中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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人类白细胞抗原分型技术的进展
学术背景:以往人类白细胞抗原分型主要采用血清学和细胞学方法,随着PCR技术、基因芯片技术及分子生物学技术的发展,已建立从基因水平上进行的人类白细胞抗原分型技术.目的:介绍人类白细胞抗原分型方法,为实际应用提供依据.检索策略:应用计算机检索PubMed1997-07/2007-07期间的相关文章,检索词"HLA technology',并限定文章语言种类为English.同时检索万方数据库1997-07/2007-07相关文章,检索词为"人类白细胞抗原",并限定文献语种为中文.共检索到相关文献142篇,选择与人类白细胞抗原分型技术有关的文献55篇.将初步筛选的文章进一步查找全文,排除综述和重复文献,内容相似的选择发表在权威杂志或近3年发表的文献,后共纳入30篇进行综述.文献评价:文献对不同的人类白细胞抗原分型方法进行汇总分析,符合纳入标准的30篇文献中,6篇为中文文献,24篇为英文文献.资料综合:传统的人类白细胞抗原分型方法主要是血清学和细胞学方法,分型准确性较差.随着PCR技术的广泛应用,人类白细胞抗原基因分型方法得到了迅速的发展.序列特异性引物、序列特异性寡核苷酸探针、直接测序、基因芯片等各具特点的人类白细胞抗原分型技术不断出现,使人类白细胞抗原的分型更加准确、精细、简便、实用,为临床推广应用打下了基础.结论:各种人类白细胞抗原基因分型方法各有优势,不能相互替代,这也是由人类白细胞抗原系统的高度多态性和复杂性所决定的,根据不同的用途可选择相应的方法.
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干细胞诱导分化为胰腺β细胞的研究现状
学术背景:干细胞体外诱导分化成的胰岛细胞可以发挥对血糖的生理性调节作用.大量研究证明可以从胚胎干细胞、胰腺干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、肝脏干细胞或脐血干细胞等诱导分化出胰腺β细胞.目的:深入认识干细胞诱导分化为胰腺β细胞的研究现状.检索策略:由该论文的研究人员应用计算机检索Pubmed数据库1990-01/2006-07的相关文献,检索词"stem cell,differentiation,culture,pancreas",并限定文章语言种类为English.同时计算机检索维普数据库2000-01/2006-07的相关文献,检索词"干细胞,胰岛,诱导分化",并限定文章语言种类为中文.共检索到142篇文献,对资料进行初审,纳入标准:①与干细胞和干细胞向胰腺β细胞诱导分化相关的文章.②若内容相似,选取首次实验报告及近5年较权威杂志发表的文章.排除标准:重复或类似的研究.文献评价:文献的来源主要是通过对干细胞向胰腺β细胞诱导分化方面内容进行汇总分析.所选用的30篇文献中,1篇为综述,其余均为临床或基础实验研究.资料综合:胰岛移植是目前治疗Ⅰ型糖尿病和部分Ⅱ型糖尿病效果理想的方法.由干细胞诱导分化得到的胰腺β细胞可以发挥调节血糖的作用,在许多小鼠糖尿病模型研究中起到了降低血糖的作用.目前用于诱导分化为胰腺β细胞的干细胞来源包括胚胎干细胞、胰腺干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、肝脏干细胞或脐血干细胞等.在不同的干细胞诱导分化为胰腺β细胞的研究中,分为体内和体外两种诱导分化方法,而体外诱导法多数采用分步诱导的方式,也有部分实验利用基因技术的方法进行诱导.结论:不同来源的干细胞可以在体外通过多种方法诱导分化得到胰腺β细胞,但得到的胰腺β细胞数量及其诱导分化方法还有待进一步研究.
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骨髓间充质干细胞治疗缺血性脑血管疾病的研究近况
学术背景:近年来研究发现骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,在缺血性脑卒中、脑损伤等疾病中可替代神经细胞,并具有修复神经系统的功能.目的:缺血性脑血管病的发病机制复杂,骨髓间充质干细胞作为神经干细胞的来源,深入认识其在治疗缺血性脑血管疾病中的作用.检索策略:由该论文的研究人员应用计算机检索Pubmed数据库和Highware数据库2002-01/2007-05的相关文献,检索词"Mesenchymal stem cells(MSCs),cerebral ischemia",并限定文章语言种类为English.共检索到119篇文献,对资料进行初审,纳入标准:①涉及骨髓间充质干细胞的特点.②与骨髓间充质干细胞在缺血性脑血管病或脑卒中的研究进展相关.排除标准:①重复研究.②Meta分析.文献评价:文献的来源主要是通过对骨髓间充质干细胞的特点及其在缺血性脑血管病或脑卒中的应用进行汇总分析.所选用的36篇文献中,17篇为综述,其余均为临床或基础实验研究.资料综合:①骨髓间充质干细胞具有跨胚层分化潜能,可在中枢神经系统内存活并能分化为神经样细胞,在体外也可通过诱导向神经细胞转化,②骨髓间充质干细胞取材方便、体外扩增迅速,且能以多种途径移植包括静脉移植、脑内移植,对脑缺血、脑外伤等疾病的神经功能的缺损有改善作用.③目前尚存在如何提高骨髓间充质干细胞向有功能的神经细胞转化,如何提高其在体内的成活率和向神经细胞定向分化的能力,移植时机、移植途径及移植安全性,寻找和鉴定骨髓间充质干细胞所特有的细胞表面标志分子,明确其移植后改善缺血性脑损伤功能的机制等问题.结论:骨髓间充质干细胞能在体内外分化为神经细胞,易获得、增殖快,能够进行自体移植,为缺血性脑血管病的治疗开辟了一条新的技术平台,在中枢神经系统损伤修复领域的临床应用前景广阔.
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干细胞在心血管疾病治疗中的应用
学术背景:冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)、心肌梗死、原发性高血压、心肌病、心瓣膜病等心血管疾病的共同特点是有完整舒缩功能的心肌细胞数量相对和绝对减少,患者对于常规的药物治疗反应性极差,而干细胞移植作为一种新的治疗方法,极具发展潜力.目的:探讨干细胞分化为心肌细胞的潜能并介绍其在心血管疾病治疗方面的应用.检索策略:由作者应用计算机检索Pubmed数据库1999-01/2007-08与干细胞和高血压病/冠心病有关的文章,检索词"bone marrow stromal cells,coronary artery disease,cardiovascular disease"组合检索,并限定语言种类为"English";同时检索中国期刊全文数据库2000-01/2007-05相关文章,检索词为"干细胞,心血管疾病,移植",并限定语言种类为中文.纳入内容与干细胞在心血管疾病治疗中的应用相关文章,内容相似者以近5年且发表在较权威杂志者优先.文献评价:共收集到300篇相关文献,阅读标题和摘要进行初筛,排除251篇内容陈旧或重复的文献,保留49篇进一步查找全文,有48篇检索到全文,选用其中34篇进行综述.5篇涉及骨髓间充质干细胞在高血压治疗中的应用,20篇为骨髓干细胞在冠心病治疗中的应用相关研究,9篇骨髓干细胞的诱导分化及其在心血管疾病治疗中的研究现状.资料综合:胚胎干细胞、成体干细胞(包括骨骼肌祖细胞、骨髓干细胞、心脏干细胞)都能用于移植治疗心血管疾病.目前干细胞移植在冠心病治疗方面已取得了可喜的成果,在高血压的治疗方面还在实验阶段,且研究较少.而且干细胞移植治疗冠心病,多为近期疗效观察,远期预后如何,尚待研究.结论:干细胞治疗心血管疾病正处在起步阶段,在治疗急性心肌梗死方面已表现出传统治疗方法无可比拟的优越性,干细胞可以在梗死的心肌中分化形成有功能活性的心肌、血管、内皮等组织,可以改善心脏的功能.
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FoxD3在胚胎发育和维持胚胎干细胞多能性的作用
学术背景:胚胎干细胞无论对转基因动物的制备还是对疾病的治疗都具有巨大的潜能,但前提是用于治疗的胚胎干细胞具有其特有的多能性和全能性,而FoxD3在胚胎发育和维持胚胎干细胞多能性都具有重要作用.目的:了解FoxD3在胚胎发育和维持胚胎干细胞多能性的作用.检索策略:应用计算机检索Pubmed 1996-09/2007-05期间的相关文章,检索词为"FoxD3',限定语言种类为英文.检索到67篇文章,排除重复的和与胚胎发育和胚胎干细胞相关性不大的文章,共纳入32篇文献.文献评价:32篇文献中分别涉及胚胎干细胞转录调节、FoxD3在胚胎发育和维持胚胎干细胞多能性的作用及其Foxd3在其他细胞中(骨髓细胞、神经嵴细胞、色素细胞)的功能等方面的内容.资料综合:胚胎干细胞具有其他细胞不可比拟的特性使胚胎干细胞应用广泛,要合理控制胚胎干细胞在体内和体外的分化,关键要了解那些控制胚胎干细胞命运的基因.FoxD3是叉头框(Forkhead box,Fox)家族中的一个转录调控因子,它对胚胎上胚层及其衍生物的形成和建立多潜能胚胎干细胞系具有重要作用,并与控制胚胎发育和胚胎干细胞多能性的其他转录凋控因子有一定的联系.结论:FoxD3是维持胚胎上胚层细胞多潜能性和在体外建立胚胎于细胞系所必需的.
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力竭运动大鼠血红蛋白及血液生化指标变化与槲皮素的影响
将40只雄性SD大鼠随机分为安静组8只、运动组16只、槲皮素运动组16只.以跑台训练建立动物模型,在后一次训练时,将运动组和槲皮素运动组分别分成2个亚组:对照组和力竭运动组,每组均8只.实验期间按每天槲皮素50 mg/kg体质量的剂量,于运动前3 h灌胃给槲皮素运动组动物,其余组按体质量灌胃给相应量的生理盐水.通过测定力竭运动大鼠血液中血红蛋白含量、血清乳酸脱氢酶、血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶活性.结果显示,服用槲皮素的大鼠在运动力竭即刻血红蛋白含量下降幅度明显小于运动力竭组,同时血清乳酸脱氢酶、血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶活性的上升幅度明显降低.
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自体骨髓干细胞移植治疗急性心肌梗死27例近期疗效
背景:有实验表明移植心肌梗死区的骨髓干细胞可以定向分化为具有正常生理功能的心肌细胞并可促进新生血管形成,达到修复梗死心肌并改善受损的心脏功能.目的:观察经皮冠状动脉内移植自体骨髓干细胞治疗急性心肌梗死的近期临床疗效.设计:自身前后对照.单位:湘潭市中心医院心内科.对象:选择2004-06/2006-12在湘潭市中心医院心内科收治的27例急性心肌梗死患者,男16例,女11例,年龄34～74岁,平均(61±9)岁;纳入标准:①入选发病超过6 h.②心电图、酶学动态的改变符合急性心肌梗死.③心功能在Ⅰ～Ⅱ级之间.④发病后急诊完成经皮冠状动脉介入治疗且梗死相关血管血流恢复至TIMI 3级.所有患者均签署了知情同意书.方法:手术过程:所有患者均于发病后行急诊冠状动脉介入治疗,1周后经皮腔导管技术建立梗死相关动脉通道,用指引导丝将微灌注导管送入支架内后,将分离的骨髓干细胞悬液经微导管中心腔内注入梗死血管远端.术后评价:移植前、后分别行24 h动态心电图评估;移植前和移植后6,12个月检测患者左室射血分数、心肌灌注缺损指数.术后6,12个月随访观察恢复及并发症情况.主要观察指标:①左室射血分数、心肌灌注缺损指数.②24 h动态心电图评估结果.③术后并发症情况.结果:纳入患者27例均进入结果分析.①左室射血分数、心肌灌注缺损指数:术后6,12个月左室射血分数均高于移植前,差异有统计学意义(P＜0.05),心肌灌注缺损指数均低于移植前,差异有统计学意义(P＜0.05).②动态心电图结果:患者均无新的心律失常类型出现,无心律失常的增多及恶性心律失常的出现.③随访评估:经冠状动脉内移植术中无并发症发生,无患者支架内狭窄.结论:经皮冠状动脉内移植骨髓干细胞治疗急性心肌梗死安全可行,术后能改善心功能.
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构建Loa22基因去信号肽片段原核重组表达载体
目的:构建赖型钩端螺旋体OmpA膜蛋白Loa22基因去信号肽片段的原核表达载体,并对其进行克隆表达.方法:实验于2004-12/2005-12在四川大学华西医学中心感染免疫研究室完成.以赖型钩端螺旋体017株基因组DNA为模板,PCR扩增Loa22基因去信号肽片段,亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,经双酶切、PCR鉴定,筛选出阳性重组质粒克隆.经DNA测序正确后,转化大肠杆菌,利用IPTG进行诱导表达,通过SDS-PAGE鉴定表达产物.结果:PCR获得长516 bp的片段.Loa22基因去信号肽片段与pGEX-4T-1的重组质粒构建成功.重组质粒经IPTG诱导后能在大肠杆菌中表达Mr45 000的融合蛋白.结论:制备了Loa22基因去信号肽片段原核重组表达载体,为钩体新型疫苗的研究奠定基础.
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巢式PCR扩增性别决定基因序列检测兔骨髓间充质干细胞移植治疗关节软骨缺损的修复组织来源
目的:明确骨髓间充质干细胞移植到关节软骨损伤处后,该处修复组织的细胞来源,以了解组织修复的过程.方法:实验于2006-01/2007-01在浙江省医学科学院生物工程所完成.①实验材料:3月龄新西兰大白兔,清洁级,体质量约2 kg,由浙江省实验动物中心提供.②实验方法:利用兔性别决定基因序列设计两对PCR引物.取雄性新西兰大白兔进行骨髓间充质干细胞的分离培养与扩增.取雌性新西兰大白兔,暴露其膝关节软骨,用电钻钻孔造成膝关节软骨内侧直径4.5 mm深3.5 mm的全层关节软骨缺损,达软骨下骨.一侧植入骨髓间充质干细胞/胶原海绵,另一侧仅植入胶原海绵.③实验评估:于术后1,2,3,4,5个月取兔关节软骨缺损修复处组织提取总DNA,进行PCR扩增,鉴定移植物中是否存在性别决定基因,以明确细胞来源.结果:移植后1,2,3,4,5个月移植雄兔骨髓间充质干细胞及胶原海绵的关节修复处组织提取的DNA,用设计的引物通过PCR扩增出一条约200 bp大小的条带,大小与阳性对照一致;而另一侧仅移植胶原海绵的关节软骨修复处组织提取的DNA,用设计的引物通过PCR扩增后未发现有条带.PCR扩增阳性样本测序分析显示,每个样本碱基序列一致,与GenBank上性别决定区Y基因组gb|AY785433.1|比较,扩增的样本序列与标准序列完全一致,序列同源性达100%.结论:雌兔关节骨髓间充质干细胞/胶原海绵复合物移植处的新生组织中含有雄性组织,提示新生软骨中有移植的雄性骨髓间充质干细胞分化来的软骨细胞.
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心肌病大鼠骨髓间充质干细胞移植后差异表达基因cDNA文库的构建
目的:构建心肌病大鼠移植骨髓间充质干细胞后心肌差异表达基因的cDNA文库,为后续的基因测序和信息学分析打下基础.方法:实验于2003-07/2005-03在重庆医科大学儿童医院儿科研究所和解放军第三军医大学野战外科研究所四室完成.实验材料:雌性Wistar大鼠54只,体质量(200±20)g,由解放军第三军医大学大坪医院实验动物中心提供.实验方法:采用贴壁筛选法分离、扩增、纯化Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,选用第三、四代的骨髓间充质干细胞用于移植实验.采用2.5 mg/kg阿霉素腹腔注射法建立大鼠心肌病心力衰竭模型.并分为实验组与对照组:实验组于左心室前壁靠心尖处注射骨髓间充质干细胞,对照组注射培养基.采用抑制性消减杂交技术构建骨髓间充质干细胞移植1周后大鼠心肌组织的差减文库.结果:①对照组和实验组移植前左室射血分数与左室缩短分数相比无差异,实验组左室射血分数与左室缩短分数在移植2周时明显高于对照组(P＞0.05,P＞0.01).②以正向消减产物为模板,在第33个循环才出现明显的G3PGH条带,而在非消减的对照中,第18个循环就能看见明显的条带,二者相差约15个PCR循环,同样在反向消减中二者相差也是15个PCR循环.按抑制性消减杂交方法的要求,只要二者之间相差5个循环以上就表明消减效率很高,可以用于下一步文库构建和筛选.③筛选出骨髓间充质干细胞移植后表达增高的cDNA克隆123个;表达降低的cDNA克隆28个.结论:运用抑制性消减杂交方法成功构建了骨髓间充质干细胞移植后心肌病大鼠的cDNA文库,为下一步研究打下基础.
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自体干细胞移植治疗老年心肌梗死后心力衰竭
目的:实验以移植后3个月、6个月时间超声心动图客观指标评估了自体干细胞冠状动脉内移植治疗老龄心肌梗死后心力衰竭的效果和安全性.方法:选择2004-06/2006-06江苏省苏北人民医院心内科自愿接受干细胞移植的7例心肌梗死后心力衰竭患者,平均年龄69岁,心功能Ⅲ～Ⅳ级,左室射血分数＜50%.药物治疗基础上加用自体干细胞冠状动脉内移植治疗的方法,其中2例骨髓干细胞在体外扩增后获得,5例经粒细胞集落刺激因子皮下注射动员自体骨髓干细胞后分离外周血获得干细胞悬液.将采集的干细胞悬液经Over-the-wire球囊导管中心腔注入梗死相关动脉.观察自体干细胞动员,培养,采集和回输过程中的不良反应.在移植前、移植后3月、6月应用超声心动图评价左室形态和心功能变化,室壁运动积分指数及6 min步行距离.结果:7例患者均进入结果分析.移植3个月后,心功能得到改善,超声心动图检查左室收缩期内径及射血分数变化不大,6 min步行距离有所提高,但差异无显著性(P＞0.05).移植6个月后,患者心功能明显改善,超声心动图检查左室收缩期内径及射血分数和室壁运动积分均有明显提高(P＜0.05),6 min步行距离也有明显提高(P＜0.05).整个过程中未出现严重并发症.结论:自体干细胞冠状动脉内移植治疗老龄心肌梗死后心力衰竭,6个月时超声心动图客观指标评估能够改善患者心功能,且安全.
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骨髓单个核细胞移植对心肌修复相关因子的调节作用
目的:干细胞移植后可以通过分化为心肌细胞、减少心肌重构等方面发挥改善心功能的作用.观察急性心肌梗死后进行骨髓单个核细胞移植对相关细胞因子的调节作用,探讨干细胞发挥改善心脏重构的可能机制.方法:实验于2006-01/2007-02在福建省高血压研究所完成.①实验材料:清洁级SD大鼠由上海实验动物公司提供.②实验方法:取SD大鼠骨髓,分离出单个核细胞,以DAPI标记骨髓单个核细胞.取体质量200～250 g雄性SD大鼠24只,建立急性心肌梗死模型后,随机分为2组,实验组从股静脉注入同种异体大鼠骨髓单个核细胞1.0×107,对照组注入等量的生理盐水.③实验评估:于移植后4周采用免疫组组织化学法检测DAPI阳性细胞、肌钙蛋白阳性细胞、基质细胞源性因子1、转化生长因子β及大鼠心功能改变.结果:24只大鼠均进入结果分析.移植后4周实验组基质细胞源性因子1表达较对照组明显升高,转化生长因子β表达较对照组下降;实验组在免疫荧光显微镜下可观察到DAPI和肌钙蛋白阳性细胞,心功能较对照组明显改善.结论:骨髓单个核细胞移植改善急性心肌梗死大鼠心功能的同时伴有基质细胞源性因子1表达增加及转化生长因子β表达下降.
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经动脉骨髓干细胞移植结合介入治疗股骨头缺血性坏死
目的:介入治疗有助于增加股骨头缺血性坏死的股骨头血供,干细胞可以促使新生毛细血管形成.实验拟证明经动脉应用骨髓干细胞移植结合常规介入疗法治疗股骨头缺血性坏死的疗效.方法:选择2005-03/2007-05年于新乡新华医院接受治疗的5例股骨头缺血性坏死患者,共8髋,均为男性,年龄(40.1±10.8)岁,5例患者均经临床症状和髋关节影像学检查确诊.所有患者均签署知情同意书,并经医院伦理委员会批准.实验方法:采集患者自体骨髓血制备骨髓干细胞.采用Seldinger穿刺技术,非治疗侧股动脉穿刺成功后,引入Terumo公司5Fcobra导管,通过非治疗侧髂总动脉、腹主动脉至治疗侧髂总动脉,注射非离子造影剂15 mL,并电影采集.血管造影,确定股骨头供血动脉和病变程度,导管超选择进入治疗侧旋股内动脉、旋股外动脉及闭孔动脉,再次血管造影证实导管到位后,经导管缓慢灌注尿激酶、丹参、低分子右旋糖酐、罂粟碱等常规介入治疗药物.药物灌注完成后将备用自体骨髓干细胞悬液等量分为3份,缓慢灌注各支血管.双侧病变者,间隔两周行另外一侧治疗.实验评估:治疗完成后1年随访,Harris评分观察股骨头缺血性坏死临床症状改变和髋关节活动度,判定ARCO分期.结果:5例患者8髋均完成1年随访.随访结果显示,患者临床症状明显缓解,髋关节临床症状Harris评分分值显著提高(P＜0.05),髋关节活动度无明显改变(P＞0.05),ARCO分期进展4髋,稳定4髋,各为50%,5例患者治疗前后未发生严重并发症.结论:经动脉骨髓干细胞移植配合常规介入疗法治疗股骨头缺血性坏死是一种安全有效的方法.但是由于病例样本小和随访时间较短,其长期效果仍然需要进一步观察.
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骨唾液酸蛋白在体外培养人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化中的角色
目的:骨唾液酸蛋白在骨矿化形成方面扮演重要角色,实验观察其是否能诱导体外培养的人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化.方法:实验于2005-10/2006-12在解放军广州军区广州总医院医学实验科完成.①材料来源:选取在本院体检的健康志愿者2人,对本实验均知情同意.采用Ni-NTA亲和纯化技术,从本室构建的毕赤酵母GS115/pPICZaA-hbsp发酵上清中纯化重组人骨唾液酸蛋白.②实验方法:对健康志愿者进行髂骨穿刺抽取骨髓液,采用贴壁法培养得到骨髓间充质干细胞.设立4组:骨唾液酸蛋白组添加0.1 nmol/L骨唾液酸蛋白;成骨诱导液组添加10 nmol/L地塞米松、10 mmol/L磷酸甘油、50 mg/L抗坏血酸;联合组添加上述两组的所有试剂;空白对照组不添加任何处理因素;各组均处理细胞12 d.③实验评估:光镜及电镜观察培养的细胞形态;以细胞计数法测定生长曲线,应用流式细胞仪分析细胞周期,采用免疫荧光细胞化学法和流式细胞分析检测干细胞标志物STRO-1的表达;生化试剂盒测定碱性磷酸酶活性;von Kossa染色法检测钙沉积.结果:①单个骨髓间充质干细胞为长梭形,经骨唾液酸蛋白处理后细胞大而扁平,原来密集的克隆分散开.②与空白对照组比较,骨唾液酸蛋白组引起细胞生长曲线右移,细胞G0/G1期比例平均增加12.09%(P＜0.01),S期比例减少65.92%(P＜0.01),STRO-1阳性细胞百分率下降26.54%(P＜0,01).③与空白对照组比较,骨唾液酸蛋白组细胞碱性磷酸酶活性增加50.0%,成骨诱导液组增加59.5%,联合组增加71.43%,并且随着处理时间的延长,活性增加越显著.④空白对照组细胞von Kossa染色呈阴性,其余各组均呈阳性.其中联合组的黑色矿化结节体积大、数目多;骨唾液酸蛋白组的结节体积较小、数目较少;成骨诱导液组居中.结论:骨唾液酸蛋白对人骨髓间充质干细胞有促进成骨分化和矿化作用,且与成骨诱导液联用效果更佳.
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骨髓基质细胞条件培养液通过p38信号转导通路诱导中脑神经干细胞分化
目的:骨髓基质细胞条件培养液能够诱导中脑神经干细胞分化为高比例神经元,但具体机制尚不十分清楚.选择p38信号转导通路作为观察切入点,剖析其在诱导分化途径中所扮演的角色.方法:实验于2006-04/2007-03在河北省脑老化与认知神经科学实验室完成.①实验方法:将SD大鼠麻醉后处死,分离股骨和胫骨,冲洗骨髓腔,将洗出的细胞悬液离心,悬浮后接种,培养48 h后弃去末贴壁细胞,更换新的培养基,6 d左右可进行传代,约铺满85%瓶底后弃去培养液,更换为含2%B27的Neurobasal培养液,24 h后经过离心的上清液即为骨髓基质细胞条件培养液.取新生SD大鼠中脑,机械分散成单细胞后离心弃上清,加入培养液分散过滤,接种时加入含2%B27的DMEM/F12培养基和20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子,7 d左右的单个神经干细胞便可增殖形成球体.将第2～3代神经干细胞球种植于预先包被多聚赖氨酸的培养皿中,贴壁后更换培养液.设立对照组和抑制剂组,均加入骨髓基质细胞条件培养液,此外抑制剂组还加入p38信号转导通路抑制剂SB203580至终浓度4 μmol/L.②实验评估:第7天进行免疫细胞化学染色,检测表达微管相关蛋白2的神经元与表达胶质原纤维酸性蛋白的星形胶质细胞在分化细胞中所占的比例.结果:①神经干细胞分化过程中的形态学变化及p38信号转导通路抑制剂的影响:加入抑制剂后24 h,光镜下可见神经干细胞长出的细胞有两种类型:一类细胞体积较小,边缘整齐,立体感强,周围有光晕并在两极有突起,免疫荧光染色显示这类细胞微管相关蛋白2呈阳性表达,即为神经元;另一类细胞突起较粗大,不规则,多聚集在神经干细胞球的中央,呈放射状排列,免疫荧光染色表明这类细胞为胶质原纤维酸性蛋白阳性的星形胶质细胞.②神经元及星形胶质细胞在分化细胞中所占的比例:p38信号转导通路抑制剂作用于神经干细胞7 d时,从神经干细胞分化成神经元的比例明显低于对照组(P＜0.01),分化成星形胶质细胞的比例明显高于对照组(P＜0.05).结论:骨髓基质细胞条件培养液在促进神经干细胞分化为神经元的同时,能够抑制其分化为星形胶质细胞,提示骨髓基质细胞分泌的可溶性分子可能是通过p38信号转导通路起作用的.
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从人外毛根鞘细胞分离获取黑素母细胞
目的:毛囊黑素细胞是皮肤黑素细胞的储库,含有黑素母细胞甚至黑素干细胞,具有更强的增殖潜力.观察人毛囊外毛根鞘细胞中黑素细胞的分布特征,尝试分离获取黑素母细胞.方法:实验于2003-04/2006-04在解放军第四军医大学组织工程实验中心和武警医学院附属医院皮肤科完成.消化游离流产胎儿头皮(产妇同意由医院处理流产胎儿)毛囊,用黑素细胞培养基接种,原代培养人外毛根鞘细胞,并观察外毛根鞘细胞和黑素细胞的分布.待原代外毛根鞘细胞融合时,加入胰酶消化,大约一半细胞漂浮时,加入含体积分数为0.10小牛血清的DMEM终止,轻柔吹打,弃去飘浮细胞.用DMEM清洗原瓶后加入黑素细胞培养基,继续培养,寻找黑素(母)细胞克隆.并采用胰酶消化法纯化培养黑素细胞.结果:在贴壁生长的毛根周围发现了外毛根鞘细胞团,以毛囊隆突部位为中心呈纺锤形排列.其中含有黑素细胞:临近毛囊漏斗部和毛球部的黑素细胞体积较大,有两个或者多个长一些的树突;隆突部位周围的黑素细胞体积偏小,树枝少而短.经纯化培养获得黑素(母)细胞集落,集落中心细胞呈短梭形,折光性很强,排列密集,增殖活跃;边缘细胞变大,树突延长;集落之间散在分布的黑素细胞体积更大,树突延长,数量增多至3个以上.结论:实验观察到人毛囊外毛根鞘细胞中有黑素细胞分布,并选择性培养获得黑素细胞克隆,分析克隆中心可能含有黑素母细胞.
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人脂肪间充质干细胞生物学特征及体外向类角质细胞的分化
目的:在体外不同培养条件下,脂肪来源间充质干细胞可以向成骨细胞、成软骨细胞、神经细胞、内皮细胞、肌肉细胞、脂肪细胞和肝脏细胞等不同胚层来源的细胞分化.观察脂肪间充质干细胞在体外培养并向类角质细胞分化的能力.方法:实验于2005-06/2006-03在解放军军事医学科学院完成.实验方法:取20～45岁健康女性(已取得患者同意)脂肪组织行脂肪抽吸术后的脂肪颗粒.参照Zuk等方法分离脂肪间充质干细胞.取培养的第3代细胞,采用流式细胞仪鉴定细胞表面分子及细胞周期.取状态良好、融合至瓶底80%的第20代细胞,在5 mg/L的秋水仙素处理后采集分裂细胞,以Giemsa染色进行核型分析.取第3代细胞以5 μm维甲酸和5 μg/L表皮细胞生长因子培养基向角质细胞诱导分化.对照组用含体积分数为0.05胎牛血清的L-DNMEM培养基.实验评估:采用倒置显微镜观察细胞形态,免疫组织化学方法检测角质细胞的标志物CK19.结果:①脂肪来源间充质干细胞表面分子CD29、CD90、CD44呈阳性,而CD34呈阴性.②细胞增殖曲线呈S型,接种的前3 d细胞处于滞留期,3 d后进入对数生长期,6 d后进入平台期,细胞的群体倍增时间约为29 h.处于对数生长期的细胞80%以上处于G0和G1期.③细胞染色体核型分析显示,染色体数目2n=46,核型46,xx,为女性正常核型.④对照组细胞贴壁后,呈成纤维细胞样,细胞呈长梭形,排列成漩涡状,贴壁较好.诱导组从诱导的第3天开始,细胞逐渐变成不规则,诱导第10天出现铺路石改变,形似角质细胞.⑤免疫组织化学方法检测显示,部分细胞专一地对CK19抗体呈阳性反应,有棕色染色.结论:可从人脂肪抽吸物中分离出间充质干细胞,脂肪间充质干细胞在体外一定条件下可向类角质细胞分化.
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山羊胚胎皮肤的发育及β1整合素在发育中的表达
目的:观察山羊胚胎皮肤发育的过程以及在此过程中表皮干细胞的特异性标志β1整合素的表达状况,以定位表皮干细胞.方法:实验于2006-11/2007-05在两北农林科技大学动物科技学院组织胚胎学实验室完成.取8～18周龄山羊胚胎背部皮肤,用组织学方法,观察山羊胚胎皮肤发育的形态学变化;用免疫组织化学SP法,观察β1整合素在山羊胚胎皮肤发育过程中的表达特征.结果:①表皮于8～9周龄时开始发育,10周龄时表皮由二层细胞构成,在11周龄时可见有原始毛囊的出现,有少量张力原纤维的存在,并发现朗格罕斯细胞,12～13周龄时表皮细胞出现角化层、透明层及颗粒层的分化,可见汗腺,14～15周龄毛球上皮细胞索开始分化为外根鞘、内根鞘的原基和毛发的前体,在毛囊一旁出现皮脂腺,张力原纤维增多、变粗,并发现典型的桥粒结构,16～17周龄时表皮层变薄,毛开始形成,并随着发育逐渐长出体表.18周龄皮肤的结构渐趋成熟.②胚胎发育早期,基底层细胞胞浆内表达β1整合素,随着皮肤发育,β1整合素阳性细胞出现在毛囊隆突区和外根鞘.结论:①山羊胚胎表皮的发生优先于真皮的发生,在胚胎时期处于剧烈的分化阶段.②β1整合素的阳性反应定位于基底层,随着皮肤的发育也表达于毛囊隆突区和外根鞘,表皮干细胞的数量和分布的部位与皮肤的发育特点有关系.
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脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞心肌样分化特性的比较
目的:骨髓间充质干细胞与脂肪干细胞均具有分化为心肌细胞的潜能.观察脂肪干细胞体外诱导分化为心肌细胞的特性及相关基因表达,比较骨髓间充质干细胞与脂肪干细胞心肌分化能力的差异.方法:实验于2006-08/2007-04在吉林省耳鼻咽喉研究所和教育部吉林大学人兽共患病重点实验室完成.①实验材料:脂肪组织标本来源于本院手术患者,所有患者知情同意,术中收集多余的皮下脂肪.②实验方法:分离培养人脂肪干细胞,用5-氮胞苷诱导传4～6代的脂肪干细胞分化,平行培养第5代骨髓间充质干细胞,诱导条件相同,对照组培养液不添加任何诱导因子.③实验评估:采用免疫荧光技术观察脂肪干细胞和骨髓间充质干细胞表达结蛋白Desmin和肌钙蛋白Troponin T的阳性细胞率.通过即时RT-PCR的方法检测诱导过程中细胞内GATA-4和NKX2.5的mRNA水平.结果:脂肪干细胞经5-氮胞苷诱导后3周,肌性基因标志结蛋白desmin和肌钙蛋白Troponin-T阳性细胞明显增加.与骨髓间充质干细胞组比较,脂肪干细胞表达心肌特异蛋白的阳性细胞率在诱导后第14天明显升高,而在第21天时,两组细胞的阳性表达率均达到60%左右,无明显的统计学差别,未加任何诱导条件的脂肪干细胞对照组培养14 d时有2.5%和1.6%的细胞表达Desmin,Troponin-T,在骨髓间充质干细胞对照组未见心肌标记蛋白的阳性表达.即时PCR检测结果发现,诱导组与未经诱导组的脂肪干细胞均表达GATA-4和NKX2.5,骨髓间充质干细胞组在诱导后第7天出现GATA-4和NKX2.5的转录活性.结论:体外培养的脂肪干细胞能够被5-氮胞苷诱导分化为心肌样细胞,并且具有自发分化的能力,与骨髓间充质干细胞相比,脂肪干细胞的早期分化特性更有利于心肌干细胞移植治疗.
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自体骨髓干细胞移植治疗急性心肌梗死围手术期并发症分析
目的:分析自体骨髓干细胞经冠脉移植治疗急性心肌梗死患者围手术期并发症情况.方法:抽取2004-09/2006-12唐山工人医院收治的急性心肌梗死患者40例,均行经皮冠状动脉介入治疗+标准药物治疗+经冠脉注入自体骨髓单个核细胞治疗,实验方案经医院伦理委员会批准,并获得患者知情同意,术前及术后根据临床需要给予标准药物治疗.于患者双侧髂后上棘穿刺,抽取骨髓,滤筛去除脂肪颗粒及骨渣,共采集100～120 mL,经密度梯度离心获得骨髓单个核细胞悬液12～15 mL,室温下保存少于4 h.两侧冠脉造影,左前降支植入支架后,将导丝放置于原病变远端,沿导丝将over the wire球囊置入支架内,将分离的骨髓单个核细胞悬液经over the wire球囊导管中心腔内注入梗死相关动脉血管远端,每次注射4.0～5.0 mL,抽空球囊间歇2 min后再次同法注射,反复共3次.结果:40例行骨髓单个核细胞冠脉移植的心肌梗死患者均进入结果分析.围手术期各种并发症共34例次,其中血管并发症发生率20%,胸痛17.5%,心律失常15%,低血压12.5%,心功能障碍10%,迷走神经反射7.5%,低血糖反应2.5%.结论:随着冠状动脉介入治疗技术的开展和操作的规范,手术成功率逐步提高,但仍然会在围手术期出现各种并发症及突发事件.提示应严密观察病情,有针对性地采取预防措施和正确的应急处置,从而减少干细胞移植手术的风险.
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嗅鞘细胞再移植治疗肌萎缩侧索硬化症1例
目的:探讨嗅鞘细胞再移植对肌萎缩侧索硬化症患者的治疗价值.方法:①患者资料:选择2005-05北京市虹天济神经科学研究院收治的肌萎缩侧索硬化症患者1例,男性白种人,42岁,西班牙籍,四肢无力伴肌萎缩进行性加重2年,分别于2005-05-27日和2006-10-11日给予嗅鞘细胞脑内移植.治疗方案患者知情同意.②移植方法:取4个月流产胚胎(孕妇及其家属均知情同意)的嗅球,消化成单个嗅鞘细胞后培养2周,细胞浓度约2×1010 L-1.第2次移植术前进行供、受体细胞HLA配型.根据两次术前MRI图片,选取双额放射冠锥体束走行部位为注射细胞靶点,局麻下采用立体定向技术注射胚嗅鞘细胞100万个/侧.术后口服他克莫司胶囊1 mg,2次/d,共42 d.③功能评估:电子邮件随访5个月,采用国际统一的肌萎缩侧索硬化功能评分标准进行延髓和呼吸功能、上肢功能、下肢功能、其他功能评定,功能从完全丧失至正常为0～4分,总分40分.结果:①患者在围手术期及随访期内均未发现任何不良事件及副反应.②术前5个月内,肌萎缩侧索硬化功能评分由33分迅速降至17分.③第1次术后2周检查,患者肢体运动功能改善,双上肢抬举好转,书写较术前清晰,站立行走时平衡能力改善,翻身及穿衣好转,肌萎缩侧索硬化功能评分由17分增加至24分.出院后半年患者病情保持稳定.2005-10,双下肢力量较前稍下降,且坐位控制平衡能力下降.2005-12患者腕部及手部无力开始缓慢加重.至术后17个月肌萎缩侧索硬化功能评分为18分.④第2次术后1周检查,双上肢、腹部和双下肢力量有所增加,但肌萎缩侧索硬化功能评分仍为18分.再次出院后5个月随访,分数增加至20分.结论:嗅鞘细胞移植能改善肌萎缩侧索硬化症患者神经功能障碍的症状,再次治疗仍然有效.
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新等位基因HLA-B*4060的认定
应用PCR-SSO基因分型技术发现可能的HLA新等位基因,对PCR产物进行测序及克隆测序,确认与同源HLA等位基因序列的差异.发现一个样本的HLA-B位点结果异常,其核苷酸序列与已知所有HLA-B位点等位基因序列均不一致,与同源性高的等位基因B*400102在第三外显子区域有7个碱基的差异.判断该等位基因为HLA-B位点的一个新等位基因,于2005年7月被WHO HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*4060.
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原位转染组织因子途径抑制物2基因抑制兔角膜新生血管形成
背景:有研究表明,基质金属蛋白酶所参与的细胞外基质降解在角膜新生血管形成过程中起关键作用,组织因子途径抑制物2是新近发现的一种新型的丝氨酸蛋白酶抑制物,能有效抑制基质金属蛋白酶的活性.选用组织通道途径抑制物组织因子途径抑制物2作为治疗基因,是否能对角膜新生血管形成产生影响?目的观察局部转染组织因子途径抑制物2基因对实验兔角膜新生血管形成的影响.设计:随机对照观察.单位:武汉协和医院外科实验室和中山大学附属第三医院中心实验室.材料:本实验于2004-06/2006-03在武汉协和医院外科实验室及中山大学附属第三医院中心实验室完成.选用健康纯种成年新西兰大白兔60只,体质量2.5～3.0 kg,雌雄不限.术前经裂隙灯检查均无明显眼前段病变.pBos-Cite-neo/组织因子途径抑制物2质粒(由协和医院血液科仲任博士惠赠),过氧化物酶阻断剂、非免疫性羊血清、鼠抗人MMP-1,2,3单克隆抗体、生物素标记的羊抗鼠IgG二抗(Santa cruz 公司).方法:实验干预:硝酸银烧灼法建立各组实验兔兔角膜新生血管模型,随机摸球法将模型兔分为Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ组,每组20只,分别结膜下注射生理盐水、空白质粒和真核表达质粒pBos-Cite-neo/组织因子途径抑制物2.实验评估:采用裂隙灯显微镜下观察角膜新生血管生长情况;采用RT-PCR方法检测造模2周后各组实验兔角膜组织组织因子途径抑制物2的表达;采用免疫组织化学测定造模后3,5,7,9,14 d角膜组织基质金属蛋白酶蛋白的表达.主要观察指标:①各组实验兔角膜新生血管生长情况.②实验兔角膜组织组织因子途径抑制物2及基质金属蛋白酶的表达情况.结果:纳入实验兔60只均进入结果分析.①角膜新生血管生长情况:Ⅲ组原位转染组织因子途径抑制物2后兔角膜新生血管形成及生长明显受抑制.②角膜组织因子途径抑制物2及基质金属蛋白酶表达:Ⅲ组实验兔角膜组织组织因子途径抑制物2基因表达高于Ⅰ,Ⅱ组(P＜0.01);Ⅲ组角膜组织MMP-1,2,3表达较Ⅰ,Ⅱ组降低,以MMP-1,3下降显著.结论:质粒pBos-Cite-neo/组织因子途径抑制物2含有组织因子途径抑制物2基因,局部转染后角膜组织表达组织因子途径抑制物2升高,通过抑制基质金属蛋白酶的活性而抑制角膜新生血管生长.
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人脐带内皮细胞与平滑肌细胞的分离培养特照
目的:如何便捷有效地获取种子细胞是构建组织工程皮肤、角膜、血管等成功与否的关键,实验对人胎儿脐带内皮细胞和平滑肌细胞的分离、纯化、培养扩增技术进行探讨.方法:实验于2006-11在暨南大学医学院完成.①实验材料:剖宫产正常胎儿脐带由暨南大学第一临床学院提供,产妇均知情同意.②实验方法:配制培养液,A液为在M199培养液中加入20%胎牛血清、20 mg/L肝素、10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子,B液为在M199培养基中加入10%胎牛血清、250 mg/L G418.取脐带15～20 cm,采用胶原酶"灌注消化法"获取脐带内皮细胞制成悬液,静置0.5 h后利用成纤维细胞短时间内贴壁的特点,把尚未贴壁细胞吸出重新接种于含有A液的培养瓶,初步去除部分成纤维细胞,细胞贴壁24 h后将培养液换为B液,继续培养3 d,去除成纤维细胞,然后再用A液扩大培养.从消化完脐静脉内皮细胞的脐带中剥取脐动脉,刮除内皮细胞,将血管条剪成小块均匀贴于培养瓶底,培养瓶内加入含20%小牛血清的DMEM培养液2 mL,缓慢竖直培养瓶,以培养液刚未浸没培养块为佳,放入37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱内干涸8 h后,将培养瓶轻轻翻转,使植块刚浸入培养液中,绝对静置3 d,以后每3 d换液1次,待植块周围生长晕的细胞融合成片时,即可传代,传代后DMEM培养液的血清浓度由原来的20%改为5%,且在培养液中加入0.2 L肝素.③实验评估:通过倒置相差显微镜观察细胞生长情况,分别以第Ⅷ因子、α-肌动蛋白免疫组织化学染色法鉴定内皮细胞和平滑肌细胞.结果:①内皮细胞的生长观察:接种24 h后,镜下可见刚贴壁的细胞呈圆形,逐渐转变为多角形或梭形,胞间可见有成纤维细胞混杂,加入B液3 d后成纤维细胞逐渐死亡.传代细胞呈"铺路石"样,细胞周围特别是近胞核处可见明显光晕,为典型的内皮细胞生长特点.②内皮细胞第Ⅷ因子相关抗原的检测:胞浆丰富且有棕黄色颗粒,细胞核不着色,呈阳性反应.③平滑肌细胞的生长观察:镜下组织块贴壁后5～7 d可见有少数细胞从植块边缘游出,第10～15天植块周围形成明显的细胞生长晕,细胞呈长梭形、带状或三角状,有1～4个细胞核,可见半透明颗粒,第20～25天细胞密集、平行排列,形成"峰谷样"结构,是平滑肌细胞的特征性生长表现.④平滑肌细胞特异性α-肌动蛋白单克隆抗体检测:胞浆内可见棕黄色细丝,为特异性α-平滑肌肌动蛋白,细胞核不着色.结论:以胎儿脐带作为种子细胞的来源,成功分离后通过调节培养液的成分,既能排除成纤维细胞的污染又可以令内皮细胞和平滑肌细胞快速增殖.
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脐血单个核细胞成功培养的相关影响因素
目的:脐血来源丰富且免疫原性低,移植后排斥反应低的特性决定其具有临床应用的可行性.实验拟验证脐血单个核细胞数量与孕妇年龄条件、脐血量及制备因素的相关性,并证实其在体外培养的佳条件.方法:实验于2006-03/2007-01在辽宁省血液中心输血医学研究所细胞研究中心完成.①实验材料:300份脐血均来源于足月分娩的健康孕妇,全部签署知情同意书.孕妇年龄20～35岁,其中≤25岁36例,＞25岁264例;脐血采集量15～130 mL,其中＜33 mL 18例,≥33 mL 282例;采集到制备时间差为2～24 h,其中＞12 h 30例,≤12 h 270例.红细胞裂解液由本实验室自制,主要成分为高渗盐水和三蒸水.②实验方法:人脐血用枸橼酸钠抗凝,采用密度梯度离心法分离得到脐血单个核细胞,锥虫蓝染色结果表明活细胞比率达95%～100%.将脐血单个核细胞分别按1×106,5×106,1×107的密度接种,以未加细胞因子作为对照组,在无血清DMEM/F12培养液中加入20 μg/L神经生长因子和2%神经营养因子B27作为扩增诱导组,于培养后的1,3,7 d进行换液,培养周期选择5 d、7～10 d和15 d.③实验评估:分别对脐血单个核细胞数与孕妇年龄、脐血采集量、采集到制备时间差的相关性进行分析.倒置荧光显微镜下观察细胞形态、细胞因子作用及佳的种植密度、首次换液时间、培养周期.观察使用红细胞裂解液后对脐血单个核细胞增殖和分化的影响.结果:①脐血细胞的生长及形态特征:脐血单个核细胞刚接种时为散在的圆形细胞,2 d贴壁,为散在的单个或数个细胞,呈长梭形,形态均一.3 d左右细胞突起增加,细胞数量增多.随着培养时间的延长,可见多个细胞之间形成网络,诱导后出现神经样细胞形态.②脐血单个核细胞数的影响因素:脐血单个核细胞数与孕妇年龄不相关(r＜0.3),与脐血量、采集到制备时间差均具有相关性(r＞0.8).③脐血单个核细胞培养影响因素:种植密度为5×106 L-1、首次换液时间在3 d左右、培养周期为7～10 d的细胞生长状态较好.扩增诱导组脐血单个核细胞增殖和分化状态好于对照组.④红细胞对脐血单个核细胞生长分化的影响:红细胞裂解的佳时间为45～50 s,并发现红细胞对脐血单个核细胞的生长有一定程度影响,且破骨细胞较多.红细胞裂解后的脐血单个核细胞增殖分化较好,细胞形态较为均一.结论:①采集量为33 mL、且采集到制备的时间差为12 h的脐血制备单个核细胞数量超过1×108的成功例数较高.②5×106 L-1接种密度、首次换液时间为3 d、培养周期7～10 d的脐血单个核细胞生长状态较好,神经细胞生长因子可促进其增殖分化.③红细胞裂解后脐血单个核细胞增殖分化更好,破骨细胞较少.
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系统性红斑狼疮患者骨髓间充质干细胞的体外扩增及鉴定
目的:探讨系统性红斑狼疮患者骨髓间充质干细胞的体外培养方法、生物学功能、表面标记表达的异常与否.方法:选择2004-12/2005-12于南京医科大学第一附属医院风湿科初诊为系统性红斑狼疮患者5例,均为女性,年龄20～35岁,诊断符合美国风湿病学院(ARA)1997年修订的诊断标准,所有患者知情同意后,获取骨髓标本.采用密度梯度离心法和贴壁筛选法分离培养5例系统性红斑狼疮患者骨髓间充质干细胞,观察其形态学改变,测定其生长曲线,采用流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞表面标记物及分析细胞周期.结果:5例系统性红斑狼疮患者骨髓间充质干细胞均分离培养成功,其中1例因出现细菌污染而终止培养.①传代细胞生长较原代要快,细胞在8～10 d即可达到90%融合.对P1、P2代细胞生长曲线进行观察,发现这2代细胞具有以下共同特征:传代培养的潜伏期为1～3 d,第4天起呈对数增长,至第7天达到高峰,之后进入平台期.②流式细胞术检测间充质干细胞细胞表面抗原显示,细胞高表达CD105、CD13、CDg0、CD73,而CD34、CD45、CD38、CD33阴性,3代以后的骨髓间充质干细胞纯度达到了95%以上,基本上排除了骨髓单个核细胞和巨噬细胞的污染.③间充质干细胞的周期分析显示,扩增后的间充质干细胞9.46%的细胞处于S/G2/M期,90.54%处于G0/G1期.结论:系统性红斑狼疮患者骨髓间充质干细胞体外可有效分离培养,所培养扩增的细胞成分单一,且保持干细胞特性,适于以后临床应用.
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人体脂肪基质细胞的分离培养及其成骨活性的研究
目的:脂肪组织来源的脂肪基质细胞具备向其他多种组织成分,如神经细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、软骨细胞、骨细胞等分化的能力.探讨人体脂肪组织来源脂肪基质细胞的分离培养方法及其成骨活性.方法:于2005-10/2006-05选取临床手术中收集的废弃脂肪组织及行脂肪抽吸术所得的脂肪组织为实验材料,采用机械切割及Ⅰ型胶原酶消化法从脂肪组织中分离获得脂肪基质细胞,原代培养后,以诱导培养基(内含10 mmol/L β-甘油磷酸钠、10-8 mol/L地塞米松、50 mg/L维生素C)进行诱导培养.实验评估:应用形态学观察、碱性磷酸酶钙-钴法染色检测碱性磷酸酶,Von Kossa钙化结节染色检测钙化结节的形成等方法来鉴定诱导分化所得细胞的成骨活性.结果:行诱导培养的脂肪基质细胞呈多层成长,形态多为梭形、锥形或立方形,细胞外基质有白色钙化结节形成;细胞增殖速度减慢,生长周期变长.碱性磷酸酶钙钴法染色及Von Kossa钙化结节染色后均表现为阳性,未诱导培养的脂肪基质细胞则表现为阴性.结论:初步建立了一套由脂肪组织分离培养脂肪基质细胞的方法,并证明该细胞具备成体干细胞的特性,在体外诱导培养条件下具备向成骨细胞分化的能力.
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体外诱导成人脂肪间充质干细胞分化为心肌样细胞
背景:目前对脂肪间充质干细胞在临床应用前还有许多问题需要解决,如脂肪间充质干细胞是否可以分化为完全意义上的心肌细胞,是否具备心肌细胞所特有的功能.如何提高脂肪间充质干细胞向心肌细胞的分化率,如何提高在移植后的归巢和存活率等问题的解决对于指导干细胞的临床应用有重要的意义.目的:观察体外培养并诱导成人脂肪间充质干细胞分化为心肌样细胞.设计:随机对照观察.单位:解放军总医院心内科实验室.材料:脂肪取自解放军总医院普外科腹部手术患者(均知情同意);IMDM(Hyclon公司),Ⅰ型胶原酶(Gibco公司),5-aza(Sigma),抗心肌特异性肌钙蛋白T(TnT)多克隆抗体(福建迈新生物技术公司),抗CD44、抗CD45、抗CD34、HLA2DR、Ⅷ因子单克隆抗体、抗结蛋白(Desmin),抗α-横纹肌肌动蛋白、抗肌球蛋白重链购自北京中杉金桥生物技术有限公司,DAB染色剂由北京中杉金桥生物技术有限公司提供,RT-PCR试剂盒由Invitrogen公司提供,心房利钠肽放免试剂盒(中国人民解放军总医院科技开发中心放免研究所).方法:实验于2005-03/2006-04在解放军总医院心内科实验室完成.细胞培养:采用消化法和贴壁培养法分离培养脂肪间充质干细胞.干预及检测:对第3代细胞进行细胞表面分子CD44,CD13,CD105,CD45,CD34,HLA-DR,factor Ⅷ的免疫细胞化学鉴定,并用5-氮杂胞苷(5-aza)进行诱导,于诱导后第7,14,21,28天采用RT-PCR法检测心肌化基因GATA4和Nkx2.5的表达,应用放射免疫法测定心房利钠肽含量.主要观察指标:①细胞表面标志鉴定结果.②心肌化基因GATA4和Nkx2.5的表达.③心房利钠肽含量.结果:①细胞表面标志鉴定:原代细胞CD13、CD44、CD105阳性表达,CD45、CD34、HLA2DR、Ⅷ因子阴性表达.诱导后7 d,所有细胞Desmin,α-横纹肌肌动蛋白、抗肌球蛋白重链和抗心肌特异性肌钙蛋白T呈阴性反应,大多数细胞CD44阳性表达.诱导后14 d少量细胞出现Desmin、α-横纹肌肌动蛋白和抗肌球蛋白重链抗原阳性表达,TnT阴性表达,部分细胞CD44呈阳性表达.诱导后21 d,多数细胞Desmin、α-横纹肌肌动蛋白、抗肌球蛋白重链和抗心肌特异性肌钙蛋白T呈阳性反应,CD44呈阴性表达.②心肌化基因GATA4和Nkx2.5的表达:诱导后14 d出现GATA4和Nkx2.5 cDNA的表达.③心房利钠肽含量:诱导后14 d心房利钠肽含量为(0.022±0.01)ng/L,与诱导后7 d比较差异无显著性(P＞0.05),诱导后21 d和诱导后28 d分别为(7.92±0.21)和(8.12±0.50)ng/L,与诱导后7 d比较差异均有显著性(P＜0.05),但两者之间差异无显著性(P＞0.05).结论:成人脂肪组织中含有间充质干细胞,且可在5-氮杂胞苷诱导21 d后分化为心肌样细胞.
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灰色数列预测模型在成骨细胞体外培养中的应用
目的:灰色模型是运用一定的数学方法使信息不完全明确的系统经数据处理后能得到较明确结果的一种数学预测模型,体外细胞培养的影响因素较多,属于信息不完全明确的灰色系统,故运用灰色GM(1,1)模型对成骨细胞增殖、分化的变化规律进行预测,验证模型在体外细胞培养中的可应用性.方法:实验于2005-11/2006-03在广东医学院药理教研室完成.①实验过程:应用酶序列消化分离培养法培养新生大鼠颅骨成骨细胞;用MTT法测定体外培养成骨细胞在不含血清培养液A值,以了解成骨细胞的增殖情况;对硝基苯磷酸盐法观察体积分数为0.01的胎牛血清培养液对体外培养成骨细胞分泌碱性磷酸酶活性的影响,代表成骨细胞的分化情况.②灰色GM(1,1)模型建立:运用灰色系统理论,通过SAS8.1软件对体外培养成骨细胞MTT值和碱性磷酸酶OT值进行分析和预测.结果:运用灰色系统理论的后验差检验方法对模型进行检验,MTT这一指标的平均相对误差为4.4%,碱性磷酸酶这一指标的平均相对误差为7.04%,后验差比值为0.048和0.315,综合评定该模型为"好".结论:灰色GM(1,1)模型对体外培养成骨细胞MTT值和碱性磷酸酶的OT值变化的预测精度高,结果可靠.体外培养成骨细胞MTT值和碱性磷酸酶的OT值的变化可用灰色GM(1,1)模型进行预测.
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外周血Th细胞因子水平与褪黑素变化在自身免疫性肝炎大鼠的表现
目的:褪黑素是机体神经内分泌免疫调节网络中的重要成员,已证实其对四氯化碳致大鼠肝损伤具有保护作用.实验观察褪黑素对自身免疫性肝炎大鼠外周血Th细胞因子水平的影响.方法:实验于2004-10/2006-10在解放军南京军区肝病中心实验室完成.①实验动物:雄性3月龄Wistar大鼠80只,随机数字表法分为4组:正常对照组、模型对照组、褪黑素治疗组、猪促肝细胞生长素治疗组,20只/组.另取同系Wistar大鼠10只用于提取肝细胞特异性脂蛋白抗原.②实验方法:除正常对照组外,其余各组均采用弗氏完全佐剂+肝细胞特异性脂蛋白建立自身免疫性肝炎模型.褪黑素用含0.01%乙醇的生理盐水配制成1 g/L的溶液,褪黑素治疗组腹腔注射2 mg/kg;猪促肝细胞生长素用含0.01%乙醇的生理盐水配制成2 g/L的溶液,猪促肝细胞生长素治疗组腹腔注射2 mg/kg;正常对照组和模型对照组均腹腔注射含0.01%乙醇的生理盐水,1次/d,连续60 d.③实验评估:检测各组大鼠外周血Th细胞因子的水平.结果:80只大鼠均进入结果分析.①褪黑素对Th1细胞因子水平的影响:与模型对照组比较,褪黑素治疗组、猪促肝细胞生长素治疗组白细胞介素2和干扰素γ水平均显著升高(P＜0.05),且褪黑素治疗组调节Th1细胞因子水平的作用强于猪促肝细胞生长素治疗组(P＜0.01).②褪黑素对Th2细胞因子水平的影响:与模型对照组比较,褪黑素治疗组、猪促肝细胞生长素治疗组白细胞介素4,6水平均显著降低(P＜0.05),且褪黑素治疗组调节Th1细胞因子水平的作用强于猪促肝细胞生长素治疗组(P＜0.01).结论:褪黑素能够刺激自身免疫性肝炎大鼠外周血Th1细胞因子表达,并抑制Th2细胞因子水平,从而改善肝组织病变程度.
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外周血单个核细胞来源树突状细胞分泌细胞因子在过敏性紫癜急性期的变化
目的:观察外周血单个核细胞来源的树突状细胞分泌白细胞介素水平在过敏性紫癜急性期的变化,分析其与Th亚群平衡的相关性.方法:实验于2006-10/2007-12在青岛大学医学院附属医院儿科研究所完成.①实验对象:取急性期过敏性紫癜患儿外周静脉血28份作为过敏性紫癜组,平均年龄7.53岁;以门诊体检的健康同龄儿童外周静脉血18份作为对照组.儿童家属均知情同意.②实验方法:采血2.0～3.0 mL/份,肝素抗凝,离心移取血浆1 mL冻存备测.采用密度梯度离心法获取外周血单个核细胞,调整细胞悬液浓度为2×109 L-1,接种于24孔板向树突状细胞进行诱导培养.每孔加入含终浓度1 000 u/mL重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、500 u/mL重组人白细胞介素4的RPMI-1640完全培养液1 mL,隔日添加1/2首次浓度的上述两种细胞因子,半量换液.培养至第6天,每孔加入重组人肿瘤坏死因子α至终浓度200 u/mL.③实验评估:倒置显微镜观察树突状细胞的生长情况,以流式细胞仪检测成熟树突状细胞特异性表面分子CD83的表达率.采用ELISA法检测血浆干扰素γ、白细胞介素4的水平及培养上清中的白细胞介素10,12,18水平.结果:①树突状细胞体外诱导培养过程的形态学观察:外周血单个核细胞贴壁3 h后获得黏附细胞,加入细胞因子24 h后可见悬浮细胞增多,并呈细胞聚集现象,培养至第8天可见到大量具有毛刺状或根须状突起的悬浮细胞,即为树突状细胞.②树突状细胞的表型鉴定:过敏性紫癜组及对照组树突状细胞表面分子CD83均呈高表达,表达率分别为(69.29±1620)%,(69.26±18.77)%.③Th亚群变化:与对照组比较,过敏性紫癜组白细胞介素4水平明显升高(t'=5.09,P＜0.01),干扰素γ、干扰素γ/白细胞介素4水平均明显降低(t=4.26,P＜0.01;t'=7.98,P＜0.01).④树突状细胞分泌细胞因子的水平:与对照组比较,过敏性紫癜组树突状细胞白细胞介素12水平明显降低(t=2.53,P＜0.05),白细胞介素10,18水平均明显升高(t=2.07,P＜0.05:t=2.10,P＜0.05).⑤树突状细胞分泌细胞因子水平与Th亚群平衡相关性分析:两组树突状细胞分泌白细胞介素12水平均与干扰素γ水平呈显著正相关(r=0.56～0.62,P均＜0.01),与干扰素γ/白细胞介素4值呈正相关(r=0.51～0.52,P＜0.01或0.05).两组白细胞介素10,18水平均与白细胞介素4水平呈显著正相关(r=0.85～0.68,P均＜0.01),与干扰素γ/白细胞介素4值呈负相关(r=-0.75-0.49,P＜0.01或0.05).结论:过敏性紫癜患儿分泌白细胞介素12水平不足,而分泌白细胞介素10,18水平升高,提示过敏性紫癜患儿存在树突状细胞功能紊乱,且与Th1/Th2失衡关系密切.
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趋化因子受体CCR1、CCR5在多发性骨髓瘤中的表达及对瘤细胞与基质细胞黏附的影响
目的:观察趋化因子受体CCR1、CCR5在多发性骨髓瘤患者骨髓单个核细胞、骨髓基质细胞、人多发性骨髓瘤细胞系KM3、SKO007、XG-6中的表达及介导巨噬细胞炎症蛋白-1α对瘤细胞与基质细胞的黏附.方法:选择2004-08/2006-07在桂林医学院附属医院血液科住院的患者16例,男10例,女6例,中位年龄56岁,经国内统一标准确诊为多发性骨髓瘤患者.患者知情同意,并经医院伦理委员会批准.①实验方法:取样本进行骨髓单个核细胞与骨髓基质细胞的分离培养.人多发性骨髓瘤细胞系KM3、SKO007、XG-6从外室传代引进后,在含体积分数为0.10胎牛血清的RPMI1640培养液中培养,每3天更换1次培养液,本实验用的细胞均处于对数生长期.②实验评估:半定量RT-PCR及Western-blot技术检测骨髓瘤骨髓单个核细胞、骨髓基质细胞及骨髓瘤细胞系KM3、SKO007、XG-6中的CCR1、CCR5表达;MTT微量酶反应比色法定量检测瘤细胞与基质细胞的黏附.结果:①约43.8%的多发性骨髓瘤患者骨髓及2/3的多发性骨髓瘤细胞系均表达CCR1、CCR5两种受体,约6.25%的多发性骨髓瘤患者骨髓单个核细胞仅表达CCR1受体,且大部分能在蛋白质水平上进一步得到鉴定.②加巨噬细胞炎症蛋白1α单抗、CCR1和/或CCR5单抗组,KM3、SKO007、XG-6细胞与基质细胞的黏附作用较对照组明显下降(P＜0.05),而单抗组间无明显差异(P＞0.05).结论:大部分多发性骨髓瘤患者及多发性骨髓瘤细胞系表达CCR1、CCR5两种受体,巨噬细胞炎症蛋白1α可能是运用CCR1、CCR5两种受体来介导瘤细胞与基质细胞的黏附.
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原代培养猪甲状腺细胞及甲状腺过氧化物酶活性与氟化钠的影响
目的:流行病学调查结果显示,地方性氟中毒与甲状腺肿的流行有很大的重叠性.探讨氟化钠对原代培养猪甲状腺细胞及甲状腺过氧化物酶活性的影响.方法:实验于2006-10/2007-05在辽宁医学院科学实验室中心完成.①实验方法:在猪死亡1 h内取其甲状腺组织,去除甲状腺组织包膜及外层活性差的组织,选取中央活性高的部位,剪成1 mm3组织块,用胰蛋白酶、胶原酶Ⅳ消化分离,得到含猪甲状腺细胞的消化液,沉淀悬于含体积分数为0.15的胎牛血清、1 U/L牛促甲状腺素、80万U/L庆大霉素的F12培养基中,过滤,调整细胞浓度至5×105 L-1,接种培养,每3 d更换培养液.常规培养48 h的猪甲状腺细胞接种于96孔培养板,按氟化钠终浓度不同分为0,40,80,160 mg/L组.②实验评估:染毒48 h后,采用噻唑蓝法测定细胞存活量,采用改良愈创木酚法测定甲状腺过氧化物酶活性.结果:①氟化钠对原代培养猪甲状腺细胞存活量的影响:与0 mg/L氟化钠比较,40 mg/L氟化钠染毒后猪甲状腺细胞的存活量基本相似;80,160 mg/L氟化钠染毒后猪甲状腺细胞的存活量均明显下降(P＜0.01).②氟化钠对甲状腺过氧化物酶活性的影响:与0 mg/L氟化钠比较,40,80,160 mg/L氟化钠染毒后的甲状腺过氧化物酶活性均明显下降(P＜0.01),呈剂量-效应关系.结论:氟化钠对原代培养的猪甲状腺细胞及甲状腺过氧化物酶活性均具有抑制作用.
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丁酸钠诱导人单核细胞源性未成熟树突状细胞的形态及免疫功能变化
背景:未成熟树突状细胞(dendritic cells,DC)可以诱导免疫耐受形成,在器官移植领域具有广阔应用前景.目前采用的诱导未成熟树突状细胞的方法仍存在一些不足,寻求新的诱导方法十分必要.目的:观察丁酸钠对人外周血来源的树突状细胞的成熟状态和免疫学功能的影响.设计:观察对比,体外细胞学实验.单位:中山大学附属第二医院肝胆外科.材料:人外周血样品取自中山大学身体健康的大学生志愿捐献者(年龄20～23岁),共5份,每份100 mL,均在献血后2 h内进行外周血单个核细胞和淋巴细胞分离.方法:实验于2006-09/2007-03在中山大学附属第二医院医学研究中心完成.①人外周血单个核细胞采用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4诱导成为未成熟树突状细胞.②诱导6 d后,加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠1 mmol/L诱导,以促成熟因子脂多糖1 mg/L为对照;设不加促成熟因子为空白对照组.③在诱导0 d时加入丁酸钠,6 d时加入脂多糖再次刺激.主要观察指标:动态观察细胞形态学变化,流式细胞仪检测DC表型,FITC标记的Dextran检测DC内吞能力,采用酶联免疫吸附法检测白细胞介素12分泌,混合淋巴细胞反应检测DC刺激淋巴细胞增殖能力.结果:①DC形态:在丁酸钠作用下,DC聚集现象明显减少.②细胞表型检测结果:丁酸钠促成熟组常规方法诱导的未成熟DC的CD80,CD83,HLA-DR表达均低于脂多糖组,差异有显著性意义(P＜0.01).采用丁酸钠法诱导的未成熟DC,在第6天时加入促成熟因子脂多糖后CD80,CD83,HLA-DR表达仍处于低水平.③DC内吞能力:常规方法诱导的未成熟DC,用LPS诱导成熟后,其内吞能力均低于空白对照组和丁酸钠促成熟组,差异有非常显著性意义(P＜0.01);而采用丁酸钠法诱导的DC,其内吞能力强,高于其他各组,差异有非常显著性意义(P＜0.01).④DC分泌白细胞介素12:常规诱导法用LPS诱导DC成熟后的白细胞介素12分泌水平高于对照组、丁酸钠促成熟组及丁酸钠诱导法,差异有非常显著性意义(P＜0.01).⑤DC诱导的MLR:常规诱导法用LPS诱导的成熟DC刺激淋巴细胞的增殖能力显著高于对照组、丁酸钠促成熟组及丁酸钠诱导法,差异有非常显著性意义(P＜0.01).结论:丁酸钠可以抑制DC成熟,稳定诱导未成熟DC生成,该DC不能被促成熟因子激活,在诱导移植免疫耐受方面具有潜在应用前景.
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荧光染色法分析17β-雌二醇对获能人精子细胞顶体反应及细胞外Ca2+和蛋白激酶C抑制剂的影响
目的:精子细胞功能受雌激素的调节,雌激素能促进精子蛋白酪氨酸磷酸化、获能和顶体反应,从而增强精子的受精能力.但有关雌激素诱导精子细胞发生顶体反应的信号途径尚未阐明.本实验于体外观察雌激素对人精子细胞顶体反应的影响,并初步探讨其可能的作用途径.方法:实验于2006-07/2007-04在成都医学院科研中心实验室完成.实验材料:实验所用49份精液标本来自年龄25～45岁、有正常生育史、身体健康的成年男性志愿者,其精液常规各项指标符合WHO制定的正常精液常规标准.实验方法:①应用FITC-PSA荧光染色法分析精子顶体反应率,以分光光度比色法测定顶体酶活性,观察雌激素类活性物质17β-雌二醇对获能人精子细胞顶体反应和顶体酶活性的影响.②取9份上游后精子细胞悬液,每份均分为2份,分别用含钙获能液(1 mmol/LCa2+)和无钙获能液(0 mmol/L Ca2+)调整密度.再将2份精子悬液均分为17β-雌二醇作用组和对照组,观察胞外钙离子对17β-雌二醇诱导顶体反应的影响.③取9份获能精子细胞悬液,每份均分为17β-雌二醇作用组、蛋白激酶C抑制剂作用组、17β-雌二醇+蛋白激酶C抑制剂作用组和空白对照组,观察蛋白激酶C抑制剂对17β-雌二醇诱导顶体反应的影响.④取10份获能精子细胞悬液,每份均分为17β-雌二醇作用组、雌二醇-牛血清白蛋白交联作用组和空白对照组.观察非透膜性大分子物质雌二醇-牛血清白蛋白交联物对人精子细胞顶体反应的影响.⑤采用流式细胞术检测精子膜雌激素受体,以初步探讨雌激素对人精子细胞顶体反应影响的作用途径.结果:①17β-雌二醇可促进精子细胞顶体反应,并增强精子细胞顶体酶的活性.②去除培养液中的Ca2+后,17β-雌二醇不能诱导精子细胞发生顶体反应.③蛋白激酶C抑制剂能明显降低17β-雌二醇所诱导的顶体反应.④雌二醇-牛血清白蛋白交联物亦能够促进精子细胞发生顶体反应,其作用与游离雌二醇无明显差异.⑤流式细胞仪检测显示,E2-BSA-FITC(异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白-雌二醇复合物)处理组和BSA-FITC(异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白)对照组间荧光强度均值差异有统计学意义.结论:雌激素对人精子细胞顶体反应有一定的促进作用,其作用途径之一可能是通过增强精子顶体酶活性来实现,此过程涉及了胞外Ca2+、蛋白激酶C及精子膜上的雌激素受体或雌激素结合位点的参与.
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白血病患者Flt-3基因突变及其与白血病发生、预后的关系
背景:Flt3基因是近年来发现的早期造血生长因子受体基因.Flt3与其配体结合后能通过信号传导途径对造血干/祖细胞的增殖和分化起调节作用.Flt3近膜区的内部串联重复(FLT3/ITD)与多种白血病的发生,发展密切相关,且为预后不良的独立指标.目的:探讨Flt-3基因内部串联重复(ITD)突变与急性白血病发生的关系及其预后判断的临床意义.设计:重复测量.单位:沈阳医学院生物化学及分子生物教研室.对象:147例样本均来自于1999-01/2004-12沈阳医学院附属医院住院及门诊收治的白血病患者,均经形态学及骨髓活检确诊.其中男95例,女52例;年龄5～23岁.参照FAB分型标准诊断:急性髓性白血病62例患者分别为AML(M1,M2)33例,AMMOL(M4)3例,AMOL(M5)18例,AMKL(M7)8例,急性淋巴细胞白血病43例,幼年型慢性粒细胞白血病13例,骨髓增生异常综合征29例.纳入对象均对检测项目知情同意.方法:采用聚合酶链反应联合序列检测147例白血病患者中的Flt-3/ITD.主要观察指标:观察伴有Flt-3/ITD急性髓性白血病患者的临床表现及预后,检测各类急性白血病中Flt-3的表达水平及Flt-3/ITD阳性率,发生的区间和长度.结果:①Flt-3/ITD:急性髓性白血病患者62例中有5例除Flt-3表达产物之外,伴有异常扩增产物,其中急性髓性白血病(M1,M2)3例、AMMOL 1例、AMOL 1例.测序及Blast比对分析显示,伴有异常产物的患者在外显子11区均有ITD,各例ITD的复制区域不同,长短不等(33～72 bp).43例急性淋巴细胞白血病、29例骨髓增生异常综合征和13例幼年型慢性粒细胞白血病患者中均未检测到Flt-3/ITD.②预后:5例Flt-3/ITD阳性患者确诊后均在短期内死亡,平均生存期10.8个月.结论:①Flt-3/ITD仅发现于急性髓性白血病患者,其存在可能与急性髓性白血病发生及进展有关.②Flt-3/ITD是急性髓性白血病患者预后判断的重要标志.
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mCD20-腺病毒载体的构建
目的:构建编码鼠CD20(mCD20)基因的腺病毒载体,即AdmCD20重组质粒,为后续将其感染DC作为疫苗免疫小鼠做准备工作,为CD20基因治疗淋巴瘤的研究奠定基础.方法:实验于2006-03/2007-04在解放军北京军区总医院血液科实验室完成.运用分子生物学技术,利用本实验室保存的mCD20,以PCR凝胶电泳、酶切进行鉴定后,将该基因cDNA片段插入腺病毒穿梭质粒pDC315中,转化至高效感受态DH5a细菌细胞中进行扩增,提取质粒,获得重组质粒腺病毒穿梭质粒pDC315-mCD20,然后采用Ad MaxTM腺病毒载体包装体系,构建Ad5/35mCD20.结果:顺序成功重组pcDNA3.1-mCD20质粒,腺病毒穿梭质粒pDC315-mCD20,然后采用Ad MaxTM腺病毒载体包装体系成功构建编码鼠CD20基因的腺病毒载体.结论:表达mCD20基因的腺病毒载体构建成功,此方法准确可行,为后续实验奠定基础.
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雄激素受体基因第一外显子区CAG缺失的构建及其在HEK293细胞中的表达
目的:构建雄激素受体基因第一外显子区CAG重复序列缺失的突变重组体,观察CAG重复序列的有/无对雄激素受体转录及表达的调控作用.方法:实验于2006-05/2007-05在解放军总医院老年医学研究所完成.按照重叠延伸反应的原理扩增CAG重复序列两端的基因片段,再将两片段混合,在加入一个引物的情况下进行8个PCR循环以有效完成重叠延伸,然后再加入另一引物进行22个循环,完成目的片段指数扩增,将目的片段克隆至真核表达载体PAR-IRES2-EGFP,转染HEK293细胞,采用Western blot法检测HEK293细胞雄激素受体蛋白.结果:构建的CAG重复序列缺失的突变重组体经酶切鉴定和DNA测序证实构建正确,转染真核细胞可检测到雄激素受体基因的表达.结论:重叠延伸PCR是进行体外基因拼接、体外缺失突变的简单、快速的基因重组技术;雄激素受体基因第一外显子区CAG重复序列缺失的突变重组体的成功构建可为今后的相关研究提供实验基础.
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逆转录病毒载体介导人胰岛素样生长因子Ⅰ在大鼠成肌细胞中的表达及分泌
目的:将经逆转录病毒载体的介导的人胰岛素样生长因子Ⅰ基因导人大鼠成肌细胞,观察其是否表达,为组织工程人工肌肉体内基因治疗打下基础.方法:实验于2005-10/2006-12在华中科技大学同济医学院协和医院心血管病研究所完成.①实验材料:PLghlGF1SN由本实验室保存,逆转录病毒包装细胞系GP+E86购自Clontech公司,包装细胞PT67购自ATCC.②实验方法:选用新生SD乳鼠骨骼肌进行成肌细胞的原代培养,选用新生SD乳鼠心脏进行心肌细胞的培养.通过脂质体2000将人胰岛素样生长因子Ⅰ c DNA导入逆转录病毒包装细胞PT67,经过G418筛选获取稳定表达病毒的克隆,NIH3T3细胞测定病毒滴度,挑取滴度高的克隆扩增,收取高滴度的病毒上清液,转染成肌细胞.③实验评估:G418筛选转染过的成肌细胞,采用ELISA方法检测其上清液中人胰岛素样生长因子Ⅰ的表达,采用MTT法检测人胰岛素样生长因子Ⅰ的生物学活性.结果:①病毒滴度的测定:利用不同量的病毒上清感染1×105 NlH3T3细胞,并经G418筛选,测得不同PT67克隆的培养上清中,病毒滴度高为8×105 cfu/mL.②ELISA方法检测人胰岛素样生长因子Ⅰ的表达:在转染后大鼠成肌细胞分泌的上清液中可以检测到人胰岛素样生长因子Ⅰ的表达,经过G418筛选2周后,收集培养液,人胰岛素样生长因子Ⅰ浓度高在40 μg/L,总量可以达到(150～200)ng/2×106/d.未转染成肌细胞组人胰岛素样生长因子Ⅰ浓度约在0.3 μg/L.③MTT法检测人胰岛素样生长因子Ⅰ的生物学活性:转染的成肌细胞培养上清液刺激心肌细胞后,心肌细胞活力明显增加.结论:人胰岛素样生长因子Ⅰ基因可在鼠成肌细胞内稳定表达并具有生物学效应,可用于心血管系统基因治疗的研究.
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反转录病毒载体介导RNA干扰抑制EphA2在Hela细胞中的蛋白表达
目的:课题前期发现EphA2和配体EphrinAl在宫颈鳞癌细胞和肿瘤相关血管内皮细胞均呈高表达,为基因治疗宫颈癌提供了理想的靶向.以此为基础,利用反转录病毒载体介导的RNA干扰抑制EphA2在Hela宫颈癌细胞中的蛋白表达.方法:实验于2006-01/06在河南省肿瘤病理重点实验室完成.①实验材料:PA317细胞、Hela229细胞购自上海生化细胞所,小鼠NIH3T3细胞为本室保存.EphA2兔抗人多克隆抗体,Actin兔抗人多克隆抗体(美国Santa Cruz公司).②实验方法:从EphA2的mRNA全序列中筛选出1个19 nt的靶序列,设计双链发夹结构.以siRNA互补双链寡核苷酸,构建反转录病毒表达载体pSIREN-EphA2,提取质粒,用BgIⅡ和EcoR Ⅰ双酶切进行鉴定.选择经酶切鉴定的正确克隆测序.挑选pSIREN-EphA2抗性克隆细胞扩增,检测转染后Hela细胞中EphA2蛋白的表达水平.结果:①pSIREN-EphA2重组质粒的酶切鉴定:双酶切后形成328 bp和6 182 bp两条电泳条带.②pSIREN-EphA2重组质粒测序:结果与已知序列完全一致.③EphA2蛋白的表达:经Western blot分析,重组pSIREN-EphA2转染的Hela细胞中EphA2蛋白表达水平明显降低.结论:通过反转录病毒载体介导的RNA干扰,能够抑制EphA2在Hela细胞中的蛋白表达,为以EphA2为靶点的宫颈癌基因治疗提供新的思路和手段.
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血管内皮细胞生长因子受体2基因短发夹RNA介导基因沉默对白血病的抑制
背景:血管内皮细胞生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)在血管内皮细胞生长因子的信号转导中有主导效应,并在某些疾病包括白血病的病理性血管生成中起关键作用.另外,白血病细胞分泌的血管内皮细胞生长因子还诱导自身表达VEGFR2,从而维持自身存活、增殖.目的:观察表达VEGFR2短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的慢病毒载体Lenti6/shVEGFR2在全身性NOD/SCID白血病模型鼠中的作用.设计:随机、平行对照、开放性实验.单位:中山大学附属第二医院儿科,中山大学生物工程研究中心.材料:实验于2004-05/2006-01在中山大学附属第二医院医学研究中心、中山大学生物工程研究中心完成.分别以HL60,EA·hy926细胞株作为实验用白血病细胞、人血管内皮细胞的来源.Block-iT Lentiviral RNAi Expression System(Invitrogen);human VEGFR2 Mcb(PE标记,R&D).CD31组化试剂盒(武汉博士德公司),CD33-PE流式细胞荧光标记抗体(BD公司).方法:①制备并筛选VEGFR2基因的有效siRNA,并据此设计shRNA寡核苷酸链.②构建pU6/shVEGFR2入门克隆.瞬时转染细胞,构建表达克隆Lenti6/shVEGFR2,与ViraPowerTM Packaging Mix共转染到293FTTM细胞中,产生携带表达克隆的慢病毒载体.③pU6/shVEGFR2入门克隆转染和Lenti6/shVEGFR2转导HL60细胞,MTT法测定HL60细胞抑制率.④建立HL60白血病模型后观察注入人血管内皮细胞后小鼠骨髓微血管的分布.⑤将NOD/SCID小鼠20只随机分为4组,每组5只:白血病模型鼠组,白血病模型鼠静脉注射重组慢病毒组,白血病模型鼠静脉注射重组慢病毒和内皮细胞组及白血病模型鼠静脉注射内皮细胞组.检测各组小鼠的骨髓细胞CD33表达变化、骨髓微血管密度变化及外周血细胞涂片、肝、脾的肿瘤浸润情况,以了解Lenti6/shVEGFR2重组慢病毒对小鼠白血病的作用.主要观察指标:①VEGFR2 siRNA鉴定结果.②pU6/shVEGFR2入门克隆转染HL60后对其VEGFR2表达的影响.③pU6/shVEGFR2入门克隆转染、Lenti6/shVEGFR2表达克隆转导HL60细胞后细胞抑制率比较.④慢病毒介导的shRNA对HL60模型鼠VEGFNEGFR2旁分泌和自分泌的影响.结果:①pU6/shVEGFR2入门克隆转染HL60后对其VEGFR2表达的影响:VEGFR2 siRNAc抑制HL60细胞效率高,利用其构建的pU6/shVEGFR2入门克隆并转染HL60,抑制细胞效率达84.9%;显著抑制HL60细胞VEGFR2基因mRNA和蛋白的表达.②pU6/shVEGFR2入门克隆转染、Lenti6/shVEGFR2表达克隆转导HL60细胞后细胞抑制率比较:pU6/shVEGFR2入门克隆转染、Lenti6/shVEGFR2表达克隆转导HL60细胞后48 h细胞抑制率相近,48 h后入门克隆转染组细胞抑制率明显下降(P＜0.01);而表达克隆转导组细胞抑制率变化缓慢,在96 h达高峰,120 h稍降,变化无显著差异.③慢病毒介导的shRNA对HL60模型鼠VEGF/VEGFR2旁分泌和自分泌的影响:白血病模型组、白血病模型鼠静脉注射重组慢病毒组、白血病模型鼠静脉注射重组慢病毒和内皮细胞组小鼠骨髓流式细胞仪HL60检测结果分别为(25.8%±4.9)%,(14.3%±5.1)%,(8.4±2.6)%,三组比较,差异有显著性意义(P＜0.05);白血病模型鼠静脉注射重组慢病毒和内皮细胞组微血管密度明显小于白血病模型鼠静脉注射内皮细胞组.白血病模型鼠静脉注射重组慢病毒和内皮细胞组与其他组相比HL60细胞数低.结论:①pLenti6/shVEGFR2表达克隆转导HL60细胞后持续高水平抑制细胞.重组慢病毒Lenti6/shVEGFR2具有抑制白血病小鼠骨髓血管生成的作用.②VEGFR2 siRNA可阻断白血病HL60细胞VEGF/VEGFR2自分泌的内环路,在体外、动物体内均得到验证.③VEGF/VEGFR2自分泌链和旁分泌链的联合阻断加强了抗白血病效果.
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构建大肠癌细胞相关基因Nrf3融合蛋白真核表达载体及其体外转染的初步功能分析
目的:应用基因芯片生物信息学分析思路筛查大肠癌细胞相关基因Nrf3,构建融合蛋白真核表达载体,检测其对体外转染癌细胞周期与凋亡的影响.方法:实验于2004-01/2006-07在南方医科大学病理解剖教研室及肿瘤研究所与中国农业大学农业生物技术国家重点实验室完成.①实验材料:大肠癌细胞组织及其配对的正常大肠黏膜各3例,由解放军总医院病理科提供;大肠癌LoVo细胞系由南方医科大学肿瘤研究所提供;肝癌SMMC7721细胞系由解放军军事医学科学院放射医学研究所提供;真核表达载体pEGFP-N1(Clontech公司).②实验方法:分别应用Excel表、Affymetrix Microarray Suite Software 5.0分析软件和STATA7.0分析软件,对基因芯片表达谱数据行交集补集分析、秩和检验及T检验,筛选"重要的大肠癌细胞差异表达基因&ESTs",差异表达P＜0.05,差异倍数＞2.应用文献轮廓法进一步分析确定首选研究基因为Nrf3,提取组织样品总RNA,cDNA合成,PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化,插入T载体中,Sal Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后连接到pEGFP-N1载体,获得重组pEGFP-N1-Nrf3质粒.LoVo细胞在体外加入含体积分数为0.1小牛血清、100 u/mL青链霉素的RPMI-1640培养基,置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中,待转染质粒pEGFP-N1-Nrf3与阴性对照质粒pEGFP-N1转染36 h后,荧光显微镜观察候选基因亚细胞定位,FCM分选术观察其在体外对LoVo细胞周期和凋亡的影响.同法观察重组pEGFP-N1-Nrf3质粒体外转染对SMMC7721细胞周期和凋亡的影响.结果:①首选研究大肠癌细胞相关基因的确认:多种统计学方法分析获得重要的大肠癌细胞相关基因17个,文献轮廓法进一步确认Nrf3为首选研究基因.②Nrf3基因表达:RT-PCR法检测Nrf3在3例大肠癌细胞组织均有表达,而在与其相配对的正常黏膜中表达较弱或不表达,与芯片检测结果基本一致;Nrf3在LoVo细胞中有表达.③Nrf3亚细胞定位:重组pEGFP-N1-Nrf3质粒转染的LoVo细胞其绿色荧光主要分布于细胞核内,提示Nrf3可能定位于细胞核内.④Nrf3在体外对癌细胞周期与凋亡的影响:体外培养36 h后与未转染LoVo细胞的空白对照比较,重组pEGFP-N1-Nrf3质粒转染的LoVo细胞S+G2/M期所占比例明显减低,G2/M期下降尤为显著,G0/G1期细胞所占比例明显增加.Nrf3转染作用于LoVo细胞后,未观察到明显"亚G1"峰(即凋亡峰)的出现.Nrf3体外转染的SMMC7721细胞周期及凋亡情况与LoVo细胞基本相似.结论:大肠癌细胞相关基因Nrf3在体外能够抑制LoVo细胞、SMMC7721细胞的DNA合成和有丝分裂,促使癌细胞阻滞于G0/G1期,抑制其生长增殖的同时不影响细胞凋亡,可作为大肠癌细胞候选分子标志物.
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中药生肌液对体外培养兔骨髓间充质干细胞成骨活性的影响
背景:在l临床工作中,外用中药生肌膏能治疗感染开放性骨折引起的骨缺损.其机制可能为生肌膏中作者前期实验从生肌膏的原料生药中提取了生肌液,并证实不同浓度的生肌液对骨髓间充质干细胞的增殖活性影响不同.有效成分促进骨髓间充质干细胞的增殖,并诱导其向成骨细胞转化.目的:观察生肌液对体外培养的兔骨髓间充质干细胞成骨活性的影响.设计:单一样本实验.单位:天津市天津医院骨科研究所.材料:实验于2004-10/2005-12在天津市天津医院骨科研究所细胞工程室完成.骨髓间充质干细胞取自5只3月龄的雄性健康日本大耳白兔.浓度为5×102 g/L生肌液从生肌象皮膏(由天津市中药饮片厂提供,原料生药当归、生地、龟板、象皮、血余)提取.方法:将25,8.3,5 g/L的生肌液作用于兔骨髓间充质干细胞,以不含生肌液的基础培养液为空白对照,以含地塞米松10-8 mol/L,维生素C0.05 g/L,β-甘油磷酸钠10 mmol/L的基础培养液为标准对照.将不同干预条件下传代后的骨髓间充质干细胞接种在培养板中培养二三周,采用荧光倒置显微镜下观察钙结节形成情况,采用四环素标记及胶原Ⅰ免疫组织化学染色观察细胞的表达情况,取细胞培养液测定胞外及胞内碱性磷酸酶、骨钙素、乳酸脱氢酶含量,将细胞内外碱性磷酸酶、骨钙素、乳酸脱氢酶数量各自加和,计算碱性磷酸酶/乳酸脱氢酶、骨钙素/乳酸脱氢酶值.主要观察指标:培养2,3周兔骨髓间充质干细胞钙结节形成、四环素标记及胶原Ⅰ免疫组织化学染色结果及碱性磷酸酶/乳酸脱氢酶、骨钙素/乳酸脱氢酶值.结果:①细胞钙结节观察结果:除了标准对照细胞外,不同浓度生肌液条件下细胞随培养时间延长,胞体先后出现拉长,聚集生长,随后中心细胞增殖、重叠,细胞之间界限模糊,逐渐形成多个散在的细胞结节,钙沉积逐渐出现,终形成钙化结节.②四环素标记及胶原Ⅰ免疫组织化学染色:除了基础培养液组外,各实验组四环素标记呈阳性的细胞及钙结节在荧光激发下呈黄绿色,空白对照细胞为阴性;除了标准对照细胞外,不同浓度生肌液条件下细胞胶原Ⅰ免疫组织化学染色呈阳性,棕黄色深染颗粒位于细胞胞浆中.③碱性磷酸酶/乳酸脱氢酶、骨钙素/乳酸脱氢酶检测结果:条件培养后2,3周,25 g/L生肌液作用下细胞碱性磷酸酶/乳酸脱氢酶、骨钙素/乳酸脱氢酶比值高于其他条件下两种含量比值,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:生肌液对体外培养的兔骨髓间充质干细胞的诱导成骨作用肯定,且高浓度时诱导成骨作用较强.
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胰岛素样生长因子1对不同生长时期鹿茸生长中心细胞体外增殖的影响
目的:在整个生长期中鹿茸生长速度的变化,究竟是由鹿茸生长中心细胞本身对生长因子刺激的敏感度引起,还是由激素等外部因素所导致目前尚不清楚.实验利用细胞培养技术观察胰岛素样生长因子1对不同生长期的鹿茸生长中心细胞体外增殖的影响.方法:实验于2005-03/2006-06在吉林大学畜牧兽医学院基础兽医研究室完成.①实验方法:3头4岁龄的健康梅花鹿,分别在鹿茸生长的早期(生长30 d)、中期(生长60 d)、晚期(生长90 d)三期各锯取1头鹿的鹿茸,在解剖显微镜下定位和切取间质层(突起部),即为鹿茸生长中心细胞所在的组织层.原代分离培养不同生长期的鹿茸生长中心细胞,锥虫蓝染色显示细胞活性达90%以上,活性确定后的细胞液氮冻存.取第2代细胞,经1,3,10 nmol/L胰岛素样生长因子1处理24 h.设立空白对照组,用不含犊牛血清的等量培养液来替换孔中正常培养液.②实验评估:3H-胸腺嘧啶核苷法检测蛋白合成放射性含量,单位为Bq.结果:①不同生长时期鹿茸生长中心细胞的分离与培养:贴壁的鹿茸生长中心细胞形态均匀,呈梭形,克隆样生长,增殖迅速.不同生长期的鹿茸生长中心细胞生长速度不同,60 d的鹿茸生长中心细胞生长快,90 d次之,30 d慢.②胰岛素样生长因子1对不同生长期鹿茸生长中心细胞蛋白合成放射性含量的影响:取材于生长30 d的鹿茸生长中心细胞,胰岛素样生长因子1各浓度组的蛋白合成放射性含量均值为49.8 Bq,是空白对照组(5.2±0.6)Bq的9.64倍,差异有显著性意义(P＜0.01).取材于生长60 d的鹿茸生长中心细胞,胰岛素样生长因子1各浓度组的蛋白合成放射性含量均值为532.0 Bq,是空白对照组(137±5.4)Bq的38.93倍,差异有显著性意义(P＜0.01).取材于生长90 d的鹿茸生长中心细胞,胰岛素样生长因子1各浓度组的蛋白合成放射性含量均值为535.8 Bq,是空白对照组(109.8±27.0)Bq的4.88倍,差异有显著性意义(P＜0.01).结论:①胰岛素样生长因子1有促进鹿茸生长中心细胞分裂增殖的作用.②不同生长期的鹿茸生长中心细胞对胰岛素样生长因子1刺激的敏感度不同,生长期为60 d时尤为显著,该敏感度与取材细胞时鹿茸的生长速度相关.
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静脉马利兰环磷酰胺联用预处理异基因造血干细胞移植19例
背景:由大剂量口服马利兰联合环磷酰胺组成的BuCy2是目前主要的移植前预处理方案之一,但存在较多口服马利兰相关副作用.目的:评价静脉马利兰预处理造血干细胞移植治疗恶性血液病的有效性及安全性.设计:病例观察.单位:华中科技大学同济医学院附属协和医院血液科.对象:选择2006-05/12在华中科技大学附属协和医院血液病研究所行改良静脉马利兰联用环磷酰胺为预处理方案的异基因的造血干细胞移植13例慢性粒细胞白血病患者及6例急性白血病患者,男12例,女7例,年龄14～50岁,平均33岁,其中亲缘性移植9例,非亲缘移植10例,造血干细胞来源:外周血18例,骨髓1例.所有患者及家属对治疗项目知情同意.方法:应用静脉注射马利兰组成的BuCy2预处理对患者进行异基因造血干细胞移植,即所有患者均采用目前国内外通用的改良马利兰联用环磷酰胺方案,即移植前10 d口服羟基脲40 mg/kg,移植前9 d静脉滴注阿糖胞苷2 g/m2,移植前8,7,6 d应用马利兰针剂0.8 mg/kg(该剂量根据既往研究与1 mg/kg口服制剂等效),通过中心静脉插管由输液泵控制滴速大于2 h输注完毕,1次/6 h,共12次,静脉注射马利兰输注前可应用生理盐水或5%葡萄糖稀释至约0.5 g/L(约稀释10倍).移植前5,4 d静脉注射环磷酰胺1.8 g/(m2·d),移植前3 d口服甲基环已亚硝脲250 mg/m2.观察患者肝静脉闭塞病以及其他副作用的发生情况,术后进行中位6.5个月的随访观察,主要观察患者疾病复发及存活情况.主要观察指标:①移植后100 d肝静脉闭塞病发生及副作用情况.②随访结果.结果:纳入患者19例均进入结果分析,术后13 d内均获造血功能重建,经血型转变、染色体核型及DNA多态性证实为供者植入.①肝静脉闭塞病发生及副作用:患者在移植后100 d内的肝静脉闭塞病发生率和100 d时的肝静脉闭塞病相关死亡率均为0,未观察到与静脉马利兰相关的严重毒副反应.②随访结果:术后6.5个月随访,1例患者因移植后肝炎死亡,2例患者复发,其中1例经氟达拉滨+阿糖胞苷+粒细胞集落刺激因子方案化疗及供者外周血造血干细胞支持后目前已经获得完全缓解,经DNA多态性证实重新获得供者植入,另1例患者目前化疗进行中.其余患者目前均无病存活.结论:静脉马利兰的应用,可能在一定程度上减少了移植后肝静脉闭塞病的发生及其他口服马利兰相关的毒副作用,从而提高了移植疗效.
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脑源性神经营养因子促进神经干细胞在体内外的定向分化
目的:观察脑源性神经营养因子促进神经干细胞在体内外条件下定向分化的作用,探索神经干细胞在体内外定向分化的规律.方法:实验于2006-09/2007-04在南京医科大学分子生物学实验室和动物实验中心完成.①体外研究:取孕14～16 d的胚胎大鼠脑组织,以无血清培养基培养获得神经干细胞,随即分成两组进行体外研究.实验组(n=10),加入5%胎牛血清和20 μg/L脑源性神经营养因子诱导其体外条件下定向分化,对照组(n=10),仅加入5%胎牛血清,用免疫荧光及流式细胞仪的方法来检测定向分化得到的神经元及其比例.②体内研究:参照Bavetta等的方法制作大鼠脊髓(T10)右半切4 mm长块状缺损模型.实验组(n=10):注射移植溴脱氧尿苷标记的细胞密度为1×109 L-1的神经干细胞悬液20μL.对照组(n=10):注射移植20 μL PBS于模型动物中.12周后,行辣根过氧化物酶神经逆行示踪评价脊髓感觉和传导功能的恢复程度,并取损伤处脊髓组织行免疫组织化学染色,观察缺损处打入的神经干细胞的存活,分化和迁移情况.结果:参加体内实验的20只大鼠均进入结果分析.①体外条件下,两组神经干细胞定向分化后均得到微管相关蛋白2阳性神经元,并且实验组微管相关蛋白2阳性神经元的比例在分化后第3天达高峰,约为60%,而同期对照组仅约为30%,差异有统计学意义(P＜0.05).②体内条件下,移植12周后,免疫组织化学染色显示:体内实验组损伤脊髓处可见溴脱氧尿苷标记的阳性细胞,且缺损处可见大量神经微丝相关蛋白和神经生长相关蛋白染色阳性的神经元,体内对照组则未见以上两种蛋白染色阳性的神经元.辣根过氧化物酶神经逆行示踪显示:体内实验组脑组织可见到部分辣根过氧化物酶标记阳性神经元,而体内对照组未见辣根过氧化物酶阳性神经元.结论:脑源性神经营养因子促进神经干细胞体内外条件下定向分化为神经元,3 d达分化高峰.在体内条件下,外源的神经干细胞能存活、分化、迁移并替代修复脊髓神经传导束,有利于受损的脊髓功能恢复.
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Transwell培养体系中受损PC12细胞促进骨髓间质干细胞向神经元样细胞的转分化
背景:药物治疗阿尔茨海默病难以达到满意效果,而多项研究表明,骨髓间质干细胞移植治疗帕金森病、脑缺血等有效,但其治疗机制尚不十分清楚.目的:采用淀粉样β1-40蛋白损伤的PC12细胞与骨髓间质干细胞共育,模拟移植环境,观察共育微环境中细胞间双向信息反馈对骨髓间质于细胞向神经细胞转分化的作用及对抗损伤的PC12凋亡的保护作用.设计:对比观察实验.单位:中国医科大学神经内科.材料:选用出生两三周的SD大鼠,雌雄不拘.PC12细胞株购自中国科学院细胞生物研究所.神经元特异性烯醇化酶(1:50,博士德,武汉);MTT 15μL(终浓度0.5 g/L).方法:实验于2004-06/07在中国医科大学实验中心完成.取1只SD大鼠双侧股骨骨髓,并培养骨髓间质干细胞,以CD44抗体用免疫荧光鉴定骨髓间质干细胞.PC12在实验中作为神经细胞的替代细胞.淀粉样β1-40蛋白刺激PC12后,用转移筛网转移PC12.实验分5组,A组:正常培养的PC12+骨髓间质干细胞共育;B组:淀粉样β1-40蛋白刺激的PC12+MSC s共育;C组:正常PC12的培养上清+骨髓间质干细胞;D组:受损PC12上清+骨髓间质干细胞;E组:普通1640培养的骨髓间质干细胞.主要观察指标:按常规进行细胞的免疫化学染色,采用荧光倒置显微镜观察神经元特异性烯醇化酶阳性细胞,随机选取10个200倍的视野,计数阳性细胞数.用四甲基偶氮唑盐代谢率(四唑盐比色试验)检测各组骨髓间质干细胞增殖情况.结果:①骨髓间质干细胞的生长:以荧光和明视野在同一视野下观察,骨髓间质干细胞生长良好,CD44免疫荧光鉴定,见95%以上细胞呈阳性表达.②神经元特异性烯醇化酶阳性细胞:以荧光和明视野在同一视野下观察,神经元特异性烯醇化酶阳性的骨髓间质干细胞呈现红色荧光,骨髓间质干细胞形态为双极形、多极形和锥形,出现类似神经元样细胞的形态,似树突样突起结构,个别神经元样细胞之间有广泛的联系.B组神经元特异性烯醇化酶细胞阳性率明显高于其他组(F=34.82,P＜0.01).③骨髓间质干细胞增殖情况:四甲基偶氮唑盐代谢率以B组低,与其他比较,差异有显著性意义(F=9713,P＜0.01).结论:淀粉样β1-40蛋白损伤PC12与骨髓间质干细胞非接触共培养的微环境细胞有利于骨髓间质干细胞向神经元样分化,而非增殖方向发展.
