中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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非病毒载体介导脑源性神经营养因子基因转染骨髓间充质干细胞:脂质体及电穿孔转染法的比较
背景:基因转染细胞有病毒及非病毒载体法,因病毒载体面临安全性、免疫排斥等问题,实验探讨脂质体及电穿孔转染法.目的:比较脂质体及电穿孔法介导人脑源性神经营养因子基因转染骨髓间允质干细胞的细胞转染特性和体外表达情况,建立基因工程细胞.方法:①脂质体法:取体外分离、培养的第3代豚鼠骨髓间充质干细胞,将质粒-脂质体混合物加入含细胞的培养基中培养6 h,再加入胎牛血清的培养基,孵育48 h后行免疫组织化学检测,即为瞬时表达.48 h后加入含G418培养基筛选.②电穿孔法:取骨髓间充质干细胞,胰酶消化,用无血清培养基重悬细胞,将细胞悬液加入电转化池中,加入质粒,将电转化池移至电极间放电转导.转染48 h后,检测目的基因瞬时表达.48 h后加入含G418培养基筛选.用免疫组织化学及RT-PCR检测两种方法脑源性神经营养因子基因表达情况.结果与结论:免疫组织化学显示脂质体介导转染的脑源性神经营养因了瞬时表达率约为5.80%,电穿孔法约为24.29%.脂质体法转染筛选14 d后细胞几乎全部死亡;电穿孔法转染后筛选并扩大培养建立工程细胞,免疫组织化学显示工程细胞脑源性神经营养因子阳性表达率达90%以上,RT-PCR扩增产物电泳证实目的基因阳性条带.结果表明,用电穿孔法可成功建立脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间充质干细胞的工程细胞,并用免疫组织化学和RT-PCR办法证实细胞体外表达目的基因.
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人正常神经组织许旺细胞的体外培养
背景:周围神经组织工程所需要的许旺细胞数量巨大.在以往的研究中,由于正常入神经组织的缺乏,常选用大鼠、兔等动物神经组织分离许旺细胞进行培养,而作为异种细胞在临床的应用相对受限.目的:体外培养人正常周围神经的许旺细胞,寻找一种佳的获取、培养、纯化的方法.方法:切取脑瘫患者周围神经缩窄术中的正常周围神经,以消化培养法为主,结合差速贴壁法纯化培养许旺细胞.将神经组织剪成碎块,接种于含胎牛血清、胶原酶、Dispase酶的培养液中消化培养,离心,将组织块加入培养基中,吹打成单细胞悬液,再移入有多聚赖氨酸的DMEM培养皿中,加入碱性成纤维细胞生长因子培养,当贴壁细胞覆盖培养皿达B5%～90%即可开始传代培养.锥虫蓝染色对培养后的第2,3,4,5,6,7,8,9,10天不同时间许旺细胞进行计数,并经S-100蛋白免疫组织化学染色鉴定计算细胞纯度.结果与结论:4 d后镜下可见基本为纯净的许旺细胞,密度在0.5×10~8 L~(-1)以上.传3代后,许旺细胞计数可达到9×10~8 L~(-1)以上;许旺细胞纯度达85%以上.结果表明,以消化培养法结合差速贴壁方法培养许旺细胞所需时间短,可获得较高纯度的人许旺细胞,能够为进一步的神经组织工程提供细胞来源.
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体外纯化乳鼠许旺细胞的4种方法比较
背景:许旺细胞是外周神经系统中修复神经损伤及神经疾病的主要种子细胞之一.但是,许旺细胞的来源有限,且由于成纤维细胞的污染,使许旺细胞的纯度受到影响.有学者提出了其他的纯化方法,但每种方法都存在其不足之处而不能很好的满足临床应用的需要.目的:比较差速贴壁消化法、冷喷注法、磁珠分选法和G418筛选法4种体外纯化乳鼠许旺细胞方法的差异.方法:取SD大鼠坐骨神经得到所需神经组织.分别用差速贴壁消化法、冷喷注法、磁珠分选法和G418筛选法纯化许旺细胞.比较4种方法获得细胞的活力,免疫组织化学法鉴定许旺细胞并计算纯度.结果与结论:差速贴壁消化法所得到的细胞纯度稍低,活力尚可;冷喷注法获得的细胞纯度和活力均较高;磁珠分选法获得的细胞纯度和冷喷注法相当,但是活力稍差:G418筛选法活力差,纯度高.
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神经干细胞移植对阿尔茨海默病大鼠海马突触素表达和学习记忆能力的影响
背景:前期实验已证实,移植入阿尔茨海默病大鼠脑内的神经干细胞能够存活、增殖,但其是否可替代损伤或坏死的神经细胞而重建神经通路,改善学习记忆能力尚不清楚.突触素是突触重建的重要标记之一.目的:观察神经干细胞移植对阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力及突触表达的影响.方法:SD大鼠随机数字表法分为正常对照组、阿尔茨海默病模型组、2周移植组和4周移植组,除正常对照组外制各阿尔茨海默病模型.另取新生24 h SD大鼠海马齿状回分离、培养神经干细胞,经Hoechst33258标记后植入2周和4周移植组海马CA1区,行Y迷宫实验检测大鼠的学习记忆能力,然后取脑进行尼氏染色和突触寨免疫组织化学染色.阿尔茨海默病模犁组则以同样的方法、同样的位点注入等量无菌生理盐水.正常对照组不施以任何处理.结果与结论:①2周和4周移植组海马CA1区细胞比阿尔茨海默病模型组增多,但仍少于正常对照组(P＜0.05),平均吸光度与正常对照组相比差异无显著性意义(P＞0.05).②2周移植组和4周移植组大鼠海马结构内突触奈吸光度值明显高于正常对照组和阿尔茨海默病模型组(P＜0.05).③与阿尔茨海默病模型组相比,2周和4周移植组大鼠学习能力和记忆能力均显著增强,正确反应率明显提高(P＜0.05),而与正常对照组相比,差异无显著性意义(P＞0.05).提示移植入脑内的神经干细胞可促进突触形成,改善学习记忆能力.
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碱性成纤维细胞生长因子与猴骨髓间充质干细胞增殖及向神经元前体细胞分化:不同质量浓度对诱导剂隐丹参酮作用有差异吗?
背景:碱性成纤维细胞生长因子属于活性单腱多肽,是一种有效的促有丝分裂因子.目的:探讨不同质量浓度碱性成纤维细胞生长因子对猴骨髓间充质干细胞增殖及成神经分化的影响.方法:密度梯度离心法体外分离培养猴骨髓间充质干细胞,传代后设立4组,对照组及低、中、高质量浓度组分别加入0,3,6,10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子,观察不同条件下猴骨髓间充质干细胞的增殖情况.取传至第5代骨髓间充质干细胞,用含20 mg/L隐丹参酮的无血清L-DMEM培养蕈向神经方向诱导分化,免疫组化染色检测诱导后巢蛋白阳性的表达.结果与结论:与对照组比较,低、中、高质量浓度组骨髓间充质干细胞增殖速度明显加快(P＜0.05),并且与培养液中碱性成纤维细胞生长因子的质浓度呈正相关.隐丹参酮诱导0.5 h后,低、中质晕浓度组猴骨髓间充质干细胞均有一定程度的巢蛋白阳性表达;诱导1.5 h后,巢蛋白阳性表达细胞数达峰值,低质量浓度组巢蛋白表达效果明显好于高质量浓度组(P＜0.05).提示碱性成纤维细胞生长因子可以促进猴骨髓间充质干细胞的体外增殖,并且在低质量浓度时能够增加隐丹参酮对骨髓间充质干细胞向神经元前体细胞分化的诱导率,在高质量浓度时则产生相反的抑制作用.
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嗅鞘细胞移植治疗大鼠脑损伤:可行性分析及效果验证
背景:脑损伤是中枢神经系统的一种严重刨伤,如何促进脑损伤后的神经再生和功能恢复尤为棘手.嗅鞘细胞有利于神经元存活,并促进轴突再生.目的:进一步探讨嗅鞘细胞移植治疗大鼠脑损伤的可行性及效果.方法:健康成年SD雄性大鼠90只,取10只用于制备嗅鞘细胞,剩余80只随机均分为2组,采用线栓法建立大脑中动脉闭塞模型,1周后细胞移植组经颈动脉将2×10~6个嗅鞘细胞注入脑缺血大鼠体内,模型对照组同法注入等体积无菌生理盐水.采用爬行记分法检测神经功能缺损情况,苏木精-伊红染色检测损伤脑组织病理变化,免疫组化染色法测定损伤脑组织中胶质原纤维酸性蛋白和神经营养因子受体p75的表达.结果与结论:与模型对照组比较,脑缺血再灌注后1,2,3,4周细胞移植组神经功能缺损评分均明显降低(P＜0.05);损伤脑组织病理变化减轻,神经细胞变性及坏死数量明显变少,间质水肿较轻.细胞移植组在梗死半球可见大量胶质原纤维酸性蛋白和神经营养因子受体p75阳性细胞,对侧半球及血管内皮细胞处也可见少量分布;模型对照组呈阴性表达.结果进一步验证了嗅鞘细胞移植治疗大鼠缺血性脑损伤是可行有效的.
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黄芪甲甙对大鼠骨髓间充质干细胞多种造血相关因子表达的影响
背景:黄芪甲甙是中药黄芪的主要有效成分,能促进骨髓间充质干细胞的增殖及诱导分化,但涉及具体作用机制的报道较少.目的:探讨中药黄芪甲甙对大鼠骨髓间充质干细胞造血相关因子表达的影响.方法:全骨髓贴壁法和单克隆培养法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,接种于96孔板中,加药组分别用25,50,100,200 g/L黄芪甲甙100 μL孵育72 h,对照组仅加等量DMEM-LG培养液.间接免疫荧光法鉴定其生物学特性,MTT法检测黄芪甲甙对骨髓间充质干细胞增殖的影响,RT-PCR法检测黄芪甲甙干预后骨髓间充质干细胞造血相关因子的表达.结果与结论:第3代骨髓间充质于细胞高表达CD44,低表达造血细胞表面标志CD45.与对照组比较,黄芪甲甙呈时间及剂量依赖性促进骨髓间充质干细胞的增殖,以200g/L黄芪甲甙干预72 h促增殖作用强(P＜0.05).与对照组比较,加药组骨髓间充质干细胞SCF的表达显著增加(P＜0.01),TPO,GM-CSF,TGF-β1等细胞因子的表达无明显变化(P＞0.05),不表达自细胞介索3.黄芪甲甙可促进骨髓间充质干细胞的体外增殖,可能与其诱导骨髓间充质干细胞分泌SCF有关.
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犬骨髓间充质干细胞片层的体外培养与制备
背景:传统的组织工程方法在收获和转移细胞方面存在诸多不足,且难以形成致密的组织,明显限制了组织工程学的发展.目的:探讨犬骨髓间充质干细胞片层的体外培养与制备方法.方法:实验犬麻醉后抽取骨髓,采用密度梯度离心法体外分离骨髓间充质干细胞.取传至第4代细胞,按1×10~9 L-1密度接种于商径3.5 cm的温度反应性培养皿中,置于37℃、体积分数为5%的CO_2饱和湿度培养箱内培养,待细胞增殖融合时再将培养皿的温度降至20℃培养20 min,倒置显微镜下观察细胞形态学变化及细胞片层形成情况.结果与结论:犬骨髓间充质干细胞原代培养24 h呈椭圆形或多角形,72 h多数细胞伸展贴壁,7 d时形成细胞集落,12 d时细胞呈长梭形,完全融合,细胞界限不清.温度反应性培养皿中的骨髓间充质干细胞在降温至20℃时,细胞形态发生变化,呈短梭形,且逐步从培养皿底分离,形成含细胞外基质的完整的细胞片层.证实密度梯度离心法可成功分离培养犬骨髓间充质干细胞,通过改变应用温度反应性培养皿的温度,能获取完整的细胞片层.
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人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化
背景:胎盘的细胞成分较复杂,其中所包含的滋养细胞在母胎免疫耐受过程中起重要作用,胎盘间充质干细胞具有多向分化潜能以及抑制淋巴细胞增殖的特性,常规分离方法通常难以获得大量且纯度较高的上述两种细胞.目的:拟建立一次操作即可同时获得大量、较高纯度的滋养细胞和胎盘间充质于细胞的操作方案.方法:人胎盘组织洗净剪碎,采用胰蛋白酶和DNAse I共同消化,分3个阶段,每个阶段在恒温37℃下180 r/min消化2 min.重悬消化产物,200目筛网过滤后采用Percoll密度梯度分离液分离,分别收集滋养细胞层和胎盘间充质干细胞层.滋养细胞层以差速贴壁法去除成纤维细胞,胎盘间充质干细胞直接接种于75 cm2培养瓶中培养.观察胎盘组织消化情况,计数滋养细胞数量及其细胞角蛋白7的表达,观察胎盘间充质干细胞生长增殖、表型及成骨分化潜能.结果与结论:经胰蛋白酶和DNAse I消化后,胎盘组织仅剩少许残渣.差速贴壁后,滋养细胞数达(5.48±1.98)×10~8个,细胞角蛋白7阳性率为(90+4.36)%.胎盘间充质干细胞接种19～21 d达90%融合,细胞数为(1.96±0.24)×10~6个,强表达CD29,CD44和HLA-ABC,不表达CD34,CD45,CD14和HLA-DR,诱导后茜素红染色呈鲜艳橙红色,可向成骨细胞方向分化.提示采用胰蛋白酶和DNAse I共同消化胎盘组织,并结合Percoll不连续密度梯度分离液分离细胞,可同时一次性获得大量的滋养细胞和较多的胎盘间充质干细胞,细胞纯度和活性均较好.
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Ca~(2+)信号介导红景天苷促进小鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞的定向分化
背景:大量文献报道具有抗氧化作用的传统中药单体能促进骨髓间充质干细胞向神经细胞定向分化,红景天苷作为红景天的有效成分,具有较强的抗氧化功效.目的:探讨红景天苷影响小鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞定向分化的分子机制.方法:体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞达80%融合后,设立3组,空白对照组加入细胞完全培养液,诱导组、阳性对照组分别在其基础上加入20 mg/L红景天苷、0.1 mg/L神经生长因子,培养12 h,采用RT-PCR和Western blot法检测诱导后神经细胞相关基因和蛋白的表达.取诱导组细胞,分别加入含EGTA(细胞外Ca~(2+) 螯合剂)、Nifedipine(L型Ca~(2+)通道阻断剂)、LY294002(IP_3受体阻断剂)作用12 h,进行生物学信号传导通路检测.结果与结论:①诱导组可见神经元特异性烯醇化酶、β-Tubulin Ⅲ和Nurr1 mRNA的表达,阳性对照组上述基因的表达丰度均低于诱导组,空白对照组未见上述基因的表达;各组GFAP mRNA表达丰度均极低,诱导组c-fos mRNA呈高丰度表达.②与阳性对照组比较,诱导组能明显促进骨髓间充质干细胞神经元特异性烯醇化酶蛋白的表达:空白对照组无神经元特异性烯醇化酶蛋白的表达.③EGTA,Nifedipine,LY294002分别阻断细胞外Ca~(2+)、L型Ca~(2+)通道、IP_3受体后,神经元特异性烯醇化酶和Nurr1基因、蛋白的表达均显著下调.结果证实红景天苷能使骨髓间充质干细胞定向分化为神经细胞,其生物学信号的传导与Ca~(2+)信号有密切关系,IP_3依赖的Ca~(2+)信号途径是实现信号传导的重要方式之一.
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单核细胞向淋巴管内皮细胞诱导分化的潜能
背景:有研究报道,在包括血管内皮生长因子在内的多种因子诱导下,单核细胞能够转化成血管内皮细胞;而在体外条件下,单核细胞能否转化成淋巴管内皮细胞,至今未见报道.目的:观察单核细胞存炎症环境中转分化成淋巴管内皮细胞的可能性.方法:采用Ficoll密度梯度离心法分离成人新鲜外周血单核细胞,用细胞培养基培养,然后分别用纤维连接蛋白、肿瘤坏死因子α诱导24 h.用RT-PCR和免疫细胞化学方法检测单核细胞对淋巴管内皮特异性标志物LYVE-1、Podoplanin、Prox1、血管内皮生长因子受体3以及内皮细胞抗原vWF、内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子受体2的摹因和蛋白表达.结果与结论:单核细胞在诱导之前,对LYVE-1表达阳性,对Podoplanin、Prox1、血管内皮生长因子受体3、vWF、内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子受体2表达均为阴性;经上述因子刺激后,单核细胞对Podoplanin、Prox-1、血管内皮生长因子受体3表达阳性,vWF、内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子受体2表达仍呈阴性.提示纤维连接蛋白、肿瘤坏死因子α均能有效刺激单核细胞表达淋巴管内皮标志物.
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体外共培养大鼠骨髓间充质干细胞对肝星状细胞增殖的影响:Cyclin D1与P27表达调控
背景:在肝纤维化发生发展过程中,肝星状细胞起着关键作用.研究证实骨髓间充质干细胞移植可作为治疗肝纤维化的方法,但其逆转肝纤维化的机制不明.目的:探讨体外共培养条件下,大鼠骨髓间充质干细胞对肝星状细胞增殖的调控机制.方法:实验组在半透膜上接种大鼠骨髓间充质干细胞,在6孔塑料培养板上接种肝星状细胞,建立上下双层细胞共培养体系;对照组将大鼠骨髓间充质干细胞更换为成纤维细胞;空白组仅行肝星状细胞单独培养.WST-8法检测肝星状细胞生长抑制率,流式细胞仪分析细胞周期,RT-PCR检测肝星状细胞CyclinD1和P27 mRNA的表达,Western blot检测肝星状细胞CyclinD1和P27蛋白的表达.结果与结论:与空白组、对照组比较,实验组共培养24,48,72 h肝星状细胞牛长抑制率均显著升高(P＜0.01):共培养72 h G_0/G_1期细胞显著增加(P＜0.01),S期细胞显著减少(P＜0.01),可阻滞肝星状细胞由G_0/G_1期向S期转换.共培养24 h,实验组CyclinD1 mRNA及蛋白表达开始下调,至72 h时表达量显著低于对照组、空白组(P＜0.01);共培养全过程中各组p27mRNA的表达无明显差异(P＞0.05),共培养24 h时实验组p27蛋白表达较对照组、空白组均显著上调(P＜0.01).结果证实大鼠骨髓间充质干细胞能够抑制肝星状细胞的增殖,其机制可能是通过下调CyclinD1表达,上调P27蛋白表达,使细胞周期停滞于G_0/G_1期实现的.
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体外培养羊骨髓来源间充质干细胞的生物学特性观察
背景:目前关于鼠、兔等小动物骨髓来源间充质干细胞的研究较多,但涉及大动物骨髓来源间充质干细胞的报道甚少.目的:体外培养羊骨髓来源间充质干细胞,并了解其生物学特性.方法:取健康10月龄中国山羊1只,麻醉后于髂后上棘穿刺抽取骨髓5mL,采用全骨髓培养法接种于无菌塑料培养瓶中,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基.待细胞达80%-90%融合后,胰蛋白酶消化传代.取P3代处于对数生长期的细胞予以冻存,然后进行复苏.倒置显微镜下观察细胞形态变化,MTT法测定细胞生长曲线,Yon Kossa's染色检测成骨诱导分化潜能.结果与结论:原代培养羊骨髓来源间充质干细胞贴壁生长,呈梭形;P3代后细胞形态基本一致,均为长梭状;冻存复苏后细胞贴壁较传代细胞稍慢,细胞形念和活性与传代细胞没有明显差别.P3-P5代细胞生长周期基本一致,接种后两三天为生长迟滞期,3 d后进入对数生长期,六七天为生长平台期,其后牛长速度减缓.羊骨髓来源间充质干细胞成骨诱导3周后,Von Kossa's矿化结节染色呈阳性.证实所培养的羊骨髓来源间充质干细胞具有较强的遗传稳定性和增殖能力,可向成骨细胞定向分化.
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大鼠骨髓间质干细胞体内诱导肝星状细胞的凋亡
背景:骨髓间质干细胞治疗肝纤维化的疗效己得到很多实验的证实,但其机制仍不明确.目的:实验观察骨髓间质干细胞移植后肝星状细胞的凋亡情况,初步探讨骨髓间质干细胞治疗肝纤维化的机制.方法:连续8周皮下注射CCl_4诱导大鼠肝纤维化.造模成功后,20只大鼠随机分为实验组及对照组,每组10只.实验组经尾静脉注射骨髓间充质干细胞,对照组经尾静脉注射DMEM培养液.于移植前,移植后第3,7天分别处死大鼠,取其肝脏行羟脯氨酸的检测,苏木精-伊红染色及masson染色,免疫组织化学检测α-SMA及α-SMA+TUNEL双染反映肝星状细胞活化及其凋亡情况.结果与结论:造模8周后,大鼠肝脏羟脯氨酸含明显升高,病理呈进展性肝纤维化表现.移植7 d后,实验组大鼠肝脏羟脯氨酸含量明显降低,肝纤维化有所缓解,而对照组的肝纤维化程度继续加重.免疫组织化学显示,CCl_4注射8周后,α-SMA阳性细胞大量增生,移植后第7天,实验组α-SMA阳件细胞明显少于对照组(P＜0.05).移植后第3天,实验组肝星状细胞凋亡明显较对照组增加(P＜0.05).结果提示,骨髓间质干细胞移植有治疗肝纤维化的作用.骨髓间质干细胞诱导肝星状细胞凋亡可能是其治疗肝纤维化的主要机制之一.
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microRNA-125b在Flk1~+脂肪源间充质干细胞向神经分化过程中的表达变化
背景:间充质干细胞的分化受遗传和表观遗传因素的严格调控,越来越多的研究表明microRNA也在这一过程中发挥重要的调控作用.目的:观察microRNA-125b在Flk1~+ 1间充质干细胞向神经细胞分化过程中的表达变化.方法:成人脂肪样品取自15～35岁健康志愿者,贴壁培养法获得间充质干细胞,采用神经诱导培养基对第3代间充质干细胞进行诱导培养.在诱导第0,4,8,12天检测microRNA-125b的表达情况.应用microRNA芯片技术检测间充质干细胞在神经诱导前后microRNA-125b的表达差异并采用反转录-聚合酶链反应和Taqman real-time PCR的方法进行验证.检测inhibitor抑制microRNA-125b表达的有效性.结果与结论:①实验成功诱导间充质干细胞向神经分化,诱导培养后12 d观察到细胞形态发生变化;大部分细胞胞体回缩,呈球形,并有轴突形成,免疫荧光检测结果显示,分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞特征性表面标志.②RT-PCR和Taqman real-time PCR显示神经诱导后microRNA-125b表达明显升高,与microRNA芯片结果一致.③inhibitor可以有效抑制microRNA-125b的表达.提示microRNA-125b可能在间充质干细胞成神经分化过程中起调控作用.
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碘对骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞存活时间的影响
背景:体外实验中人们发现,常规化学诱导剂诱导骨髓间充质干细胞分化的神经元样细胞存活时间较短,这就限制了其进一步的应用.关于碘是否可以延长诱导的神经元样细胞的存活时间尚未见系统报道.目的:观察微量兀索碘对由骨髓间充质干细胞分化成的神经元样细胞存活时间的影响.方法:无菌条件下取大鼠第3代间充质干细胞,分为A～F组:A组不加碘离子,B～F组中分别加入质量浓度为2,55,90,125和2 500 mg/L的碘离子,另设空白对照组,同时加化学诱导剂二甲基亚砜向神经元方向诱导分化.对诱导后的细胞进行免疫组织化学检测,观察诱导的神经元样细胞在不同质量浓度碘离子下的存活时间.结果与结论:加入的碘离子质量浓度在55～125 mg/L时,细胞存活时间可达到5 d,镜下细胞结构完整,5 d后随培养时间的延长,死亡细胞逐渐增多,至1周左右,神经元样细胞几乎全部死亡.碘离子质量浓度为2 mg/L和2 500 mg/L时,细胞存活时间为12～36 h,和未加碘离子组差异无显著性意义,至两三天,神经元样细胞几乎全部死亡.提示适当浓度的碘离子加入到常规化学诱导剂中,可延长骨髓间充质干细胞分化的神经元样细胞的存活时间;加入到化学诱导剂中的碘离子质量浓度过低或过高时,不改变骨髓间充质干细胞分化的神经元样细胞的存活时间.
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骨髓间充质干细胞成脂和成骨分化过程中Wnt信号通路的调控效应
背景:骨髓间充质干细胞的成脂肪分化与成骨分化比例的失衡与许多骨疾病密切相关,而近些年发现Wnt信号通路在调控骨髓间充质干细胞的分化方向中起重要作用.目的:通过Wnt信号通路PCR基因芯片观察大鼠骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞和成骨细胞后相关基因表达的变化,寻找Wnt信号通路中调控骨髓间充质干细胞分化的靶基因.方法:采用大鼠第3代骨髓间充质干细胞分别进行成骨诱导和成脂诱导,7 d后用Trizol萃取培养瓶中的细胞总RNA,倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态特征及成骨诱导后和成脂诱导后细胞形态特征.采用Wnt信号通路PCR芯片(大鼠)进行摹因芯片检测,以未诱导组为对照,计算成脂肪诱导,成骨诱导后相关基因上调/下调的比值.结果与结论:①倒置显微镜下观察,传3代后可获得均一性较高的骨髓间充质干细胞,骨髓间充质干细胞经成骨诱导后向成骨细胞方向分化,经成脂诱导后向脂肪细胞方向分化.②与未诱导组相比,骨髓间充质干细胞成脂诱导后Wnt信号通路表达上调的基因(Dkk-1,kremen,FZD1,FZD7)等15个(ratio＞2),下调的基因(sFrp 5,β-catenin,Dvl3,Tcf7)等16个(ratio＜0.5).成骨诱导后,Wnt信号通路表达上调的基因(Dkk1,kmmen,β-catenin,Wnt11)6个,表达下调的基因(sFrp5,sFRP4,Fzd1)等15个.提示WnI信号通路在骨髓间克质干细胞成脂细胞分化和成骨细胞分化中发挥重要作用.
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筛选鉴定Thy-1标记阳性肝癌细胞系中的卵圆细胞样干细胞:可能是肝肿瘤干细胞吗?
背景:肝癌的转移复发被认为可能存在有肿瘤干细胞,后者在肿瘤细胞中数目极少,使得临床鉴别存在一定困难.Thy-1是卵圆细胞的表面标记蛋白,通过特异性标记物间接证明肿瘤中存在肿瘤干细胞是目前研究的重点.目的:探讨肝癌细胞中是否存在Thy-1标记阳性的卵圆细胞,并进行筛选鉴定.方法:流式细胞仪检测卵圆细胞标记蛋白Thy-1在肝癌细胞HepG2,BEL7402及正常肝细胞QSG7701的阳性表达情况,免疫磁珠分选Thy-1标记阳性的肝癌细胞,免疫荧光鉴定分选效率.裸鼠皮下接种实验设立3组,Thy-1~+细胞组裸鼠于背部皮下接种分选的Thy-1~+细胞5×10~5/只,HepG2细胞阳性对照组同法接种HepG2细胞0.5×10~7/只,Thy-1细胞阴性对照组同法接种分选的Thy-1-细胞0.5×10~7/只,1个月后观察各组成瘤性.结果与结论:卵圆细胞表面标记蛋白Thy-1在肝癌细胞HepG2,BEL7402中的表达明显高于正常肝细胞QSG7701(P＜0.05).Thy-1~+细胞组免疫荧光染色阳性率为85%,HepG2细胞阳性对照组为1%,Thy-1~-细胞阴性对照组几乎无免疫荧光表达.HepG2细胞阳性对照组、Thy-1~+细胞组5只裸鼠全部成瘤,且瘤体体积相对较大;而Thy-1~-细胞阴性对照组仅有1只裸鼠成瘤,瘤体体积明显小于前2组(F=144.568,P＜0.05),提示肝癌细胞中存在Thy-1标记阳性的卵圆细胞样干细胞,其可能是肝癌细胞中的肿瘤干细胞.
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人脐带血间充质干细胞的分离培养及增殖及增殖能力
背景:随年龄的增加,骨髓来源的间充质干细胞在数量和质量上均受到影响,并对供体损伤较大,寻找替代的间充质干细胞来源成为研究热点,而脐带血中是否含有间充质干细胞仍存在争议.目的:拟从人脐带血中分离培养间充质干细胞,并对其生物学特性进行检测.方法:无菌条件下,应用Percoll密度梯度离心法分离脐血标本,收获中间层细胞,加入含胎牛血清、青霉素和链霉索、L-谷氨酰胺的DMEM基础培养液,再经反复贴壁纯化,除去悬浮生长细胞,得到较多呈融合状态的贴擘细胞,待细胞达60%～80%融合时胰酶消化传代.分别取第1,5,9代细胞,观察细胞形态变化,流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达,绘制细胞生长曲线,MTT法检测细胞活性.结果与结论:分离的脐血间充质干细胞大小均匀,呈梭形或星形的成纤维细胞样细胞.第1,5,9代脐带血间充质干细胞高表达CD29,CD105和CD166,低表达CD34和CD45:接种后5 d细胞进入指数增生期,9 d后数量减少,群体倍增时间为(53.5±8.32)h;细胞生长状态良好,在细胞活力方面1～7代摹本相似(P＞0.05),至第9代细胞增殖活力稍下降,但仍无明显差异(P＞0.05).结果证实可在体外成功从脐血中分离培养出间充质干细胞,第1～9代细胞均具有良好的增殖能力.
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胰岛素样生长因子1对人脂肪来源的间充质干细胞向软骨细胞定向诱导分化的作用
背景:近年研究者发现胰岛素样生长因子1还可以诱导骨髓来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化,但目前尚未见胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化及在此过程中与转化生长因子β1相瓦作用的报道.目的:观察胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞定向分化的可能性及在诱导分化中和转化生长因子β1的相互作用.方法:获取脂肪来源间充质干细胞,以2×10~5 cells/cm~2的密度接种于培养瓶,使用含胰岛素样生长因子1或(和)转化生长因子β1的无胰岛素软骨诱导剂诱导脂肪来源间充质干细胞.2周后获取细胞,制备细胞爬片,进行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,观察细胞内高硫酸化的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原着色情况.RT-PCR检测Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan及Sox9mRNA的表达.结果与结论:加入诱导剂后,甲苯胺蓝染色显示3个诱导组细胞呈多角形,胞浆及胞膜呈蓝色异染.Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示3个诱导组细胞胞浆及胞膜呈棕黄色着色.RT-PCR检测显示胰岛索样生长因子+转化生长因子组Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan、Sox9 mRNA的表达均显著强于胰岛素样生长因子组和转化生长因子组,胰岛素样生长因子组和转化生长因子组显著强于对照组,而胰岛素样生长因子组与转化生长因子组差异无显著性意义.提示胰岛素样生长因子1可以单独诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化,表达软骨细胞特异性细胞表型,胰岛素样生长因子1与转化生长因子β1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化有协同作用.
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不同分离方法及培养条件对兔骨髓间充质干细胞生物活性的影响
背景:骨髓间充质干细胞常被用作骨组织工程的种子细胞和基因治疗的载体细胞,如何获得纯度较高活性较好的骨髓间充质干细胞是很多研究者关心的问题.目的:观察不同分离方法及培养条件对兔骨髓间充质干细胞生物活性的影响.方法:分别用密度梯度离心法、全骨髓培养法和红细胞裂解液法提取兔骨髓间充质干细胞,48 h后观察各组获得的细胞量,记录各组首次传代时间,相差显微镜观察细胞的形态,流式细胞仪鉴定其CD44抗原表达.分别用DMEM-LG、MEM-HG和DMEM/F12 3种培养基培养第3代细胞和第7代老化细胞,MTT法和计数板计数法比较不同时间点3种培养基培养细胞的生长情况,相差显微镜观察老化细胞的形态变化.结果与结论:3种分离方法均能得到较均一的梭形或者多角形贴壁细胞,胞核大胞浆丰富,CD44抗原表达阳性.其中红细胞裂解液法获得的贴壁细胞的量较其他方法多,首次传代时间短(P＜0.05).用DMEM/F12培养的细胞活力更好,细胞生长更迅速,并且经过DMEM/F12培养一段时间后,部分静止期细胞开始分裂增殖.提示红细胞裂解液法能够提高骨髓间充质干细胞的贴壁效率,是一种方便、有效的提取方法;DMEM/F12更能够促进细胞的增殖,较适合于培养骨髓间充质干细胞.
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维生素A对体外培养小鼠精原干细胞生长增殖的影响
背景:维生紊A在体内对精原干细胞生长具有重要作用,目前还没有发现在体外培养过程中能够很好促进精原干细胞生长与分化的诱导物质.目的:探讨维生索A对体外培养小鼠精原干细胞生长增殖的影响.方法:无菌收集5～7 d龄昆明雄性小鼠双侧睾丸,采用差速贴壁联合非连续性Percoll密度梯度离心法分离纯化精原干细胞.无菌取出12～15 d龄昆明雄性小鼠双侧睾丸,酶消化法分离纯化Sertoli细胞,贴壁并极化后作为饲养层,将精原干细胞接种在单层Sertoli细胞上.设立2组,实验组向DMEM/F12培养液中加入1 g/L维生素A,对照组不添加维生素A.采用酶联仪测定精原干细胞生长增殖情况,流式细胞仪检测精原干细胞生长周期.结果与结论:共培养6,9,12,15d时,实验组精原干细胞吸光度值明显高于对照组(P＜0.05或0.01).随共培养时间的延长,实验组精原干细胞S期染色体含量逐渐增多,然后又逐渐下降,开始另一个分裂周期;与实验组比较,对照组精原干细胞S期染色体含量增长缓慢(P＜0.05).小鼠精原干细胞在体外培养过程中,维生素A可促进其增殖分化.
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体外分离培养昆明小鼠胚胎干细胞佳胚龄的筛选:孕2.5 d与3.5 d及4.5 d比较
背景:昆明小鼠基因型与人类近似,建立昆明小鼠胚胎干细胞系有利于其转基因动物的获得,但目前对于何时收集胚胎尚无明确报道.目的:探讨体外分离培养昆明小鼠胚胎干细胞的佳胚龄.方法:分别从孕2.5 d,3.5 d和4.5 d的昆明系母鼠子宫中分离收集胚胎,于显微镜下观察胚胎的形态、贴壁情况、内细胞团形成情况、胚胎干细胞克隆率、胚胎干细胞亚克隆率等,并进行碱性磷酸酶染色.结果与结论:孕2.5 d采集的胚胎多为16细胞期胚胎,孕3.5 d采集的胚胎多为桑椹胚,孕4.5 d采集的胚胎多为囊胚.孕2.5 d胚胎和孕3.5 d胚胎的贴壁率、内细胞团形成率、胚胎干细胞克隆率、胚胎干细胞亚克隆率均无明显差异(P＞0.05);孕4.5 d胚胎上述指标均显著高丁二前两者,更适合作为胚胎干细胞培养、克隆、分离、传代的材料.
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脐带沃顿胶间充质干细胞的分离培养及其诱导分化
背景:骨髓是目前间充质干细胞的丰要来源,但由于取材不便、细胞数量受年龄限制等原因,其应用具有一定局限性.近年来,脐带作为阈充质干细胞的新来源已经得到广泛关注.目的:探讨从人脐带沃顿胶中分离、扩增间充质干细胞的方法,鉴定其免疫表型与分化潜能.方法:种植法分离和扩增间充质干细胞:用FasGrow培养基培养,光镜观察获得的人脐带沃顿胶间充质干细胞的形态:免疫组织化学方法检测其免疫表型:Gomori钙钴碱性磷酸酶染色、von Kossa钙结节染色、四环素荧光标记鉴定其向成骨方向分化的能力及油红O染色鉴定其向成脂肪分化的能力.结果与结论:种植法容易从人脐带沃顿胶中获得间充质干细胞;原代培养后12-16 d达70%～80%融合,传代后可维持未分化状态并稳定增殖;细胞倍增时间为2 d左右,体外增殖达20代以上:表面标记分析显示:CD44、CD105、CD133、MHC-1呈阳性,CD34、CD45呈阴性;体外诱导实验表明:该细胞具有体外成脂肪、成骨和神经样细胞分化的能力.
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人脐带间充质干细胞冻存复苏后的生物学特征
背景:冻存脐带间充质干细胞,并有效地保持其生物学特性,是储存脐带间充质干细胞以供临床使用的重要工艺之一.目的:观察冻存后脐带间充质干细胞的生物学特性,验证其是否仍具有间充质干细胞的基本特征.方法:从脐带分离得到间充质干细胞后,将其冻存于液氮之中.比较经冻存复苏后的脐带间充质干细胞和新鲜制各的脐带间充质干细胞活率、抑制人外周血单个核细胞分泌γ-干扰素等方面的异同.检验经冻存复苏后的脐带间充质干细胞是否具有多向分化潜能,其表型是否满足间充质干细胞的基本特征.结果与结论:在细胞活率和抑制人外周血单个核细胞分泌γ-干扰紊方面,冻存和新鲜的脐带间充质干细胞差异无显著性意义.经冻存复苏后的脐带间充质干细胞保持了间充质干细胞的基本形态,其表型满足间充质干细胞的基本要求,具有多向分化的潜能.
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肝干细胞移植在肝病治疗中的应用
背景:目前,肝移植存在供体短缺、手术损伤、手术并发症发生率高以及费用高昂等问题,而肝干细胞移植为终末期肝病的治疗提供了崭新的思路.目的:介绍肝干细胞的来源与分类、肝干细胞移植治疗终末期肝病的研究现状及面临的问题,并展望了其临床应用前景.方法:应用计算机检索中国期刊全文数据库(CNKI:1999/2009)和Medline database数据库(1999/2009)相关文献,检索词分别为"肝干细胞,肝脏疾病,移植"和"hepatic stem cells,liver disease,transplantation",语言分别设定为中文和英文,共检索到87篇文章,阅读文题和摘要进行筛选,选择具有原创性,论点论据可靠且分析全面的与肝干细胞移植临床应用密切相关的文章,排除重复研究及质量较差的文献,后纳入30篇进行总结综述.结果与结论:肝干细胞可分为肝源性和非肝源性.肝源性肝干细胞包括肝卵圆细胞、成熟肝细胞和间充质干细胞等,非肝源性肝干细胞主要来源于胚胎干细胞、骨髓造血干细胞和胰腺干细胞等.目前肝干细胞治疗肿病的研究尚处在初期阶段,从肝干细胞的发现到分离、纯化、全面鉴定、体外培养、定向分化及临床试验等,仍存在许多难题需要研究解决.不过作为一种新兴的种子细胞来源,肝干细胞不但可替换受损组织,而且可刺激受体组织再生以达到自身修复的目的,所以相比现在临床常用的原位肝移植和生物人工肝而言,肝干细胞在治疗各种原因引起的肝脏疾病中都具有十分广阔的前景.
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肿瘤干细胞与肿瘤血管生成研究进展
背景:近研究结果证实,肿瘤中存在一小部分肿瘤干细胞,肿瘤干细胞兼有成体干细胞和胚胎干细胞的自我更新和多能性特征,在肿瘤发展中起重要作用.血管内皮生长因子可调节内皮增殖、血管生成,调节血管通透性及血栓形成.目的:文章就肿瘤干细胞与肿瘤血管生成的研究进展做一综述.方法:应用计算机检索Pubmed数据库(2000-01/2009-10),以"Cancer stem cells,Vascular endothelial growth factor,New vascularize"为检索训:同时应用计算机检索CNKI数据库(2000-01/2009-10)和万方数据库(2000-01/2009-10),以"肿瘤十细胞血、管内皮生长因子、新生血管化"为检索词.结果与结论:计算机初检得到153篇,中文13篇,英文140篇.阅读标题和摘要进行初筛,排除因研究目的与此文无关的35篇,内容重复性文献30篇,Meta分析57篇,共保留31篇做进一步分析.由多种因素调控的血管新生是肿瘤生长和转移过程中的必需环节,干细胞参与并促进肿瘤血管新生,从而促进肿瘤的生长和转移,而修饰后的干细胞则可以起到反向的作用.同时,干细胞也可以作为治疗物质的载体定位肿瘤病灶,特别是在寻找亚临床病灶及远处转移病灶方面具有潜在的优越性.
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脐血及血浆输注治疗肝炎:分组对照1年随访
背景:研究资料证明脐血干细胞移植能改善患者肝功能和免疫功能,修复肝损伤,促进肝细胞再生,但具体分化机制及生物学特性尚不明了,远期治疗前景有待分析.目的:对照分析脐血输注与血浆输注对慢性乙型重型肝炎患者的远期治疗效果.方法:2003-01/2004-01中南大学湘雅二医院住院的慢性重型肝炎患者50例,随机分为治疗组、对照组,25例/组,两组患者均接受护肝、对症、支持等综合治疗,在年龄、病情、用药等方面无明显差异,具有可比性.脐血来源干产前检查HBsAg、抗HCV、抗HIV、KT阴性,无血液病的健康足月顺产产妇,应用一次性采血袋,以封闭式采血法采血.脐血离心后,保留有核细胞及脐血浆,24 h内使用.治疗组输沣脐血干细胞悬液,200 mL/次,每周一两次,每例患者输注4～8次,平均5次;对照组输注成人新鲜血浆.检测两组患者治疗前后血象和肝功能各项指标的变化.结果与结论:两组患者全部完成1年随访.治疗前两组患者肝功能和血象各项指标均基本相似(P＞0.05).脐血治疗1年后,两组患者血象各项指标无明显差异(P＞0.05),但治疗组谷丙转氨酶、总胆红素明显低于对照组(P＜0.05),血清白蛋白明显高于对照组(P＜0.05).与治疗前比较,脐血治疗1年后治疗组血小板无明显变化,谷丙转氨酶、总胆红素均明显下降(P＜0.05),血清白蛋白明显升高(P＜0.05);对照组血小板明显下降(P＜0.05),血清白蛋白明显下降(P＜0.05).提示脐血输注可改善重型肝炎患者的肝功能和血象,可作为其辅助治疗措施.
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自体角膜缘干细胞移植与翼状胬肉单纯切除后眼表泪膜稳定性的对比观察
背景:翼状胬肉的治疗主要有翼状胬肉单纯切除、翼状胬肉切除联合局部使用丝裂霉素、翼状胬肉切除联合结膜瓣转移以及翼状胬肉切除联合自体角膜缘干细胞移植等,许多患者在翼状胬肉切除后会出现不同程度的干眼症表现.目的:对比观察自体角膜缘干细胞移植与翼状胬肉单纯切除对眼表泪膜稳定性的影响.方法:翼状胬肉患者共80例(80眼),随机分为2组,单纯切除组40例40眼在10倍显微镜下行翼状胬肉单纯切除;自体角膜缘干细胞移植组40例40眼在10倍显微镜下行翼状胬肉切除联合自体角膜缘干细胞移植,即切除翼状胬肉组织后在手术区移植白体颞上方带角膜缘干细胞的游离球结膜.于术前、术后1周,3个月行裂隙灯及泪膜破裂时间检查以及干眼症状询问.结果与结论:术后两组患者中均有部分患者有干涩感、异物感、烧灼感,单纯切除组干眼症患者明显多于自体角膜缘干细胞移植组(P＜0.05).自体角膜缘干细胞移植组1周后植片红润,并开始融合生长,无感染或排斥等异常现象出现.术后1周自体角膜缘干细胞移植组泪膜破裂时间较翼状胬肉单纯切除组延长,术后3个月,两组之间差异无显著性意义.结果说明自体角膜缘干细胞移植较传统单纯性胬肉切除效果好,术后早、中期可明显减少患者干眼症状,保持较好的眼表泪膜稳定性.
