中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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干扰素调节因子4在B细胞淋巴瘤细胞株中表达及其与细胞耐药的关系
背景:干扰素调节因子4是B细胞终末分化的重要转录因子,限制性表达于淋巴细胞,在基因调控中起重要作用,但其与疾病预后的终关系仍未确定.目的:假设干扰素调节因子4在B淋巴细胞中的表达与细胞耐药有关,观察新型抗肿瘤药蛋白酶体抑制剂硼替佐米对干扰素调节因子4的影响.设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2006-03/2007-02在河南省肿瘤医院中心实验室完成.材料:Daudi和Namalwa细胞株由上海血液学研究所提供.阿霉素为山西普德药业有限公司产品,硼替佐米为西安杨森公司产品.方法:将Daudi和Namalwa细胞各自接种于200 μ L RPMI-1640培养体系中,分别加入0,5,10,20,30,50,100 μg/L阿霉素:对T-Namalwa细胞,另设立联合用药组,即15nmol/L硼替佐米+上述各浓度阿霉素:药物处理48h后,加入MTT继续培养.选择单药50 μg/L阿霉素、15 mnol/L硼替佐米以及两药联合作用Namalwa细胞12,24,48,72h,行半定量RT-PCR和Western印迹分析.主要观察指标:干扰素调节因子4在细胞株中的表达.MTT法检测细胞增殖抑制率.AnnexinV/PI法检测细胞凋亡情况.药物对Namalwa细胞干扰素调节因子4基因和蛋白表达的影响.结果:Namalwa细胞表达干扰素调节因子4基因和蛋白,Dandi细胞中未检测出其表达.各浓度阿霉紊作用48 h后,Daudi细胞增殖抑制率显著高于Namalwa细胞(P<0.05);阿霉素联合硼替佐米共培养48 h,Namalwa细胞增殖抑制率显著高于单药阿霉素(P<0.05).硼替佐米、阿霉素联合硼替佐米作用48 h细胞凋亡率显著高于单药阿霉素(P<0.01).单药阿霉素处理12,24,48,72 h,干扰素调节因子4基因和蛋白均未发生明显变化:单药硼替佐米处理48 h干扰素调节因子4基因表达开始下调,72h出现蛋白表达下调;两药联合处理24 hEP出现干扰索调节因子4基因表达下调,4Bh随之出现蛋白表达下调.结论:Namalwa细胞中干扰素调节因子4的表达与阿霉素耐药有关,硼替佐米能够下调干扰素调节因子4的表达,克服阿霉素的耐药.
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Nucleofector TM技术在胰腺十二指肠同源基因1转染大鼠骨髓来源巢蛋白阳性细胞中的应用
背景:通过直接转入基因可强化调控骨髓间充质干细胞特异性分化.所以,有效的基因转染技术是髓间充质干细胞可以在组织工程中使用的关键.目的:选择Nucleofector TM技术转染大鼠骨髓间充质干细胞的优化转染方案,为高效体外转染大鼠髓间充质干细胞提供一个新方法.设计、时间及地点:对比观察细胞基因工程实验,于2007-10/12在南方医科大学珠江医院神经外科实验室完成.材料:骨髓间充质干细胞来源于SD大鼠,三四周龄,清洁级,体质量60～70 g.实验过程:采用密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,采用全骨髓法+神经干细胞培养基获得巢蛋白阳性细胞.运用NucleofectorTM技术的A33及A31程序,分别用1,5,10 μ g重组质粒pEGFP-C1转染骨髓间充质干细胞及巢蛋白阳性细胞,并将转染后的细胞分别培养在含体积分数为0.10及体积分数为0.20胎牛血清的培养基中.主要观察指标:①通过Leica DMIRE荧光显微镜F观察和计数表达绿色荧光的细胞计数转染率.②台盼蓝排斥实验检测细胞活力.③用RT-PCR法分析胰腺十二指肠同源基因1基因在转染细胞中的表达.结果:应用NucleofectorTM技术的A33程序转染神经干细胞较转染骨髓间充质干细胞的转染率高,并优于A31程序.转染后在含体积分数为0.20胎牛血清中培养的细胞24 h转染率及存活率均显著高于在含体积分数为0.10胎牛血清培养的细胞(P<0.05).RT-PCR检测转染重组质粒的巢蛋白阳性细胞中可见胰腺十二指肠同源基因1的mRNA表达,未转染胰腺十二指肠同源基因1的巢蛋白阳性细胞无胰腺十二指肠同源基因1的mRNA表达.结论:运用Nucleofector TM技术的A33程序以5 μ g的DNA转染骨髓来源的巢蛋白阳性细胞,转染后的细胞接种于含体积分数为0.20胎牛血清的培养基中可获得较高的转染效率及较高的存活率.
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胰腺干细胞体外诱导分化为胰岛素分泌细胞及对1型糖尿病模型鼠的治疗作用
背景:有实验证实人和动物起源的胚胎干细胞或成体干细胞可分化为胰岛素分泌细胞,但其分泌胰岛索的功能及对实验性糖尿病的治疗价值尚需要验证.目的:观察从大鼠的胰腺组织分离纯化干细胞在体外将诱导分化胰岛素分泌细胞后胰岛素mRNA的表达、分泌胰岛素的能力及对1型糖尿病模型鼠的治疗作用.设计:随机对照观察.单位:中日友好医院临床医学研究所.材料:实验于2004-08/2007-12在北京中日友好医院临床医学研究所病理生理研究室完成.选用8～10周龄雄性SD大鼠及雌性裸鼠各10只,均购自北京维通利华实验动物技术有限公司.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.尼克酰胺、链脲菌素均为Sigma公司产品,nestin抗体为BDBiosciences产品.大鼠胰岛素放射免疫检测试剂盒购自Linco research.胰岛索抗体及胰高糖素抗体为Santa Cruz产品.方法:应用nestin结合的免疫磁珠从SD大鼠胰腺导管细胞中分离和纯化干细胞,经体外扩增及诱导分化形成胰岛素分泌细胞.①采用RT-PCR法检测细胞分化过程中胰岛素mRNA的表达.②将干细胞经诱导分化形成的胰岛进行冰冻切片,采用免疫荧光染色观察胰岛素及胰商糖索阳性细胞表达.③对干细胞分化胰岛的胰岛素释放功能进行评价,放射免疫法测定上清中胰岛素检测干细胞分化形成的胰岛分泌胰岛素的能力.④鼠按220 mg/kg链脲菌素腹腔注射法制备为1型糖尿病模型,造模后随机摸球分为天然胰岛组及干细胞胰岛组,每组5只.将大鼠天然胰岛(SD大鼠分离)及干细胞分化形成的胰岛分别移植于糖尿病裸鼠左肾包膜下,观察移植后鼠尾静脉血糖变化.主要观察指标:①细胞分化过程胰岛索mRNA表达.②胰岛样结构中胰岛素及胰高糖素阳性细胞表达.③干细胞分化形成的胰岛分泌胰岛素情况.④移植后鼠尾静脉血糖变化.结果:①RT-PCR检测结果表明胰岛素mRNA的表达随诱导时间延长而明显升高.②免疫荧光染色结果显示胰岛结构的中间存在大量胰岛素阳性细胞,胰高糖素阳性细胞主要分布于胰岛样结构的周边.③干细胞分化的胰岛在高浓度葡萄糖刺激后明显缺乏快速相的胰岛索释放,而是表现细胞外上清中胰岛素浓度的缓慢升高.④天然胰岛组移植后3 d使血糖降低到10 mmol/L以下,至观察到60 d仍维持在正常水平:干细胞胰岛在移植后8 d使血糖降低至10 mmol/L以下,且在移植35 d后血糖逐渐升高并恢复到胰岛移植前的水平.结论:大鼠胰腺干细胞经体外扩增和诱导分化后可分化胰岛素分泌细胞,但对葡萄糖的刺激没有快速相的胰岛素分泌.将胰岛素分泌细胞移植到1型糖尿病模型裸鼠后可一定程度地改善糖代谢的紊乱.
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不同深度针刺足三里穴对健康大鼠外周血细胞形态数量及淋巴细胞增殖能力和胸腺指数的影响
目的:有研究表明,针刺足三里穴能够提高衰老机体的免疫系统功能,关于足三里穴适宜的针刺深度及对健康机体影响的研究较少.实验观察不同深度针刺足三里穴对健康大鼠免疫功能的影响.方法:实验于2006-09/10在北京联合大学生物活性物质与功能食品北京市重点实验室完成.实验选用健康清洁级雄性Wistar大鼠24只,按随机数字表法分为3组:空白组、皮下组、肌肉组,每组8只.皮F组将毫针沿15.角斜向上平刺入足三里穴皮下,肌肉组将毫针直刺入足三里穴肌肉层,留针20 min,1次/d,共14次,空白组不做针刺处理.测定针刺前后各组大鼠体质量的变化、大鼠胸腺指数、脾脏淋巴细胞增殖能力及外周血细胞计数等变化.结果:针刺作用后,肌肉组大鼠胸腺指数及淋巴细胞增殖能力均较空白组明显升高(P<0.05),皮下组和空白组大鼠胸腺指数及淋巴细胞增殖能力无统计学差异(P>0.05).肌肉组与皮下组大鼠白细胞总数、红细胞计数、血红蛋白含量及血小板总数与空白组比较,差异均不显著(P>0.05).针刺一二周后,肌肉组与皮下组大鼠体重质量均明显低于空白组(P<0.01).结论:肌肉层深层针刺足三里穴可提高健康大鼠胸腺指数及淋巴细胞增殖能力,增强大鼠机体免疫能力,同时对于机体外周血细胞无明显影响.
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神经生长因子对神经干细胞分化及神经元轴突形成的影响
背景:将大量的神经干细胞定向诱导分化后的神经细胞能否与其他神经细胞建立功能联系是目前解决神经干细胞应用于临床的重要问题之一.目的:观察神经生长因子对体外培养的神经干细胞生长和分化的影响,以及神经生长因子对神经轴突形成和生长的作用.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-06/2008-12在中国医科大学设备处完成.材料:清洁级二三天龄新生SD雄性大鼠3只,神经生长因子为peprmech公司产品.方法:酶消化和机械分离法相结合体外分离培养新生鼠神经干细胞,传至第4代的细胞克隆团行巢蛋白免疫细胞化学染色观察,剩余细胞团用机械法分散,采用有限稀释法进行单克隆神经干细胞培养.加入完全培养基制成108L-1的单细胞悬液,分为2组滴入培养板,对照组加入10%FBS,诱导组加入10%FBS+50 μg/L神经生长因子,培养5-7 d.连续观察5个神经元特异烯醇化酶染色阳性且未与其他神经元发生连接的孤立神经元,求助于以神经元为圆心的同心圆,分别计数内径为37.5 μ m和75 μm圆环内的突触数量,特两者均值视为神经元轴突数量,通过此同心圆测量长轴突的长度.主要观察指标:通过巢蛋白、神经元特异烯醇化酶、胶质原纤维酸性蚩白免疫组化染色对培养细胞进行鉴定.检测神经元数量及轴突数量、长度.结果:所培养出的细胞团均为巢蛋白阳性,诱导分化后均可产生神经元特异烯醇化酶、胶质原纤维酸性蛋白阳性细胞.诱导分化第6天,诱导组神经元数量、单个神经元轴突数量、长轴突长度均明显高于对照组0=3.301,2.982,4.012,P均<0.01).结论:神经生长因子可促进神经干细胞向神经元的分化,还可以增加由神经干细胞分化而来的神经元突起数量及长度.
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免疫磁珠法分离成人骨髓来源神经干细胞的生物学特征
背景:骨髓间充质干细胞在一定条件下可分化成为多种结缔组织细胞,也可分化成神经系统的神经元和神经胶质细胞.目的:观察采用免疫磁珠法分离成人骨髓来源神经干细胞的生物学特征.设计、时间及地点:以患者自身骨髓组织为观察对象的实验,于2003-03/2007-06在菏泽市立医院检验科完成.材料:骨髓组织来自菏泽市立医院神经内科住院的中风、老年性痴呆、帕金森病、脑缺血等神经系统疾病患者.方法:利用免疫磁珠表面的特异性抗体与骨髓组织中神经干细胞抗原相结合,在磁场作用下使结合磁珠与其他细胞分离,从而获得神经干细胞,再将所分离的纯化神经干细胞接种到含体积分数为0.20胎牛血清的Eagles MEM培养液,再在培养基中加入碱性成纤维因子和表皮生长因子进行原代培养.主要观察指标:采用免疫组织化学染色与免疫荧光染色鉴定细胞,并采用流式细胞术测定细胞DNA含量.结果:在相差显微镜下观察培养的神经干细胞,细胞形态丰满,胞核及核仁清晰可见,神经突起粗大,网络稠密.免疫组织化学和免疫荧光染色显示,细胞神经元特异性烯醇化酶、神经蛋白、胶质纤维酸性蛋白酶、微管相关蛋白为阳性.传代后的细胞用流式细胞术测定DNA含量为正常二倍体,无诱发突变.结论:利用免疫磁珠表面的特异性抗体与骨髓组织中神经干细胞抗原相结合方法从成人骨髓分离出神经干细胞,在神经化学和形态上已具备神经细胞的特征.
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自体骨髓干细胞移植治疗下肢缺血性疾病60例术
背景:动物实验已经证实,来源于骨髓或外周血干细胞能够在血管损伤部位分化形成新生血管,进而改善肢体血液供应.目的:观察自体骨髓干细胞移植治疗慢性下肢缺血的临床疗效.设计、时间及地点:自身对照加非随机对照的双盲试验,于2004-09/2007-09在山东大学附属省立医院血管外科及科研中心完成.对象:受试对象为下肢血管缺血性病变失去外科手术或介入治疗适应症,并愿意接受自体干细胞移植的患者60例,男36例,女24例,年龄33～83岁,平均65岁.方法:实验采用干细胞分离液,利用梯度密度法分离患者自体骨髓干细胞,制备干细胞悬液.根据缺血范围选取缺血肢体肌肉多点穿刺注射.主要观察指标:以治疗后6个月患者下肢疼痛症状、行走能力、皮肤溃疡、踝肱指数、足坏疽评分的变化来评价临床疗效.结果:治疗后6个月,患肢疼痛、麻木感和冷感觉改善率为78.33%,47例患者静息痛消失或明显减轻,5例患者跛行距离由不足50 m提高到大于100 m.10例伴有溃疡的患者,溃疡愈合或面积逐渐减小.11例踝肱指数增加大于0.1,4例足趾坏疽患者中1例症状明显缓解,静息痛消失,行坏疽足趾切除,愈合良好;2例疼痛消失,睡眠改善,坏疽组织有脱落迹象:1例于膝下截肢.结论:自体骨髓干细胞移植对肢体疼痛、冷感、麻木疗效确切,对创面愈合有促进作用.
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大鼠神经干细胞与"癫痫样细胞"体外共培养后的分化发育料
背景:在癫痫微环境神经干细胞能否被诱导分化为异常放电的"癫痫神经元"?癫痫微环境包括两种情况:一是"无镁"细胞外液,二是与癫痫细胞共培养.其中前者比后者的致癫痫作用强.目的:模型模拟体内癫痫微环境,将大鼠海马神经干细胞和正常海马神经元以及"癫痫神经元"体外共培养,观察干细胞的分化发育情况.设计:重复测量观察.单位:哈尔滨医科大学附属第一医院.材料:实验于2005-08/2007-04在哈尔滨医科大学病原学教研室及药理学教研室完成,选用150只新生Wistar大鼠,雌雄不拘,由哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.兔抗鼠突触素抗体购自美国LabVision公司.携带增强型绿色荧光蛋白标记基因的血清型2型腺相关病毒购自北京本元正阳公司.Axopatch 200B放大器为美国Axon公司产品.5111A示波器为美国Tektronix公司产品.方法:①分离大鼠海马神经元,采用"无镁"外液处理神经元建立"癫痫神经元"模型.常规方法培养大鼠海马神经干细胞,将绿色荧光蛋白标记的神经干细胞分别与正常海马神经元、"癫痫神经元"共培养14 d.②应用膜片钳记录与两种神经元共培养后细胞突触后电位:利用免疫荧光检测神经干细胞突触素抗体染色情况:将神经干细胞分化的神经元放入"无镁"外液,应用膜片钳记录其突触后电位.主要观察指标:①海马神经干细胞与两种神经元共培养14 d后突触后电位、突触素抗体染色结果.②分化后神经元在.无镁"外液中突触后电位及"癫痫样放电"情况.结果:①神经干细胞与正常海马神经元共培养后,膜片钳记录到60%(6/10)神经干细胞14次/5min兴奋性突触后电位;与"瘴痫神经元"共培养后记录到12次/5 min兴奋性突触后电位.②神经干细胞分别与正常海马神经元及"癫痫神经元"共培养后,免疫荧光检测均显示80%(12/15)表达绿色荧光蛋白的干细胞突触索抗体染色阳性.③60%(9/15)干细胞分化的神经元在"无镁"外液中出现14次/5 min时程约10 s的兴奋性突触后电位,未记录到"癫痫样放电".结论:大鼠海马神经干细胞与"癫痫神经元"体外共培养后可形成功能性突触,未转变成"癫痫神经元".
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小鼠骨髓组织细胞微核DAPI染色法
实验将DAPI染色方法运用到小鼠微核检测中.选取20只小鼠随机分为实验组和对照组,每组10只.2组均往小鼠腹腔注射环磷酰胺60 mg/kg,1次/d,连续注射3 d.实验组采用DAPI染色;对照组采用10%的Giemsa染色.结果显示,实验小鼠骨髓组织细胞微核DAPI染色特异性强,易判断,对照组Giemsa染色结果特异性差,且不能排除染色过程中Giemsa染液中的染色颗粒沉淀的干扰,这样就使Giemsa染色后,对微核的判断造成困难.本实验建立了小鼠骨髓组织细胞微核DAPI染色方法,检测效果好,特异性强.
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共培养法神经细胞诱导骨髓间充质干细胞向神经元的分化
背景:目前神经细胞是否具有直接诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元的作用还未见报道.目的:拟在体外建立人骨髓间充质干细胞和神经细胞的共培养体系,观察共培养条件下神经细胞对骨髓间充质干细胞分化为神经元的影响.设计、时间及地点:分组对照,体外细胞学实验,于2006-12/2007-12在山东省青岛大学医学院附属医院中心实验室完成.材料:骨髓间充质干细胞来源于青岛大学医学院附属医院行自体干细胞移植治疗的糖尿病患者骨髓血,神经细胞取材于分娩过程中窒息死亡的新生儿脑组织,传至第3代用于实验.用于细胞共培养的Transwell双层培养皿为Coming Costar公司产品,培养体系孔径小于3.0 μm,细胞不会迁徙通过,但上、下层培养液可互通融合.方法:共培养组将神经细胞按1×106密度接种于Transwell双层培养皿的底层,上层接种骨髓间充质干细胞,加入LG-DMEM培养基,培养4～5 d.对照组上、下层均接种骨髓间充质干细胞.主要观察指标:观察骨髓间充质干细胞的形态变化,免疫荧光染色检测骨髓间充质干细胞中神经元特异性标志物的表达.结果:共培养组骨髓间充质干细胞生长伸展,呈放射状突起,并可相互连接,神经元特异性烯醇化酶阳性率为(32.7±11.5)%,表现神经元细胞的特性.对照组骨髓间充质干细胞形状扁而宽,未形成神经样形态结构,神经元特异性烯醇化酶呈阴性.结论:神绛细胞生长过程中提供的微环境对骨髓间充质干细胞分化为神经元具有诱导促进作用.
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骨髓间充质干细胞在含转化生长因子β1诱导培养基及二维培养条件下向软骨细胞的分化
背景:骨髓间充质干细胞可定向诱导为软骨细胞.目的:建立二维培养条件下骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的诱导体系,分析转化生长因子β 1作为诱导条件的佳浓度,以及诱导骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞的相关影响因素,观察细胞诱导后的细胞形态及表型变化.设计:随机对照动物实验.单位:贵阳医学院动物实验中心.材料:实验于2005-09/2006-11在贵阳医学院动物实验中心完成.4周龄雄性SD大鼠24只由贵阳医学院动物中心提供,体质量(98.23±7.97)g,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.方法:取SD大鼠的股骨及胫骨,采用贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,取第4代骨髓间充质干细胞行流式细胞术检测鉴定其表面抗原,分别以含1,5,10,15,20 μ g/L 的转化生长因子β 1的诱导培养基在二维培养条件下对第4代骨髓间充质干细胞诱导培养,对照组加入阴性诱导培养基.2周后采用免疫组织化学法对Ⅱ型胶原进行定性检测,采用二甲基亚甲蓝比色法定量检测诱导后细胞外基质糖胺多糖的表达.主要观察指标:各组细胞表面抗原检测、Ⅱ型胶原定性检测及细胞外基质糖胺多糖表达检测.结果:贴壁培养法可分离并纯化SD大鼠的骨髓间充质干细胞,所得第4代骨髓间充质干细胞表面抗原CD44阳性,CD34、CD45阴性.经诱导培养2周后细胞形态变为不规则,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示,15,10,15,20 μg/L 转化生长因子β1组可见阳性细胞,二甲基亚甲蓝比色法检测显示各实验组细胞外基质糖胺多糖含量均明显高于对照组(P<0.01).10 μg/L 转化生长因子β 1组细胞分泌的细胞外基质糖胺多糖明显多于其它剂量组(P<0.01),并且细胞分泌细胞外基质糖胺多糖的能力与细胞密度呈正相关(r=0.822,P<0.01).结论:10 μg/L转化生长因子β 1存在的二维培养条件下,较高的细胞密度有利于骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化.
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人骨髓间充质干细胞源性多巴胺神经元的结构和功能特征
背景:研究人骨髓间充质干细胞定向分化为多巴胺神经元及分化后细胞的功能特征,对细胞移植治疗包括帕金森病在内的神经精神性疾病具有重要临床意义.目的:采用脑源性神经营养因子、forskolin及多巴胺联合诱导人骨髓间充质干细胞向多巴胺神经元定向分化,观察诱导产生的多巴胺神经元的结构和功能.设计:随机对照观察.单位:郑州大学及河南大学.材料:实验于2005-03/2006-09在郑州大学和河南大学实验室完成.实验用骨髓取自15名健康志愿者.脑源性神经营养因子、多巴胺、forskolin及单克隆抗体酪氨酸羟化酶为美国Sigma公司产品.方法:①通过密度梯度离心获取人骨髓中的单个核细胞,贴壁培养纯化骨髓间充质干细胞.采用50 μmol/L 脑源性神经营养因子,10 μ mol/Lforskolin和10 μmol/L多巴胺联合对骨髓间充质干细胞进行诱导.②诱导2周后应用电子显微镜观察细胞超微结构;免疫细胞化学染色检测神经元烯醇化酶(NSE)和酪氨酸羟化酶(TH)的表达:采用RT-PCR检测多巴胺神经元分化过程中转录因子Nmr1,Ptx3,Lam1b及酪氨酸羟化酶mRNA表达;同时以未诱导的细胞为对照,应用高效液相色谱检测细胞多巴胺的释放水平.主要观察指标:①细胞超微结构.②NAE和TH的表达变化.③细胞内关键转录因子及酪氨酸羟化酶mRNA变化.④细胞释放多巴胺情况.结果:①细胞超微结构:诱导2周后细胞胞浆中有大量密集的呈扁平囊状的粗面内质网及其间的一些游离核糖体以及神经微丝的形成.②NSE和TH表达的变化:免疫细胞化学染色结果表明诱导分化后NSE和TH阳性细胞的表达随诱导时间的延长逐渐增高(P<0.001).③细胞内酪氨酸羟化酶及关键转录因子变化:RT-PCR结果显示细胞均可表达Nurr1,Ptx3,Lmx1b和酪氨酸羟化酶的mRNA.④细胞释放多巴胺情况:诱导2周后的细胞多巴胺释放水平高于未经诱导的细胞,差异有统计学意义(P<0.05).结论:脑源性神经营养因子、forskolin及多巴胺可在体外诱导人骨髓间充质干细胞向多巴胺神经元分化,并具有多巴胺神经元的结构和功能特征.
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人转化生长因子β1基因转染骨髓基质干细胞复合藻酸钙修复骨软骨缺损
目的:拟利用人转化生长因子β 1基因转染骨髓基质干细胞,再与可降解藻酸钙材料复合构建具有较好生物学活性的组织工程化人工骨软骨,以期获得良好的软骨间整合.方法:雄性12个月龄的崇明山羊18只.由上海交通大学附属第九人民医院动物实验中心提供.携带人转化生长因子β 1基因的重组腺病毒由上海交通大学附属第九人民医院骨科研究室提供.制备藻酸钙凝胶的氯化钙、藻酸钠为Gibco公司产品.从羊髂嵴抽取8 mL骨髓,贴壁法分离培养骨髓基质干细胞,传至第3代以携带人转化生长因子β 1基因的重组腺病毒转染过夜.18只山羊均于双膝股骨内髁负重区建立骨软骨缺损模型,造模后分为3组,6只,组:转染细胞-藻酸钙组将转染人转化生长因子β 1基因的骨髓基质干细胞悬于1.2%藻酸钠中,调整细胞密度为5×1010L-1,吸取5 mL注入骨软骨缺损处,随后缓慢滴入过量的2.5%氯化钙,使氯化钙与藻酸钠发生交联反应形成藻酸钙凝胶.复合对照组同法注入未转染人转化生长因子β 1基凼的骨髓基质干细胞-藻酸钙凝胶,模型组不给予任何干预.转染后Western blot法检测细胞外源基因的表达.移植后组织形态学检查及缺损评分.结果:人转化生长因子β 1基因转染后,骨髓基质干细胞表达人转化生长因子β 1,并分泌细胞外基质Ⅱ型胶原及Aggrecan.移植后24周,转染细胞-藻酸钙组缺损获得类透明样软骨修复,复合对照组及模型组均为纤维组织或纤维样软骨修复.与模型组比较,移植后第12,24周复合对照组、转染细胞.藻酸钙组骨软骨缺损组织形态学评分均明显升高(P<0.05),且转染细胞-藻酸钙组升高幅度显著大于复合对照组(P<0.05);转染细胞.藻酸钙组缺损评分随着修复时间的延长而明显升高(P<0.05).结论:实验成功将组织工程学与分子生物学有机结合,经基因修饰的骨髓基质干细胞可使人转化生长因子β1持续高效发挥作用,并逐步转化为成熟的软骨细胞且分泌软骨基质,与藻酸钙复合修复骨软骨缺损效果满意.
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自发性高血压大鼠骨髓来源内皮祖细胞数量、功能及吡格列酮的预处理
背景:研究证明过氧化物酶体增殖物激活受体γ具有上调内皮祖细胞的功能.目的:验证过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂吡格列酮对体外培养自发性高血压大鼠骨髓来源内皮祖细胞数量及功能的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-05/08在解放军第四军医大学西京院心脏内科国家重点实验室完成.材料:选取清洁级自发性高血压大鼠及周龄、体质量相匹配的正常血压WKY大鼠各20只.方法:随机将自发性高血压大鼠及正常血压WKY大鼠各分为药物组和对照组,每组10只.分别给予毗格列酮(20 mg/kg·d)或等量生理盐水预处理14 d.于试验开始前1 d和结束当天分别测各组大鼠尾动脉收缩压.以密度梯度离心法分离骨髓来源单个核细胞体外培养,差速贴壁法培养收集贴壁细胞.主要观察指标:鉴定内皮祖细胞;测定内皮祖细胞数量;采用四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖活力及一氧化氮分泌功能.结果:吡格列酮治疗后,正常WKY大鼠内皮祖细胞数量、增殖及一氧化氮分泌功能无明显变化:自发性高血压大鼠内皮祖细胞数量增加,增殖能力增强,一氧化氮分泌增加,3项与对照组比较,差异均具有显著性意义(P<0.01,P<0.05,P<0.01).结论:吡格列酮预处理能上调其骨髓来源内皮祖细胞数量,并通过促进其增殖和一氧化氮分泌功能,对内皮祖细胞有保护作用.
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二甲基亚砜诱导成年大鼠骨髓基质细胞转分化为胰岛样细胞
背景:已有报道,二甲基亚砜可使骨髓基质细胞分化为神经元,那么可否用二甲基亚砜诱导骨髓基质细胞向nestin阳性细胞分化,继而向胰岛分化.目的:探讨二甲基亚砜对成年大鼠骨髓基质细胞定向诱导分化为胰岛样细胞团的作用.设计:以细胞为观察对象,随机对照,体外实验.单位:河北北方学院医学院组织学与胚胎学教研室.材料:实验于2006-05/2007-07在河北北方学院组胚教研室细胞审完成.选取6～8周龄Wistar大鼠10只,性别不拘,由解放军军事医学科学院实验动物中心提供.实验用分析纯二甲基亚砜购自北京市化学试剂厂,反转录聚合酶链反应系统为Promega公司产品(A3500),Taq酶和DNA marker DL2000购自北京天为时代生物技术有限公司,鼠抗人胰岛素单克隆抗体(ZM20155)、兔抗人胰高血糖素多克隆抗体(zA20119)购自北京中杉金桥生物技术有限公司,兔抗人nestin多克隆抗体(与大鼠组织有良好的交叉反应,可用于检测人、大鼠等哺乳动物组织)、SABC试剂盒购自武汉博士德公司,大鼠胰岛素放射免疫试剂盒,购自美国Linco公司.方法:骨髓基质细胞以含体积分数0.1胎牛血清的H-DMEM培养60 min,收集未贴壁细胞以含10 g/L二甲基亚砜的无血清H-DMEM作为诱导液,以109/cm2密度接种于6孔板,诱导3 d,继之用体积分数0.1胎牛血清的H-DMEM培养7 d.主要观察指标:用DTZ染色观察诱导细胞团的形态,免疫细胞化学染色检测巢蛋白、胰岛素、胰高血糖素、生长抑索的定位:反转录聚合酶链反应检测诱导细胞团的内分泌基因表达;放免分析检测细胞团的胰岛素分泌量.结果:①骨髓基质细胞分化的细胞团形态:骨髓基质细胞为典型的成纤维细胞样或葡萄样贴壁细胞,经二甲基亚砜诱导3 d后,出现胰岛样细胞团,经DTZ染色显示了和胰岛同样的特性.②免疫细胞化学染色显示:二甲基亚砜诱导后1 d骨髓基质细胞表达nestin蛋白,诱导10 d表达胰岛素和胰高血糖素;未经二甲基哑砜诱导的骨髓基质细胞则不表达胰岛素和胰高血糖素.③反转录聚合酶链反应结果显示:骨髓基质细胞经二甲基亚砜诱导后胰岛样细胞团表达insulin1,insulin2,glucagon和somatostain基因.④细胞团的胰岛索分泌量:胰岛样细胞团对葡萄糖刺激敏感,低糖(3.3 mmol/L)和高糖条件下(16.7 mmol/L)胰岛素分泌量分别为5.56和24.5μU/mL.结论:体外经二甲基亚砜诱导的大鼠骨髓基质细胞可定向分化为胰岛样细胞.
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骨髓间充质干细胞对肺损伤大鼠转化生长因子β及单核细胞趋化蛋白1的影响
背景:转化生长因子β及单核细胞趋化蛋白1是肺纤维化形成过程中的重要细胞因子,已证实骨髓间充质干细胞可降低损伤肺组织中的胶原含量,减轻肺纤维化.目的:观察骨髓间充质干细胞对肺损伤大鼠转化生长因子β及单核细胞趋化蛋白1的影响.设计、时间及地点:随机对照,细胞学体外实验,于2005-05/2006-02在解放军第四军医大学完成.材料:清洁级雌性SD大鼠20只,随机分为正常对照组、细胞对照组、肺损伤组、细胞移植组,5只/组.雄性SD大鼠5只用于骨髓间充质干细胞的采集.方法:肺损伤组、细胞移植组大鼠经气管注入5 mg/kg博来霉素0.2～0.3 mL诱发建立肺损伤模型.造模后12 h,细胞移植组、细胞对照组大鼠经尾静脉注入骨髓间充质干细胞悬液0.5 mL,约5×106个细胞;肺损伤组、正常对照组大鼠同法注入无血清DMEM-F12 0.5 mL.主要观察指标:苏木精-伊红染色观察肺组织形态学变化.酸解法测定肺组织羟脯氨酸含量.ELISA法检测血清及支气管肺泡灌洗液中转化生长因子β、单核细胞趋化蛋白1的表达.结果:细胞移植2周后,正常对照组及细胞对照组的肺泡腔均匀完整;肺损伤组的肺泡结构破坏,肺泡间隔增厚,间质增生;细胞移植组肺损伤程度明显减轻.与正常对照组比较,肺损伤组、细胞移植组的肺组织羟脯氨酸含量均显著升高(P<0.01或0.05),细胞移植组升高幅度明显低于肺损伤组(P<0.01).各组大鼠血清及支气管肺泡灌洗液中转化生长因子β、单核细胞趋化蛋白1的表达水平与肺组织羟脯氨酸含鼍基本相似.结论:骨髓间充质干细胞可减少肺损伤大鼠肺组织羟脯氨酸含量,减轻大鼠肺损伤及纤维化程度,可能与降低转化生长因子β、单核细胞趋化蛋白1的表达有关.
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人血管内皮生长因子与绿色荧光蛋白标记双基因共表达AAV载体的构建及鉴定
背景:血管内皮生长因子能促进内皮细胞分裂增殖及血运重建,诱导血管生成,近年来以血管内皮生长因子为基础的基因治疗已逐步试用于临床.但质粒载体转染率低、腺病毒载体对机体的免疫原性及存在潜在感染危险等问题尚需探讨.目的:拟构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒,鉴定并测定病毒滴度及活性.设计、时间和地点:开放性实验,于2007-03/09在陕西省疾病预防控制中心病毒室完成.材料:病毒包装细胞AAV-293、病毒滴度检测细胞AAV-HT1080购自Stratagene公司;Ecoli DH5.菌株由陕西省疾病预防控制中心保存:AAV helper-free system腺相关病毒包装系统中pAAV-IRES-hrGFP质粒包含绿色荧光报告基因,购自Stratagene公司;重组携带hVEGF165基因的质粒pUC18-hVEGF165由西安交通大学第二医院骨科时志斌博士构建.方法: 从含有hVEGF165基因的pUC18-hVEGF165质粒中扩增出hVEGF165片段,插入腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-hrGFP,构建重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP.将此重组质粒和腺相关病毒包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper磷酸钙法共转染AAV-293细胞,通过同源重组产生重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-GFP.荧光显微镜下监测病毒包装效率,裂解AAV_293细胞收获重组病毒并进行浓缩纯化.应用该重组病毒感染AAV-HT1080细胞,荧光计数法测定病毒滴度,并通过病毒基因组外源基因hVEGF165扩增鉴定重组病毒的包装是否成功.应用该重组病毒感染AAV-HT1080细胞.主要观察指标:荧光显微镜下监测病毒包装效率.荧光计数法测定病毒滴度,并通过病毒基因组外源基因hVEGF165扩增鉴定重组病毒的包装是否成功.结果:扩增产物经DNA测序确定为hVEGF165 cDNA片段,重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP经双酶切鉴定正确.病毒包装效率达95%以上,收获纯化病毒滴度达5.5×1011vg/mL.提取重组病毒基因组成功扩增出外源目的基因片段hVEGF165,证实重组病毒rAAV-VEGF165-GFP包装成功.结论:成功构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒rAAV-VEGF165-GFP.收获的病毒具有较高滴度和感染活性.
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人脐血单个核细胞移植对裸鼠造血及免疫功能的影响
随机对照动物实验,于2006-11/2007-02在辽宁医学院SPF级动物实验室完成.应用60Co对Balb/C nu+裸鼠进行移植前放射.照射后脐血移植组输入新鲜人脐血单个核细胞,对照组输入生理盐水.结果移植组小鼠存活率及存活时间均明显高于对照组.骨髓中人CD45+细胞2周时就已出现,随后迅速上升,4～8周维持较高水平,8周时达高,8周后明显下降,至12周时仍可检测出.脐血移植后2周,在小鼠的骨髓、外周血中出现了人类特异性Cart-1基因.并继续存在至12周.对照组未检测到人DNA.证实人脐血干细胞移植能在免疫缺陷BALB/cnu+裸鼠体内成功植入,使免疫缺陷小鼠获得造血和免疫重建.
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大量活性神经元细胞核的分离技术
背景:细胞分化、细胞融合乃至克隆均需要应用分离细胞核的方法以获得大量有活性的细胞核,但是目前很难在数量和质量上同时达到较高的水准.目的:探索简单易行的分离细胞核的方法,为神经元细胞核移植、细胞拆合以及细胞核成分的研究提供大量完好有活性的细胞核.设计、时间及地点:对比实验,于2006-09/2007-01在南京医科大学基础医学院卫生部抗体技术重点实验室完成.材料:Cytochalasin B为Sigma公司提供,清洁级SD孕大鼠来源于南京医科大学动物实验中心.方法:取胎鼠大脑皮质,进行神经元的培养并鉴定.用Cytochalasia B结合梯度离心法及细胞核分离液法两种方法进行细胞核分离的对比观察.主要观察指标:用碘化丙啶标记后进行流式细胞仪检测凋亡率并用免疫荧光染色对细胞核进行形态学观察.结果:两种方法均成功地分离出大量有活性神经元细胞核,且梯度离心法可以得到较为完整的胞质体,与完整细胞细胞核荧光强度比较无显著性差异(P>0.05).结论:Cytochalasin B结合梯度离心法及细胞核分离液法均能够有效地进行神经元细胞核的分离,且细胞核在短期内有较高的活性.
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小鼠异基因骨髓移植继发急性移植物抗宿主病细胞因子的表达
背景:急性移植物抗宿主病仍然是限制异基因造血干细胞移植临床应用的主要障碍之一,已证实造成发病的首要因素是转化生长因子β1、肿瘤坏死因子α、干扰素γ等分泌异常.目的:拟通过建立小鼠异基因骨髓移植模型诱导急性移植物抗宿主病反应,检测外周血血清中Th1及Th2型代表因子干扰素γ、白细胞介素4的表达水平,分析其与急性移植物抗宿主病严重程度的关系.设计、时间及地点:随机对照体内移植实验,于2005-08110在北京口腔医院动物部及首都医科大学附属北京友谊医院完成.材料:清洁级C57BL/6(H-2b)雄鼠20只作为供鼠用于制备骨髓细胞及脾脏淋巴细胞,BALB/c(H-2d)雌鼠50只作为受鼠,随机分为正常对照组10只、骨髓细胞移植组20只、混合移植组20只.方法:骨髓细胞移植组、混合移植组均给予总剂量9.0Gy的6MV-X射线照射,前者经尾静脉单纯输入异基因骨髓细胞2.0×107个,后者混合输入异基因骨髓细胞、脾脏淋巴细胞各2.0×107个.主要观察指标:记录小鼠生存时间,计数外周血白细胞,ELISA法测定移植后不同时间外周血血清中细胞因子水平,苏木精-伊红染色观察组织病理学变化.结果:骨髓细胞移植组从第8天开始出现死亡,混合移植组从第4天开始出现死亡.前者平均生存时间明显长于后者,Kaplan-Meier法检验P<0.05.移植后第7天,骨髓细胞移植组白细胞数明显低于混合移植组(P<0.05),第14,21天两组白细胞数比较差异无显著性意义(P>0.05).与骨髓细胞移植组比较,移植后第7,14天混合移植组白细胞介素4水平明显降低(P<0.05,P<0.01),干扰素γ水平明显升高(P<0.05).骨髓细胞移植组镜下可见肝细胞轻度变性,小肠有少量淋巴细胞浸润,病理分级为Ⅰ、Ⅱ级.混合移植组肝细胞呈不同程度的变性或坏死,小肠绒毛坏死脱落,黏膜下层大量淋巴细胞浸润,病理分级为Ⅲ-Ⅴ级.结论:随着急性移植物抗宿主病程度的加重,血清白细胞介素4水平明显下降,干扰素y水平显著升高,尤其在发病早期两种细胞因子变化更为明显.
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自体骨髓基质细胞源神经干细胞移植治疗持续性植物状态
背景:前期动物脑干损伤模型实验中观察到骨髓基质细胞源神经干细胞移植后对脑干损伤具有趋化作用.目的:观察骨髓基质细胞源性神经干细胞移植治疗持续性植物状态的可行性及临床效果.设计、时间及地点:自身对照观察实验,于2002-10/2006-12在解放军北京军区总医院神经外科进行.对象:选择持续性植物生存患者45例,年龄3.5～56.0岁,男28例,女17例.方法:患者入院后进行意识指数评分、各项术前常规检查、脑电图、听觉诱发电位检测.取患者自体骨髓20～30 mL,分离出骨髓基质细胞,再经过扩增及预分化处理后,将骨髓源神经干细胞制成109 L-1浓度.经开颅或立体定向及导管介入将骨髓基质源神经干细胞植入脑内特定区域,靶区为损伤脑区皮质、室管膜下区、纹状体区、丘脑底核或患侧大脑中动脉、椎动脉.主要观察指标:3～4月后检查记录昏迷指数、脑电图、听觉诱发电位,并与治疗前进行对比.结果:全部患者干细胞移植后,生命指征均平稳.5例有短时发热,经对症处理体温恢复正常.3～4个月后随访复查,患者意识(昏迷)指数、脑电图、听觉诱发电位均明显改善.结论:骨髓基质细胞源性神经干细胞移植治疗战创伤性脑损伤及其后遗症,具有促进中枢神经系统组织及功能恢复的作用.
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重组人促红细胞生成素联合骨骼肌卫星细胞移植对免急性心肌梗死的影响
背景:研究发现促红细胞生成素尚具有多种非血液系统生理效应,如参与哺乳动物胚胎的正常发育、抑制炎症、促进血管生长.以及在多种组织和细胞损伤中抑制细胞凋亡、减少梗死面积、促进功能恢复等作用.目的:观察重组人促红细胞生成素与骨骼肌卫星细胞联合移植对兔急性心肌梗死是否具有积极作用?设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-01/07在深圳市人民医院中心实验室完成.材料:自体移植:清洁级雄性新西兰大白兔50只,随机分为假手术组、模型对照组、细胞移植组、重组人促红细胞生成素组、联合组,10只/组.异体异性移植:同品系雄性新西兰大白兔10只,作为供体用于制备骨骼肌卫星细胞;另取雌性兔10只作为受体,分为细胞移植组、联合组,5只/组.重组人促红细胞生成素为沈阳三生制药股份有限公司产品.方法:自体移植实验:除假手术组外,其余4组建立急性心肌梗死模型.重组人促红细胞生成素组、联合组在冠脉结扎同时,采用肌注法一次性给予重组人促红细胞生成素3 000 U/kg;细胞移植组、联合组将含有约107个骨骼肌卫星细胞的DMEM溶液200 μ L多点直接注射在心脏表面梗死区.异体异性移植实验:细胞移植组、联合组均建立急性心肌梗死模型,根据分组要求注射骨骼肌卫星细胞和重组人促红细胞生成素,浓度及方法同上,5 d后取材行PCR检测.主要观察指标:测定心肌梗死面积,免疫组织化学法检测心肌组织血运改善及desmin表达,荧光检测骨骼肌卫星细胞,SRY基因PCR检测结果.结果:移植后4周与模型对照组比较,细胞移植组、重组人促红细胞生成素组、联合组心肌梗死面积均明显减小(P<0.05),且联合组减小幅度强于另外两组(P<0.05).各组梗死中心区CD34阳性细胞数量与上面结果相似.细胞移植组、联合组心肌组织desmin呈阳性表达,其余3组呈阴性.联合组移植区DAPI标记的蓝色荧光细胞数较细胞移植组明显增多.异体异性移植实验中,联合组SRY基因扩增条带的宽度和亮度均明显强于细胞移植组.结论:重组人促红细胞生成素与骨骼肌卫星细胞联合移植能够进一步缩小兔心肌梗死面积,改善梗死区血运,提高骨骼肌卫星细胞移植后的存活率,二者对治疗急性心肌梗死具有协同作用.
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人β-干扰素核基质附着区在CHO细胞中对转基因表达的调控
背景:核基质附着区是染色质被限制酶消化后仍附着在核基质上的DNA序列,不仅可影响邻近内源基因的表达,还能克服转基因沉默,提高外源基因的转录与表达.目的:探讨在CHO细胞中β-干扰素核基质附着区对氯霉素乙酰转移酶转基因表达的影响.设计、时间及地点:开放性实验,于2006-10/2007-04在新乡医学院生物化学与分子生物学实验室及分子研究室完成.材料:CHO细胞株由中国典型培养物保藏中心提供.含氯霉素乙酰转移酶报告基因及G418筛选标记的质粒pCATG载体由本实验室构建.方法:将PCR扩增得到的人β-干扰素核基质附着区分别用Sac I/Kpn I及BamHI/SalI酶切,连接至用相应内切酶酶切的pCATG载体上,转化E.coliJM109,提取质粒行酶切电泳,将构建好的载体命名为pCAT-MAR,该载体含氯霉素乙酰转移酶报告基因表达盒及两侧的β-干扰素核基质附着区.分别用载体pCATG及pCAT-MAR转化CHO细胞,提取具有G418抗性的细胞株基因组DNA,PCR扩增氯霉素乙酰转移酶基因.主要观察指标:ELISA法分析氯霉素乙酰转移酶报告基因的表达.PCR法检测pCAT-MAR载体是否稳定整合在宿主基因组上.结果:①pCATG转化的CHO细胞共筛选出16个阳性细胞株,pCAT-MAR转化的CHO细胞筛选出17个阳性细胞株.β-干扰素核基质附着区可使氯霉素乙酰转移酶报告基因表达水平提高2.8倍,pCATG转化CHO细胞的变异系数为2.065 0,PCAT-MAR转化CHO细胞的变异系数仅为0.8131.②稳定转化的细胞株基因组DNA均扩增出437 bp目的片段,证明pCAT-MAR载体已经稳定整合到基因组上.结论:β-干扰素核基质附着区能提高转基因在CHO细胞的表达水平,并且可降低不同转化细胞株之间转基因表达的差异性.
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骨髓间充质干细胞联合来氟米特对小鼠淋巴细胞增殖的抑制
背景:来氟米特是一种新型的免疫抑制剂,其活性产物A771726在体外能抑制增生分裂细胞的二氢乳清酸脱氢酶和酩氨酸激酶的活性,抑制活化淋巴细胞的增殖.目的:观察骨髓间充质干细胞在体外联合来氟米特对小鼠淋巴细胞增殖的抑制效应.设计、时间及地点:随机对照,细胞学免疫调控实验,于2007-06/11在江苏大学附属医院中心实验室完成.材料:清洁级5～6周龄BALB/c雌性小鼠42只,18只分离制备骨髓间充质干细胞,传至第3代用于实验:24只用于制备脾淋巴细胞.来氟米特活性代谢产物A771726由美国欣凯公司肖飞博士惠赠.非特异性有丝分裂原ConA、脂多糖为sigma公司产品.方法:将制备的T、B淋巴细胞恳液分为骨髓间充质干细胞组、来氟米特组、骨髓间充质干细胞+来氟米特组.其中骨髓间充质干细胞浓度为2×108L-1,骨髓间充质干细胞数:淋巴细胞数=1:30,来氟米特终浓度为15 mg/L,此外各组加入5 mg/L非特异性有丝分裂原ConA或25 mg/L脂多糖.主要观察指标:MTT法检测T、B淋巴细胞增殖抑制率.通过表面标志检测T、B淋巴细胞活化情况.流式细胞仪测定T淋巴细胞凋亡程度.RT-PCR法榆测T淋巴细胞干扰素γ、白细胞介素10、白细胞介素4 mRNA表达水平.结果:与阳性对照比较,骨髓间充质干细胞组、来氟米特组、骨髓间充质干细胞+来氟米特组T淋巴细胞体外增殖抑制率均明显提高(P<0.05),且后者变化幅度大于前两组(P<0.05):各组B淋巴细胞增殖抑制情况与上述结果相似.与阳性对照比较,各组T淋巴细胞CD3+CD69+、CD3+CD28+的表达以及B淋巴细胞CD19+CD69+、CD19+CD86+的表达均基本相似:骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞+来氟米特组T淋巴细胞凋亡率明显下降(P<0.05).与阳性对照比较,骨髓间充质干细胞+来氟米特组可使T淋巴细胞干扰素γ mRNA提高、白细胞介素10 mRNA降低(P<0.05),白细胞介素4 mRNA表达无变化,且其前2项指标变化幅度明显大于骨髓间充质干细胞组、来氟米特组(P<0.05).结论:骨髓间充质干细胞与来氟米特体外联合,能抑制T淋巴细胞凋亡,可协同抑制T、B淋巴细胞增殖、白细胞介素10 mRNA表达,协同促进干扰素γ mRNA的表达,对T、B淋巴细胞活化、白细胞介素4 mRNA表达无影响.
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促红细胞生成素对人骨髓间充质干细胞增殖和细胞周期的影响
背景:促红细胞生成素能够促进内皮祖细胞增殖、迁延形成新生血管,因此促红细胞生成素可能在骨髓间充质干细胞增殖分化中起重要作用.目的:观察促红细胞生成素对人骨髓间充质干细胞增殖和细胞周期的影响.设计、时间及地点:于2007-07/11在兰州军区兰州总医院血液病研究所完成对比观察性细胞实验.材料:骨髓液标本来源于自愿捐献患者,所有患者对实验知情同意,并经医院伦理委员会批准.方法:采用Percoll淋巴细胞分离液,以密度梯度离心法分离人骨髓间充质干细胞,采用流式细胞仪榆测第2,3代细胞增殖周期.在无血清条件下,以0.25,0.50,1.00,2.00,5.00 U/mL的促红细胞生成素与骨髓间充质干细胞共培养,以不加促红细胞生成素培养的骨髓间充质干细胞为对照;将10 U/mL促红细胞生成素与骨髓间充质干细胞共培养72 h,应用流式细胞仪检测细胞周期情况.主要观察指标:①培养24,48,72 h后,以MTT方法检测骨髓间充质干细胞增殖情况.②10 U/mL促红细胞生成素与骨髓间充质干细胞共培养72 h,流式细胞仪检测细胞周期情况.结果:骨髓间充质干细胞与促红细胞生成素共培养后,骨髓间充质干细胞的增殖指数明显增加,促红细胞生成素呈时间、剂量依赖性促进骨髓间充质干细胞增殖,以5 U/mL促红细胞生成素促骨髓间充质干细胞增殖作用明显.与对照组比较,促红细胞生成素干预组G0/G1期比例降低,S期和G2/M期细胞比例增加,两组差异显著(P<0.05).结论:在促红细胞生成素培养条件下可以促进更多的骨髓间充质干细胞进入DNA合成期,从而有更多的细胞分裂,产生大量的增殖细胞,并且这种影响呈时间、剂量依赖性.
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染料木黄酮诱导HL-60细胞凋亡的作用途径
背景:近年的研究发现,染料木黄酮具有抗氧化、抑制血管生成、调节细胞周期等生物活性.目的:观察染料木黄酮在体外诱导HL-60细胞凋亡过程中,对HL-60细胞c-Myc,Bcl-2和增殖细胞核抗原表达水平的影响,并分析其作用途径.设计、时间及地点:对比观察的细胞分子生物学实验,于2006-03/2007-09在广东医学院血液疾病研究室完成.材料:人早幼粒细胞白血病细胞株HL-60来源于中国典型培养物保藏中心.方法:HL-60细胞分别以0.1,0.5和1.0 mmol/L的染料木黄酮处理12～16 h,显微镜下观察并经DNA凝胶电泳检测细胞凋亡情况.分别经碘化丙啶染色和经异硫氰酸荧光素标记的鼠抗人Bcl-2,c-Myc及增殖细胞核抗原单克隆抗体作用后,用流式细胞仪检测凋亡细胞和Bcl-2,c-Myc和增殖细胞核抗原阳性细胞的表达百分率.主要观察指标:①HL-60凋亡细胞的形态学变化.②HL-60细胞凋亡百分率和c-Myc,Bcl-2及增殖细胞核抗原表达阳性率.结果:①HL-60细胞经染料木黄酮处理12～16 h,显微镜下可见核碎裂和凋亡小体等细胞凋亡形态学改变:DNA凝胶电泳显示典型的凋亡DNA梯形条带.②0.1～1.0 mmol/L的染料木黄酮在诱导HL-60细胞凋亡同时,下调Bcl-2,c-Myc和增殖细胞核抗原表达水平,且均呈剂量效应关系.结论:染料木黄酮可能通过抑制Bcl-2和c-Myc的表达水平从而诱导HL-60细胞凋亡;而增殖细胞核抗原表达下调,则可能是染料木黄酮诱导HL-60细胞凋亡的结果.
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全反式维甲酸诱导神经干细胞向神经元的分化
背景:目前研究证实全反式维甲酸在调控多种组织和细胞的增殖、生长发育、代谢以及维持内环境稳定等方面具有广泛生物学作用.目的:探讨全反式维甲酸诱导神经干细胞分化为神经元过程中的作用及其分子机制.设计、时间及地点:对照观察,体外细胞学实验,于2006-07/2007-06在上海同济大学附属医院实验室完成.材料:普通级孕13～14 d雌性SD大鼠6只,取胎鼠用于制备神经干细胞.诱导剂全反式维甲酸为Sigma公司产品.方法:取第3代神经干细胞,以2×108 L-1密度接种,分为全反式维甲酸诱导1 d,3 d,7d,10d组和空白对照组,各诱导组均加入1 μ mol/L全反式维甲酸,空白对照组仅加入等量生理盐水.主要观察指标:免疫荧光染色鉴定结果,计数分化为神经元的比例,应用半定量RT-PCR法检测维甲酸受体α mRNA的表达.结果:全反式维甲酸诱导后神经元特异性烯醇化酶染色呈阳性,细胞有多个细长突起,胞体呈绿色荧光,胞核呈蓝色荧光.与空白对照组比较,诱导3 d,7 d,10 d组神经元特异性烯醇化酶染色阳性细胞率均明显升高(P<0.05),且诱导7 d组达峰值.与空白对照组比较,各诱导组维甲酸受体α mRNA的表达量均明显升高(P<0.01).结论:全反式维甲酸能显著提高大鼠胚胎神经干细胞分化为神经元的比例,同时发现细胞维甲酸受体α mRNA的表达增加.
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胚胎干细胞向胆管上皮细胞定向分化的体外实验
背景:在胚胎干细胞向肝细胞诱导分化的培养条件基础上增加向胆管上皮细胞分化的培养条件,使其向胆管上皮细胞方向分化在理论上是可行的.目的:验证在细胞生长因子胚胎干细胞体外定向分化为胆管上皮细胞的可行性.设计:单一样本观察.单位:中山大学附属第一医院.材料:选用BALB/c系小鼠胚胎干细胞(BALB/c-ES)由中山大学实验动物中心建系和保存.分化生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、上皮生长因子、角化细胞生长因子均为美国Sigma公司产品,实验用抗小鼠细胞角蛋白7(CK7)和细胞角蛋白19(CK19)购自丹麦DAKO公司,间接免疫荧光试剂盒为美国Biodesign产品,IX70-S8F2倒置相差荧光显微镜为日本OLYMPUS产品.方法:实验于2004-10/2005-06在中山大学附属第一医院中心实验室完成.①将小鼠胚胎干细胞进行拟胚体分化,在培养系统中按不同时间段分别添加分化生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、上皮生长因子、角化细胞生长因子,使胚胎干细胞向胆管上皮细胞方向分化.以培养液中不添加上述细胞生长因子为对照组,使胚胎干细胞自然分化.②采用倒置相差荧光显微镜动态观察细胞生长及三维的环状结构形成情况.③于细胞分化第10天开始采用免疫细胞化学方法检测胆管上皮细胞标记物CK7、CK19,γ-谷胺酰转肽酶(GGT)表达变化,同时观察γ-谷胺酰转肽酶阳性细胞的形态学特点.主要观察指标:①细胞生长及三维环状结构形成情况.②胆管上皮细胞标记蛋白CK7、CK19的表达.③胆管上皮细胞标记酶GGT表达及其阳性细胞形态学情况.结果:①细胞生长及三维的环状结构形成情况:胚胎干细胞悬浮培养10 h后即可见小的拟胚体形成并悬浮在培养液中.分化第10天在拟胚体细胞分化群落中出现一种三维的环状结构,细胞呈同心圆层状排列,内层细胞排列紧密,继续培养.内层细胞逐渐排列疏松,分化20 d左右时细胞活力达到好,其后活力开始下降,分化36 d时三维结构裂解并呈条索状悬浮于培养液中.对照组环状结构于第13天出现,细胞结构于27d裂解.②CK7,CK19表达:胆管上皮细胞环状结构形成当日即有CK7表达,分化第13天时CK19表达,其后两者同时表达于三维结构细胞中并随培养时间增加而表达逐渐增强.对照组细胞在分化第13,15天开始出现CK7,CK19表达.③胆管上皮细胞标记酶GGT表达及其阳性细胞形态学变化:加入生长因子后,细胞环状结构形成初始即表达GGT,说明此结构中含有胆管上皮细胞.在环状结构形成初始,细胞间连接紧密,不能分清单个细胞结构,随着培养时间增长,单细胞结构逐渐清晰.GGT阳性细胞呈多角型或方形排列,核位于中央,细胞器较少,胞质染色较浅,符合立方上皮细胞特点,体现出胆管上皮细胞的形态学特点.结论:胚胎干细胞在细胞生长因子的作用下可定向分化为胆管上皮细胞并可以形成类胆管样结构.
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甲基-β-环糊精对中性粒细胞极性化及其与细胞内游离钙离子浓度变化的关系
背景:脂筏是质膜上富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域.甲基-β-环糊精(Methyl-β-cyclodextrin,m β CD)为脂筏破裂剂,破坏膜脂的完整性.目的:观察mβCD对甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine,fMLP)诱导的中性粒细胞极性化过程中的作用,及其与胞内游离钙离子浓度(Cytosolic free Ca2+ concentration.[Ca+]i)的关系.设计、时间及地点:开放性实验,于2007-02在南方医科大学公共卫生与热带医学学院环境医学研究室完成.材料:fMLP山美国Phoenix pharmaceuticals公司提供,mβCD由美国Sigma公司提供.方法:取健康志愿者外周静脉血5 mL.采用重复梯度密度离心的方法分离中性粒细胞.根据诱导中性粒细胞极性化处理条件的不同分为3组,正常对照组、fMLP组、m βCD+fMLP组.正常对照组不加入任何试剂.fMLP组加入100 nmol/L fMLP孵育15 min.mβ CD+fMLP组先加入10mmol/L m β CD预孵育15 min,然后加入100 nmol/L fMLP孵育15 min.后3组均滴入终浓度为10 μmol/L furo-3/AM避光孵育45～60 min.主要观察指标:倒置显微镜下观察中性粒细胞在不同处理条件下的细胞极性化情况,使用激光共聚焦显微镜监测[Ca2+]i在m β CD抑制细胞极性化过程中的变化.结果:fMLP可以诱导中性粒细胞的极性化,而预先使用10 mmol/L m β CD孵育15 min后,fMLP诱导的中性粒细胞极性化受抑制.同时,极性化过程中中性粒细胞的[Ca2+]i急剧增加,而mβCD预孵育后[Ca2+]i上升相幅度明显下降.结论:脂筏破裂剂m β CD抑制了fMLP诱导中性粒细胞极性化过程,该作用可能与[Ca2+]i变化有关.
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人胚胎心脏来源间充质干细胞的获取及其生物学特征
背景:目前尚缺乏关于人胚胎心脏来源间充质干细胞各代在体外生物学特征的报道.目的:以不同培养方法获取人胚胎心脏来源的间充质干细胞,并观察其生物学特征,筛选适合作为心肌修复细胞源的传代次数.设计、时间及地点:细胞学体外对比观察,在南京大学医学院和国家生物医药技术重点实验室完成.材料:流产人胚胎10例,均来自南京大学医学院附属鼓楼医院,经产妇及家属知情同意,实验获得医学伦理委员会批准.方法:取心脏组织,剪为约1 mm的碎块,胶原酶消化过筛.获得单细胞悬液采用细胞培养法,向细胞悬液中添加10%FBS的DMEM/F12培养基;消化后的残余组织采取组织块培养法,放于培养板中,于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中放置1.5 h后,添加10%FBS的DMEM/F12培养基.两种方法均采取直接贴壁方式获取贴壁细胞,常规传代.主要观察指标:倒置显微镜观察心脏组织来源各代细胞的形态特征;流式细胞仪检测各代细胞表面标志,分析细胞周期.结果:细胞培养与组织块培养至P3代后,细胞形态相似且均呈梭形.细胞培养的P3和P4代以及组织块培养的细胞群中CD29和CD44阳性比例较高,而c-Kit、CD31、CD45、GATA-4和c-Tnt均呈阴性;细胞培养的P2和P3代细胞群间充质干细胞的比例大,组织块培养的细胞中P3代细胞群间充质干细胞的比例大;且P2-P4代细胞状态较好,当传至P7代时细胞生长速度开始减慢.原代～P5代细胞绝大部分处于静息状态.但保留自我更生的潜能,符合干细胞特性.结论:利用细胞培养法或组织块培养法都可以成功获得人胚胎心脏来源间充质干细胞,P3代细胞更适合于心脏修复的细胞移植治疗.
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神经干细胞的应用
神经干细胞存在于人类神经系统中,具有自我更新、活跃的增殖和分化能力、向脑内病变部位迁移以及分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力.近年来神经干细胞疗法已成为治疗多种疾病的新策略,其目的是替代、修复或加强受损的细胞或器官的生物学功能,是基因疗法的一种理想的靶细胞.应用主要集中以下几方面:①直接细胞移植进行替代治疗,神经下细胞作为细胞移植的来源,可以通过神经干细胞的体外移植或体内神经干细胞的激活,分化为神经元和胶质细胞,与已经存在的细胞结构整合到一起.②作为基因载体,携带治疗作用的报告基因进行移植,从而达到细胞替代和基因治疗的双重作用.③通过对生长因子和细胞因子的研究.诱导自身的神经干细胞分化进行神经自我修复.可广泛应用于脑外伤、脑血管病后脑功能损伤、脑瘤及其他疾病的治疗.
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组织工程化气管的种子细胞研究
检索Medline、中国期刊网和维普网2000-01/2006-12有关组织工程化气管和种子细胞的研究文章,综述组织工程化气管种子细胞的来源、选择、培养和生长的研究概况.文献显示组织工程化气管与其他气管替代物相比具有明显的优点,它应用的是自体细胞,无免疫原性,具有生物活性,有潜在的生长能力.但在研究过程中至今尚未找到理想的种子细胞的来源.在成体干细胞中,月前虽已能以软骨细胞或骨髓间质干细胞为种子细胞构建出与自体气管相近的组织工程化气管,而且能够用软骨细胞及上皮细胞构建出带有气管黏膜上皮的复合组织工程化气管,但这些组织工程化气管移植到体内能否长期具有活性、发挥正常的生理功能等还需要进一步的实验验证.
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组织工程心脏瓣膜的种子细胞
应用计算机检索Pubmed数据库1995-01/2008-01期间和CNKI、维普数据库2001-01/2008-01期间与组织工程心脏瓣膜种子细胞相关的44篇资料显示:临床应用的机械瓣和生物瓣存在一些缺点,而组织工程心脏瓣膜优点包括无需抗凝治疗、抗感染、有活力、具有生长和修复能力,具有很好的前景.组织工程心脏瓣膜种子细胞可来源于:血管、骨髓、血液、脐带、绒毛膜和胚胎干细胞等,这些细胞具有相应特异的细胞表型.并适合产生用作组织工程的细胞外基质.组织工程心脏瓣膜研究已经取得了相当大的进展和令人鼓舞的成绩,但有许多技术问题和临床实际问题尚待解决和克服.要想组织工程心脏瓣膜成功应用于临床,需要更深入的研究:比如可降解多聚物支架材料特性、干细胞分化、尽量发挥自体细胞功能、使用无创技术评价瓣膜生长和重构的速度及质量等,这样就会催生更新进的技术应用于体内安全性实验以及临床前期研究.
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间充质干细胞在造血干细胞移植中的应用
应用计算机检索PubMed数据库2000-01/2008-01期间有关间充质干细胞与造血干细胞移植相关的文章,检索词为"MSC,HSCT",限定文章语言种类为English.同时计算机检索维普数据库2000-01/2008-01期间相关文章,检索词为"间充质干细胞,造血干细胞移植",限定文章语言种类为中文.并查阅与干细胞实验研究有关的书籍.对资料进行初审,选取符合要求的有关文章查找全文.纳入标准:①有关间充质干细胞对造血干细胞移植影响的研究.②造血干细胞移植机制的相关性研究.排除标准:重复性文章.共收集到66篇相关文献,28篇文献符合纳入标准.临床资料显示,两者共移植安全可行,可提高移植效果,降低近期死亡率.但其确切效果还需前瞻性随机对照临床实验进一步证实.
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脂肪间充质干细胞多向分化潜能的特征
脂肪间充质干细胞具有较强的体外增殖能力,因存在生物学特性稳定、来源充足、体外培养条件低等优势已引起各国学者的关注.在一定条件下,可成功地将其诱导为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪前体细胞、心肌细胞、神经样细胞.现阶段尚未找到脂肪间充质干细胞的特异性分子标记,对其多向分化潜能判定的公认方法是观察检测分化所得细胞的形态学变化及表面标记物的表达,基本未涉及细胞特异性功能分析.脂肪间充质干细胞凭借其多向分化潜能,是人体干细胞库潜存的重要来源,可作为多种组织工程种子细胞应用于组织缺损的修复,但多向分化潜能的科学性、重复性及安全性等问题均有待深入分析.
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胚胎干细胞分化的调控因子
应用计算机检索Pubmed数据库1999-01/2008-01期间及万方数据库、维普数据库2001-01/2008-01期间与胚胎干细胞分化的调控因子相关的44篇文章显示:胚胎干细胞分化的调控是一个极其复杂的过程,是由多个因素组成的一个庞大的维持胚胎干细胞自我更新能力的调控网络,其中特异分子和各种转录因子的终表达量是决定胚胎干细胞是否分化的关键因素.当各种因子分泌量达到相互平衡状态时,胚胎干细胞维持自我更新,但是如果其中一个或几个因子的表达量发生改变时.就会促使胚胎干细胞向某一特定方向分化.目前研究主要集中在八聚体结合蛋白4、Nanog、SOX基因、白血病抑制因子等几条既平行又相互交错的通路所决定胚胎干细胞的自我更新.
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肿瘤干细胞在实体肿瘤放射治疗中的意义
在肿瘤形成学说中有随机学说与阶层学说两种.阶层学说认为肿瘤起源细胞即为肿瘤干细胞.在白细胞以及部分实体肿瘤中的一部分肿瘤细胞具有无限增殖的能力,并可形成新的肿瘤灶,称之为肿瘤干细胞.肿瘤干细胞是肿瘤转移、复发的根源.肿瘤是干细胞长期自我更新过程中,由于多基因突变导致其生长失去了正常调控而停止在分化的某一阶段无限制增殖所形成,所处的微环境通过某些信号通道以及分泌多种细胞因子来发挥调控作用,而微环境的改变致使干细胞的分化方向发生改变可能是肿瘤发生的基础.目前,利用细胞不同表面抗原标记及侧群细胞分选是肿瘤干细胞分选的两种常用方法.侧群细胞分选更为方便、经济,并可表面标记未知肿瘤干细胞的分选.肿瘤干细胞的鉴定只能用功能学方法,即对其自我更新能力与分化潜能两个主要特征进行评价.肿瘤干细胞放射抗拒的机制可能与损伤DNA的修复.影响细胞周期调控、细胞凋亡、增殖等转导通路改变有关.将肿瘤干细胞作为放射治疗的切入点,针对其放射生物学行为制订对策,才能从根本上解决问题.
