大鼠肌源性干细胞的分离、纯化和培养

背景:要获得满足临床需要的肌源性干细胞,体外筛选和扩增已成为关键环节.目的:拟建立稳定高效的成年大鼠肌源性干细胞的分离培养、纯化方法.方法:成年SD大鼠麻醉后,无菌条件下取骨骼肌,采用Ⅺ型胶原酶、Dispase和胰酶消化法获得肌源性干细胞,以密度梯度离心法和差速贴壁法进行纯化.记录细胞生长曲线,MTT比色法观察不同接种密度对细胞生长的影响,采用免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定.结果与结论:原代肌源性干细胞体积较小,贴壁缓慢,折光性较好,多呈球形、梭形或纺锤形,增殖缓慢.传代培养后,加入含体积分数为20%血清浓度的完全培养基,以1×109L-1密度接种时活细胞数量多,为适宜接种密度,传1～4代细胞生长状态良好.免疫细胞化学染色结果为desmin(+),CD34(+),CD45(-),Sea-1(+),证实通过体外原代培养获得了高纯度的肌源性干细胞,并成功扩增.

骨髓间充质干细胞肝中叶注射移植治疗新西兰大白兔肝脏衰竭

背景:肝细胞移植作为治疗肝脏衰竭的一种有效方法在各种动物模型及临床应用中得到广泛证实,但供体短缺及移植肝细胞增殖困难等问题严重困扰着肝细胞移植的发展.研究表明骨髓间充质干细胞具有向肝细胞及胆管上皮细胞双向分化的潜能,而且具有强大的增殖能力,它作为一种新的细胞来源为解决上述难题提供了新思路.目的:以肝中叶注射移植骨髓间充质干细胞治疗新西兰在白兔肝脏衰竭,验证其效果.方法:健康雄性新西兰大白兔给予D氨基半乳糖24 h后,移植组于肝中叶注射骨髓间充质干细胞悬液3 mL(1x109L-1),对照组注射相同体积不含骨髓间充质干细胞的培养液.移植后48 h、72 h、1周、4周取外周血测定谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性,移植后4周取肝脏做病理检测.结果与结论:移植后新西兰大白兔肝功能指标明显下降,存第4周时移植组谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性明显低于对照组(P＜0.05).移植后4周对照组表现为肝素紊乱.肝细胞肿胀变性、灶性及大片坏死,伴出血及炎性细胞浸润.移植组显示肝小叶结构可辨认,点状坏死肝细胞间再生肝细胞较前增多,汇管区、中央静脉及坏死灶周围可见核/浆比例较大的小细胞,并向肝组织内延伸,可见灶性增生.

脐血间充质干细胞的体外培养及其表面标志变化

背景:目前有关脐血间充质干细胞的体外培养和大规模扩增方法不一,存在一定困难.目的:观察脐血间充质样干细胞体外分离和培养的方法,并检测其表面分子的变化.方法:取新鲜采集脐带血,用1.077 g/cm3的淋巴细胞分层液,密度梯度离心法分离脐血单个核细胞.将脐血单个核细胞接种于37℃、含体积分数为5%CO2培养箱内培养.于不同时间观察细胞形态的变化并通过流式细胞仪检测细胞表面分子的表达情况.结果与结论:从脐血中分离出的单个核细胞,培养中先出现大量的造血细胞集落,CFU-GM与BFU-E集落形成多,集落分别增加了(37.1+2.3)和(10.4+1.7)倍,瑞氏染色显示这些细胞大多数为粒系的集落(80.1±85.2)%,其次为红系的细胞集落(14.2±1.8)%,7d后出现贴壁的扁平状上皮样细胞和长梭形成纤维样细胞,同时有大量的破骨样细胞混杂.扩增后第14天经流式细胞仪分析CD38+细胞为1.64%,CD34+/CD38+细胞为1_71%,CD34+/CD38-细胞为0.55%,PI+细胞为0.05%,Annexin-V+细胞为0.18%.随着培养时间的延长,细胞数目不断增加,培养21 d时,单个核细胞扩增了近7.8倍.,第28天增加了1.71倍.经流式细胞仪分析CD38+细胞为74.32%,CD34+/CD38+细胞为1.61%,CD34+/CD38-细胞为0.24%.提示脐血间充质干细胞可以体外培养.

新生C57小鼠耳蜗螺旋神经节细胞的原代培养

背景:目前在原代细胞培养领域内,对耳蜗螺旋神经节细胞培养条件的报道各有差异,个别方法重复性较差,不利于实际应用.目的:原代培养并鉴定新生C57小鼠螺旋神经节细胞.方法:显微解剖分离新生C57小鼠蜗轴组织,经胰酶消化+差速贴壁+化学药物相结合方法培养;倒置相差显微镜及苏木精-伊红染色观察细胞生长状态,免疫组织化学染色鉴别细胞来源.结果与结论:蜗轴组织细胞纯化后,胞体呈椭圆形或三角形,有细长的突起,Nuen染色胞核呈棕黄色阳性反应,β3-Tubulin染色细胞胞浆与轴突均呈棕黄色阳性反应.提示实验成功培养出小鼠螺旋神经节细胞.

黄芪注射液对体外培养嗅鞘细胞增殖及其分泌神经营养因子的影响

背景:单独黄芪注射或嗅鞘细胞移植均可促进多种神经元的存活及脊髓损伤后神经功能的恢复,若联合嗅鞘细胞移植和中药黄芪注射液治疗脊髓损伤,是否可达到更好临床效果?目的:观察黄芪注射液对嗅鞘细胞增埴及其分泌神经营养因子的影响.方法:分离培养新生24 h内SD大鼠嗅鞘细胞并纯化,采用免疫组织化学方法鉴定.取培养至第8天的嗅鞘细胞,种植于多聚赖氨酸包被的96孔板,置于37℃、体积分数5%CO2培养箱饥饿24 h后,加入2mg/L,20mg/L,200mg/L,2 g/L,20 g/L黄茛注射液作用24 h,采用MTT法和流式细胞仪检测黄芪注射液对嗅鞘细胞增殖的影响:采用ELISA法测定培养上清中胶质细胞源性神经营养因子的水平.以血清培养液组为阴性对照.结果与结论:与阴性对照组比较,2,20 mg/L质量浓度黄芪注射液可明显促进嗅鞘细胞增殖(P＜0.05,P＜0.01):不同质量浓度黄芪注射液均增加嗅鞘细胞G1细胞比例,减少S、G2期细胞所占比例,但差异无显著性意义(P＞0.05),但各质量浓度黄芪注射液均显著减少嗅鞘细胞凋亡数量(P＜0.05):2 mg/L质量浓度黄芪能对嗅鞘细胞分泌胶质细胞源性神经营养因子有显著的促进作用.结果说明黄芪注射液可协同嗅鞘细胞促进脊髓损伤的恢复.

骨髓间充质干细胞立体定向移植治疗大鼠脊髓损伤

背景:干细胞治疗神经组织损伤的关键在于移植具有再生能力的干细胞,通过多种作用机制,重建中枢神经系统的结构和功能.目的:立体定向移植骨髓间充质干细胞观察其对大鼠脊髓损伤修复的影响并探讨其机制.方法:密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离骨髓间充质干细胞,于细胞移植前掺入10 mg/L的BrdU进行标记.将成年雌性Wistar大鼠以动脉瘤夹闭法制备大鼠脊髓损伤模型后随机分为对照组、生理盐水组与移植组.移植组大鼠致伤后第7天,通过立体定向途径移植骨髓间充质干细胞到脊髓损伤中心,生理盐水组给予等量生理盐水,对照组大鼠不做处理.于大鼠脊髓损伤前及损伤后第7,14,30,60,90天进行BBB评分;损伤后第90天处死大鼠,观察其脊髓组织中有无BrdU阳性细胞、Brdu+神经元特异性烯醇化酶、Brdu+胶质纤维酸性蛋白、Brdu+碱性成纤维细胞生长因子、Brdu+脑源性神经生长因子免疫组织化学双染阳性细胞及单染阳性细胞.结果与结论:①骨髓间充质干细胞移植组大鼠BBB后肢功能评分恢复优于对照组(P＜0.05):生理盐水组BBB评分在损伤后30 d内恢复速度慢于对照组(P＜0.05),至第90天与对照组比较差异无显著性意义(P＞0.05).②移植组大鼠脊髓内在损伤中心及头、尾端距离脊髓损伤中心1 cm处均可见BrdU染色阳性细胞及免疫组织化学双染阳性细胞.移植组神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经生长因子单染阳性细胞数明显高于对照组和生理盐水组(P＜0.05).结果提示,骨髓间充质干细胞移植可以促进脊髓损伤大鼠的神经功能的恢复,其机制可能与移植细胞分化为神经元样和神经胶质细胞样细胞,并分泌或促进宿主分泌神经营养因子有关.

彩色多普勒超声评价自体外周血干细胞移植治疗糖尿病下肢动脉闭塞症:与血管造影结果吻合吗?

背景:糖尿病下肢动脉闭塞的传统治疗方法如药物、介入等效果不佳,干细胞移植是近几年治疗该病变的新方法,临床取得了较好的效果.评价干细胞移植的治疗效果造影检查损伤大,费用高,所以采用彩色多普勒超声进行下肢动脉无创性检查具有重要的临床价值.目的:应用彩色多普勒超声评价自体外周血干细胞移植后下肢动脉病变的改善情况,并与血管造影结果相比较.方法:纳入确诊糖尿病下肢动脉闭塞症患者41例,经重组人粒细胞集落刺激因子150 μg皮下注射,1次/d进行外周血干细胞动员,第5天用血细胞分离机采集分离干细胞,配成干细胞悬液,将干细胞悬液肌肉注射进行双下肢移植(3×109细胞/肢).干细胞移植后观察3个月至1年,同时进行各项指标的综合评估.结果与结论:干细胞移植后,患肢疼痛、冷感、间歇性跛行、溃疡明显好转,踝臂指数明显升高(P＜0.01),彩色多普勒超声测量足背动脉血流速度明显增加(P＜0.01).移植后下肢动脉管腔血流有不同程度改善,闭塞动脉周围、肌肉内的侧支血管增多;螺旋CT血管造影显示新生侧支血管明显增多.41例患者均未发生并发症和不良反应.提示彩色多普勒超声可准确、快速地检测和评价干细胞移植后下肢血运改善情况,和血管造影结果相吻合,在评价干细胞移植治疗糖尿病下肢动脉闭塞症的疗效方面能为临床提供可靠的诊断依据.

干细胞因子促进牙髓干细胞增殖与骨向分化能力

背景:干细胞因子作为对干细胞的增殖分化具有一定促进作用的因子,是否影响牙髓干细胞的生物学特性从而在牙齿再生中发挥重要作用尚不清楚.目的:观察干细胞因子对人牙髓干细胞增殖与骨向分化能力的影响.方法:采用酶消化法培养因正畸需要拔H{的健康人牙的牙髓组织,接种于培养板,加入含1,10 μmol/L干细胞因子的培养液,以正常培养液作为对照.MTT法检测细胞增殖,real-time PCR检测成骨相关基因骨唾液蛋白、骨钙素Mrna的表达,碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶活性.结果与结论:干细胞因子对牙髓干细胞的增殖具有促进作用,干细胞因子上调了骨唾液蛋白、骨钙素Mrna的表达,增强了牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性,且具有随浓度增加促进作用增强的趋势.提示干细胞因子可以促进人牙髓干细胞的增殖及骨向分化能力.

Ad-GFP修饰的间充质干细胞在肺气肿大鼠体内向肺部的定向迁移

背景:近些年来应用相关干细胞及生长因子促进肺再生修复肺气肿病变的研究逐渐成为热点,那么通过干细胞携带相关外源生长因子基因能否更好的修复肺气肿病变值得关注.目的:观察携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒(adenovirus vecto rmediated green fluorescence protein,Ad-GFP)转染骨髓间充质干细胞的效率、对细胞增殖的影响,及携带目的基因的间充质于细胞尾静脉移植在肺气肿大鼠肺部的定居情况.方法:采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离、培养间充质干细胞,流式细胞仪鉴定;在不同感染复数时,激光共聚焦显微镜检测转染效果及转染效率,MTT法检测转染48 h的细胞活性:Wistar大鼠16只,随机分为模型组和对照组,每组8只,采用单纯被动烟熏法制备肺气肿大鼠模型.通过尾静脉移植Ad-GFP修饰的间充质干细胞,于24 h后取大鼠肺组织做快速冰冻切片,在荧光显微镜下观察间充质干细胞在肺部的分布情况.结果与结论:实验成功获得大鼠间充质干细胞,Ad-GFP成功转染间充质干细胞,且在MOI=200时,转染效率达到88.42%.在不同MOI下,Ad-GFP转染间充质干细胞对细胞增殖无影响(P＞0.05).移植24 h后,模型组大鼠及对照组大鼠肺部可见到发绿色荧光的间充质干细胞,且模型组荧光强度明显强于对照组(P＜0.05).提示导入目的基因可能不会影响骨髓间充质干细胞增殖和归巢特性.

神经生长因子联合神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤

背景:单纯的神经干细胞移植对受损脊髓组织的修复作用并不理想,研究证实神经生长因子兼有神经元营养和促突起生长双重作用,可以有效的促进脊髓损伤后神经功能的恢复.目的:观察神经干细胞移植联合应用神经生长因子对脊髓损伤后大鼠运动功能恢复的影响.方法:SD大鼠42只,建立急性脊髓损伤模型后随机分成3组,伤后1周于损伤处分别注入培养液、单纯神经干细胞或神经干细胞联合神经生长因子.于伤后1,2,4,6,8周进行BBB评分和斜板实验等运动功能检测.伤后4周取材行病理切片苏木精-伊红染色及BrdU免疫组化染色,伤后8周取材行辣根过氧化物酶示踪观察及体感诱发电位观察神经电生理恢复情况.结果与结论:伤后4周单纯神经干细胞组、神经于细胞联合神经生长因子组大鼠后肢运动功能均有较明显恢复,神经干细胞联合神经生长因子组较单纯神经干细胞组快,差异有显著性意义(P＜0.05).培养液组亦有所恢复,但程度较轻.病理切片显示培养液组未见神经轴索通过.单纯神经干细胞组可见少量神经轴索样结构,神经干细胞联合神经生长因子组可见较多神经轴索样结构.BrdU的阳性细胞数及HRP阳性神经纤维数:神经干细胞联合神经生长因子组＞单纯神经干细胞组＞培养液组且各组之间差异有显著性意义(P＜0.01).神经干细胞联合神经生长因子组大鼠体感诱发电位的潜伏期、波幅优于单纯神经干细胞组(P＜0.05),明显优于培养液组(P＜0.01). 结果提示神经干细胞移植对于后肢功能的恢复有促进作用,联合应用神经生长因子有协同效果.

Ad5-增强型绿色荧光蛋白和rAAV2-增强型绿色荧光蛋白转染脂肪间充质干细胞的对比

背景:利用基因转染技术诱导脂肪间充质干细胞成软骨细胞已有报道,但腺病毒和腺相关病毒转染脂肪间充质干细胞各有不同,且腺相关病毒载体能否转染脂肪间充质干细胞众说不一.目的:观察Ad5-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和Raav2-EGFP转染脂肪间充质干细胞后增强型绿色荧光蛋白的表达及转染后细胞增值能力的变化.方法:脂肪组织来源于6月龄新西兰大白兔颈背部.机械消化和酶消化法分取脂肪间充质干细胞,体外培养扩增.分别采用腺病毒载体(Ad5-EGFP)和腺相关病毒载体(Raav2-EGFP)转染脂肪间充质干细胞,并观察EGFP的表达.Raav2-EGFP转染后,需加入2 Μl丁酸钠(1 mol/L).采用MTT法检测基因转染对脂肪间充质干细胞增殖能力的影响.结果与结论:体外培养的脂肪间充质干细胞呈扁平状和长梭形,细胞形态均一,传代稳定.Ad5-EGFP组和Raav2-EGFP组均能观察到较多荧光细胞,转染效率分别达到88%和83%.腺病毒和腺相关病毒载体均能转染脂肪间充质干细胞,且转染效率很高.腺相关病毒需要借助丁酸钠来提高其基因表达水平.

神经干细胞NgR基因沉默立体定向移植治疗大鼠脑损伤

背景:神经干细胞具有自我增殖能力和多向分化潜能,一定条件下可以分化成神经系统的各种细胞,因此在神经损伤修复方面有着良好的应用前景.而RNA干扰避免了永久基因沉默的弊病,有希望与神经干细胞移植相结合治疗颅脑损伤.目的:检测是否可以通过沉默NgR基因的方法提高神经干细胞立体定向移植对重型颅脑损伤大鼠的治疗效果.方法:60只雄性Wistar大鼠制成重型液压颅脑损伤模型后随机区组法分为3组,每组20只.实验组:造模24 h后向损伤的大鼠脑组织内注射NgR基因沉默的神经干细胞悬液6 μL:对照组:同法注射等量的神经干细胞悬液:空白组:同法注射等量的不含干细胞的培养液.伤后24 h,3 d,1,2周行动物神经学缺损评分.2周后处死行免疫组织化学和苏木精-伊红染色.结果与结论:转染小分子干扰RNA后,与对照组相比,实验组NgR基因蛋白表达量明显降低,移植后1周和2周,接受神经干细胞移植的大鼠神经学缺损评分明显低于对照组(P＜0.05):且其脑组织切片中的神经元数量较对照组明显增多(P＜0.01).伤后2周苏木精-伊红染色空白组可见损伤处脑组织断裂,为瘢痕连接,有明显空洞形成;对照组在移植部位出现典型的神经细胞样形态学改变;实验组出现媳型的神经细胞样形态学改变且空洞消失.免疫组织化学染色观察空白组BrdU标记的阳性细胞为(37.92±16.02)个/高倍视野,对照组为(89.68±15.34)个/高倍视野,实验组为(102.67±13.52)个/高倍视野,各组间两两比较,差异均有显著性意义(P＜0.01).提示神经干细胞NgR基因沉默后立体定向移植治疗大鼠脑损伤可明显改善重型颅脑损伤后大鼠的神经学功能.

碱性成纤维细胞生长因子对胚胎干细胞来源集落形成细胞的作用

背景:有研究表明,在卵黄囊造血、胎肝造血和在胚胎干细胞向造血干细胞分化过程中,碱性成纤维细胞生长因子可强烈表达.目的:在拟胚体培养阶段施加碱性成纤维细胞生长因子,验证碱性成纤维细胞生长因子对集落形成细胞产生的调控作用.方法:购买小鼠胚胎干细胞D3细胞系,取第3～5代小鼠原代胚胎成纤维细胞,加入新配制含丝裂霉素C的DMEM生长培养基孵育2.5 h,使饲养层细胞失去增殖能力;加入胰酶消化适度,离心后制成单细胞悬液,以10×104/cm2的密度种至用明胶包被的培养瓶中,放入孵箱内培养24 h之后使用.复苏胚胎干细胞D3细胞并将其接种于饲养层细胞之上.在拟胚体培养阶段按培养基成分不同分为2组:对照组(标准培养基+血管内皮生长因子+干细胞因子组)、实验组(标准培养基+血管内皮生长因子+干细胞因子+碱性成纤维细胞生长因子组).各组于培养3,6d时分别计数克隆形成数,通过免疫荧光法检测Flk-1+细胞表达情况,并用IMAGE-PRO PLUS图像分析系统统计阳件细胞数及平均吸光度值.结果与结论:与对照组比较,在拟胚体培养阶段加入碱性成纤维细胞生长因子可显著增加集落形成细胞的数量(P＜0.01),Flk-1阳性细胞数及平均吸光度值也显著增加(P＜0.01).证明碱性成纤维细胞生长因子能够有效地促进胚胎体的扩增以及成血管血液干细胞的产生与增殖.

Hes1在成年小鼠脑中表达的免疫组织化学分析

背景:近年来的研究显示,在胚胎神经系统发育过程中,Hes1的表达调控对保持神经干细胞的数量、调控其分化至关重要.此外,成年个体内处于静止期的纤维母细胞重新获得分裂增殖的能力需要Hes1表达的上调.这表明Hes1在成体中也与某些潜在干细胞的增殖具有密切的关系.因此研究Hes1在成体神经干细胞中的表达及其与成体神经细胞生成的关系也就被提上日程.但Hes1在成年个体神经系统的表达至今未明.目的:观察和分析小鼠脑中不同部位Hes1的表达及Hes1阳性细胞的细胞类型.方法:12只成年雄性C57BL/6小鼠随机数字表法分为单染组和双染组,每组6只.单染组商接取材,采用免疫组织化学技术检测Hes1在小鼠脑中各部位的表达.双染组小鼠以200 mg/kg Brdu的剂量每天腹腔注射1次,连续注射3 d,第4天取材,采用双标记物染色观察分析海马区Hes1阳性细胞的细胞类型.结果与结论:在所有观察的解剖部位中,Hes1表达于所有存在神经细胞的部位,Brdu阳性细胞几乎全部表达Hes1,NeuN阳性细胞全部表达Hes1,而神经胶质原纤维酸性蛋白阳性细胞则完全不表达Hes1.由此可知,Hes1表达于神经细胞和神经干细胞中,胶质细胞不表达Hes1.

体外培养大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化:Wnt3a信号分子的诱导作用

背景:Wnt信号通路是细胞增殖分化的关键调控环节.已有证据显示此通路参与了对神经前体细胞增殖、分化以及决定细胞命运的调控.目前有关Wnt信号通路对间充质干细胞向神经元样细胞分化的作用还少见报道.目的:寻找促进间充质干细胞向神经元样细胞分化的Wnt信号分子.方法:采用密度梯度离心法在体外分离培养SD大鼠股骨间充质干细胞并培养.传代后通过形态学和流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44、CD34、CD45,筛选并鉴定培养细胞.采用神经营养因子碱性成纤维细胞生长因子分别联合Wnt3a和Wnt5a诱导方案,通过免疫组化和RT-PCR的方法比较Wnt3a、Wnt5a在间充质干细胞向神经元样细胞分化过程中的作用,以碱性成纤维细胞生长因子单独培养为对照.结果与结论:间充质干细胞经培养、传代后,细胞贴壁生长,形态均一,呈长梭形,流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44高表达,CD34、CD45低表达.Wnt3a诱导后细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶呈阳性,胶质纤维酸性蛋白无明显表达,诱导后细胞的活力良好;Wnt5a诱导组及对照组巢蛋白呈弱阳性表达,神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白阴性.RT-PCR结果显示,Wnt3a诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异性烯醇化酶在诱导后5d可见明显的扩增条带,10d后更加明显;胶质纤维酸性蛋白在诱导10d后有比较弱的扩增条带出现.结果说明Wnt3a分子能够促进体外培养的间充质干细胞向神经元样细胞分化.

音猬因子诱导恒河猴间充质干细胞向神经样细胞的分化

背景:骨髓间充质干细胞诱导分化为神经细胞,是神经系统疾病细胞治疗的有效手段,但目前的时效尚不完善.目的:应用神经发育音猬因子诱导恒河猴骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化.方法:应用经典的维甲酸方案与音猬因子方案两种方法诱导恒河猴骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞,采用密度梯度离心法分离培养恒河猴骨髓间充质干细胞,倒置相差显微镜观察生长情况,MTT法测定细胞生长曲线,流式细胞仪鉴定细胞表型,免疫组织化学鉴定分化细胞标志,透射电镜和扫描电镜观察分化细胞超微结构.结果与结论:体外分离培养的恒河猴骨髓间充质干细胞,经流式细胞仪表型鉴定,具有较高均一性.通过音猬因子诱导方案诱导处理7 d后,分化细胞多数表现为NSE、NF-M、Tau和Nestin染色阳性,经图像统计分析发现经音猬因子诱导方案神经干细胞标志物Nestin阳性率显著高于维甲酸诱导方案(P＜0.01),另一方面经维甲酸诱导方案诱导的细胞表现GFAP阳性率高于音猬因子诱导方案,差异具有显著性意义(P＜0.05).提示音猬因子诱导方案是一种诱导恒河猴骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的有效途径.

pDsRed-C1-CDNF真核表达载体在大鼠骨髓间质干细胞中的表达

背景:骨髓间质干细胞是一类具有多向分化能力的成体干细胞,目前,已有将其作为细胞载体对帕金森病进行治疗的相关报道.目的;构建pDsRed-C1-CDNF真核表达载体,并诱导其在大鼠骨髓间质干细胞中表达.方法:通过RT-PCR的方法从小鼠组织中扩增出CDNF基因片段,并在其两端引入Xho I、BamH I限制性内切酶酶切位点,然后将其克隆至pDsRed-C1真核载体,构建pDsRed-C1-CDNF真核表达载体,并通过Lipofectin2000将其转染至大鼠骨髓间质干细胞中.结果与结论:pDsRed-C1-CDNF真核表达载体经双酶切、单酶切、PCR及测序验证正确,提示已成功构建pDsRed-C1-CDNF真核表达载体并已转染至大鼠骨髓间质干细胞中.

大鼠骨髓间充质干细胞体外向神经元样细胞的诱导

背景:选择合适的诱导方法诱导骨髓间充质干细胞为神经元样细胞是临床治疗神经损伤的关键.目的:在大鼠骨髓间充质干细胞中加入大鼠齿状回蛋白提取物,观察其诱导分化为神经元样细胞的可行性.方法:应用20,40,60,80 mg/L齿状回蛋白提取物诱导分化大鼠骨髓间充质干细胞,蛋白印记检测神经元分化情况,筛选佳剂量.收集诱导后的神经元样细胞,倒置显微镜下观察分化后细胞的形态学变化,用蛋白印记技术检测NSE、NeuN的表达,免疫荧光技术检测细胞内NeuN的表达.结果与结论:诱导分化7d后,经蛋白印记检测可见60mg/L的齿状回蛋白提取物为佳诱导剂量,随质量浓度的增加NSE与NeuN的表达量逐渐增加,当质量浓度为80 mg/L时,细胞表达的NSE与NeuN减少;选择60 mg/L齿状回蛋白提取物诱导分化骨髓间充质干细胞,诱导后的细胞变长,有突触:免疫荧光NeuN染色发现,诱导分化后的神经元样细胞有阳性表达.结果提示齿状回提取物是一种可以诱导骨髓间充质干细胞分化的有效生物诱导剂.

人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化

背景:研究报道显示人脐带间充质干细胞体外分离方法及效率、培养条件各不相同,并且尚未有统一的鉴定标准.因此建立高效、经济的培养体系十分必要.目的:建立从人脐带组织分离培养间充质干细胞的方法,并进行向脂肪细胞和成骨细胞的诱导分化.方法:采用组织块贴壁法和酶消化法分离纯化获得人脐带间充质干细胞,取对数生长期的第3代细胞,分析其细胞形态、增随方式和某些免疫表型,并在体外诱导其向脂肪细胞和成骨细胞分化.结果与结论:采用组织块贴壁法和酶消化法均能成功获得贴壁生长的人脐带间充质干细胞,并在体外扩增培养.流式细胞术分析结果显示,人脐带间充质干细胞强表达CD29,CD44,CD59,CD105,阴性表达CD28,CD31,CD34,CD45,CD40,CD86,HLA-DR.人脐带间充质干细胞在适当的诱导条件下能向脂肪和成骨细胞分化,体外能连续传代40次以上,且形态和表型保持稳定.这证实了人脐带组织存在间充质干细胞,且具有向脂肪和成骨细胞分化的潜能,因此将可能成为细胞治疗和组织工程新的种子细胞.

间充质干细胞向神经细胞诱导过程中表面标记的变化

背景:成熟的中枢神经系统缺乏再生能力.因此,找寻新的神经干细胞来源就显得尤为重要.目的:观察碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子对间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞的差异.方法:从正常人骨髓中分离获取间充质干细胞,体外培养扩增、纯化后种植于96孔板中,调整细胞密度为0.25×108 L-1,每孔200 μL DMEM/F12培养液,从第0～7天,每天于固定时间在5个孔里加入20 μL MTT,放入培养箱继续培养4 h后吸净孔内的培养液,加入二甲基亚砜100 μL/孔.另外,一部分细胞用碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子单独或联合对其进行诱导分化.MTT法绘制细胞的生长曲线,RT-PCR比较两种细胞因子诱导细胞的差异,TRAP(PCR)-ELISA检测诱导后细胞的端粒酶活性.结果与结论:未诱导的第4代间充质干细胞有nestin,GFAP和NF-M mRNA的表达,随着诱导时间延长表达逐渐加强,但是诱导7 d后nestin的表达量逐渐下降.MAP2 mRNA的表达在诱导后出现,随着诱导,表达逐渐加强.碱性成纤维细胞生长因子+表皮生长因子诱导组和碱性成纤维细胞生长因子诱导组MAP2 mRNA的表达量明显多于表皮生长因子诱导组,而表皮生长因子组可见较多胶质纤维酸性蛋白的表达.提示间充质干细胞可以在体外培养,扩增以及向神经干细胞分化.分化后的神经干细胞具有增殖的活性,但是不具备肿瘤细胞的无限增殖性.

全骨髓贴壁并差速传代分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞:与密度梯度离心法的比较

背景:目前国内外分离纯化骨髓间充质干细胞有两种主要方法;密度梯度离心法及全骨髓贴壁法,前者步骤较复杂,后者简单易操作,但纯化效果不理想.目的:在全骨髓贴壁分离骨髓间充质干细胞基础上,并用差速传代消化法,建立大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养纯化方法.方法:全骨髓贴壁培养法分离并差速消化传代大鼠骨髓间充质干细胞,利用间充质干细胞在消化传代过程中较其他骨髓细胞消化悬浮速度快,以及贴壁快的特点,代替密度梯度离心操作来分离纯化间充质干细胞,对其形态学特征进行观察,并与密度梯度离心法比较两种分离培养法的细胞生长增殖情况;观察碱性磷酸酶及油红染色情况,验证骨髓间充质干细胞的分化能力;检测细胞表面标记物,验证免疫特性及检测其纯度.结果与结论:全骨髓贴壁培养法分离并差速传代大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞鉴定、成骨成脂肪培养结果显示其细胞免疫特性、纯度、分化能力与密度梯度离心法无显著差异,但细胞活力,增殖能力有明显提高.

原代培养大鼠视网膜与视皮质神经元的方法学特点

背景:神经元的原代培养是进行神经系统结构和功能研究的一种重要手段.如果能建立稳定良好的视网膜、视皮质神经细胞体外培养体系,对深入研究其各种细胞成分的生物学功能、病理改变过程与机制以及药物反应等十分重要.目的:对比观察原代培养新生大鼠视网膜及视皮质神经元的特点,探求佳分离和培养方法.方法:分别采用机械分离及酶消化法分离新生大鼠视网膜及视皮质神经元,应用含体积分数为10%新牛牛血清、10%F-12 Nutrient Mixtures的DMEM培养基进行接种培养,含2%B-27 Serum-Free Supplements的Neurobasal Medium进行维持培养,利用尼氏染色进行神经元鉴定.结果与结论:培养的神经元生长良好,胞体饱满,突起长.尼氏染色示视网膜神经元比例大于90%,视皮质神经元比例大于50%.提示视网膜及视皮质神经元培养方法及生长特点存在不同,需采用不同的方法进行培养以获得高纯度的神经元.

不同血清微环境对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养的影响

背景:骨髓间充质干细胞在培养过程中,常在基础培养基中添加一定的血清,常见的是小牛血清和胎牛血清,但这存在着一定的生物安全性件隐患.目的:观察不同血清微环境对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养的影响.方法:自成年大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞,采用全骨髓贴壁法培养.分别以下列血清微环境培养:自身血清组:分离细胞后原代用含大鼠自身血清的培养基培养,传代后换用含胎牛血清的培养基培养:同种异体衄清组:分离细胞后原代用含同种异体血清的培养基培养,以后用胎牛血清培养基培养;胎牛血清组:分离后用含胎牛血清培养基培养,以后一直用含胎牛血清培养基培养:DMEM组:分离细胞后原代用不含血清的DMEM培养基培养,传代后换用含胎牛血清的培养基培养.在倒置相差显微镜下观察细胞的形态;细胞的贴比率:生长曲线;流式细胞仪观测细胞表面CD11b、CD45和CD90表达.结果与结论:大鼠自身血清微环境及同种异体血清微环境细胞形态均一性、在融合度均高于其他组;首次传代天数低于其他组.24,48,72 h贴比率自身血清组、同种异体血清组和胎牛血清组均高于DMEM组(P＜0.01).在细胞生长曲线中大鼠自身血清组倍增速率快,其次为同种异体血清组,再者为胎牛血清组,而DMEM组细胞未见明显倍增现象.流式细胞仪检测含血清培养基培养条件下各组第3代细胞CD11b和CD45阳性细胞率均达到98%以上,CD90阳性率小于2%,可以得到纯度较高的骨髓间充质干细胞.但是在无血清微环境条件下,CD11b的阳性率为95.83%、CD90阳性率达2.07%,而CD45阳性率仅为64.79%.可见无血清环境下培养的骨髓间充质干细胞纯度明显低于含血清微环境.提示大鼠自身血清微环境下更有利于骨髓间充质干细胞的贴壁、生长及纯化.

高压氧对大鼠骨髓间充质干细胞分化和Wnt3表达的影响

背景:高压氧治疗可以促进缺氧缺血性脑损伤新生大鼠内源性神经干细胞的增殖和分化,且其机制与Wnt信号通路的活化有关,但在体外高压氧对干细胞分化的影响是否也通过Wnt信号通路起作用目前尚未见相关报道.目的:观察高压氧对大鼠骨髓间充质干细胞分化的影响,认识其相关机制.方法:全骨髓法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁纯化,取传至第3～5代细胞,加入含bFGF,EGF,B27的DMEM/F12培养基诱导培养24 h.诱导后细胞随机分为2组,对照组未做任何处理,高压氧组给予0.10 MPa的压力治疗,稳压时间60min,稳压期间平均氧浓度不低于90%.免疫荧光染色检测巢蛋白、NSE,GFAP,04等抗体的表达,Western-blot法检测Wnt3蛋白的表达.结果与结论:骨髓间充质干细胞用神经干细胞经典培养基诱导后巢蛋白呈阳性表达.与对照组比较,高压氧组NSE,04阳性细胞分化率均著增加(P＜0.01),GFAP阳性细胞分化率无明显差异(P＞0.05),Wnt3蛋白的表达明显升高(P＜0.05).高压氧可以促进骨髓间充质干细胞向神经元细胞和少突胶质细胞分化,但对星形胶质细胞的分化无明显影响,其机制可能与Wnt3蛋白的活化有关.

体外诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化:肝细胞生长因子和表皮细胞生长因子的作用

背景:研究证实人骨髓间充质干细胞能够诱导分化为肝样细胞,但其具体生物学特性及分化机制尚不清楚,且诱导分化培养体系尚不成熟.目的:探讨肝细胞生长因子和表皮细胞生长因子体外诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的可行性.方法:取食管癌手术患者肋骨,采用密度梯度离心联合贴壁筛选法获取人骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面分子的表达.取第3代人骨髓间充质干细胞,分为4组,肝细胞生长因子组加入20 μg/L肝细胞生长因子,表皮细胞生长因子组加入20 μg/L表皮细胞生长因子,联合组同时加入上述两种生长因子,空白对照组不加任何生长因子.倒置显微镜下观察细胞形态的变化,诱导7,14 d RT-PCR检测甲胎蛋白与白蛋白mRNA的表达.结果与结论:入骨髓间质干细胞不表达造血细胞标志CD34,CD45,强表达β1-整合素CD29和基质受体CD44.肝细胞生长园子组、表皮细胞生长因子组、联合组诱导后,细胞形态由长梭形变为类圆形或多角形,诱导第7,14天甲胎蛋白、白蛋白mRNA均呈阳性表达:空白对照组未见多角形细胞,甲胎蛋白、白蛋白mRNA均呈阴性表达.证明肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子以及二者联合均具有诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的能力,至于二者联合是否能增强其分化能力尚待进一步免疫细胞化学染色定量分析予以验证.

干细胞在口腔医学中的研究与应用特点

背景:牙髓干细胞、骨髓基质干细胞和牙周膜干细胞属于口腔中的成体干细胞,具有成体干细胞的两大特征:较强的自我更新能力和分化潜能.通过对口腔中多种干细胞的深入研究,有助于人类更加深入地揭示牙齿硬组织形成过程与诱导机制,进而指导临床相关治疗与预防.目的:总结各类口腔成体干细胞的特点及在临床中的应用前景.方法:由第一作者检索1999-01/2009-12 PubMed数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed)及中国知网数据库(http://www.cnki.net).英文检索词为"stem cell,dentistry",中文检索词为"干细胞,口腔医学".检索文献量总计80篇,选择干细胞在口腔医学领域中的基础研究及临床应用,排除陈旧及重复实验文章,终纳入19篇符合标准的文献.结果与结论:随着研究的深入,口腔特有的成体干细胞将会逐渐被发现,从而建立完整的干细胞库,为口腔各组织的组织工程研究提供可能的细胞来源.

室管膜前下区神经干细胞向神经元分化中骨形成蛋白2及DLX5的作用

背景:目前神经干细胞应用的大障碍还在于分化的调控,而对干细胞分化调控机制尚知之甚少.室管膜前下区是目前公认的神经干细胞富集区之一.在此区的神经干细胞可以长距离迁移到嗅球而保持神经干细胞不分化,后在嗅球分化为中间神经元.骨形成蛋白2及DLX5在室管膜前下区神经干细胞向嗅球迁移分化过程中起着重要作用.目的:研究室管膜前下区神经干细胞的构筑及迁移特点,以及目前国内外有关骨形成蛋白2及DLX5在此区神经干细胞迁移分化中的作用,希望对神经干细胞的分化调控机制有一定的认识.方法:由第一作者利用中文检索词"神经干细胞,室管膜前下区,骨形成蛋白2,DLX5"及英文检索词"neural stem cells,SVZa,BMP-2,DLX5",在PubMed数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed)、中国期刊全文数据库(www.cnki.net/index.htm)、万方数据库(http://www.wanfangdata.com.cn)中检索1997-01/2009-01关于骨形成蛋白2、DLX5在室管膜前下区神经干细胞向神经元分化中作用的文献.排除内容陈旧或重复文献.结果与结论:初检得到121篇文献,中文86篇,英文35篇.后对符合标准的28篇文献作进一步的分析.结果提示,室管膜前下区神经干细胞具有其独特细胞构筑和长距离迁移的特点,骨形成蛋白2及DLX5在其迁移分化过程中起着重要作用,但其具体作用机制仍不清楚.

间充质干细胞诱导移植耐受的研究进展及可能机制

背景:间充质干细胞能自我更新、高度增殖,具有多向分化潜能、低免疫原性及免疫调节特性.在体内和体外均能调节同种异体免疫反应,在实体器官移植中发挥着重要作用,有望成为诱导移植耐受的新途径.目的:综述间充质干细胞在实体器官移植中的应用及其免疫调节机制的新进展.方法:应用计算机检索Pubmed 1994-01/2009-10期间相关文章,运用MeSH主题词检索,检索词为"Mesenchymal Stem Cells, Mesenchymal Stem cell Transplantation,Organ Transplantation,Transplantation Immunology,Immunologic Graft Enhancement,Graft vs Host Disease",并限定文章语言种类为"English".同时计算机检索万方数据库1994-01/2009-10期间相关文章,检索词为"间充质干细胞、器官移植、移植免疫".纳入标准:文章所述内容应与间充质干细胞免疫学特性、器官移植中的应用及移植免疫进展研究相关.排除标准:重复研究或Meta分析类文章.结果与结论:共收集到200篇相关文献,86篇文献符合纳入标准.间充质干细胞具有低免疫原性及调节免疫调节特性,在诱导移植耐受和器官移植后组织修复中有着不可或缺的优势,其诱导免疫耐受的机制可能与町溶性因子、调节性T细胞、耐受性树突细胞、骨髓嵌合状态、抗炎和组织修复功能有关,并受间充质干细胞输入方式、剂量与时间的影响.

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