中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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人外根鞘细胞体外培养及其增殖或抑制情况下米诺地尔浓度的选择
目的:观察钾通道开放剂米诺地尔在不同浓度下对体外培养人外根鞘细胞增殖活性的影响.方法:实验于2005-04/11在解放军第四军医大学西京医院烧伤实验室完成.①实验材料:所有毛囊标本均来自解放军第四军医大学西京医院美容整形术后,供体为健康成年男性,年龄28～49岁,局部头皮无秃发、感染及其他皮肤疾病,均对本实验知情同意.以同一供体的毛囊标本为一个批次,至少取3批以上标本进行培养.米诺地尔(Sigma公司,美国,批号M20001001).②实验方法:将头皮剪成0.3～0.5 cm宽的皮条,再将真皮层剪去少许,消毒后以Dispase酶消化过夜,16～18 h后揭去头皮表皮,拔出毛囊,使用无血清DMEM培养基清洗分离的毛囊.将毛囊置于胰酶+乙二胺四乙酸中消化8 min,血清中止消化后离心,再加无血清DMEM培养基洗涤,然后置于预先铺Ⅰ型胶原作基质的角质形成细胞无血清培养基中培养,至外根鞘细胞长出并接近融合时按1∶3传代.电子天平称取米诺地尔21 mg,加入角质形成细胞无血清培养基20 mL溶解,用稀释法分别配制成0,0.01,0.05,0.1,0.5,1.0 mmol/L 6个梯度浓度.③实验评估:取第2代外根鞘细胞,胰酶消化后计数,用相应培养基稀释成2×107L-1的细胞悬液,接种于96孔板.1 d后细胞贴壁生长,分别换用含有0,0.01,0.05,0.1,0.5,1.0 mmol/L的米诺地尔培养基,第4天加入四氮噻唑蓝在酶联免疫检测仪上检测吸光度值.结果:0,0.01,0.05,0.1,0.5,1.0 mmol/L米诺地尔吸光度值分别为0.501±0.019,0.774±0.038,0.819±0.040,0.418±0.040,0.329±0.026,0.220±0.031.结论:①角质形成细胞无血清培养基有助于人外根鞘细胞的生长和传代,是较合适的培养基.②0.01～0.05 mmol/L米诺地尔能够促进外根鞘细胞的增殖,而0.1 mmol/L以上浓度反而抑制其生长.
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树突状细胞CD80和CD86表达及胞外白细胞介素12分泌与不同剂量青藤碱干预的影响
背景:青藤碱是从抗风湿中药青风藤中分离提取的单体生物碱,具有抗炎、镇痛、免疫抑制等药理作用,该药用于治疗类风湿性关节炎等风湿性疾病具有较明确的疗效,在临床上得到了广泛的应用.树突状细胞是目前所知的机体内功能强的抗原提呈细胞.目的:观察不同剂量青藤碱对树突状细胞CD80和CD86表达及胞外白细胞介素12分泌的影响.设计:重复测量实验.单位:广东医学院药理教研室.材料:实验于2004-09/2005-05在解放军第三军医大学全军免疫学研究所完成.健康志愿者外周血由西南医院血库提供.青藤碱由湖南正清药业有限公司提供.RPMI1640培养基购于Hyclone公司,FITC标记的单克隆抗体CD60、CD86、鼠免疫球蛋白亚型IgG1均购于eBioscience公司,重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子,重组人白细胞介素4,肿瘤坏死因子α购于PE公司.人白细胞介素12 ELISA试剂盒购于法国Diaclone公司.方法:取健康志愿者外周血稀释,培养,按重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子1×106 U/L、重组人白细胞介素45×105U/L终浓度加入细胞因子,培养7 d后可获得树突状细胞.①将常规培养7 d后的树突状细胞调整细胞浓度为2×108L-1,加入6孔培养板,分别加入青藤碱使其终浓度为3,10,30 mg/L以及肿瘤坏死因子α使其终浓度为10μg/L,同时设对照组,于第9天分别收集悬浮细胞,每管取2×105细胞,用PBS洗涤2次,加入20μL FITC标记的CD80或CD86,对照管则加入鼠免疫球蛋白亚型IgG1,4℃避光孵育30 min,充分洗涤后,10 g/L多聚甲醛固定,将细胞悬液在流式细胞仪上进行分析.②将常规培养7 d后的树突状细胞调整细胞浓度为2×108L-1,加入6孔培养版,分别加入青藤碱使其终浓度为3,10,30 mg/L以及肿瘤坏死因子α使其终浓度为10μg/L,同时设对照组,继续培养48 h后,收集上清进行白细胞介素12测定.白细胞介素12的检测采用夹心ELISA法检测胞外的白细胞介素12分泌量,按试剂盒说明操作.主要观察指标:①不同剂量青藤碱对树突状细胞表面CD80及CD86表达的影响.②不同剂量青藤碱对树突状细胞分泌白细胞介素12的影响.结果:①树突状细胞表面CD80及CD86表达:不同剂量青藤碱组与对照组树突状细胞表面CD80分子阳性表达率及平均荧光强度差异无统计学意义(P＞0.05),各组细胞表面CD86分子阳性表达率及平均荧光强度差异亦无统计学意义(P＞0.05).②各组树突状细胞分泌白细胞介素12水平检测结果:由ELISA测量值可见,青藤碱小、中、大剂量组树突状细胞白细胞介素12水平分别为(863.1±33.7),(668.8±31.9),(512.6±29.6)ng/L,高于对照组[(922.2±36.6),P＜0.05-0.01],随青藤碱剂量增大,抑制树突状细胞分泌白细胞介素12水平呈依赖性减少.结论:青藤碱可剂量依赖性地抑制树突状细胞分泌白细胞介素12,而对树突状细胞表面CD80和CD83表达无明显影响;青藤碱的抗类风湿作用可能与其抑制树突状细胞分泌白细胞介素12有关.
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自身免疫性肝炎大鼠模型外周血淋巴细胞体外培养与褪黑素的影响
目的:观察褪黑素对体外培养淋巴细胞增殖及促进细胞因子分泌的作用.方法:实验于2004-10/2006-10在解放军第一二三医院南京军区肝病中心实验室完成.①实验材料:Wistar大鼠,雄性,3月龄,体质量(230±20)g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司.褪黑素:美国Sigma公司产品.②实验方法:采用弗氏完全佐剂加肝细胞特异性脂蛋白法建立自身免疫性肝炎大鼠模型.分别抽取正常大鼠及模型大鼠的外周血,实验室常规培养,并将其分为3组:褪黑素组培养基中加褪黑素使终浓度为2 mg/L;促肝细胞生长素组培养基中加促肝细胞生长素使终浓度为2 mg/L;空白对照组培养基中不加任何细胞分裂刺激剂.③实验评估:培养48 h后,对外周血淋巴细胞进行常规计数并采用液体闪烁计数仪记录1 min计数结果值.用于观察褪黑素与促肝细胞生长素促进外周血淋巴细胞增殖的效果.并检测培养上清液中的各细胞因子浓度,用于观察褪黑素与促肝细胞生长素促进外周血淋巴细胞分泌细胞因子的作用.结果:①褪黑素对正常大鼠外周血淋巴细胞有促进增殖作用,细胞数与1 min计数值较空白对照组明显升高(P＜0.05),促肝细胞生长素无促进外周血淋巴细胞增殖作用.②褪黑素对模型大鼠外周血淋巴细胞有促进增殖作用,细胞数与1 min计数值较空白对照组明显升高(P＜0.05),促肝细胞生长素无促进外周血淋巴细胞增殖作用.③在褪黑素作用下,正常大鼠Th1细胞因子IL-2和IFN-γ水平明显高于空白对照组和促肝细胞生长素组(P＜0.01),Th2细胞因子IL-6明显升高(P＜0.05),IL-4水平与空白对照组比较,差异不显著(P＞0.05),促肝细胞生长素组Th1和Th2细胞因子与空白对照组无明显差异(P＞0.05).④在褪黑素作用下,模型大鼠Th1细胞因子IL-2和IFN-y水平较空白对照和促肝细胞生长素组明显升高(P＜0.05),Th2细胞因子IL-4和IL-6水平与空白对照和促肝细胞生长素组无明显差异(P＞0.05).结论:褪黑素对自身免疫性肝炎大鼠外周血淋巴细胞有较强的刺激分裂作用.
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艾灸或针刺膈俞穴对环磷酰胺致白细胞减少大鼠诱生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的作用
目的:对比观察艾灸或针刺膈俞穴以及常规西药治疗对环磷酰胺所致骨髓造血抑制大鼠巨噬细胞诱生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的能力.方法:实验于2004-06/2005-12在贵阳中医学院完成.①实验材料:选取普通级Wistar大鼠60只,白细胞值(3.0～15.0)×109L-1,随机数字表法分为6组:空白组、模型组、西药组、针刺组、艾灸组、非穴位组,10只/组.②实验方法:除空白组外,其余5组均建立白细胞减少症低免疫力动物模型,以环磷酰胺40 mg/kg腹腔注射,1次/d,连续5 d,白细胞数值较长时间维持在1 50～2.95×109L-1水平为造模成功.西药组大鼠按每100 g体质量给予2.1 g/L利血生水溶液1 mL灌胃,自造模结束后第1天起,1次/d,连续11 d.针刺组将大鼠选取"膈俞"穴(在第7胸椎棘突下两旁肋间),用直径0.22 mm、长13 mm的毫针刺入约3 mm,然后接电子针疗仪,电流强度以使局部肌肉抽动为度,留针连续刺激15 min,自造模结束后第1天起,1次/d,连续11 d.艾灸组于"膈俞"穴上涂医用凡士林少许,制小艾炷(稍大于绿豆,重量约15 mg),直接放在"膈俞"穴上,用线香点燃,待艾炷燃至大鼠挣扎时用镊子夹去,每穴3壮,自造模结束后第1天起,1次/d,连续11次.非穴位组同法固定大鼠,针刺尾部任一非穴位点,自造模结束后第1天起,1次/d,连续11次.模型组造膜后仅抓取固定,但不治疗.空白组不经过任何处理.③实验评估:治疗第1,3,5,7,9,11天检测各组外周血白细胞数量.治疗第11天检测各组脾质量及脾脏指数,125I放射免疫试剂盒测定血清粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子含量.结果:①治疗后各组大鼠外周血白细胞数值的变化:与模型组比较,治疗第5天西药组、针刺组、艾灸组白细胞数量均明显回升(P＜0.001);其中艾灸组作用为显著,明显高于西药组(P＜0.05).治疗第9天艾灸组外周血白细胞数量与空白组基本接近(P＞0.05),第11天针刺组、西药组外周血白细胞数量与空白组基本相似(P＞0.05).②治疗后各组大鼠脾质量及脾脏指数的比较:与模型组比较,治疗第11天西药组、针刺组、艾灸组脾质量及脾脏指数均明显增加(P＜0.001或0.01),且艾灸组脾质量及脾脏指数已达正常水平,与空白组基本相似(P＞0.05);针刺组、西药组仍未达正常水平(P＜0.05).③治疗后各组大鼠血清粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子含量的变化:与模型组比较,治疗第11天西药组、针刺组、艾灸组血清粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子含量均明显增加(P＜0.001或0.01),与空白组基本相似(P＞0.05);且艾灸组升高作用强于针刺组和西药组(P＜0.05).结论:针刺或艾灸膈俞穴以及常规西药治疗均能回升外周血白细胞数量,增强化疗大鼠巨噬细胞诱生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的能力,尤以艾灸膈俞穴效果为佳.
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ABO血型主要不合的供者外周血造血干细胞采集
目的:应用血细胞分离机采集血型主要不合的供者外周血造血干细胞的效率,观察不去除红细胞进行造血干细胞移植的安全性.方法:实验于1998-10/2006-10在华中科技大学附属协和医院血液科完成.①实验对象:健康异基因造血干细胞供者23例,均与受者经HLA配型证实为全相合,亲缘性供者21例,中华骨髓库无血缘关系供者2例;供者为A型血、患者为O型血15例,供者为B型血、患者为O型血8例.23例受者中,急性淋巴细胞白血病患者9例,急性非淋巴细胞白血病患者8例,慢性粒细胞白血病患者5例,再生障碍性贫血患者1例.实验经医院伦理委员会批准,供、受者均知情同意.②实验方法:23例供者均在采集前5 d皮下注射粒细胞集落刺激因子5 μg/(kg·d)进行干细胞动员,至第5天供者外周血白细胞计数达20×109L-1、单个核细胞所占比例达10%以上时,应用Cobe Spectra血细胞分离机的自动外周血干细胞采集程序进行外周血造血干细胞采集,平均循环血量为9 210 mL,分离过程中平均采血速度为42 mL/min,每例供者均采集2次,共46次,采集时可静脉注射或口服10%葡萄糖酸钙,或采集前3 d口服钙片,一定程度上可预防低钙反应、麻木甚至抽搐等不良反应.23例受者每次输注干细胞采集物前给予相关干预措施以防止溶血反应及保护肾功能,每例受者均输注2次,共46次.③实验评估:供者采集完毕后留取标本检查有核细胞数、红细胞比容、CD34+细胞计数和细胞存活率锥虫蓝拒染情况.受者输注后注意观察生命体征、尿液颜色及是否有溶血相关不良反应等.结果:①供者外周血造血干细胞采集时不良反应:46例次的供者采集中,4例次(8.7%)出现复方枸椽酸钠相关低钙反应,表现为口周、四肢麻木感、胃肠道反应、胸闷、头昏等,经加大口服10%葡萄糖酸钙症状均得到控制,每例供者平均每次采集的补钙量为50 mL,多者补充80 mL;1例次(2.17%)出现血管迷走神经性面色苍白、出汗症状.②受者外周血造血干细胞输注时不良反应:每例供者采集物中的有核细胞数为(3.76±0.89)×108/kg,CD34+细胞计数为(3.23±0.89)×106/kg,采集物锥虫蓝拒染率均为100%,红细胞混入量即血红蛋白为(18±4)g/L,不去除红细胞,直接输给受者,23例受者46次输注后仅1例次出现较严重的溶血性输血反应,应用地塞米松、静脉滴注5%碳酸氢钠并加大输液量后症状逐渐减轻直至完全消失.所有患者造血功能均获得重建.结论:应用血细胞分离机采集ABO血型主要不合供者的外周血造血干细胞,回输时不去除采集物中的红细胞,可获得足够的干细胞数量并安全用于移植.
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大鼠白细胞介素10复制缺陷型重组腺病毒前体质粒的构建
目的:构建含有大鼠白细胞介素10基因的重组复制缺陷型腺病毒前体质粒pAd.rIL-10,为后续病毒构建、真核表达及其动物模型研究提供实验基础.方法:实验于2005-07/2006-04在中山大学附属第一医院普通外科实验室完成.①实验材料:SD大鼠购自中山大学动物实验中心(SCXK(粤)2004-0011).AdEasy系统由美国John Hopkins肿瘤研究中心惠赠.ThermoscriptTMRT kit和Trizol为InVitrogen产品;质粒小量提取试剂盒(QIAGENE公司);PCR试剂盒、限制性内切酶HindⅢ和SaⅡ、DNA marker(大连宝生物公司);限制性内切酶Pme Ⅰ(英国NEB公司).克隆大鼠白细胞介素10基因引物合成及测序由上海博亚生物技术有限公司完成.②实验方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法从健康SD大鼠脾脏新鲜组织中提取的总RNA中,克隆大鼠白细胞介素10基因,采用AdEasy-1腺病毒载体系统,经两步氯化钙法通过E.ColiBJ5183细菌内同源重组而获得重组腺病毒前体质粒pAd.rIL-10.③实验评估:使用PCR、酶切及DNA测序方法证实重组质粒中的目的基因.结果:①克隆大鼠白细胞介素10基因:用RT-PCR的方法从健康SD大鼠脾脏组织提取的总RNA中扩增出大鼠白细胞介素10基因,基因两端加上了限制酶酶切位点,均经测序证实.②重组腺病毒前体质粒pAd.rIL-10的鉴定:重组转移质粒pAdTrack-CMV.rIL-10及腺病毒前体质粒pAd.rIL-10均含大鼠白细胞介素10基因,经HindⅢ和SaⅡ双酶切后均获得538bp的大鼠白细胞介素10片段.结论:采用AdEasy-1系统经两步氯化钙法成功构建出大鼠白细胞介素10重组腺病毒前体质粒,方法简便易行,结果稳定可靠.
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不同体积分数血清对培养原代破骨细胞噬骨能力的影响
目的:改变培养液中血清的浓度,观察破骨细胞形态结构,并比较不同体积分数血清对培养的原代破骨细胞噬骨能力的影响.方法:实验于2007-03/06在沈阳医学院中心实验室完成.①实验材料:选取清洁级新生24 h Wistar大鼠6只;胎牛血清(天津灏洋);新鲜成年牛股骨皮质(市售).②实验过程:取新鲜成年牛股骨皮质,用磨片机磨成厚50μm的1 cm×1 cm骨片;取新生大鼠四肢长骨,分离破骨细胞,并用不同体积分数血清(分别为0,0.05,0.1,0.15,0.2,0.25)培养原代破骨细胞.③实验评估:第1,6天倒置显微镜下计数,第3天取细胞玻片观察细胞形态结构;扫描电镜观察不同体积分数血清培养的破骨细胞在牛骨皮质上产生骨陷凹面积的差异.结果:①破骨细胞的分离培养结果:分离培养的破骨细胞数量较少,体积大,胞浆丰满,细胞突起延展,细胞核呈圆形或椭圆形,积聚在细胞中央或排列在细胞周边.②不同体积分数血清培养液中骨片上吸收陷窝深度比较:随着培养液中血清体积分数的增加,骨片上陷窝深度逐渐增加,在培养液中血清体积分数为0.15时,骨片上陷窝深,此后随着培养基血清体积分数的增加,形成骨陷凹的深度无明显增加.结论:血清体积分数为0.15培养基培养的破骨细胞在牛皮质骨片上产生骨陷凹深,噬骨能力强.
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鸡胚胎素对小鼠红细胞数量及免疫器官质量的影响
目的:建立血虚和免疫抑制动物模型,观察鸡胚胎低温提取物对其红细胞造血以及免疫器官质量的影响.方法:实验于2001-04/2002-09在新乡医学院药物研究室完成.①实验材料:健康昆明种小鼠50只,雌雄各半.鸡胚胎素[中国发明专利公开(公告)号:CN1748713],符合研究者申报专利时提出的质量检验标准.②鸡胚胎素对血虚模型小鼠红细胞数值及血红蛋白含量的影响:取20只小鼠,随机排列表法分为鸡胚胎素组、模型对照组,10只/组,建立失血性血虚动物模型.失血后24 h当红细胞数＜3.2×1012 L-1、血红蛋白含量＜84 g/L,且小鼠外观出现皮色苍白、食欲不振等现象时,代表造模成功.次日,鸡胚胎素组给予鸡胚胎素5 g/(kg·d)灌胃,模型对照组给予生理盐水20 mL/(kg·d)灌胃,连续14 d.分别于失血前、失血后24 h、末次给鸡胚胎素后2 h尾部采血测定两组红细胞数量及血红蛋白含量的变化.③鸡胚胎素对免疫抑制模型小鼠免疫器官质量的影响:取30只小鼠,随机排列表法分为鸡胚胎素组、模型对照组、正常对照组,10只/组.鸡胚胎素组给予鸡胚胎素5 g/(kg·d)灌胃,模型对照组和正常对照组均灌服等量生理盐水,连续14 d.在第11天上午鸡胚胎素灌胃2 h后,鸡胚胎素组、模型对照组腹腔注射环磷酰胺60 mg/(kg·d),连续4 d,复制免疫抑制动物模型.末次给予环磷酰胺2 h后颈椎脱位法处死小鼠,计算胸腺、脾脏质量指数.结果:50只小鼠均进入结果分析.①失血前及失血后24 h鸡胚胎素组与模型对照组的红细胞数值、血红蛋白含量基本相似(P＞0.05).末次给鸡胚胎素后2 h与模型对照组比较,鸡胚胎素组红细胞数值、血红蛋白含量均明显升高(t=3.39,P＜0.01;t=2.52,P＜0.05).②末次给环磷酰胺2 h后与模型对照组比较,鸡胚胎素组、正常对照组的胸腺质量指数和脾脏质量指数均明显升高(t=6.62,P＜0.01;t=2.47,P＜0.05).结论:鸡胚胎素灌胃对血虚小鼠具有较好的促红细胞造血功能,同时对环磷酰胺造成的免疫器官质量下降具有明显的增重作用.
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共同培养骨髓基质干细胞对髓核细胞增殖分化的影响
目的:针对椎间盘退行性变的组织修复目前集中于细胞移植治疗,实验在体外联合培养条件下观察骨髓基质干细胞对髓核细胞增殖分化的影响.方法:实验于2005-12/2006-09在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室和同济医院卫生部重点实验室进行.①实验方法:4月龄健康新西兰大耳白兔3只,麻醉后于髂嵴处作骨髓腔穿刺,抽吸6 mL骨髓,分离骨髓基质干细胞;相同实验兔抽取骨髓后立即处死,取腰骶部脊柱之椎间盘,切开纤维环,取出髓核组织,分离椎间盘髓核细胞,同时设立单独髓核细胞培噜养组.②实验评估:在相同的培养条件下,定期观察两组髓核细胞在光镜下形态学变化及电镜下细胞超微结构的改变;于诱导培养7,14 d通过RT-PCR法、Western blot法和免疫组化法法检测两组髓核细胞Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的表达.结果:(①髓核细胞大体形态学及超微结构变化:髓核细胞与骨髓基质干细胞共同培养后,髓核细胞很快就呈现为圆形或多角形,且细胞形体变大、折光性好,贴壁时间早,数量增殖快,超微结构细胞表面可见许多短而粗的微绒毛突起,胞质内有大量扩张的粗面内质网、丰富的线粒体和高尔基体,细胞合成代谢旺盛.单独培养的髓核细胞胞体小,贴壁、增殖慢,细胞器不丰富.②髓核细胞Ⅱ型胶原蛋白与聚集蛋白聚糖检测结果:RT-PCR和Western blot检测显示诱导培养7,14 d骨髓基质干细胞与髓核细胞共同培养组的Ⅱ型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖条带均明显亮于单独髓核细胞培养组,吸光度值比较差异有显著性意义(P＜0.01).免疫组化检测显示骨髓基质干细胞与髓核细胞共同培养组中Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖在细胞胞浆中的表达随时间延长而逐渐增加,2周达到高峰,单独髓核细胞培养组中此两种蛋白表达很低,且培养第7,14天无明显变化.结论:骨髓基质干细胞在体外与髓核细胞共同培养时,能激活髓核细胞并促进其增殖分化,增加髓核细胞外基质的合成.提示骨髓基质干细胞与髓核细胞联合培养有利于退变椎间盘的髓核细胞修复、再生.
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复合诱导液诱导人脂肪基质细胞向神经元样细胞分化
目的:目前对脂肪基质细胞向神经元样细胞分化基本采用人工合成的化学诱导剂的方法进行诱导,其中部分组合试剂费用昂贵,不适合进行大规模基础和临床实验.因此以复合诱导液作替代,观察其能否在体外诱导人脂肪基质细胞向神经元样细胞方向分化.方法:实验于2004-10/2005-06在华北煤炭医学院中学实验室完成.①实验材料:腹部皮下的脂肪组织来源于30例自愿捐献者,年龄20～35岁,通过外科手术获得.复合诱导液的组成:alpha-MEM+BHA(200 μmol/L)+KCI(5 mmol/L)+丙戊酸钠(2 μmol/L)+IBMX(0.5 mmol/L)+氢化可的松(1 μmol/L)+胰岛素(5 mg/L)+乙醇(0.5%)+青霉素(100 U/mL)+链霉素(100 mg/L).②实验方法:离体的脂肪组织消化、离心、过滤,进行人脂肪基质细胞的原代培养.按8×103/cm2接种,消化传代.取第3代人脂肪基质细胞,接种到孔中预先放置无菌盖玻片的24孔培养板,细胞生长达50%～60%融合时,去除培养液,换为复合诱导液进行诱导;空白对照组培养液为DMEM/F12培养基.③实验评估:自加入诱导剂后在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况和形态变化,应用免疫细胞化学方法检测神经前体细胞的特异性标志神经巢蛋白、神经细胞的特异性标志神经元特异性烯醇化酶及微管联合蛋白2、神经胶质细胞的特异性标志胶质纤维酸性蛋白的表达.结果:①体外培养过程人脂肪基质细胞的形态学观察:刚分离接种的细胞呈圆形,悬浮状态.接种24 h内细胞大多已贴壁,呈梭形、圆形或多角形,有粗大突起,核居中,1～2个核仁.48 h后贴壁细胞开始分裂增殖,多呈梭形.1周后细胞融合成单层,排列出现方向性,但有少量圆形及卵圆形细胞混杂生长.②复合诱导液诱导脂肪基质细胞向神经元样细胞分化的形态学观察:人脂肪基质细胞胞体回缩,呈圆形或锥形,胞体周围具有较强的光晕,胞体有突起伸展,具有典型的神经细胞样形态.空白对照组形态无变化.③免疫细胞化学检测神经元样细胞的特异性标志的表达:诱导5 h后,人脂肪基质细胞神经巢蛋白阳性表达率为(21.8±2.6)%,神经元特异性烯醇化酶为(36.8±3.3)%,微管联合蛋白2为(92.0±10.5)%,胶质纤维酸性蛋白为(96.0±5.6)%.空白对照组细胞以上各指标表达均呈阴性.结论:复合诱导液可替代费用昂贵的人工合成的化学诱导剂,在体外成功诱导人脂肪基质细胞向神经元样细胞分化.
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胚胎源脊髓组织诱导骨髓间质干细胞向神经元样细胞的分化
背景:研究发现骨髓间质干细胞在体外专门的诱导体系中能产生类似神经元烯醇化酶克隆球样神经球结构,故骨髓间质干细胞成为中枢神经损伤修复种子细胞的热门候选.目的:观察体外分化体系诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的情况.设计:观察性实验.单位:深圳市第二人民医院脊柱外科.材料:选用孕16 d及2月龄的SD大鼠,由华中科大同济医学院动物中心提供.神经元烯醇化酶单抗、胶质纤维酸性蛋白多抗、神经中丝蛋白单抗均购自武汉博士德公司.方法:实验于2006-09在华中科技大学同济医学院基础医学部免疫室开放实验室及本院中心实验室完成.取大鼠下肢骨,离心分离鼠骨髓间质干细胞.提取孕16 d大鼠胚胎脊髓组织匀浆,制备诱导液,诱导骨髓间质干细胞的分化.另取胚胎肌组织同法制备肌组织匀浆作对照.主要观察指标:对诱导后骨髓间质干细胞进行形态学观察及用抗神经元烯醇化酶、NF200、抗胶质纤维酸性蛋白分别标记神经元,星形胶质细胞.反应阳性诱导细胞免疫组化染色后光镜下随机数取10个非重叠视野进行观察,计算神经元烯醇化酶和神经中丝蛋白阳性细胞占总细胞数的比例.结果:①大鼠骨髓间质干细胞在诱导后细胞形态变化:诱导早期光镜下即见部分细胞胞体回缩,突起变长,变细;逐渐出现分化细胞突起生长,并相互交织,类似神经细胞,有的分支类似树突状分枝,对照组细胞形态变化不大.②诱导1周后,骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化相关抗原表达情况:脊髓匀浆组多数细胞表现为神经元烯醇化酶和神经中丝蛋白阳性;少数细胞表达胶质纤维酸性蛋白,对照组无神经细胞抗体阳性染色出现.而对照组未见神经细胞抗原反应阳性.免疫组化发现分化细胞神经元烯醇化酶、神经中丝蛋白表达阳性率分别为(68±1.7)%,(76.2±2.9)%.结论:胚胎脊髓组织匀浆可诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞.
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应用干细胞分离仪分离脐血与传统手工分离法的效果比较
目的:脐血处理的关键问题是提高干细胞的回收率及实现处理过程的标准化和可重复化,实验对此进行探讨,比较干细胞分离仪与传统羟乙基淀粉手工法分离脐血的效果.方法:实验于2006-12/2007-05在广州医学院附属市一人民医院完成.①脐血来源:39份脐血采自广州医学院附属市一人命医院妇产科健康顺产新生儿脐带,产妇均知情同意.随机数字表法分为仪器分离组17份、手工分离组22份.②实验方法:仪器分离组收集脐血称质量,计算体积,在开始处理前20 min缓慢加入相当于20%脐血体积的60 g/L羟乙基淀粉.仪器分离组按仪器要求自动分离,分离终体积20 mL.手工分离组50 g离心5 min,压浆板压出全部血浆以及18 mL红细胞移至无菌空袋,500 g离心13 min,自动压浆板压出血浆,保留20 mL终体积样本.③实验评估:采用全自动计数仪进行检测有核细胞(白细胞)、红细胞数量.流式细胞仪分析CD34+含量.结果:采用干细胞分离仪处理浓缩脐血,有核细胞回收率为(89.7±3.4)%,CD34+细胞回收率为(98.8±5.1)%,红细胞去除率为(55.2±16.7)%,均比手工分离组分离效果好,差异有显著性意义(P＜0.05或0.01).同时,仪器分离组有核细胞回收率、CD34+细胞回收率的标准差均明显低于手工分离组(3.4 vs.15.3;5.1 vs.10.3).结论:相比传统的羟乙基淀粉手工分离法,干细胞分离仪脐血分离浓缩效果理想,且结果标准误小,数据稳定.
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应用胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液诱导胚胎干细胞的分化
目的:为克服类胚体和视黄酸诱导体系的不足,实验使用胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液定向诱导分化胚胎干细胞,观察是否可以获得大量具有高度增殖和进一步分化能力的神经干/祖细胞.方法:实验于2005-06/2006-09在中山大学干细胞与组织工程中心实验室完成.①取孕12.5d的C57BL/6J小鼠胚胎脑组织,放入含有神经干细胞培养液(含B27、肝素5 mg/L、碱性成纤维细胞生长因子20 μg/L、表皮生长因子20 μg/L、100 U/mL青霉素、0.1 g/L链霉素的DMEM/F12)的离心管内,接种后37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中饱和湿度培养.3～5 d后可见团状细胞球出现,即为原代的神经干细胞.取P5～10代神经干细胞消化成单细胞悬液,以5×104/cm2密度接种于神经干细胞培养液中,4～5 d离心后收集上清液,即为胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液.②P30代SC1002鼠胚胎干细胞消化成单个细胞后,移入上述制备的条件培养液中,5 d后消化细胞,再重新接种于条件培养液中培养5 d.常规消化后接种于神经干细胞培养液中,培养4～5 d,即得到胚胎干细胞来源的神经干/祖细胞.对照组用神经干细胞培养液代替条件培养液.③所得细胞进行特异性抗原免疫细胞化学染色,并计数免疫染色阳性细胞率.RT-PCR检测标志性基因的表达.结果:①胚胎干细胞分化为神经干/祖细胞的比例:当消化成单个细胞的胚胎干细胞接种到神经干细胞条件培养液后,24 h内聚集成细胞球并悬浮生长.免疫细胞化学检测少部分细胞表达nestin,在随后的培养过程中nestin阳性细胞逐渐增多.第4天细胞球周围的细胞几乎全部呈nestin阳性.当消化后重新接种于神经干细胞条件培养液中,可见部分细胞贴壁生长,10 d后再常规消化接种于神经干细胞培养液中,呈典型的双极外形,nestin及RC2检测均呈阳性.RT-PCR检测显示Oct-4不再表达,而sox2,sox3,nestin,fabp7及bHLH转录因子均有显著表达.另一方面,当单个胚胎干细胞直接培养在神经干细胞培养液中,大量细胞死亡,仅10%存活,存活细胞表达Oct-4和nestin.②胚胎干细胞来源的神经干/祖细胞向神经元和胶质细胞的分化:经过10～12 d的诱导分化,微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白细胞阳性率分别为(27.6±9.2)%和(29.7±11.6)%.结论:不需要共培养或添加诱导因子,应用胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液成功地将胚胎干细胞定向诱导分化为大量高纯度的神经前体细胞,并进一步得到神经元和神经胶质细胞.
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成人自体血清体外扩增培养骨髓间充质干细胞的生物学特性分析
目的:为避免种子细胞培养过程中应用异体或异种血清的排斥及伦理问题,制备成人自体血清体外扩增培养骨髓间充质干细胞,观察其增殖及生长特征.方法:实验于2005-01/2006-01在北华大学医学院细胞生物实验室完成.①细胞来源:选取北华大学医学院附属医院收治的行骨髓干细胞保健治疗的成年志愿者3名,25～30岁,对本实验均知情同意.②实验方法:空腹无菌采集志愿者外周静脉血40 mL,4℃静置4 h,37℃静置4 h,500 g离心30 min,吸取上清,即自体血清.从骨髓血中提取间充质干细胞,利用DMEM/F12培养基添加自体血清进行黏附培养和扩增.原代记为P1,按1:3进行传代接种,第2代记为P2,以此类推.每次传代培养的细胞接种密度严格控制与原代培养接种密度相同的水平.③实验评估:倒置光学显微镜下观察骨髓间充质干细胞生长和形态变化,计数和MTT法观察原代和传代培养的增殖及生长特征,免疫组化法分析骨髓间充质干细胞纯度.结果:①原代及传代培养的成人骨髓间充质干细胞的光镜观察:原代培养24 h后可见贴壁细胞,部分细胞有伪足伸展,第3天换液时有散在克隆生长,第5天呈克隆式增殖,10～12 d可达90%细胞融合,基本铺满孔底面,呈骨髓间充质干细胞特征性的旋涡状生长,排列有方向性,旋涡中心细胞呈多层分布,细胞界限不清,细胞形态多呈梭形.传代细胞的生长较原代快,4 h内即发现有贴壁细胞,24 h内完全贴壁并伸展,第6～8天即可达到80%以上融合.②成人骨髓间充质干细胞的生长曲线分析:原代接种后2～6 d为生长潜伏期,第7天开始形成大小不一的多个细胞克隆,至第9天细胞克隆进一步扩大,细胞数目呈指数级递增,为对数增殖期;第10～12天细胞生长进入平台期,原代培养结束.传至5代内的细胞生长旺盛,生长特性基本与第1代一致.③成人骨髓间充质干细胞免疫组化鉴定结果:P0、P1、P3、P5代细胞CD34染色呈阴性,而CD105染色阳性细胞在95%以上.结论:以自体血清体外扩增培养的骨髓间充质干细胞纯度高、增殖活性强,且至少在5代内生长旺盛并维持其生物特性.
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成人骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学特性
目的:观察成人骨髓间充质干细胞体外分离培养方法及其生物学特性,为骨髓间充质干细胞的临床应用奠定技术基础.方法:实验于2005-12在吉林省四平市中心医院中心实验室进行.实验材料:人骨髓间充质干细胞,Ficoll淋巴细胞分离液,胎牛血清,牛血清白蛋白,α-MEM培养基,胰蛋白酶,FITC标记的CD44和CD90.实验方法:①人骨髓间充质干细胞的分离与培养:采集成人骨髓,密度梯度法分离单个核细胞,条件培养基培养和扩增,倒置光学显微镜下观察细胞形态及生长情况.②人骨髓间充质干细胞生长曲线的测定:取生长良好的P1,P5,P10细胞,用胰酶消化,接种于24孔板培养,每天各取3孔消化计数细胞,取平均值,连续培养7 d,绘制生长曲线.③人骨髓间充质干细胞表面标志的测定:取生长良好P5细胞进行免疫荧光染色鉴定(CD44,CD90并设同型对照).④人骨髓间充质干细胞的冻存及复苏:收集生长良好细胞,计数细胞密度及冻前存活率.将细胞加入到细胞冻存液中液氮冷冻保存.30 d后复苏细胞,每日倒置光学显微镜下观察细胞生长状况.结果:①倒置显微镜下观察细胞形态:倒置显微镜下观察细胞呈纤维形,漩涡状生长.②人骨髓间充质干细胞的生长曲线分析:传代的细胞生长较原代要快,从第10代开始细胞生长开始出现缓慢征象.③细胞表面标记检测结果:免疫荧光染色后细胞膜着色明显,CD44,CD90阳性率均大于90%.④细胞冻存及复苏生长特性分析:椎虫蓝计数细胞存活率90%以上,增殖能力强,和未冻存过的传代细胞具有同样的生长特性.结论:应用密度梯度法分离法能获得较高纯度的骨髓间充质干细胞,能在体外长期培养,在传代培养5代内生长旺盛且生物学特性稳定.
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骨髓基质干细胞移植对正常和心肌梗死大鼠心电图及心功能的影响
目的:骨髓基质干细胞移植到心肌梗死的瘢痕心肌组织中可以改善心功能,但以心电图为观察指标的研究不多.实验观察骨髓基质干细胞移植对正常和心肌梗死大鼠心电图及心功能的影响.方法:实验于2004-01/2005-03在哈尔滨医科大学完成.①实验动物:选取4周龄雄性Wistar大鼠80只,随机数字表法分为梗死移植组、正常移植组、梗死非移植组、正常非移植组,20只/组.另选取7 d龄Wistar雄鼠30只作为骨髓基质干细胞的来源.②实验方法:采用密度梯度离心法获取鼠骨髓基质干细胞,配成1×109L-1的细胞悬液,使用5-氮胞苷体外诱导培养3～4周,移植前24～48 h行Brdu标记.取载有细胞的盖玻片,测定钙释放时将20 mmol/L的caffeine快速加在细胞表面.梗死移植组、梗死非移植组大鼠建立心肌梗死模型.造模4周后,梗死移植组将0.25 mL诱导的骨髓基质干细胞悬液注射至大鼠心肌梗死后的瘢痕组织,正常移植组同法将骨髓基质干细胞悬液注射至正常心肌组织,梗死非移植组、正常非移植组注射等量不含骨髓基质干细胞的培养液基质.③实验评估:观察骨髓基质干细胞的诱导分化情况及其植入后在瘢痕心肌组织中的生存状态.测定细胞内钙离子浓度.记录术前、冠脉结扎后即刻/细胞移植即刻、术后4周的心电图变化.检测术后4周的超声和血流动力学指标变化.结果:80只大鼠均进入结果分析.①骨髓基质干细胞的诱导分化及其植入后的生存状态:5-氮胞苷诱导3周后,骨髓基质干细胞表达肌钙蛋白Ⅰ和肌凝蛋白重链,细胞内有丰富的肌丝和Z线,细胞器较多.植入4周后在心肌瘢痕组织中分化为心肌细胞.②细胞内钙离子浓度:两组细胞在caffeine刺激下钙离子的释放均呈波峰状,但诱导组应用caffeine后钙离子浓度降低且低于基础状态,钙释放受到抑制,未诱导组不受影响.③心电图观察:与术前比较,梗死移植组QRS波变窄,R波降支出现正常顿挫波,未见显著心律失常.④超声检测及血流动力学分析:术后4周,与梗死非移植组比较,梗死移植组左室收缩末压、左室射血分数和压力变化速率大值均显著升高(P＜0.05或0.01).结论:骨髓基质干细胞体外诱导后能分化为心肌样细胞,植入到瘢痕心肌组织中生存、增殖良好,可改善心电图及心肌弹性,从而改善心肌梗死大鼠的心功能.
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小鼠胎盘间充质干细胞的生物学特性
目的:胎盘中包含大量能够自我更新、具有多向分化潜能的细胞,其低免疫原性几乎不引起移植物抗宿主反应疾病.观察体外培养的小鼠胎盘来源间充质干细胞的生物学特性.方法:实验于2006-01/11在首都医科大学组织胚胎学教研室实验室(国家中医药管理局三级实验室)完成.①实验方法:孕10 d ICR小鼠100只,取出子宫收集胎盘实体组织,经0.1%Ⅳ型胶原酶消化获得细胞,以3×106接种于25 cm2培养瓶中,加入含体积分数0.1胎牛血清、200 U/mL青链霉素的高糖DMEM培养基进行体外培养.②实验评估:每天在倒置显微镜下观察细胞形态;MTT检测细胞生长状况,记录生长曲线;流式细胞术分析细胞周期;免疫细胞化学方法分析胎盘间充质干细胞的免疫表型表达.结果:①小鼠胎盘间充质干细胞的形态学特征:原代培养初期仅有少量细胞贴壁,3 d后贴壁细胞逐渐增多,培养过程中细胞呈梭形,散在、集落式分布,细胞集落随着增殖而逐渐融合.②小鼠胎盘间充质干细胞的生长特性:接种3 d后细胞增殖速度加快,随后保持稳定增殖速度,第9天速度大幅增长达峰值,10 d后进入平台期.G0/G1期、S期、G2期的比例分别为64.4%,25.2%,10.4%.③小鼠胎盘间充质干细胞免疫表型检测:原代培养的小鼠胎盘间充质干细胞CD105、CD44、波形蛋白均呈阳性表达.结论:小鼠胎盘来源的间充质干细胞可成功在体外培养并大量扩增,生物学性状稳定,是组织工程优良的种子细胞来源之一.
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富集自体骨髓间质干细胞复合羟基磷灰石/磷酸三钙植骨材料在脊柱融合中的应用
目的:探索通过自体骨髓富集的间质干细胞复合羟基磷灰石/磷酸三钙作为植骨材料进行脊柱融合的新方法.方法:①观察对象:选择2005-01/2006-02建湖县人民医院骨科收治的胸腰椎骨折均采用后路椎弓根钉系统复位及固定患者48例.②实验分组:根据植骨融合材料不同随机分为2组,干细胞+复合材料组24例,男13例,女11例;年龄25～49岁.自体髂骨移植组24例,男15例,女9例;年龄26～50岁.③实验干预:采自体骨髓通过密度梯度离心得到富集的间质干细胞悬液与羟基磷灰石磷酸三钙复合2 h后作为植骨材料.干细胞+复合材料组采用骨髓间质干细胞复合羟基磷灰石磷酸三钙移植;自体髂骨移植组采用自体髂骨移植.④实验评估:对所有患者脊柱融合情况、临床疗效、伤椎复位后高度丢失等进行比较分析,评定脊柱融合效果.结果:术后随访12个月,48例患者全部进入结果分析.①骨髓富集的有效性:富集前后骨髓间质细胞浓度达到8倍.②临床疗效:干细胞+复合材料组所有病例取髓处疼痛术后1周消失,均未发生感染.自体髂骨移植组术后3个月取骨处仍有疼痛.所有病例无感染和内固定松动断裂等并发症.两组术后12个月LBOS评分优良率干细胞+复合材料组71%(17/24),自体髂骨移植组79%(19/24).③脊柱融合情况:术后随访6个月以上的患者X射线、CT检查均示有良好的脊柱融合,两组在术后3个月移植物密度降低并可见双侧薄层融合块,术后6个月双侧可见整块新生骨或单侧大块新生骨.按Lenke字母分级法融合分级,两组均无C、D级融合.(④Cobb角测量结果:伤椎复位后高度丢失干细胞+复合材料组平均为2.38°,自体髂骨移植组平均为2.42°.结论:通过自体骨髓富集的间质干细胞复合羟基磷灰石磷酸三钙应用于胸腰椎骨折后外侧融合可取得与自体髂骨移植同等的临床疗效,是一种安全可靠,简便有效的植骨替代材料.
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急性心肌梗死后CD34+干细胞自体动员的意义
目的:已有理论提出急性心肌梗死后骨髓和外周血中的CD34+干细胞具有自身动员的潜能,观察这一潜能的变化特征及其对心肌梗死组织再生能力的影响.方法:实验于2004-09/2005-02在阜外心血管病医院完成.①实验动物:雄性SD大鼠40只,随机数字表法分为心肌梗死组、假手术组,20只/组.②实验方法:心肌梗死组大鼠采用冠状动脉结扎法建立心肌梗死模型.心电图ST段抬高或有室性心律出现,前壁心肌呈苍白色为造模成功.假手术组仅作开胸手术,前降支不予结扎.③实验评估:于心肌梗死后3,7,14,28 d,流式细胞仪检测骨髓和外周血中CD34+干细胞的含量.用免疫组化方法检测梗死心肌组织中的Ki67细胞和毛细血管数量.结果:①外周血及骨髓CD34+干细胞含量的变化:心肌梗死组外周血中的CD34+干细胞数量于造模后3 d开始上升,7 d后明显高于假手术组(P＜0.01),至14,28 d时逐渐回落至假手术组水平(P＞0.05).心肌梗死组骨髓中的CD34+干细胞数量于造模后各时间点始终无明显变化(P＞0.05).②组织学评定:心肌梗死组梗死区Ki67细胞和毛细血管数量于造模后3 d开始增多,7 d时明显多于非梗死区(P＜0.05);至14,28 d梗死区Ki67细胞数量明显少于造模后7 d(P＜0.05),毛细血管数量的减少不明显(P＞0.05).免疫组化染色显示少数Ki67细胞分化为血管内皮细胞,未见向心肌细胞分化.③相关性分析:梗死区Ki67细胞、毛细血管数量于造模后7 d与外周血中CD34+干细胞数量呈显著正相关(r=0.913,P=0.021;r=0.887,P=0.035).结论:机体CD34+干细胞的自体动员、增殖反应的潜能随急性心肌梗死时间的延长而逐渐减弱,自体动员的干细胞功能尚不足以达到修复梗死心肌组织的效果.
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美托洛尔对小型猪缺血再灌注损伤后移植内皮祖细胞的保护效应
目的:观察美托洛尔对小型猪骨髓内皮祖细胞作用的有效剂量和对缺血再灌注损伤后移植内皮祖细胞的保护作用.方法:实验于2004-12/2005-07在解放军第四军医大学放射医学教研室完成.①选用健康雄性中国小型猪6只,抽取骨髓细胞,经密度梯度离心法分离,差速贴壁纯化,诱导生成猪内皮祖细胞,用荧光双标、激光共聚焦法进行生物学标志物的鉴定.②将内皮祖细胞设立1×10-3mol/L,1×10-4mol/L,1×10-5mol/L,1×10-6 mol/L,1×10-7mol/L的美托洛尔组,观察美托洛尔对内皮祖细胞作用的有效剂量.③另设立美托洛尔预处理后缺血再灌注损伤组、缺血再灌注损伤后加美托洛尔组、美托洛尔处理组、缺血再灌注损伤组和正常对照组.用光镜和四甲基偶氮唑盐法观察细胞生长情况;用生化法测定乳酸脱氢酶和一氧化氮合酶的活性,观察内皮祖细胞的分泌功能;用流式细胞仪检测内皮祖细胞凋亡情况;应用Western Blotting法测定内皮祖细胞表面Flk-1的表达.结果:①经5个不同剂量组筛查,显示1×10-6mol/L的美托洛尔对内皮祖细胞的增殖作用强.②美托洛尔能上调内皮祖细胞表面Flk-1的表达水平.③美托洛尔预处理后缺血再灌注损伤组内皮祖细胞的凋亡率低于缺血再灌注损伤组和缺血再灌注损伤后加美托洛尔组(6.8%,13.9%,7.4%,P＜0.05),但高于正常对照组和美托洛尔组(3.7%,2.3%;P＜0.05).④美托洛尔预处理后缺血再灌注损伤组细胞的乳酸脱氢酶、诱导型一氧化氮合酶活性低于缺血再灌注损伤组和缺血再灌注损伤后加美托洛尔组(P＜0.05),但高于正常对照组和美托洛尔组(P＜0.05).结论:美托洛尔促进内皮祖细胞增殖的有效剂量是1×10-6mol/L;美托洛尔可能通过上调内皮祖细胞的FIK-1水平,减少内皮祖细胞凋亡及有害的诱导型一氧化氮合酶生成,促进细胞增殖能力等细胞功能的恢复.
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乙交酯-丙交酯共聚物-细胞复合体移植治疗脊髓损伤
目的:观察神经干细胞、许旺细胞和组织工程支架材料乙交酯-丙交酯共聚物于大鼠髓内共移植后的生物相容性,及其对大鼠损伤脊髓形态和功能的修复作用.方法:实验于2005-05/2006-09在首都医科大学附属北京市神经外科研究所损伤修复实验室完成.①实验材料:健康成年雌性Wistar大鼠36只,随机数字表法分为单纯支架组、神经干细胞+支架复合体组、神经干细胞+许旺细胞+支架复合体组,12只/组.乙交酯-丙交酯共聚物由中科院化学研究所医用高分子材料中心提供.②实验方法:各组大鼠均建立脊髓T9半横断损伤模型.神经干细胞+许旺细胞+支架复合体组取2×1010L-1的许旺细胞、神经干细胞各10μL接种于乙交酯-丙交酯共聚物支架内,神经干细胞+支架复合体组取2×1010L-1的神经干细胞10μL接种于乙交酯-丙交酯共聚物支架内,单纯支架组取10μL DMEM培养液置于乙交酯-丙交酯共聚物支架内,于脊髓缺损处分别植入对应的复合物.③实验评估:应用电镜观察乙交酯-丙交酯共聚物支架的降解及轴突的再生状况;应用BBB评分和电生理技术检测大鼠脊髓功能性的恢复情况.结果:36只Wistar大鼠均进入结果分析.①行为学观察结果:移植术后4,12周,神经干细胞+支架复合体组、神经干细胞+许旺细胞+支架复合体组大鼠的后肢运动功能BBB评分均好于单纯支架组(P＜0.01),其中神经干细胞+许旺细胞+支架复合体组尤为明显.②神经电生理检查结果:在脊髓半横断损伤后即刻,所有动物的体感诱发电位和运动诱发电位波幅都明显减低甚至消失.移植术后4周,神经干细胞+支架复合体组、神经干细胞+许旺细胞+支架复合体组大鼠的体感诱发电位和运动诱发电位波幅均有所恢复;至移植术后12周恢复明显.单纯支架组移植术后4,12周体感诱发电位和运动诱发电位波幅无明显变化.③电镜观察结果:扫描电镜下,随着时间的延长各组植入的乙交酯-丙交酯共聚物逐渐降解.透射电镜下,各组植入材料正中横断面可见新生的无髓及有髓神经纤维,至12周时神经干细胞+许旺细胞+支架复合体组明显.结论:乙交酯-丙交酯共聚物在大鼠损伤的脊髓内具有良好的生物相容性;其与神经干细胞、许旺细胞共移植能够明显促进脊髓半横断损伤大鼠的脊髓轴突再生,并改善肢体的运动功能.
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表皮干细胞临床应用现状
目的:干细胞的研究已成为世界高新技术的亮点,势必导致一场医学和生物学革命.文章对干细胞研究现状及表皮干细胞临床应用进展作一综述.资料来源:应用计算机检索PUBMED 1996-01/2007-01期间的相关文章,检索词为"stem cell",并限定文章语言种类为English.同时计算机检索中国期刊全文数据库1996-01/2007-01期间的相关文章,检索词为"表皮干细胞,临床",并限定文章语言种类为中文.资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文.纳入标准:文章所述内容应与表皮干细胞临床临床应用研究相关.排除标准:重复研究.资料提炼:共收集到86篇相关文献,35篇文献符合纳入标准,排除的51篇文献为内容陈旧或重复.资料综合:干细胞具有多向分化潜能和自我复制功能,可分化成不同的组织和器官,包括全能干细胞、胚胎干细胞、多能干细胞.皮肤干细胞在维持内环境稳定以及伤口修复中起关键作用,具有慢周期性和自我增殖能力的细胞,其正常增殖分化是维持皮肤正常组织结构和细胞内环境稳定的基本要求.表皮干细胞来源于胚胎的外胚层,毛囊上半部的隆起处数量众多,在缺乏毛发的手掌等处位于表皮的基地层.表皮干细胞具有双向分化的能力,一方面可向下迁移分化为表皮基底层,进而生成毛囊;另一方面可向上迁移并终分化为各种表皮细胞.结论:表皮干细胞来源于外胚层,将其按组织工程原理构建皮肤,用于严重创伤、大面积烧伤以及整形术后的创面覆盖,已成为解决临床治疗中皮源缺乏问题的根本途径.
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间充质干细胞的免疫调节作用
目的:间充质干细胞因具有多向分化潜能及植入体内无排斥反应等特性而被广泛应用于医学领域.文章就间充质干细胞的生物学特性、免疫原性、免疫调节作用及其应用进行综述.资料来源:应用计算机检索PUBMED 1994-02/2007-03期间的相关文章,检索词为"mesenchymal stem cell,immune",并限定文章语言种类为English.同时计算机检索中国期刊全文数据库2004-01/2007-02期间的相关文章,检索词为"间充质干细胞,免疫",并限定文章语言种类为中文.资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文.纳入标准:文章所述内容应与间充质干细胞的免疫调节研究相关.排除标准:重复研究.资料提炼:共收集到152篇相关文献,56篇文献符合纳入标准,排除的96篇文献为内容陈旧或重复.文章选择符合纳入标准的31篇文献,分别涉及间充质干细胞的生物学特性、免疫原性、免疫调节作用(抑制T细胞的增殖、移植物和宿主的免疫反应)及应用等内容.资料综合:间充质干细胞可以从哺乳动物成体骨髓、脂肪组织、肾脏、皮肤及相应胎儿组织中分离获得,具有向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等多种组织细胞分化的潜能.此外其在免疫反应中可逃避免疫识别、抑制免疫反应的特性引起医学研究领域的广泛关注.间充质干细胞通过与免疫细胞(包括抗原递呈细胞、淋巴细胞、自然杀伤细胞)的相互作用降低免疫原性,调节免疫反应活性.间充质干细胞用于细胞治疗在心脏功能修复、骨骼重建、代谢疾病等方面应用前景不可忽视,利用基因修饰的间充质干细胞作为载体的基因治疗将为未来医学研究提供更广阔的空间.结论:间充质干细胞具有调节免疫系统的功能,在诱导移植耐受和治疗自身免疫性疾病中存在不可忽略的优势.对于如何有效控制其在体内定向分化、增殖、迁移并整合参与宿主细胞组织功能等问题还需深入系统研究.
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骨髓间充质干细胞在医学领域中的研究与应用
目的:骨髓间充质干细胞主要存在于全身结缔组织和器官间质中,自我更新和增殖能力强,在适宜的微环境里具有多向分化潜能.文章就骨髓间充质干细胞的生物学特性及其在医学领域应用的新进展做一综述.资料来源:应用计算机检索PUBMED 2000-01/2006-12期间的相关文章,检索词为"mesenchymal stem cell",并限定文章语言种类为English.同时计算机检索中国期刊全文数据库2000-01/2006-12期间的相关文章,检索词为"骨髓间充质干细胞",并限定文章语言种类为中文.资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文.纳入标准:文章所述内容应与骨髓间充质干细胞的发展现状及其临床应用相关.排除标准:重复研究或较陈旧的文献.资料提炼:共收集到160篇相关文献,68文献符合纳入标准,排除的92篇文献为内容陈旧或重复.选取符合纳入标准的30篇文献进行分析,分别涉及骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定、在医学领域中的应用、当前存在的问题及展望.资料综合:骨髓间充质干细胞是一类具有分裂增殖和多向分化潜能的干细胞,在适宜的诱导条件下可定向分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、腱细胞、肌肉细胞和神经细胞等,且已在退行性及缺损性疾病、心血管疾病、肝移植、肺纤维化等疾病治疗方面取得良好效果.目前骨髓间充质干细胞在体内的细胞生物学和分子生物学作用机制仍不清楚,如何限定体内外诱导条件使其向所需细胞或组织定向分化以及移植时机、是否具有致瘤性等问题尚需深入研究.结论:骨髓间充质干细胞具有易获得、易培养、低免疫原性、易于外源基因的转入和表达等特性,已成为具有细胞治疗和基因治疗临床疾病潜在实用价值的有效载体.
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神经干细胞相关研究进展
目的:综合分析国内外关于神经干细胞的研究,以期进一步了解神经干细胞的分布、生物学特性、鉴定、增殖与分化.资料来源:应用计算机检索Medline数据库和万方数据库1990-01/2006-03期间有关神经干细胞的文献,检索词"Neural stem cells;Differentiation,神经干细胞,分化".资料选择:对资料进行初审,筛除重复文献.资料提炼:经过筛选共收集到30篇有关神经干细胞的分布、生物学特性、鉴定、增殖与分化的文章.资料综合:神经干细胞的形态、位置和表面标志已被初步认识,分离培养技术日趋成熟,对其调控机制、迁移特性的研究也进一步深入,外源性神经干细胞移植治疗和内源性神经干细胞激活疗法等临床实验也已展开,临床开展的神经干细胞移植已经应用于人类神经组织损伤和神经系统退行性疾病的治疗,但如何高效地诱导神经干细胞分化为特定递质类型的神经元或特定类型的神经胶质细胞有待进一步研究.结论:目前神经干细胞研究已经取得了可喜的进展,但如何高效地诱导神经干细胞分化为特定递质类型的神经元或特定类型的神经胶质细胞有待进一步研究.
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脊髓损伤传统治疗及细胞移植基因治疗的进展
目的:脊髓损伤分为原发性损伤和继发性损伤,治疗主要目的在于阻止或减少继发性损伤.文章对采用传统疗法、细胞移植、基因治疗等方式修复脊髓损伤的研究进展作一综述.资料来源:应用计算机检索PUBMED 1997-02/2007-02期间的相关文章,检索词为"Spinal Cord Injuries,surgery,transplants,gene cure",并限定文章语言种类为English.同时计算机检索中国期刊全文数据库2001-01/2006-12期间的相关文章,检索词为"脊髓损伤,基因治疗,细胞移植,手术治疗",并限定文章语言种类为中文.资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文.纳入标准:文章所述内容应与传统疗法、细胞移植或基因治疗等方式修复脊髓损伤相关.排除标准:重复研究或Meta分析类文章.资料提炼:共收集到98篇相关文献,32篇文献符合纳入标准,排除的66篇文献为内容陈旧或重复.符合纳入标准的32篇文献中,分别涉及手术治疗、药物治疗、高压氧治疗、细胞移植、基因治疗脊髓损伤以及所面临的问题.资料综合:脊髓损伤采取手术治疗可解除脊髓压迫和(或)通过体内固定维持脊柱稳定性;药物、高压氧等非手术治疗是通过减轻脊髓继发性损伤,从而促进神经功能的恢复或再生;细胞移植、基因治疗可刺激神经细胞再生.脊髓损伤后的修复面临许多问题,主要是损伤后脊髓中的环境不利于修复的发生和发展.结论:细胞移植和基因治疗是脊髓损伤修复的重要手段,在动物实验中已取得了一定效果,具有很好的临床应用前景.
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当归补血汤对血细胞及相关免疫因子的作用
目的:当归补血汤对正常及免疫功能低下机体的免疫功能具有增强作用.文章就近年来当归补血汤免疫药理方面的研究作一综述.资料来源:应用计算机检索中国期刊全文数据库1979-01/2007-03期间的相关文章,检索词为"当归,黄芪",并限定文章语言种类为中文.资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文.纳入标准:文章所述内容应与当归补血汤免疫药理研究相关.排除标准:重复研究.资料提炼:共收集到78篇相关文献,30篇文献符合纳入标准,排除的48篇文献为内容陈旧或重复.资料综合:当归补血汤是补益气血经典方剂,该方由黄芪和当归以5∶1比例组成,重用黄芪大补脾肺之气,以滋生血之源,主治劳倦内伤,气弱血虚之证.该方在免疫药理作用方面,国内学者对正常及免疫功能低下机体进行了较多实验研究.既有体内实验,又有进一步的离体观察;既有对免疫器官形态的观察,又有对不同免疫细胞数量和功能的测定,并对其作用分子机制进行探讨.研究结果表明当归补血汤可以增强机体红细胞的免疫黏附及清除免疫复合物的能力,增强吞噬细胞的吞噬功能,增强NK细胞的杀伤功能,不同程度的促进T、B淋巴细胞的增殖和相应的免疫功能.当归补血汤还具有促进造血和血管生成作用.上述作用的发生机制可能与其调节基因活性和活性分子作用相关.结论:当归补血汤组方简单,配伍配比精当,能够增强正常及免疫功能低下机体的免疫功能,临床应用广泛.但药理研究大多集中在动物整体、器官、细胞等,分子水平研究还有欠缺.
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骨髓采集术麻醉方法的选择
目的:介绍骨髓移植供者行骨髓采集术过程中麻醉方法的选择,分析其麻醉效果.方法:应用计算机检索中文科技期刊数据库1994-01/2006-12期间与骨髓移植和麻醉相关的文献,检索词"骨髓移植、麻醉",限定文章语言种类为中文.对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文,文献所述内容应与骨髓移植、骨髓采集术麻醉方法的选择、处理及效果相关,且以近5年发表在较权威杂志者优先.排除重复性文章及Meta分析类文章.结果:共检索到52篇相关文献,通过阅读摘要或全文对其内容进行分类整理,19篇符合纳入标准.骨髓移植术是目前根治血液系统恶性疾病及某些遗传性疾病的主要手段之一,如何顺利地采集供者骨髓、同时又能大程度地保障其安全一直是人们十分重视的问题.采集骨髓时麻醉方法的选择及其效果关系到供者的生命安全,具体方法包括连续硬膜外麻醉、全身麻醉、局部麻醉3种.19篇文献报道了783例骨髓移植供者行骨髓采集时的麻醉方法,其中以连续硬膜外麻醉为主,占93.49%,局部麻醉占5.87%,全身麻醉占0.64%.结论:骨髓移植供者行骨髓采集术时,相对全身麻醉、局部麻醉而言,采用连续硬膜外麻醉法简便易行、用药单纯,对供者的生理干扰不大,又可达到麻醉和手术的要求,对循环、呼吸功能影响小,临床上具有一定的优越性.
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人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养
目的:验证贴壁方式分离人骨髓间充质干细胞,并进行体外扩增培养的可行性.方法:实验于2006-02/12在解放军济南军区总医院脊髓修复科完成.①实验材料:骨髓来源于解放军济南军区总医院脊髓修复科收治的脊髓完全性损伤患者,对本实验知情同意.基础培养液由含体积分数为0.15胎牛血清和低糖α-MEM配置.②实验方法:无菌条件下髂后上棘穿刺抽取骨髓组织6 mL,进行细胞培养,观察细胞生长情况,待细胞融合成片、长满培养瓶底部后,用质量浓度为2.5 g/L的胰蛋白酶流过所有细胞表面.倒置显微镜下观察细胞变圆、部分脱壁后,立即加入有血清培养液终止消化.③实验评估:取第3代生长状态良好的细胞,胰蛋白酶消化制成细胞悬液,接种,以细胞数为纵坐标,时间为横坐标,绘制细胞生长曲线.同时每隔2 h进行细胞贴壁率检测.结果:①骨髓间充质干细胞的形态学观察:倒置显微镜下,骨髓间充质干细胞接种1 d即贴壁,去除悬浮细胞后继续培养3 d贴壁细胞开始增殖,伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等.至14 d细胞密集在集落中心,基本铺满瓶底,第3～5代细胞呈均匀一致的长梭型,排列成旋涡状或放射状.②骨髓间充质干细胞的生长曲线:细胞传代后3 d内处于潜伏期,3 d后进入生长期,7 d后进入平台期.③骨髓间充质干细胞的贴壁率:随着培养时间的延长,骨髓间充质干细胞贴壁率逐渐升高.传代后2,4,6,8,10,12,14,16,18,20 h细胞贴壁率分别为(20.20±0.25)%,(33.00±0.29)%,(46.50±0.32)%,(69.20±0.30)%,(76.60±0.34)%,(86.50±0.27)%,(90.30±0.20)%,(96.10±0.28)%,(98.50±0.12)%,(99.00±0.07)%.结论:贴壁法分离骨髓间充质干细胞操作简便,经体外扩增培养后细胞增殖活性强,传代周期为7 d,是比较理想的骨髓间充质干细胞培养方法.
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体外原代培养成年大鼠许旺细胞的实验方法:组织块反复种植+低浓度酶消化+差速贴壁
目的:探讨获得高纯度成年SD大鼠许旺细胞的有效方法.方法:实验于2006-12在武汉理工大学完成.①许旺细胞原代培养:无菌条件下暴露SD大鼠左侧坐骨神经,切断神经,结扎后缝合臀大肌及皮肤.7 d后处死大鼠,切取左侧预变性坐骨神经,并取右侧正常坐骨神经做对照,显微镜下尽量去除神经外膜及黏连组织,将神经剪成1 mm3的组织块,植入培养瓶中进行培养,组织块间距以1 cm为宜.②许旺细胞传代及纯化:培养7 d后,将组织转移到新的培养板中继续培养,继之依次应用低浓度酶消化法、差速贴壁分离法去除成纤维细胞,纯化许旺细胞.③许旺细胞的观察和计数:在倒置相差显微镜下观察许旺细胞的形态和增殖情况,定期随机采集细胞图像,并用MTT法测试其增殖能力.④许旺细胞的鉴定:对纯化的许旺细胞进行S-100蛋白酶联免疫细胞化学染色鉴定.结果:①许旺细胞的分离培养和纯化:预变性组许旺细胞密度高于正常对照组,培养7 d后两组的密度差别尤为显著.②许旺细胞的形态学观察:许旺细胞为典型的长梭状,具有双极或多级,两端突起较长,汇合成片并交织呈网状.正常对照组细胞密度较低,生长较慢,胞体较长,细胞多呈三角形或多角形.MTT生长曲线显示:预变性组许旺细胞倍增时间为3 d,正常为4 d.③许旺细胞的免疫化学鉴定:许旺细胞胞体及突起呈棕褐色,而成纤维细胞为扁平状且未着色,呈透明状.预变性组许旺细胞纯度为95%,正常对照组为86%.结论:本实验所采用的组织块反复种植+低浓度酶消化+差速贴壁法分离纯化许旺细胞切实可行,可有效获得大量高纯度许旺细胞.
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胚胎嗅鞘细胞移植治疗脑性瘫痪:4例术后4周结果报告
目的:观察胚胎嗅鞘细胞移植治疗脑性瘫痪的有效性和安全性.方法:①病例资料:4例因出生时缺血缺氧确诊为脑性瘫痪的患者,男2例,女2例,年龄分别为14岁、9岁、28个月、17岁.嗅鞘细胞由北京市虹天济神经科学研究院细胞中心提供,实验经医学伦理委员会批准,4例脑性瘫痪患者均签署知情同意书.②实验方法:根据术前MRI或CT片,患者均在局麻下行微创立体定向嗅鞘细胞移植术,选取双额放射冠为注射靶点,每侧注射1.0×106个细胞.术后给予止血、抗感染、康复等常规处理.③实验评估:分别于嗅鞘细胞移植前、移植后4周采用脑瘫综合功能评定量表、脑瘫日常生活能力量表评价患者神经功能及生活质量的改善.结果:①嗅鞘细胞移植术后4周,4例患者较术前均有不同程度的神经功能改善,未出现手术并发症.②脑瘫综合功能评定总分:病例1由92.5分增至94分,病例2由55分增至56分,病例3由10.5分增至11.5分,病例4由9.5分增至13分.③脑性瘫痪日常生活能力量表总分:病例1由82.0分增至83.5分,病例2无变化,为16.5分,病例3由5.0分增至7.5分,病例4由5.0分增至8分.结论:嗅鞘细胞移植治疗脑性瘫痪患者近期评价安全可行,可部分改善神经功能与生活质量,长期效果有待进一步随访.
