中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子的克隆及其转录活性检测
目的:X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1能够诱导半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3凋亡,其具体转录调控机制尚不十分清楚.克隆X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1基因启动子,检测干扰素对其转录活性的影响.方法:实验于2006-05/2007-07在香港大学分子生物学研究所和洛阳华美生物工程公司完成.①材料:结肠癌细胞株Lovo和Sw1116来自美国 American Type Culture Col-lection.pGL3 basic载体,内参照pRL-CMV载体和Dual-luciferase reporter Kit,T4 DNA连接酶,限制性内切酶Kpn I和XhoI均由Promega公司提供.②实验方法:采用PCR法扩增获得X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1基因的启动子片段,将之定向克隆到含荧光素酶报告基因的pGL3 basic载体上,获得的报告基因质粒命名为pLUC107,瞬时转染Lovo和Sw1116细胞株,经α-干扰素刺激处理,启动子转录活性用荧光素酶相对表达活性表示.结果:①PCR扩增结果:在预期的271 bp处出现清晰DNA片段,无非特异扩增现象,证明其为X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子的PCR扩增产物.②重组质粒的酶切鉴定及测序:重组质粒pLUC107双酶切后可见约为271 bp的DNA片段,与理论值相一致.DNA测序证实含X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子荧光素酶报告基因质粒构建成功.③干扰素对X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子转录活性的影响:与未经α-干扰素处理的含pLUC107的Lovo和Sw1116细胞的荧光素酶相对活性值比较,经α-干扰素处理后两种细胞的荧光素酶相对活性值均明显升高(P均 < 0.05),且升高幅度与α-干扰素呈剂量依赖性.结论:成功克隆出X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1基因启动子片段,并利用荧光素酶报告基因证实α-干扰素可上调其转录活性.
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钙离子ATP酶2a基因修饰骨髓间充质干细胞移植改善慢性心力衰竭大鼠的心功能
背景:目前仍缺乏有效手段修复心力衰竭后受损心肌,逆转心肌病理性重塑.作为一种新的治疗策略,用正常肌细胞和治疗性基因干预受损心肌正逐渐显示出其在改善心功能方面的优势.目的:观察腺病毒转染不同代骨髓间充质干细胞的有效性和稳定性.并以携带肌浆网钙离子ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca(2+) ATP-ase,SERCA2a) 基因的腺病毒转染骨髓间充质干细胞,治疗心力衰竭大鼠,比较SERCA2a基因治疗,骨髓间充质干细胞移植以及骨髓干细胞基础的SERCA2a基因治疗慢性心力衰竭大鼠的效果.设计:随机对照实验.单位:解放军总医院老年心血管病科和北京医科大学生物化学系.材料:选取购于北京医科大学动物实验中心的4周龄雄性SD大鼠作为骨髓供体.选取体质量200～250 g雌性成年SD大鼠作为细胞移植和基因治疗受体.以雄性大鼠Y染色体sry基因鉴定供体移植细胞是否在雌性大鼠受体心肌内存活.实验所用Ad-SERCa2a,Ad-EGFP的构建由我科鲁小春博士完成;第3和8代骨髓间充质干细胞自行分离培养.方法:实验于2004-07/2005-12在北京医科大学生物化学系周春燕实验室完成.对30只雌性SD大鼠进行左冠状动脉结扎,制作急性心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠模型.将造模成功的29只大鼠随机分为4组:基因治疗组7只,干细胞移植治疗组7只,基因修饰的干细胞移植组8只,腺病毒空载体对照组7只,分别予以单纯SERCA2a基因、MSC移植、SERCA2a基因修饰的骨髓间充质干细胞移植及腺病毒空载体干预.分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,用携带SERCA2a及绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-SERCA2a-GFP)转染第3和8代骨髓间充质干细胞.主要观察指标:采用流式细胞仪检测不同代骨髓间充质干细胞的Ad-SERCA2a-GFP转染率.分别在治疗前及治疗后14,21 d采用超声心动图检测大鼠心功能.采用免疫组化法检测大鼠心脏Ⅷ因子表达;采用RT-PCR 和Western杂交检测SERCA2a的基因和蛋白水平表达,并按照说明书检测宿主SERCA2a功能活性.结果:①转染率:腺病毒转染不同代骨髓间充质干细胞的转染率超过80%,第3代骨髓间充质干细胞与第8代的转染率比较,差异无显著性意义(P > 0.05).②大鼠心功能:治疗后14 d,与腺病毒空载体对照组相比,其余3组左室射血分数均明显升高(P < 0.01).治疗后 21 d,与腺病毒空载体对照组相比,干细胞移植治疗组和基因修饰的干细胞移植组大鼠室壁增厚;干细胞移植治疗组和基因修饰的干细胞移植组左室射血分数和左室短轴缩短率改善率持续升高(P < 0.01),基因治疗组两指标改善率较治疗14 d时下降.与腺病毒空载体对照组相比,基因修饰的干细胞移植组左室前壁和室间隔收缩期纵向峰值速度显著升高(P < 0.01),左室前壁和室间隔舒张期纵向峰值速度亦呈现相同改善(P < 0.01).③心肌SERCA2a的基因、蛋白水平表达和功能活性,以及Ⅷ因子表达:携带SERCA2a基因的骨髓干细胞在宿主心肌能有效地合成和表达有功能的SERCA2a蛋白.与腺病毒空载体对照组相比,基因修饰的干细胞移植组SERCA2a基因、蛋白表达和酶活性均显著增强.干细胞移植组心力衰竭大鼠心脏瘢痕区可观察到Ⅷ因子表达.结论:①第3和8代骨髓间充质干细胞均具有高腺病毒转染率,骨髓间充质干细胞是基因治疗的良好细胞载体,其介导的SERCA2a基因治疗对衰竭心肌具有持续稳定的心功能改善作用.②骨髓间充质干细胞移植改善心功能的作用可能与促进血管新生有关.
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恶性血液病患者接受造血干细胞移植后发生糖尿病的危险因素分析
目的:造血干细胞移植是目前根治血液病的惟一方法.调查分析恶性血液病造血干细胞移植后糖尿病发生及发展的危险因素.方法:①对象和分组:收集2003-01/2007-02武汉市中心医院行造血干细胞移植后患者和外院行造血干细胞移植后转至武汉市中心医院的患者16例.根据干细胞移植术后血糖水平分为糖尿病组6例,非糖尿病组11例,两组平均年龄45.2岁.②评估:分析移植后糖尿病的发生与患者年龄、术前疾病状态(化疗次数、大剂量强化的次数、血压状态、糖耐量情况)、免疫抑制剂、皮质激素用量及时间的关系,以及移植后糖尿病对患者的影响.结果:16例患者均进入结果分析.①术后出现5例糖尿病;术前有糖耐量异常者其移植后糖尿病的发生率高于无糖耐量异常者.②年龄大于40岁、曾经多次使用过含有糖皮质激素化疗方案的患者,其糖尿病的发病率较高;激素半年内撤离的患者移植后糖尿病的发生率明显低于半年内未撤离者.③两组患者使用免疫抑制剂及血药浓度的情况对糖尿病的发生无影响.④糖尿病组对术后巨细胞病毒感染率无明显影响.结论:年龄大于40岁、曾多次使用过含糖质皮激素的化疗方案、糖耐量异常、长期使用糖皮质激素预防移植物抗宿主反应者是糖尿病的高危人群.
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自体骨髓干细胞移植对心力衰竭患者近期心功能的影响
目的:心肌细胞在人类出生后已几乎失去增殖能力,增加具有完整收缩功能的心肌细胞数目是治疗心力衰竭所致心肌损伤的关键.实验拟进一步观察和验证自体骨髓干细胞移植对心力衰竭患者近期心功能的影响.方法:①对象:选取2003-10/2005-06苏州大学附属第四医院胸心外科收治的23例急性心肌梗死患者,随机数字表法分为心肌梗死细胞移植组7例,心肌梗死对照组16例.另选取2003-10/2005-06收治的11例严重风湿性心脏病、二尖瓣狭窄合并全心衰竭女性患者为二尖瓣病变细胞移植组,以2001-10/2003-10收治的同类疾病女性患者10例为二尖瓣病变瓣膜置换组.以上4组患者术前均依靠大剂量正性肌力药物和利尿剂维持心功能,患者及其家属对治疗均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:无菌条件下在髂前上棘抽取骨髓25 mL,用DMEM完全培养基分离培养骨髓干细胞,贴壁筛选法进行纯化的.细胞达80%融合时用胰酶消化传代,取第3代细胞用于移植,浓度调整为1.5×1010 L-1.心肌梗死细胞移植组将自体骨髓干细胞悬液自左、右冠状动脉注入5 mL.心肌梗死对照组患者仅行常规治疗.二尖瓣病变细胞移植组患者在二尖瓣置换术中将自体骨髓干细胞悬液自左、右冠状动脉注入,同时行心肌内注射,每点注射0.1～0.2 mL,间距2 cm,注入量共5 mL.二尖瓣病变瓣膜置换组单纯行二尖瓣置换术.③实验评估:细胞移植前后通过心脏超声以及核素显像方法全面评价心功能.结果:4组患者均完成3个月随访.①自体骨髓干细胞移植对急性心肌梗死心功能的影响:与心肌梗死对照组比较,术前 10 d及术后2周心肌梗死细胞移植组射血分数、心输出量、心肌梗死面积均基本相似(P > 0.05);术后4,6,8周射血分数、心输出量均显著提高(P < 0.01),心肌梗死面积均显著缩小(P < 0.01).②自体骨髓干细胞移植对风湿性二尖瓣病变心功能的影响:与二尖瓣病变瓣膜置换组比较,二尖瓣病变细胞移植组术后4周射血分数和心输出量均明显提高(t =3.97,P < 0.01;t = 3.61,P < 0.01) ,至术后8周差异为明显,提高效果均显著优于术后4周(t =2.91,P < 0.05;t=2.64,P < 0.05).结论:自体骨髓干细胞移植可明显改善冠状动脉粥样硬化性心脏病心肌梗死患者的心功能,辅助用于风湿性二尖瓣并发心力衰竭患者的外科治疗亦能对心功能有所提高.
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干细胞移植改善股骨头坏死缺血状态的实验及临床效应:20只模型兔及188例患者资料分析
背景:缺血性股骨头坏死由于股骨头局部滋养血管损伤、供血不足致病,迄今尚无佳治疗方案,改善股骨头血液供应成为治疗本病的关键.目的:通过动物实验和临床观察,验证自体骨髓间充质干细胞移植血管再生技术改善股骨头坏死缺血状态的效果.设计:对比动物实验和自身对照临床观察.单位:解放军第四六三医院细胞治疗中心.资料:①动物:选用日本大耳白兔20只,雌雄不拘,体质量3.0～4.0 kg,购于沈阳军区总医院动物实验中心.此动物实验符合动物伦理学要求.②对象:选择2004-07/2007-07在解放军第四六三医院细胞治疗中心住院的具有完整随访资料的缺血性股骨头坏死患者188例(335髋),男113例,女75 例,年龄18～72岁.均经髋关节X线摄片、核素扫描、MRI、CT检查确诊;对治疗和实验知情同意.实验经医院伦理委员会批准.方法:①动物实验:实验于2004-01/2004-06在沈阳军区总医院动物实验中心完成.采用液氮冷冻股骨头缺血性坏死模型建立方法,双后肢股骨头均制作缺血模型,右侧为移植组,左侧为对照组.抽取骨髓,将所获单个核细胞经右股动脉注入;同法将生理盐水注入左侧股动脉内.②临床观察:密度梯度离心缺血性股骨头坏死患者自体骨髓,分离单个核细胞.行旋股内、旋股外及闭孔动脉干细胞移植术.主要观察指标:①4周后行DSA动脉造影观察双侧血管新生情况.4,12周后取双侧股骨头标本,行病理切片观察新骨再生及股骨头修复程度.②于移植后第3,6,12,24个月观察患者髋关节疼痛、行走间距及步态、髋关节外展与内旋功能变化.于干细胞移植后6个月行股骨头供血动脉造影术,观察血管新生及股骨头供血动脉充盈情况.于干细胞移植后6,12,24个月行CT,X射线,MRI检查,观察股骨头区形态学及缺血状态变化.于干细胞移植前,移植后3,6,12,24个月进行髋关节Harris评分评价髋关节功能.结果:动物实验结果:①20只兔均进入结果分析.②DSA动脉造影结果:移植后4周移植组兔右后肢股骨头区供血动脉较对照组股动脉明显增多.③病理结果:移植后12周右侧股骨头软骨、板层骨及骨小梁明显修复,左侧股骨头坏死无改善.临床观察:188例患者均进入结果分析.①症状改善:188例患者中髋关节疼痛缓解164例(87.3%),关节功能改善147例(78.4%),行走间距延长150例(80.0%).②影像学改变:移植后6个月12例患者DSA动脉造影显示,股骨头供血动脉较移植前明显增多、增粗,血流速度增快;12～24个月后X射线平片,CT,MRI检查24例患者坏死的股骨头区可见骨质病变获得改善.③髋关节Harris评分:干细胞移植后6,12,24个月高于移植前,差异有非常显著性意义(t=-3.423,-6.714,-9.039,P﹤0.01).结论:经动脉自体骨髓间充质干细胞移植可改善股骨头坏死缺血状态,是治疗缺血性股骨头坏死的有效手段.
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体外诱导大鼠骨髓干细胞向肝干细胞分化的特征
目的:骨髓干细胞分化为肝干细胞的发现具有重要的临床应用价值,可用其作为生物人工肝或肝细胞移植的供体细胞,以解决供体缺乏,同时自体细胞还可免除异基因或异种细胞所致的许多问题.为此,实验模拟肝脏发育的微环境,观察体外诱导分化大鼠骨髓干细胞为肝干细胞的可行性及特征.方法:实验于2006-10/2007-08在解放军第一二三医院南京军区肝病中心实验室完成.①实验动物: SPF级SD大鼠,2月龄,体质量(200±20) g,雌雄不拘,购于上海斯莱克实验动物公司.实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:采用密度梯度分离法分离培养大鼠骨髓干细胞,并设诱导组和非诱导组,应用25 μg/L肝细胞生长因子、10 μg/L成纤维生长因子-4、10 μg/L干细胞生长因子共同诱导.③实验评估:于诱导第0,7,14,21,28天,观察细胞形态变化,采用放射免疫法检测培养上清液中甲胎蛋白浓度,免疫组织化学染色检测甲胎蛋白、细胞角蛋白19、白蛋白的表达,应用流式细胞仪检测甲胎蛋白、细胞角蛋白19表达阳性细胞比例.结果:①诱导培养的骨髓干细胞呈卵圆形或圆形的肝干细胞样改变.②放射免疫法检测到诱导组细胞甲胎蛋白浓度逐渐升高,第14天达高峰,随后呈下降趋势,与非诱导组相比,除第0,7天无差异,其余各时间点差异均显著(P < 0.05).③免疫细胞化学法检测到诱导组细胞特异性表达甲胎蛋白、细胞角蛋白19及白蛋白,非诱导组不表达3种蛋白.④流式细胞分析诱导组甲胎蛋白阳性细胞比例为66.20%、细胞角蛋白19阳性细胞的比例为44.96%.结论:在实验建立的诱导培养体系中,骨髓干细胞在体外能分化为肝干细胞样细胞,诱导细胞有分泌甲胎蛋白、细胞角蛋白19、白蛋白的特征性功能.
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体外模拟心肌环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化
目的:以往研究将长有一层心肌细胞的半透膜放于骨髓间充质干细胞培养皿中,或用培养过心肌细胞的培养基来培养骨髓间充质干细胞,均未发现心肌细胞特异蛋白表达.为此体外模拟心肌微环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,并与常规诱导剂5-氮杂胞苷的诱导效果进行比较.方法:实验于2007-03/09在山西医科大学中心实验室完成.①动物:Wistar大鼠20只,新生1 d龄Wistar乳鼠10只,均由山西医科大学动物房提供,清洁级,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.诱导剂5-氮杂胞苷为美国Sigma公司产品.②实验方法:自新生Wistar乳鼠心脏分离培养心肌细胞,取第1、2代制成1×109 L-1细胞悬液,-70 ℃放置4～5 h后融化,吸管吹打,反复3次,离心取上清,过滤后即为心肌细胞冻融液,以此作为培养基体外模拟心肌微环境.自成年Wistar大鼠骨髓分离骨髓间充质干细胞,取生长良好的第2代制成1×108 L-1细胞悬液,分为4组:血清对照组加入含15%胎牛血清的DMEM/F12培养基;5-氮杂胞苷组加入10μmol/L 5-氮杂胞苷37 ℃避光孵育24 h后,换DMEM/F12培养基继续培养;5-氮杂胞苷+心肌细胞冻融液组加入10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导24 h后,在培养体系中加入相当于4倍骨髓间充质干细胞数量的心肌细胞冻融液;心肌细胞冻融液组加入相当于4倍骨髓间充质干细胞数量的心肌细胞冻融液.③实验评估:诱导1周后观察骨髓间充质干细胞的形态变化,利用免疫细胞化学技术鉴定心肌特异性肌钙蛋白T、连接蛋白43、α-横纹肌肌动蛋白、CD31的表达情况.结果:①体外模拟心肌微环境情况:培养7 d时心肌细胞形成细胞簇或细胞单层,呈放射状排列的同心圆状或峰谷样生长,细胞簇搏动呈明显同步性.传代后的心肌细胞仍具有自主收缩的特性.②骨髓间充质干细胞的体外诱导结果:诱导处理1周后,5-氮杂胞苷组多数细胞呈杆状,紧密平行排列生长,细胞体积变大,可见肌丝样结构形成;心肌细胞冻融液组细胞有聚集生长趋势,形成大量的子细胞,可见大量的肌丝样的结构;5-氮杂胞苷+心肌细胞冻融液组脱落或降解的细胞数明显少于5-氮杂胞苷组,也形成肌丝样结构,但部分细胞内有脂肪空泡形成.③免疫细胞化学鉴定结果:诱导培养1周后,血清对照组仅表达α-横纹肌肌动蛋白;5-氮杂胞苷组表达心肌特异性蛋白T、α-横纹肌肌动蛋白、连接蛋白43,其阳性率分别为20%,28%,25%,抗CD31染色呈阴性;心肌细胞冻融液组上述蛋白阳性表达率分别为23%,32%,28%,明显高于5-氮杂胞苷组(P < 0.05),同时抗CD31染色呈阳性;5-氮杂胞苷+心肌细胞冻融液组上述蛋白阳性表达率略低于心肌细胞冻融液组,抗CD31染色呈阳性.结论:①以心肌细胞冻融液体外模拟心肌微环境,可高效诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞.②部分骨髓间充质干细胞表达CD31,即可向血管内皮细胞分化,提示与5-氮杂胞苷单一的肌细胞诱导作用相比,心肌细胞冻融液更能提供一个心肌再生所需的自然条件.
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体外诱导的人脂肪间充质干细胞源性软骨细胞体内成骨活性
目的:目前对间充质干细胞向软骨细胞诱导分化主要包括体内诱导和体外诱导两种方式,前者依靠体内微环境,随机性大且难以进行监控和调整.本实验探讨体外诱导人脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化,以及诱导后细胞在裸鼠体内的成软骨能力.方法:实验于2006-08/2007-05在中南大学湘雅医院中心实验室完成.①对象与材料:皮下脂肪组织来源于股骨颈骨折手术患者6例,年龄25～64岁,对实验及治疗均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.清洁级裸鼠5只,体内成软骨实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.离心管容量20 mL,由GeneRay公司生产.②实验方法:将皮下脂肪组织剪碎,I型胶原酶消化法分离培养脂肪间充质干细胞,待细胞铺满瓶底80%时胰酶消化传代.传至第6代时收集 5×106个细胞,用含1%新生牛血清、高糖DMEM、10 μg/L转化生长因子β1、37.5 mg/L维生素C、6.25 mg/L胰岛素、6.25 mg/L转铁蛋白、10-7 mol/L地塞米松的软骨细胞诱导剂重悬于无支架离心管内.③实验评估:诱导过程中观察细胞聚集状态.诱导2周后采用苏木精-伊红染色、RT-PCR、Western blot对细胞形态及功能变化进行检测.将诱导后细胞与纤维蛋白原凝胶混合,植入裸鼠皮下,3周后切取植入组织块,苏木精-伊红染色及II型胶原免疫组化染色观察体内成软骨情况.结果:①诱导后细胞聚集状态:诱导2 d后脂肪间充质干细胞自行聚集为一条状细胞团,1周后细胞团聚集呈球状.②苏木精-伊红染色结果:未见有软骨陷窝形成.③RT-PCR检测结果:细胞团内Ⅱ型胶原蛋白和Sox9 mRNA均呈阳性表达.④Western blot检测结果:细胞团内有较强的Ⅱ型胶原蛋白和Aggrecan表达.⑤体内成软骨情况:植入裸鼠皮下的组织块内有大量软骨陷窝及II型胶原蛋白形成.结论:①在无支架离心管内,脂肪间充质干细胞经软骨诱导剂作用后具有典型的软骨细胞表型,但未形成成熟软骨组织所具备的软骨陷窝.②诱导后细胞与凝胶复合种植于裸鼠体内,可形成具有典型软骨特征的组织.
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不同体外诱导培养条件下新生鼠基底前脑神经干细胞增殖和分化为神经元的能力
目的:研究神经干细胞的增殖、迁移和分化可为揭示神经系统的发生、发育过程提供可靠依据.观察表皮生长因子和碱性成纤维生长因子在体外刺激新生鼠基底前脑神经干细胞的增殖情况,及其各自诱导神经干细胞分化成神经元的能力.方法:实验于2005-12/2006-07在广州医学院解剖学教研室完成.①动物:清洁级新生24 h内的SD大鼠30只,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:新生鼠在无菌条件下取脑,分离出基底前脑,胰蛋白酶消化,离心过滤制备单细胞悬液,接种于含B27的DMEM/F12培养基培养瓶中,每瓶40～60万个细胞,加入终浓度均为10μg/L的表皮生长因子和碱性成纤维生长因子刺激生长,在体外进行神经干细胞的克隆培养,传代培养过程中加入终浓度为6 mg/L BrdU用于标记神经球,设立3组,各自加入体积分数为0.1的小牛血清、终浓度均为10μg/L的表皮生长因子、碱性成纤维生长因子,对培养得到的神经干细胞进行诱导分化.③实验评估:免疫荧光染色检测神经干细胞巢蛋白抗原的表达,并用BrdU标记和免疫荧光证实其增殖能力.免疫荧光染色检测不同诱导条件下神经干细胞向神经元分化的能力. 结果:①细胞形态观察:从新生鼠基底前脑成功分离出神经干细胞,原代培养呈透亮的圆球形,2～3 d后细胞数目明显减少,部分细胞开始分裂.1周左右培养瓶中出现许多由数十到数百个细胞组成的悬浮生长的细胞球,球中的细胞形态规则,边界清楚,折光性较强,胞浆颜色较深,核/浆比较大.该细胞具有连续增殖能力,可以传代培养.②巢蛋白抗原的表达:传代神经球中的细胞均呈巢蛋白抗原阳性.③BrdU标记检测:克隆球中的细胞均为BrdU阳性,表明克隆球是由不断分裂增殖的细胞组成.④诱导分化结果:在体积分数为0.1小牛血清、终浓度均为10μg/L的表皮生长因子、碱性成纤维生长因子诱导条件下,神经干细胞分化为神经元的比例分别为20%,22%,40%.结论:①表皮生长因子和碱性成纤维生长因子在体外能够刺激新生鼠基底前脑神经干细胞连续增殖,且具有胚胎源性.②以血清作为对照,碱性成纤维生长因子诱导神经干细胞向神经元分化的能力强于表皮生长因子.
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新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后骨髓基质细胞移植时间的选择
目的:众多研究已证实骨髓基质细胞移植治疗缺氧缺血性脑损伤是有效的,但移植时间点的选择尚无定论.在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后不同时间点进行骨髓基质细胞移植,通过对其远期行为学及组织学检测,探讨佳的移植时间窗.方法:实验于2005-06/2006-06在中南大学湘雅医院中心实验室完成.①动物:选取清洁级7 d龄SD大鼠50只,随机数字表法分为5组:正常对照组、模型对照组、24 h,72 h,7 d细胞移植组,10只/组.另取4周龄SD大鼠10只用于骨髓基质细胞的培养.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:除正常对照组外,其余组大鼠均建立缺氧缺血性脑损伤模型.在脑立体定位仪下,24 h,72 h,7 d细胞移植组分别于造模后对应时间点,将体外培养3~5代且经Hochest33324标记24 h的鼠骨髓基质细胞2 μL脑内移植于左侧海马,约105个细胞.③实验评估:各组大鼠40 d日龄时进行迷宫觅水测试,记录觅水时间、错误次数、重复次数.行为学测试后取脑组织片行尼氏染色,计数左侧海马CA1区神经元数.在荧光显微镜下观察骨髓基质细胞的存活、增殖,用免疫组化法检测骨髓基质细胞神经元特异性烯醇化酶的阳性率.结果:50只大鼠均进入结果分析.①放射臂迷宫实验检测:模型对照组觅水时间、错误次数、重复次数均高于正常对照组和各细胞移植组（P < 0.01）,24 h细胞移植组上述3项指标均低于72 h,7 d细胞移植组（P < 0.05）.②左侧海马CA1区神经元尼氏染色结果:模型对照组神经元数较正常对照组明显减少（P < 0.01）,且排列紊乱,丢失明显;24 h,72 h,7 d细胞移植组神经元数均较模型对照组显著增加（P < 0.01）,排列整齐;24 h细胞移植组神经元数较72 h,7 d细胞移植组明显增多（P < 0.05）.③骨髓基质细胞体内增殖和神经分化情况:骨髓基质细胞移植后30~40 d仍可在移植部位及左侧皮质区存活、增殖.24 h细胞移植组左脑神经元特异性烯醇化酶阳性表达率显著高于72 h,7 d细胞移植组（P < 0.01）.结论:新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后24 h接受骨髓基质细胞移植可大程度改善脑损伤所导致的远期行为学障碍,其机制可能与早期移植可有效减轻神经元的坏死、凋亡,且有利于骨髓基质细胞的迁移、分化有关.
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人外周单个核细胞来源树突细胞成熟与肺炎支原体膜脂蛋白的影响
目的:实验着眼于肺炎支原体膜脂蛋白对人外周血单个核细胞来源的树突细胞的表型(CD83,CD86)及分泌细胞因子的作用,探讨肺炎支原体加重哮喘的机制是否是改变了树突细胞的性状.方法:①对象:所有外周血采自正常人,志愿献血者为武汉大学医学院2005级硕士博士研究生6人;实验用肺炎支原体膜脂蛋白购自广州华银医药科技有限公司.②实验过程及分组:从肘静脉采集志愿者20 mL新鲜全血,以不连续密度梯度离心法及贴壁法获取单核细胞,加入重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,重组人白细胞介素4培养5 d得到不成熟树突细胞后,分别予肺炎支原体膜脂蛋白,脂多糖和空白刺激再培养2 d.③评估:用流式细胞仪检测各组树突细胞表面表达CD83,CD86的情况,用酶联免疫吸附法检测各组树突细胞分泌白细胞介素12的水平.结果:①肺炎支原体膜脂蛋白组树突细胞表达CD83,CD86高于未刺激组(P < 0.01,P < 0.01);脂多糖组树突细胞表达CD83,CD86高于未刺激组(P < 0.01,P < 0.01);肺炎支原体膜脂蛋白组树突细胞表达CD83较脂多糖组无差异,表达CD86高于脂多糖组(P < 0.05).②肺炎支原体膜脂蛋白组树突细胞分泌白细胞介素12高于未刺激组(P < 0.01);脂多糖组树突细胞分泌白细胞介素12高于未刺激组(P < 0.01);肺炎支原体膜脂蛋白组树突细胞分泌白细胞介素12低于脂多糖组(P < 0.05).结论:肺炎支原体膜脂蛋白可刺激未成熟树突细胞分化成熟,但较脂多糖刺激的不同,前者刺激成熟的树突细胞在呈递抗原给T细胞时,可进一步使T细胞向Th2极化,导致Th1/Th2平衡失调,从而加重哮喘.
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大鼠毛囊干细胞的体外分离培养及增强型绿色荧光蛋白示踪
目的:毛囊干细胞具有分化为表皮、皮脂腺和毛囊的能力,在烧伤、创伤及大面积皮肤缺损的细胞治疗和基因治疗等方面均有很好的应用前景,但其特异性标志物和体外培养条件等方面存在争议.实验拟进一步探讨毛囊干细胞体外分离培养的方法,以及增强型绿色荧光蛋白作为其示踪标志物的可行性.方法:实验于2007-05/09在解放军第三军医大学细胞生物教研室完成.①材料:新生7 d龄SPF级SD大鼠5只,由解放军第三军医大学实验动物中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.pEGFP-N1质粒由本实验室保存.②实验方法:大鼠在体视显微镜下分离出含真皮鞘的完整毛囊,dispase消化,将毛囊从真皮鞘中挤出,收集形态完好且处于生长期的毛囊,分别在毛球部上端、皮脂腺下端横切毛囊,取中间部分置于胰酶和EDTA中联合消化,向所得细胞悬液中添加含10%胎牛血清DMEM/F12完全FAD培养基,常规培养7 d后,采用IV型胶原快速贴壁法两次筛选以分离纯化大鼠毛囊干细胞.待筛选后的细胞生长至70%～80%融合后,进行pEGFP-N1质粒细胞转染.③实验评估:通过超微结构观察与流式细胞仪检测CD34、α6-integrin的表达,对分离纯化的大鼠毛囊干细胞进行鉴定.转染24～72 h后,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,以毛囊干细胞克隆形成率判定标记细胞的增殖能力.结果:①细胞形态及超微结构:筛选后的毛囊干细胞形态均一,呈铺路石状,透射电镜显示细胞胞体小,核浆比例大,核仁明显,细胞器发育不成熟,处于原始状态.②细胞表型:高表达CD34和α6-integrin,细胞阳性率≥ 90%.③pEGFP-N1质粒转染及示踪:转染16 h左右细胞出现微弱绿色荧光,经G418筛选后稳定表达绿色荧光蛋白.④细胞克隆形成率:与转染前比较,转染后细胞克隆形成率明显降低(t =4.541,P < 0.01).结论:①利用二步酶消化法联合IV型胶原快速贴壁法可以获得较高纯度的毛囊干细胞.②增强型绿色荧光蛋白能稳定标记毛囊干细胞,是较理想的示踪方法,但细胞增殖能力受一定影响.
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人脐静脉间充质干细胞体外诱导分化为神经元的可行性
目的:探讨来源于人脐静脉内皮及内皮下层间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的可行性,分析体外分离纯化、原代及传代培养的佳条件,为神经组织修复选择理想的种子细胞来源.方法:实验于2006-04/12在辽宁医学院解剖学实验室完成.①对象:取正常健康产妇顺产或剖宫产的新生儿脐带20条,由辽宁医学院附属第一医院提供,产妇及其家属均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:无菌条件下用1 g/LⅠ型胶原酶消化脐静脉内皮及内皮下层,收集的细胞按5×107 L-1,1×108 L-1,5×108 L-1,1×109 L-1,3×109 L-1密度接种进行原代培养,待细胞80%融合时胰酶消化传代.取第2代细胞,诱导组经含有3 μmo/Lβ-巯基乙醇、20%胎牛血清的DMEM预诱导液处理后,换成含10 g/L二甲基亚砜、100 mmol/L丁化羟基茴香醚的无血清DMEM诱导液进行诱导.未诱导组将诱导液更换为无血清DMEM.③实验评估:记录原代培养过程中不同接种密度细胞贴壁所需时间.免疫细胞化学检测诱导前细胞表面抗原血管性血友病因子、CD166的表达及诱导后细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白的表达,倒置相差显微镜下计数阳性细胞分化率.结果:①不同接种密度细胞贴壁所需的原代培养时间比较:5×107 L-1组仅有1孔细胞贴壁呈克隆样生长,但培养至28 d时仍不能传代,其余培养孔均无细胞贴壁生长.与1×108 L-1组比较,5×108 L-1,1×109 L-1,3×109 L-1组细胞贴壁生长的原代培养时间均明显缩短(P < 0.05),且后3组比较差异无显著性意义(P > 0.05).②贴壁细胞表面抗原检测:CD166呈阳性,血管性血友病因子呈阴性.③诱导分化:诱导组脐静脉间充质干细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶呈阳性表达,不表达胶质纤维酸性蛋白.巢蛋白阳性细胞率为(9.5±1.2)%,神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率为(15.6±2.6)%.未诱导组以上3种标志均不表达.结论:①在体外可以成功分离培养获得人脐静脉内皮及内皮下层的间充质干细胞,其原代培养细胞的种植密度以5×108 L-1～ 1×109 L-1为佳.②细胞传2代后性质相对均一,基本无造血细胞和内皮细胞污染,达到纯化目的,具有间充质干细胞特点.③在化学诱导剂β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基茴香醚联合作用下,其可以向神经元样细胞分化.
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胚胎干细胞源性肝干细胞肝内移植对宿主肝功能的影响及安全性评估
背景:体外诱导胚胎干细胞分化为肝细胞已有不少成功的报道,但其体内移植后能否有效整合入宿主肝板、在肝内能否进一步生长分化并表达肝细胞功能以及成瘤的风险等情况目前还不清楚.目的:应用治疗性肝再生模型进行胚胎干细胞源性肝干细胞肝内移植, 观察其在肝组织替代、体内的生长分化及成瘤性情况.设计:随机对照动物实验.单位:中山大学附属第二医院小儿外科.材料:选用BALB/c小鼠24只为受体,鼠龄6～8周,体质量20～ 35 g,雌雄不拘购自广州市实验动物中心.实验所用胚胎干细胞源性肝干细胞由作者所在课题组诱导胚胎干细胞分化而成.小鼠胚胎干细胞株E14由本院干细胞中心提供.方法:实验于2006-07/2007-06在中山大学附属第二医院干细胞研究中心完成.将24只小鼠随机分为2组:肝再生模型+干细胞移植组和肝切除+干细胞移植组,每组12只.前组分两次按50 mg/kg剂量腹腔内注射倒千里光碱(retrorsine) ,间隔2周,第2次注射4周后行70%肝部分切除制造肝损伤;然后经门静脉分别移植1×105羟基荧光素乙酰乙酸(CFDA-SE)荧光标记的细胞入小鼠肝内进行胚胎干细胞源性肝干细胞移植.后组在行70%肝部分切除制造肝损伤模型后进行胚胎干细胞源性肝干细胞移植.主要观察指标:荧光显微镜下观察移植细胞组受体鼠肝脏内分布、整合与体内生长分化情况.2周后行白蛋白荧光免疫组化(双荧光染色)、血清白蛋白水平检测其功能状况.将胚胎干细胞源性肝干细胞注入治疗性肝再生小鼠肝内,将未分化的胚胎干细胞移植入小鼠腋区皮下作为对照,观察胚胎干细胞源性肝干细胞体内成瘤情况.结果:①肝干细胞在受体鼠肝内生长情况:CFDA SE标记的胚胎干细胞源性肝干细胞肝内移植1周,受体小鼠肝实质内可见散在绿色荧光分布.2周后,肝实质内绿色荧光分布区域明显扩大,且可见类似肝索样结构排列.②肝功能:共焦白蛋白荧光免疫组化(双荧光染色)结果表明,受体小鼠肝组织内可见标记细胞表达白蛋白阳性信号(呈黄色荧光),肝再生模型+干细胞移植组和肝切除+干细胞移植组血清白蛋白水平则无明显差异(P > 0.05).③肝干细胞移植安全性:6周内未见畸胎瘤形成,而将未分化的胚胎干细胞移植入小鼠腋区皮下6周后则可见畸胎瘤形成.结论:胚胎干细胞源性肝干细胞移植入治疗性肝再生模型小鼠肝内后可有效在肝内能进一步生长分化并部分表达肝细胞功能;且此移植安全性较好.
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减低预处理剂量异基因造血干细胞移植后的白血病复发
目的:减低预处理剂量异基因造血干细胞移植预处理方案剂量强度弱于清髓性移植且又强于真正的非清髓移植,期望在降低毒副反应的同时能够减少复发.评价减低预处理剂量的异基因造血干细胞移植后白血病的复发情况及主要影响因素.＃方法:①对象:选取2003-03/2005-06厦门大学附属中山医院血液科收治的23例白血病患者,急性粒细胞白血病6例,急性淋巴细胞白血病7例,慢性粒细胞白血病10例.供者同胞HLA全相合10例,同胞或亲缘供者不全相合12例,非血缘1例.供受者对治疗均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:23例白血病患者均采用减低预处理剂量方案,马利兰4 mg/(kg·d),2～3 d;环磷酰胺50 mg/(kg·d),2 d.其中19例患者在上述方案的基础上加用氟达拉滨30 mg/(m2·d),3～5 d;10例患者同时加用阿糖胞苷(1.0～2.0)g/(m2·d),1～3 d.供受者HLA位点不合时用兔抗胸腺细胞球蛋白(3.0～5.0)mg/(kg·d),3～5 d.异基因造血干细胞移植前行供者外周血干细胞动员,4～5 d后连续采集2次,23例白血病患者输入CD34+细胞中位数为4.02×106/kg.采用骁悉+环孢素+短程甲氨喋呤方案预防移植物抗宿主病.③实验评估:采用STR-PCR方法检测异基因造血干细胞植入证据.结果:①造血功能重建检测:23例患者均顺利完成造血功能重建,无一例发生预处理相关死亡.经预处理后外周血白细胞低值为(0.01～0.30)×109 L-1,血小板低值为(5～20)×109 L-1;中性粒细胞恢复到0.5×109 L-1的中位时间为术后11 d,血小板恢复到30×109 L-1的中位时间为术后12 d.术后30 d经STR-PCR检测22例患者为完全供者型,骨髓象均完全缓解,剩余1例复发患者未行STR-PCR检测.②移植物抗宿主病发生情况:23例患者中,9例(39.1%)发生急性移植物抗宿主病,19例(82.6%)发生慢性移植物抗宿主病.③术后复发及生存情况:随访截止至2007-06-30,共5例患者复发,复发率21.7%,复发时间为移植后1～24个月;其中急性淋巴细胞白血病2例,急性粒细胞白血病2例,慢性粒细胞白血病1例,后3例移植前处于复发状态.移植前处于缓解期的患者其复发率为10%.结论:①急、慢性粒细胞白血病缓解期患者采用减低预处理剂量的异基因造血干细胞移植方式,其术后复发率并未高于清髓性异基因造血干细胞移植,且预处理相关死亡率低.②疾病类型的选择、移植时的疾病状态、适当的预处理强度以及移植物抗宿主病是影响术后复发的重要因素.
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三种不同饲养层上人胚胎干细胞生长状态的比较
背景:人胚胎干细胞传代培养的关键是抑制其自发分化、保证细胞的全能性.以小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞作为饲养层尽管能够维持胚胎干细胞的未分化状态,但存在细胞克隆不饱满、平铺情况明显等问题.目的:制备小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞的混合饲养层,观察人胚胎干细胞在其上面的生长状态.设计:多样本观察比较.单位:海南医学院附属医院生殖医学中心.材料:实验于2006-04/2007-07在海南医学院附属医院生殖医学中心完成.包皮来自于行包皮环切的儿童,由海南医学院附属医院泌尿外科提供,儿童家属对治疗及实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.人胚胎干细胞系HN-1由本实验室从人类囊胚中分离培养并鉴定.清洁级孕12.5～14.5 d的胎鼠11只,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.方法:胎鼠麻醉后去除头、四肢和内脏,按常规胰蛋白酶反复消化法获得细胞悬液进行接种培养,待生长汇合后冻存部分原代细胞,用丝裂霉素C处理2.0～3.0 h后,按1×108 L-1密度接种于明胶包被的中心皿内,即小鼠胚胎成纤维细胞饲养层.人包皮成纤维细胞的分离培养与饲养层制备同上.上述两种成纤维细胞分别计数后,按1∶0,3∶1,1∶1,1∶3,0∶1比例混合,然后以1×108 L-1密度接种于明胶包被的中心皿内,即混合饲养层.观察体外传代培养的人胚胎干细胞在3种不同饲养层上的生长状态,并对生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞进行碱性磷酸酶检测、OCT-4表达免疫组化检测、OCT-4及端粒酶mRNA表达RT-PCR检测.撤除饲养层,观察人胚胎干细胞体外分化情况.主要观察指标:①不同饲养层上人胚胎干细胞的生长状态比较.②人胚胎干细胞在不同比例混合饲养层上的生长状态比较.③混合饲养层上人胚胎干细胞未分化状态的检测.④体外分化实验.结果:①:生长在小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤维细胞上的人胚胎干细胞克隆扁平、不饱满,而生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞克隆饱满、厚实,其克隆形态显著好于其他两种饲养层.②:小鼠胚胎成纤维细胞:人包皮成纤维细胞按1∶1混合时,人胚胎干细胞显著堆积生长,克隆边缘清晰、隆起明显且饱满,按1:3混合时无明显变化,优于其余3种混合比例.③:碱性磷酸酶染色及OCT-4抗原表达均呈强阳性,分别在200～300 bp和300～400 bp处可见OCT-4和端粒酶mRNA表达的特异性条带.④:能形成拟胚体,贴壁后人胚胎干细胞可分化为多种形态的细胞.?＃结论:①与小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞常规饲养层相比,两者混合饲养层能够更好的支持人胚胎干细胞的体外传代培养,获得更佳的克隆形态.②小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞的混合比例为1∶1时效果较好.
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乳腺干细胞的体外培养及免疫磁珠法分离
目的:乳腺干细胞可以从正常乳腺腺体、良性或恶性乳腺肿瘤的瘤旁组织以及乳汁分离的乳腺上皮细胞中获得.实验选取乳腺癌旁正常组织,体外培养并利用免疫磁珠法分离出具有干细胞特性的乳腺细胞,拟进一步验证在成人乳腺组织中含有可为组织工程所用的种子细胞.方法:实验于2007-03/10在吉林大学公共卫生学院放射生物学教研室完成.①细胞来源:标本取材于吉林大学第一医院乳腺外科同期收治的20例女性乳腺癌患者手术切除的癌旁组织(> 3 cm),经病理证实为正常乳腺腺体,患者对治疗及实验均知情同意.②实验方法:去除乳腺腺体周围脂肪组织及毛细血管,剪碎成约为0.3 cm3的组织块,离心,去上清,I型胶原酶消化,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12基础培养基进行原代培养.2周后待细胞接近铺满整个培养瓶底部时,用胰蛋白酶 + D-HANKS液将贴壁细胞消化分离,按1∶2 或1∶3传代.利用免疫磁珠系统分离筛选乳腺成体干细胞.③实验评估:观察原代与传代培养的乳腺细胞生长特点,以及免疫磁珠分选后的乳腺干细胞形态、生长特性.采用免疫组化法对分选结果进行鉴定.结果:①体外培养的乳腺细胞生长特点:原代培养72 h后可见乳腺细胞贴壁,5 d后细胞呈纺锤形、多角形生长,10 d后细胞生长旺盛且排列紧密,随着培养时间的延长梭形细胞逐渐占据优势.传代后细胞增殖速度加快,细胞更加均匀有序的生长.②乳腺干细胞的形态特点及生长特性:分离出的人乳腺成体干细胞生长状态良好,呈类圆形,培养3 d后呈多角形分化生长.③分选结果免疫组化鉴定:免疫磁珠分选出的乳腺干细胞均表达上皮特异性抗原,而不表达唾液黏蛋白1.结论:成人乳腺组织中存在唾液黏蛋白1-上皮特异性抗原+且具有干细胞特性的乳腺细胞,利用免疫磁珠技术可成功地将其从人乳腺癌旁正常组织中分离出来.
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骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死后炎性细胞因子表达的调节
目的:近来研究表明,骨髓间充质干细胞具有独特的免疫调节特性,实验拟观察骨髓间充质干细胞移植对梗死心脏炎性细胞因子表达的影响,以进一步认识干细胞治疗心肌梗死的可能机制.方法:实验于2006-11/2007-08在中南大学湘雅二医院心内科实验室和实验动物中心完成.①实验材料:清洁级SD大鼠由中南大学湘雅二医院实验动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:提取体质量120～150 g SD大鼠骨髓间充质干细胞,以溴脱氧尿嘧啶核苷标记.取体质量180～200 g 雄性SD大鼠,结扎冠状动脉前降支建立心肌梗死模型,将模型随机分为3组:假手术组:仅穿线不接扎血管;PBS溶液注射组:模型制作成功即刻心外膜注射PBS液;干细胞移植组:模型制作成功即刻心外膜注射溴脱氧尿嘧啶核苷标记的骨髓间充质干细胞,每组8只.③实验评估:于术后1 ,28 d行心脏超声检测,测量大鼠射血分数、左室短轴缩短率和左室舒张末期直径以评价心脏功能,并进行免疫组织化学和western blot检测,分析移植细胞存活和炎性细胞因子的表达情况.结果:24只建模成功大鼠均进入结果分析.①术后28 d,心脏超声检测显示与注射PBS溶液相比,移植骨髓间充质干细胞可以延缓心室重构,改善心功能[射血分数:(30.76±3.39)%,(24.06±4.71)%,P < 0.05;左室短轴缩短率:(29.33±4.87)%,(23.05±3.94)%,P < 0.05;左室舒张末期直径:(6.45±0.47)mm,(7.81±0.31)mm,P < 0.05] .②免疫组织化学检测显示,心肌梗死后即刻心外膜移植的骨髓间充质干细胞可以在宿主体内存活.③与注射PBS溶液相比,骨髓间充质干细胞移植可以明显降低肿瘤坏死因子α、白细胞介素6表达(P < 0.05) ,同时增加白细胞介素10表达(P < 0.05) .western blot检测与免疫组织化学结果一致.结论:骨髓间充质干细胞移植可以延缓心肌梗死大鼠心室重构,同时下调大鼠梗死心脏促炎细胞因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素6表达,上调抗炎细胞因子白细胞介素10表达.
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骨髓单个核细胞移植治疗急性脊髓损伤
目的:研究已证实,各种干细胞移植治疗损伤脊髓,都可以一定程度的恢复脊髓中枢神经的功能.但对骨髓单个核细胞移植治疗损伤脊髓以及长期效果的研究少见.利用大鼠抽取新鲜分离的骨髓单个核细胞,将其移植入脊髓损伤大鼠模型,评价脊髓功能恢复情况、神经再生和新生血管形成及长期预后效果.方法:实验于2005-10/2006-04在上海第二医科大学发育生物学研究中心实验室完成.实验室级别:生物安全一级.①实验材料:8周龄SD雌性大鼠,体质量200～220 g,清洁级,由中国科学院实验动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:从大鼠胫骨及股骨采集骨髓细胞,密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞备用.制作大鼠脊髓损伤动物模型,将造模成功22只大鼠随机分成2组:模型+细胞组(n =11):脊髓完全横断T9～10后,椎管内注射骨髓单个核细胞;模型+DMEM组(n =11):脊髓完全横断T9～10后在损伤邻近区注射DMEM.假手术组(n =9):仅剪除T9-10棘突和椎板后,不损伤脊髓,逐层缝合.③实验评估:采用原位杂交和免疫组织化学技术检测移植细胞在宿主脊髓内的存活情况,BBB评分评估大鼠脊髓神经功能恢复情况.结果:①假手术组在术后各时间点观察中评分无明显差异,属评分正常.模型+DMEM组评分为0分,其脊髓功能无明显恢复.模型+细胞组在2,4,6,8周脊髓功能处于逐渐恢复的过程.与模型+DMEM组及假手术组比较,差异有显著性意义 (P < 0.01).②原位杂交和免疫组织化学检测显示,移植的细胞能在宿主体内存活,并嵌合到宿主脊髓组织表达血管标志.结论:骨髓单个核细胞移植后8周,不仅能够在损伤脊髓内存活,而且还能分化新生血管,促进脊髓功能的恢复.
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体外定向诱导鹿茸间充质干细胞向软骨细胞的分化
目的:间充质干细胞的诱导分化的研究多见于骨髓、脐血等组织,而在鹿茸组织中分离的间充质干细胞是否能诱导为软骨细胞目前尚不清楚.实验拟建立梅花鹿鹿茸生长中心间充质干细胞体外培养方法,观察转化生长因子β1体外诱导鹿茸间充质细胞分化为软骨细胞的可行性.方法:实验于2006-03/2007-06在吉林大学畜牧兽医学院基础兽医研究室完成.①实验材料:4岁龄健康雄性梅花鹿由中国农科院左家特产研究所提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:于生长早期锯取梅花鹿鹿茸,在解剖显微镜下定位和切取间质层(突起部),即为鹿茸间充质干细胞所在的组织层.Ⅰ型胶原酶消化法原代分离培养鹿茸生长中心间充质干细胞,锥虫蓝染色显示细胞活性达90%以上,将活性确定后的细胞液氮冻存.取第3代细胞,用含10%胎牛血清以及10 μg/L转化生长因子β1的条件培养基诱导培养.③实验评估:培养12 d 后于倒置显微镜下观察细胞形态,采用细胞化学及免疫细胞化学鉴定细胞.结果:①鹿茸生长中心间充质干细胞的分离与培养:Ⅰ型胶原酶消化法培养可以获得均一的间充质干细胞,贴壁的间充质干细胞形态均匀,呈长梭形,克隆样生长,增殖迅速.②转化生长因子β1体外定向诱导鹿茸间充质细胞分化为软骨细胞:转化生长因子β1诱导分化的鹿茸间充质细胞生长迅速,诱导后细胞形态明显改变,呈典型的软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原表达阳性.结论:采用酶消化法可以从鹿茸生长中心间充质层中分离出间充质干细胞,在体外转化生长因子β1具有促进鹿茸生长中心间充质干细胞分化为软骨细胞的能力.
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兔骨髓间充质干细胞体外培养向成骨和成脂方向的诱导分化
目的:骨髓间充质干细胞是存在于骨髓组织中多种干细胞的混和体,因其具有取材方便、扩增迅速、可自体移植并且具有多分化潜能等特点,是近年研究的热点.实验建立了体外分离、培养及鉴定兔骨髓间充质干细胞的方法,并通过此进一步验证其诱导成骨及成脂多向分化的潜能.方法: 实验于2006-08/2007-06在吉林大学药学院生物工程实验室完成, 实验室属吉林大学重点实验室.①实验材料:四五月龄新西兰大白兔2只, 由吉林大学基础医学院动物培养中心提供, 体质量1.0～1.5 kg, 雌雄不限, 实验动物级别为二级, 实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:实验应用了密度梯度离心法与贴壁培养法相结合的方法从兔股骨、胫骨中分离、纯化骨髓间充质干细胞并在体外进行培养,以形态学及细胞表面标志的方法鉴定间充质干细胞,在倒置显微镜下观察细胞的形态特征,并利用成骨诱导剂包括0.1 μmol/L的地塞米松、50 mg/L的维生素C、10 mmol/Lβ-磷酸甘油钠和成脂诱导剂含10%FBS的L-DMEM、0.25 μmol/L地塞米松、50 μmol/L吲哚美辛、0.5 mmol/L IBMX、10 mg/L牛胰岛素诱导其向软骨细胞及脂肪细胞分化.结果:①经原代及传代培养的骨髓间充质干细胞呈梭形,类似于成纤维细胞,骨髓间充质干细胞均一地表达CD29、CD44,而CD34、CD45均阴性表达.②成骨诱导14 d后细胞不明显,未形成钙结节,21 d后碱性磷酸酶钙钴法染色后大多数细胞的胞质呈棕黑色.③成脂诱导48 h后,细胞内有小脂滴出现,2周后脂滴数量增加并相互融合,细胞(有)由长梭形变为圆形或多边形,油红O染色显示有大量脂质沉积.结论:密度梯度离心法与贴壁培养法相结合的方法是比较理想的骨髓间充质干细胞培养法,骨髓间充质干细胞经诱导培养后具有多向分化潜能.
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MTT法检测黄芪和丹参对人乳腺干细胞体外增殖的影响
目的:文献报道黄芪和丹参均可诱导间质干细胞向神经细胞分化.实验以乳腺癌患者乳腺再生为终目的,通过MTT比色法分析不同剂量黄芪和丹参对体外分离培养的乳腺成体干细胞增殖的影响.方法:实验于2006-09/2007-09在吉林大学公共卫生学院放射生物实验室完成.①对象:女性非家族性乳腺癌癌旁病理证实为正常的乳腺组织取自吉林大学第一医院乳腺外科,共24例,患者年龄29～45岁,对治疗及实验均签署知情同意书.②实验方法:取切除的正常乳腺组织,去除血管及脂肪,剪碎至1.0 mm3块,组织块消化培养传代后应用免疫磁珠分离收集MUC-、ESA+标记的细胞,即乳腺成体干细胞,按1×108 L-1密度接种于96孔培养板,无血清培养48h后更换培养基,设立4组:空白对照组不加任何药物;黄芪注射液组分为25,50,100,200 mL/L 4个亚剂量;丹参注射液组分为12.5,25,50,100 mL/L 4个亚剂量;黄芪+丹参复合注射液组分为(25+12.5),(50+25),(100+50),(200+100)mL/L 4个亚剂量.③实验评估:各组加入对应药物后培养72 h,加入5 g/L MTT溶液20 μL,再加入二甲基亚砜振荡溶解,在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光度值,分析乳腺干细胞的增殖情况.结果:①乳腺细胞形态观察:乳腺组织原代培养后形成腺上皮细胞和肌上皮细胞.②乳腺干细胞增殖检测:黄芪注射液以 50 mL/L为界,剂量越小对乳腺成体干细胞的促增殖作用越强(P < 0.01),达200 mL/L时产生抑制作用(P < 0.05).丹参注射液剂量在12.5～100 mL/L范围内变动时,均能够促进乳腺成体干细胞的增殖(P > 0.05).黄芪与丹参复合注射液以(100+ 50)mL/L为界,复合剂量越小对乳腺成体干细胞的促增殖作用越强(P < 0.01),且复合用药效果好于单独用药,当剂量达到(200+100)mL/L时产生抑制作用(P < 0.05).结论:丹参和小剂量黄芪均可提高体外分离培养的乳腺干细胞增殖能力,且两药低剂量联合使用促增殖作用更为明显.
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电针任脉和肌肉注射碱性成纤维细胞生长因子对脑缺血模型大鼠侧脑室下区原位神经干细胞增殖的影响
目的:近来的研究认为,针刺任脉治疗脑卒中的机制在于针刺任脉可能产生与干细胞增殖分化有一些联系的生长因子.脑缺血损伤后调动内源性神经干细胞试图自我修复的途径应是多元化的,针刺及外源性生成因子的给予为其不同的途径.实验拟观察电针任脉和肌肉注射碱性成纤维细胞生长因子对脑缺血模型大鼠缺血侧脑室下区5-溴-2'-脱氧尿苷和5-溴-2'-脱氧尿苷/巢蛋白阳性细胞的表达的影响.方法:实验于2004-09/2005-07在中山大学医学院解剖学实验室完成.①材料:选用成年健康雄性Wistar大鼠83只.将实验动物按随机抽签法分为5组:空白对照组6只、假手术组6只、模型组26只、电针任脉组23只、碱性成纤维细胞生长因子组22只.后3组又分为缺血后7,14和28 d 3个时间点进行观察.②干预:除空白对照组和假手术组外,其余大鼠采用线栓法制作局灶性脑缺血模型.再灌注后参考Longa神经病学评分标准,1～4分为造模成功.空白对照组不作任何处理;假手术组仅分离右侧颈总动脉并离断右颈外动脉,不予栓塞.电针任脉组大鼠于造模后第2天采用上海华谊医用仪器厂生产的G6805Ⅱ型电针仪针刺承浆、气海、关元3穴,针刺后加电,疏密波刺激(疏波30 Hz,密波100 Hz),强度6～15 V,以身体相应部位出现轻微颤动为准,持续时间为20 min.碱性成纤维细胞生长因子组:再灌后立即给药,肌注碱性成纤维细胞生长因子4 000 U/d,此后每天肌注碱性成纤维细胞生长因子,1次/d.模型组、假手术组大鼠于造模后第2天固定于针刺操作台上20 min,不予针刺.空白对照组大鼠不作任何处理.③观察指标:通过免疫荧光方法测定侧脑室下区5-溴-2'-脱氧尿苷和5-溴-2'-脱氧尿苷/巢蛋白阳性细胞的表达.用Olympus FV 500激光共聚焦显微镜系统,在200倍镜下,计数平均5个视野阳性细胞数.结果:造模成功大鼠54只及空白对照组和模型组各6只进入结果分析.侧脑室5-溴-2'-脱氧尿苷阳性细胞数和5-溴-2'-脱氧尿苷/巢蛋白双标细胞:空白对照组与假手术组比较,差异无显著性意义(P > 0.05).模型组与空白对照组相比,均有不同程度的增加,其中造模后7和14 d差异有显著性意义(P < 0.01).电针任脉组和碱性成纤维细胞生长因子组造模后3个时间点与模型组比较,均有较大程度的增加,差异有显著性意义(P < 0.05～0.01).碱性成纤维细胞生长因子组与电针任脉组相比,差异无显著性意义(P > 0.05).结论:电针任脉和肌肉注射碱性成纤维细胞生长因子均可促进局灶性缺血模型大鼠原位神经干细胞增殖,且两者作用相当.
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补肾活血中药对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖的影响
背景:骨髓间充质干细胞因其获取容易、创伤微小、具有无限扩增和多分化潜能、自体移植不存在免疫排斥反应而受到医学研究者的青睐.目的:体外分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,观察不同浓度补肾活血中药含药血清对其增殖的影响.设计:完全随机对照的动物实验.单位:广州中医药大学第一附属医院髋中心.材料:选用健康雄性SD大鼠40只,SPF级,体质量170～180 g,由广州中医药大学实验动物中心提供.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.将实验动物按随机数字表分为4组,正常对照组和高、中、低剂量给药组,每组10只.方法:实验于2005-01/03在广州中医药大学实验动物中心完成.采用Percoll密度梯度离心法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养,建立大鼠骨髓间充质干细胞培养体系.高、中、低剂量给药组大鼠分别灌胃补肾活血中药4.4,2.2和1.1 g/kg,分别相当临床成人用量的20,10和5倍.正常对照组灌胃纯净水.连续给药1周.末次给药1 h后,无菌条件下,腹主动脉取血6 mL/只,2 000 r/min离心15 min,收集血清.高、中、低剂量给药组用10%大鼠含药血清代替10%的牛血清,正常对照组的培养基加入10%的血清.每天观察并记录细胞生长情况,绘制生长曲线.主要观察指标:①骨髓间充质干细胞的生长状况.②HE染色和吉姆萨染色观察骨髓间充质干细胞形态.③免疫细胞化学法检测骨髓间充质干细胞的抗原表达.④不同浓度含药血清对骨髓间充质干细胞生长情况的影响.结果:①骨髓间充质干细胞的生长状况:原代培养的骨髓细胞24 h后开始贴壁,7 d后可达80%融合.②骨髓间充质干细胞的一般形态:骨髓间充质干细胞的细胞多成长梭形或多角形,细胞体积小,胞核位于胞中或稍偏,核浆比略大.③髓间充质干细胞的抗原表达:单个核细胞的胞浆中有CD44表达,着蓝色,部分骨髓间充质干细胞表达c-Kit,在表型表达和细胞形态上具备骨髓间充质干细胞特征.④补肾活血中药对骨髓间充质干细胞生长曲线的影响:高、中、低剂量给药组在加入补肾活血中药血清3 d后,骨髓间充质干细胞数量比空白对照组明显增多,并与剂量呈正比.结论:补肾活血中药含药血清能促进骨髓间充质干细胞的体外增殖.
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通心络对大鼠胚胎神经干细胞源性神经细胞谱系的影响
目的:前期体内动物模型实验说明,通心络可能具有影响神经干细胞增殖及向各种神经细胞分化的作用.实验拟观察通心络对大鼠胚胎神经干细胞源性神经细胞谱系的影响以及时效、量效的关系.方法:实验于2007-06/10在南方医科大学机能学实验室完成.①实验材料:孕12～14 d SD大鼠由南方医科大学实验动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.通心络,主要成分为人参、水蛭、全蝎、土鳖虫、蜈蚣、蝉蜕、赤芍、冰片等,由石家庄以岭药业股份有限公司生产,国药准字Z19980015.通心络含药血清的制备:按大剂量组1 g/(d·kg)、小剂量组0.5 g/(d·kg)分别予大鼠通心络混悬液灌胃,7 d后抽血离心,吸取血清,过滤消毒,分装,-70 ℃冻存备用.②实验方法:自孕12～14 d大鼠胚胎中分离培养神经干细胞,取第3代细胞分别给予大、小剂量组通心络含药血清干预.以添加普通血清干预的为对照.③实验评估:于培养1,3,7 d通过免疫荧光染色观察各种类型神经细胞所占比例.结果:①神经干细胞经通心络含药血清干预后1 d,仅在大剂量组海马齿状回有极少数细胞呈BrdU(+)GFAP(+),其余细胞都呈BrdU(+)Nestin(+),小剂量组和对照组均为BrdU(+)Nestin(+)细胞.②经通心络含药血清干预后3d,大剂量组、小剂量组和对照组Nestin(+)、βtubulin(+)、GFAP(+)细胞比例差异有显著性意义(P < 0.01),GalC(+)细胞比例差异无统计学意义(P > 0.05).③大鼠胚胎神经干细胞经通心络含药血清干预后:各组Nestin(+)细胞比例先降后升;βtubulin(+)细胞比例大剂量组持续上升,小剂量组和对照组先升后降;GFAP(+)细胞比例大剂量组先升后降,小剂量组和对照组持续上升,GalC(+)细胞比例大、小剂量组均较平稳,对照组7 d时明显上升.结论:通心络有促进大鼠胚胎神经干细胞增殖及向神经元分化的效应,并存在时效、量效关系,剂量越大效应越明显及持久.
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三七总皂苷促进脑出血后侧脑室室管膜下神经干细胞的增殖和分化
目的:三七总皂苷可促进去大脑皮质血管后成年大鼠前脑侧脑室室管膜下层神经干细胞Nestin、PCNA和bFGF的表达,以及促进离体胎鼠皮质神经干细胞增殖、分化作用.实验拟采用胶原酶诱导大鼠脑出血模型和免疫组织化学染色法观察三七总皂甙对脑出血大鼠侧脑室室管膜下神经干细胞增殖和分化的作用.方法:实验于2002/2006年在北京中医药大学神经解剖学实验室完成.①实验材料:Wistar大鼠60只,雄性,清洁级,体质量220～250 g,由中国中医研究院实验动物中心提供,将大鼠随机分为正常组、模型组和给药组,20只/组,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.三七总皂苷血栓通注射液由内蒙古康源药业提供,批准文号:22-5802-内卫药准字(1999) 1787号,规格:5 mL:175 mg.②实验方法:采用胶原酶诱导大鼠脑出血模型,给药组术后腹腔内注射三七总皂苷35 mg,1次/d,模型组术后腹腔注射生理盐水,1次/d,正常组不作任何处理.③实验评估:采用免疫组织化学染色法和图像分析技术检测增殖细胞核抗原(PCNA)、β－Ⅲ型微管蛋白(Tuj-1)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)在室管膜下的表达.结果:60只大鼠均进入结果分析.脑出血后模型组同侧侧脑室内、外侧壁及背外侧角室管膜下区有增殖细胞核抗原、β－Ⅲ型微管蛋白、胶质原纤维酸性蛋白阳性细胞,给予三七总皂苷干预后,室管膜下细胞增殖细胞核抗原、胶质原纤维酸性蛋白、β－Ⅲ型微管蛋白阳性细胞数目和反应强度较模型组明显增强,差异具有显著性意义(P < 0.05, P < 0.01).结论:三七总皂苷具有促进脑出血后侧脑室背外侧角室管膜下区神经干细胞增殖、分化,并向病灶迁移,促进损伤修复的作用.
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靶基因调控的脐血干/祖细胞体外长期扩增与调控
背景:脐血干细胞是基因治疗理想的靶细胞之一,但基因转移率低下是目前面临的主要障碍.酪氨酸激酶JAK2在造血干/祖细胞自我更新中扮演着重要的作用,为了克服脐血基因转移率低下的障碍,根据基因调控表达技术原理,是否可开发一个可以靶向扩增JAK2基因修饰的脐血CD34+细胞体系.目的:探讨转基因JAK2介导的脐血干祖细胞长期扩增调控的可行性和安全性. 单位:卫生部北京医院血液科.材料:实验于2003-06/2006-04在卫生部北京医院血液科实验室完成.脐血取自健康、足月、自然分娩后立即断脐的脐血.脐血由北京医院妇产科提供,产妇及家属均知情同意,实验经医学伦理委员会批准.MiniMACS磁性分离仪、免疫磁珠吸附CD34单抗购自德国Miltenyi Biotec公司, 流式细胞仪购自美国FACScalibur,人重组干细胞因子、Flt3配体、人白介素-6、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、血小板生成素为PeproTec产品,SPF级裸鼠购自北京医科大学动物中心.方法:构建逆转录病毒载体MGI-F2JAK2,内含有JAK2基因的功能催化区和两个与小分子靶向基因合成药物(AP20187)结合的位点蛋白(2xF36v,F2)组成.AP20187可与F36v特异结合引起JAK2二聚化而激活细胞内信号传导.该载体同时含有绿色荧光蛋白报告基因,用作检测细胞增殖的标记.应用MiniMACS免疫磁珠分选系统纯化分离脐血CD34+ 细胞,用含JAK2的逆转录病毒上清转染脐血CD34+细胞.转导后的CD34+ 细胞在集落刺激因子、Flt3配体、血小板生成素、白介素-6细胞因子的联合培养条件下,以不加或加入AP20187分别作为对照组和实验组.主要观察指标:①应用流式细胞仪测定两组CD34+细胞中所含绿色荧光蛋白细胞的百分率,确定基因转移率.②扩增后的脐血祖细胞集落培养结果.③取培养10周的脐血CD34+细胞于裸鼠的胁部皮下注射,30 d后观察成瘤情况.结果:①实验组与对照组均可获得CD34+ 细胞大量扩增.随着培养时间的延长,实验组扩增的CD34+细胞GFP阳性率由基线水平逐渐上升于第11周时达到95%以上,而对照组绿色荧光蛋白报告基因阳性率逐渐下降到基线水平以下并逐渐消失.②实验组转基因CD34+ 细胞于12周后仍可产生造血祖细胞集落红系祖细胞、粒单系祖细胞、脐血多向造血祖细胞,所形成的造血祖细胞集落以粒单系祖细胞为主.③裸鼠实验无致瘤特性.结论:转染JAK2 基因的人脐血CD34+ 细胞协同其他细胞因子可以体外长期扩增脐血干祖细胞,对今后开展干细胞治疗某些遗传性血液病有潜在的应用价值.
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pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达
背景:骨髓间充质干细胞在体外易分离和扩增,还易于外源基因的转入及表达,在人类医学上被认为是一种理想的治疗性细胞和基因治疗中的靶细胞.目的:探讨脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染兔骨髓间充质干细胞及其基因的表达.设计:单一样本观察.单位:大连市干细胞与组织工程研发中心,大连医科大学基础医学院生化室.材料:实验于2006-03/2007-06在大连市干细胞与组织工程研发中心及大连医科大学基础医学院生化室完成.新西兰大白耳兔,5月龄,雌雄不拘,体质量2.0～2.5 kg.方法:以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板,用PCR方法获得目的基因片段,定向克隆至载体pMD19-T,限制性内切酶消化鉴定、基因测序后,构建pIRES2-AcGFP1-CD真核表达质粒.同时对兔骨髓间充质干细胞取材、培养、鉴定.真核表达质粒经酶切鉴定后,采用Lipofectamine 2000介导法转染经过鉴定的兔骨髓间充质干细胞.并于转染后24 h 在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达.主要观察指标:表达载体的构建及基因转染骨髓间充质干细胞鉴定.结果:实验克隆出胞嘧啶脱氨酶基因,并将其与带荧光的真核表达载体pIRES2-AcGFP1连接.经转染兔骨髓间充质干细胞24 h 后,在倒置荧光显微镜488 nm 蓝光激发下观察,pIRES2-AcGFP1-CD组和pIRES2-AcGFP1空载体组均可见细胞发出绿色荧光,未经转染的细胞未见发出绿色荧光,说明胞嘧啶脱氨酶基因成功转染了骨髓间充质干细胞.结论:骨髓间充质干细胞有望成为胞嘧啶脱氨酶基因治疗中的理想载体.
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膀胱匀浆上清液在大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为平滑肌样细胞中的作用
目的:环境因素对干细胞的分化起到重要的作用.实验拟观察经低浓度二甲亚枫进行预诱导后,大鼠骨髓间充质干细胞在体外经膀胱组织匀浆上清液诱导定向分化为平滑肌样细胞的可行性.方法:实验于2007-04/2007-09在河北医科大学解剖教研室下属细胞培养室完成.①实验材料:4～6周龄100～150 g健康清洁级SD大鼠1只,雌雄不限,8周龄220～250 gSD大鼠4只,由河北医科大学实验动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:采用骨髓干细胞培养基和贴壁法从SD大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞,并在体外扩增、传代.选择8周龄SD大鼠进行膀胱组织上清液的制备.取第4代骨髓间充质干细胞用1%二甲亚砜预诱导8 h后,应用膀胱匀浆上清液诱导7 d.以未进行诱导的骨髓间充质干细胞为阴性对照组.③实验评估:观察细胞形态学的变化,并运用免疫细胞化学检测特异性α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达.结果:骨髓间充质干细胞经诱导分化后,细胞呈梭形平滑肌样,融合后形成峰谷状排列,并表达平滑肌特异性蛋白标志物α-平滑肌肌动蛋白,诱导分化率为(45.6±3.5)%,与阴性对照组相比差异具有显著性意义(P < 0.05).结论:采用此方法成功诱导骨髓间充质干细胞分化为平滑肌样细胞.
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干细胞移植治疗肝病的研究现状
学术背景:常规的内科保肝治疗效果不佳,原位肝移植仍然是治疗终末期肝病有效的措施,但肝源缺乏、费用昂贵、移植排斥反应及长期应用免疫抑制剂引起并发症等成为限制其广泛应用的主要原因.干细胞移植有利于受损肝组织修复,能够代偿部分肝功能,已成为治疗肝病的一种新方法.目的:介绍干细胞移植治疗肝病的研究现状.检索策略:由该论文的研究人员应用计算机检索 Pubmed 2002-01/2007-12的相关文献,检索词"transplantation of stem cell,liver disease,hepatic disease",并限定文献语种为"English".同时计算机检索中国知识资源总库CNKI 2002-01/2007-12的相关文献,检索词"干细胞移植,肝病",并限定文献语种为中文.共检索到125篇文献,对资料进行初审,纳入标准:①文章内容与干细胞移植应用于肝病的治疗相关.②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章.排除标准:重复研究或Meta分析类文章.文献评价:文献的来源主要是通过对干细胞移植治疗肝病方面内容进行汇总分析,其中36篇相关度较高,对完全符合标准的30篇作为参考文献进行综述.进一步查找全文,2篇为综述,其余均为临床或基础实验研究.资料综合:①干细胞移植动物实验:采用不同方法建立肝损伤动物模型,对成模动物以不同途径进行不同种类的干细胞移植实验,移植后行肝脏组织学检查及检测转氨酶和白蛋白等肝功能指标,结果显示干细胞移植能够改善肝功能,修复肝脏组织结构,减轻肝脏损伤.②干细胞移植用于临床治疗:多项通过干细胞移植治疗终末期肝病和难治性肝病患者的研究表明,干细胞移植后患者症状缓解,肝功能和凝血功能明显好转,治疗时间缩短,改善预后,且无严重并发症出现.③干细胞移植相关并发症及其应用评价:行干细胞移植治疗肝病患者的临床研究,未经合理的多中心、大样本、随机对照实验设计,其治疗效果不确切,至今仍存在不同观点,且移植后可出现病毒感染及肝静脉梗阻等并发症,以及干细胞的致瘤性,均限制了其应用.结论:尽管目前多项干细胞移植用于治疗肝病患者的临床研究均已取得一些疗效,但有报道认为其对肝损伤无明显改善,且产生相关并发症,同时仍存在一定问题.因此需要合理设计,并进行随机对照来确证以往研究结果的可靠性,使其成为治疗肝病的一个安全有效措施,从而排除质疑,推进其临床应用.
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结直肠癌干细胞的研究与进展
学术背景:结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤,肿瘤干细胞理论为了解结直肠癌的发生发展机制提供了新思路.目的:综述结直肠癌干细胞的存在依据,来源及分离鉴定等研究进展.检索策略:应用计算机检索Pubmed1990-01/2007-07期间相关文章,检索词为"colorectal cancer,stem cell,tumor stem cells".同时检索维普数据库1990-01/2007-07期间相关文章,检索词为"结直肠癌,干细胞,肿瘤干细胞".对资料进行初审,并查看每篇文献及其引文.纳入标准:文章所述内容应与结直肠癌干细胞存在依据,来源及分离鉴定等研究进展相关.排除标准:重复性研究.共收集到63篇相关文献,33篇文献符合纳入标准,排除的30篇为内容陈旧或重复文献.文献评价:符合纳入标准的33篇文献中,28篇涉及结直肠癌干细胞的存在依据及来源,4篇涉及结直肠癌干细胞的分离鉴定,1篇涉及存在的问题与展望.资料综合:肿瘤干细胞是肿瘤组织中数量极少的、具有无限增殖和自我更新能力、导致肿瘤发生的细胞,它是肿瘤转移、复发及耐药的根源,也有望成为根治恶性肿瘤的新靶点.目前已在白血病和多种实体瘤中发现具有特殊表面标记的肿瘤干细胞,肠道干细胞本身为分化未成熟的细胞,因此,其细胞表型难以确定而不易鉴别,目前对其数量、定位、组织起源、功能以及和肠道疾病关系研究的相对较多.在结直肠癌中已经分离出以EpCAMhigh/CD44+为表型特征的肿瘤干细胞,进一步加速了人们对结直肠癌发生发展机制的认识.结论:结直肠癌干细胞的发现是人类认识恶性肿瘤发生发展机制的又一进步,肿瘤干细胞可能成为根治恶性肿瘤的为重要的新靶点,为人类战胜肿瘤带来了希望.
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造血干细胞移植与自身免疫性疾病
目的:认识造血干细胞移植治疗自身免疫性疾病的历史发展及其机制,讨论治疗过程中关于疗效和安全性的相关问题.方法:检索Pubmed数据库和中国期刊全文数据库文献,然后对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文.纳入标准:文章所述内容为造血干细胞移植治疗自身免疫性疾病的机制和应用研究;以近5年且发表在较权威杂志者优先.排除标准:重复研究或Meta分析类文章.结果:①造血干细胞移植早用于治疗血液恶性肿瘤,随着临床医学的发展,其适应证逐步扩展至血液系统疾病、自身免疫性疾病、实体瘤和基因缺陷疾病等.②目前认为造血干细胞移植治疗自身免疫性疾病的作用,主要是建立在大剂量免疫抑制剂对原有免疫系统的清除作用基础上造血干细胞移植后的免疫重建.③造血干细胞移植治疗自身免疫性疾病的疗效与安全性各不相同,与病种、病例的选择、预处理方案有关.结论:①造血干细胞移植治疗自身免疫性疾病尚未确定可获得长期安全稳定临床效应的佳移植方案.总体认为造血干细胞移植近期疗效显著,而远期疗效尚需多中心、多病例的临床研究和观察,以进一步探讨其安全性和有效性.②只有在真正实现移植后的免疫重建,控制移植后复发,终才能达到通过造血干细胞移植治愈自身免疫性疾病.
