<0.05);而未感染腺病毒的空白对照组与阴性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05).与感染阴性对照腺病毒的BGC-823细胞相比,感染负载人miR-138腺病毒(Ad-miR138)的BGC-823细胞内hTERT蛋白表达有所下调.结论 以复制缺陷型腺病毒为载体,可有效上调hTERT调控相关miR-138的表达丰度,进而可有效抑制miR-138靶基因hTERT的表达水平.
关键词： RNA指导的DNA聚合酶 胃肿瘤 复制缺陷型腺病毒载体 -
HBV逆转录酶mRNA在乙型病毒性肝炎病人 PBMCs中的表达
①目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)逆转录酶mRNA在乙型病毒性肝炎病人外周血单个核细胞(PBMCs)中的表达及临床意义.②方法选择30例乙型病毒性肝炎病人,分别提取其PBMCs中的总RNA,逆转录合成cDNA,设计引物进行PCR扩增以检测HBV逆转录酶mRNA的表达情况.③结果30例乙型病毒性肝炎病人PBMCs中HBV逆转录酶mRNA的表达阳性率为13.3%(4/30),慢性乙型病毒性肝炎病人表达阳性率为1 6.0%(4/25),其中慢性轻度、中度和重度乙型病毒性肝炎病人表达的阳性率分别为11.1%(1/9)、16.7%(1/6)、20.0%(2/10),5例急性乙型病毒性肝炎病人表达均阴性.④结论HBV逆转录酶mRNA在PBMCs中的表达与乙型病毒性肝炎的慢性化及重症化有关.
关键词： 肝炎病毒 乙型 RNA指导的DNA聚合酶 聚合酶链反应
