血清剥夺与β-巯基乙醇联合诱导孕足月羊水干细胞向神经元样细胞分化

背景:羊水干细胞是一种新的干细胞来源,具有不同于成体间充质干细胞的生物特性.目前有关羊水干细胞的研究多数以孕中期羊水为基础,对孕足月羊水所知甚少.目的:探讨孕足月羊水干细胞向神经元分化的可能性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-10/2008-08在解放军总医院妇产科及解放军军事医学科学院干细胞及再生医学研究室完成.材料:孕足月羊水来自在解放军总医院行剖宫产、排除胎儿畸形的孕38～40周健康孕妇.方法:贴壁法从羊水中体外分离培养羊水干细胞,胰酶-EDTA消化传代.取第四五代细胞,用含1 mmol/L β-巯基乙醇、体积分数为20%胎牛血清、10 μg/L碱性成纤维生长因子的低糖培养基预诱导24 h,去除培养液,洗涤后加入含5 mmol/Lβ-巯基乙醇的无血清低糖培养基向神经元方向诱导4.0～5.0 h:对照组不加任何诱导剂.主要观察指标:孕足月羊水干细胞的形态及免疫表型,诱导后向神经元样细胞的分化.结果:培养的羊水干细胞呈梭形,漩涡状排列,间质干细胞来源标志CD105,CD29及1类组织相容性抗原HLA-ABC均呈阳性表达,胚胎干细胞标志性基因SSEA-4亦呈阳性表达,不表达造血干细胞标志.诱导后,细胞形态发生明显改变,胞浆回缩,出现类似轴突的细长的两极或多极突起,免疫荧光染色神经元特异性烯醇化酶呈阳性表达.结论:在血清剥夺与β-巯基乙醇联合诱导条件下,孕足月羊水干细胞具有向神经元样细胞分化的潜力.

鼠胚胎神经干细胞的体外培养及诱导分化

背景:随着神经干细胞培养技术条件的成熟,为颅脑损伤后神经系统功能重建、神经再生和神经系统疾病治疗提供了新的思路和途径.但移植所用的细胞来源及移植后的神经干细胞能否分化为神经细胞是急需解决的重要问题.目的:拟将体外分离培养的鼠胚胎神经干细胞稳定增殖传代,并诱导分化出神经系统的3种基本细胞.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-06/2008-06在新疆维吾尔自治区人民医院完成.材料:14～16d孕龄Wistar大鼠胚胎,由新疆自治区实验动物研究所和新疆医科大学实验动物中心提供.方法:取胎鼠额叶大脑皮质,组织块消化法体外分离培养神经干细胞,在表皮生长因子、碱性成纤维生长因子和B27联合作用下使其稳定增殖.原代培养7 d后,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基诱导14 d.主要观察指标:倒置显微镜下观察神经干细胞的生长形态,并行巢蛋白免疫荧光染色鉴定.应用免疫组化染色检测诱导后神经干细胞的分化情况.结果:原代培养一两天细胞散在分布,胞体较小,呈圆形,折光性较好,3 d后逐渐形成由数个细胞组成的细胞球;传代后贴壁细胞多数分化为长梭形或扁平形的胶质细胞,10 d时可见大量由数十至数百个细胞组成的较大细胞球,其生长速度基本与原代培养相同,但成球速度明显加快;免疫荧光染色呈巢蛋白阳性反应.以含体积分数为10%胎牛血清的培养液诱导后,免疫化学染色示神经干细胞球呈神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、髓鞘碱性蛋白阳性表达.结论:实验成功从鼠胚胎脑皮质分离培养出神经干细胞,并诱导分化为神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞.

同种异体骨髓间充质干细胞单独及联合生长因子移植对免梗死心肌心功能的影响

背景:骨髓间充质干细胞拥有多向分化的潜能,生长因子在细胞的移行,存活以及分化中具有重要作用.目的:观察肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子联合干细胞移植对兔心肌梗死后心功能的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-11/2008-03在中国医科大学动物实验中心完成.材料:取健康成年兔28只,雌雄不拘,体质量2.0～2.5 kg.方法:体外培养扩增兔骨髓间充质干细胞,在冠状动脉左室支主干第1,2对角支之间闭塞血管1 h后再灌注,建立缺血再灌注心肌梗死模型.将28只成年兔随机抽签法分为4组,每组7只.联合应用治疗组:造模后3 d注射5×1011 L-1密度间充质干细胞40 μ L和含150 μ g/L肝细胞生长因于及200 μg/L胰岛素样生长因子1的DMEM培养液8 μ L:单纯干细胞治疗组:单独给予5×1011 L-1密度间充质干细胞40 μL;生长因子治疗组:注射含150 μg/L肝细胞生长因子和200 μ g/L胰岛素样生长因子1的DMEM培养液8 μL;对照组:给予相同剂量DMEM培养液.采用IE33型超声仪,三维探头X-3获取左室三维全容积图像.主要观察指标:骨髓间充质干细胞荧光标记检测结果;三维超声测定造模后6周各组动物左室舒张末期容积、左室收缩末期容积及射血分数变化.结果:28只成年兔均进入结果分析.①骨髓间充质干细胞贴壁生长,形态各异,1周后贴壁细胞逐渐呈细胞集落,为纺锤形、梭形的成纤维细胞形态,2周后达到80%～90%融合.荧光显微镜观察发现,除对照组及生长因子治疗组以外,联合应用治疗组和单纯干细胞治疗组心脏标本中均发现有DAPI标记的阳性细胞,在宿主兔心肌内呈散在分布于瘢痕周边区并沿心肌纤维排列方向走行.②与对照组和生长因子治疗组相比,联合应用治疗组和单纯干细胞治疗组心功能均有明显改善(P<0.05);但联合应用治疗组与单纯干细胞治疗组相比,射血分数值差异无显著性意义(P=0.45).结论:单纯干细胞移植与联合生长因子应用均能有效改善心肌梗死后心功能.

人胚神经干细胞植入脑出血大鼠的存活和分化状态

背景:研究证实外源性神经干细胞能修复神经,促进脑出血后神经功能障碍的恢复.然而,脑出血后局部内环境对移植神经干细胞存活分化的影响是一个复杂多变的过程.目的:观察人胚神经干细胞植入脑出血大鼠脑内的存活和分化状态.设计、时间及地点:免疫组织化学水平的开放性实验,于2007 05/2008 04在泸州医学院附属医院分子生物实验室完成.材料:纳入40只SD雌性大鼠,由中国医学科学院实验动物研究所提供;8周龄流产胚胎大脑由德阳市人民医院医院妇产科提供.方法:取8周龄流产人胚胎大脑皮质细胞,体外培养获得人胚神经干细胞.通过注射自体动脉血到尾状核制作大鼠脑出血模型,出血后2 d将标有5'-溴脱氧尿嘧啶的人胚神经干细胞悬液移植到血肿腔周围的4点,1,2周后处死大鼠,相邻脑组织切片行5'-溴脱氧尿嘧啶,微管相关蛋白2和5'-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学双染.主要观察指标:应用免疫组织化学及免疫荧光染色方法观察移植入脑出血大鼠脑内的人胚神经干细胞存活、分化状态和迁徙情况.结果:5'-溴脱氧尿嘧啶阳性细胞为椭圆形棕褐色,移植后1周及2周均可见其存活并向周围迁移,且移植后2周迁移的范围广.移植后1周,脑组织切片见5'-溴脱氧尿嘧啶/微管相关蛋白2和5'-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞,且5' -溴脱氧尿嘧啶/微管相关蛋白2双阳性细胞多于5' -溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞.移植后2周,5' -溴脱氧尿嘧啶阳性细胞数明显减少,在脉络丛和微血管中可见,且5'-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞多于5'-溴脱氧尿嘧啶,微管相关蛋白2双阳性细胞.结论:人胚神经干细胞移植入脑出血大鼠脑内能够存活,移植后逐渐分化为神经细胞和星形胶质细胞.

简化无血清培养基分离U2-OS人骨肉瘤细胞系肿瘤干细胞

背景:已有实验应用成分复杂的无血清培养基从骨肉瘤组织中分离出干细胞样肿瘤细胞.目的:应用简化的无血清培养基在U2-OS人骨肉瘤细胞系中分离培养出骨肉瘤干细胞并对其作肿瘤干细胞的相关检验.设计、时间及地点:干细胞体外培养实验,于2006-02/2007-02在兰州大学第二医院骨科研究所完成.材料:U2-OS人骨肉瘤细胞系购自中科院上海生命科学研究院细胞库.无血清培养基为在DMEM/F12培养基中添加重组表皮生长因子(20 μ g/L)和重组成纤维生长因子(20 μ g/L),L-谷氨酰胺(2 mmol/L),胰岛素(4 U/L),青莓素G(1×10°U/L),链霉素(100 mg/L).方法:取在含血清培养基中贴壁生长的U2-OS细胞,接种于含有表皮生长因子和成纤维生长因子的简化无血清培养基中,形成悬浮生长的骨肉瘤细胞球后观察其增殖、分化能力.用免疫细胞化学染色法检测间充质干细胞标志CD44、CD105蛋白在骨肉瘤细胞球中的表达.反转录-聚合酶链反应法检测U2-OS细胞及其肿瘤干细胞中胚胎多能干细胞管家基因Oct3/4mRNA的表达.主要观察指标:①悬浮细胞球的形成.②肿瘤干细胞增殖活性.③肿瘤干细胞的侵袭能力.④CD44、CD105蛋自在骨肉瘤细胞球细胞中的表达.⑤肿瘤干细胞中Oct 3/4 mRNA的表达.结果:U2-OS人骨肉瘤细胞系中有极少数的细胞能在简化无血清培养基中增殖形成骨肉瘤细胞球,具有很强的增殖分化能力,其表面具有间充质干细胞的膜分子CD44、CD105,表达胚胎干细胞管家基因Oct 3/4 mRNA.结论:U2-OS细胞系中存在肿瘤干细胞,简化无血清培养基可用于分离培养骨肉瘤干细胞.

胎鼠纹状体神经干细胞分离培养及鉴定

背景:从胎鼠神经系统的多个部位如大脑半球、海马、皮质、脑室区等可分离出神经干细胞.目的:探讨胚胎大鼠大脑纹状体神经干细胞的取材、分离、培养和鉴定方法,观察神经干细胞增殖、传代和分化的规律.设计、时间及地点:观察性实验,于2008-03/08往烟台毓璜顶医院中心实验室完成.材料:选用普通级健康成年Wistar大鼠12只,按雌雄1:1比例于每晚6时合笼,次晨检查出阴道栓子(阴道内皮结晶)为妊娠0 d.方法:在无菌条件下取孕13 d胚胎大鼠脑纹状体组织,用无血清培养技术在体外进行神经干细胞的培养、扩增和传代.分别用抗巢蛋白抗体、抗微管相关蛋白2抗体和抗胶质原纤维酸性蛋白抗体对培养的细胞进行干细胞特性和多分化潜能的免疫组织化学鉴定.主要观察指标:①显微镜下观察细胞生长情况.②神经干细胞分化情况及免疫签定.结果:①原代细胞种植后24 h可见大量分裂期的神经干细胞,呈对称或不对称分裂,细胞核较大,连续观察可见细胞分裂成2个完全独立的神经干细胞;48 h后出现许多由4～10个细胞疏松连接的细胞团;神经干细胞进入快速增殖期5 d后出现许多大小不等的细胞集落,即神经球,神经球呈规则的圆球状,细胞排列紧密,表面光滑没有突起.②培养4～6 h后悬浮的神经干细胞球逐渐贴壁,大部分细胞分化后胞体呈圆形或椭圆形,具有1个或2个长突起,少量细胞具有多个粗长突起.贴壁分化3 d左右,具有1个或2个突起的神经元样细胞逐渐减少,具有多个租长突起的星形胶质细胞样细胞逐渐增多.悬浮的神经干细胞球经巢蛋白染色呈阳性反应,部分细胞呈微管相关蛋白2和胶质原纤维酸性蛋白染色阳性.结论:从胎鼠纹状体中分离培养的神经干细胞具有自我增殖、自我更新能力,并能分化为神经元及神经胶质细胞.

以CM-Dil作为骨髓干细胞移植示踪剂的可行性术

背景:供体细胞的示踪始终是干细胞移植研究中面临的一个重要问题,以往用于干细胞移植的示踪技术主要有核素、5-溴脱氧尿嘧啶核苷、绿色荧光蛋白、Hoechst和荧光原位杂交等.目的:探讨CM-Dil作为骨髓干细胞移植示踪剂的可行性和示踪效果.设计、时间及地点:细胞学体内观察,于2004-10/2007-12在中山大学附属第一医院神经科实验室完成.材料:四五周龄雄性DL小鼠80只为供体,2月龄遗传性肝功能障碍模型TX小鼠40只为受体,均由澳大利亚Dean教授馈赠.CM-Dil为Molecular Probes公司产品.方法:全骨髓法体外分离培养供体鼠骨髓干细胞,加入CM-Dil行荧光标记,无菌条件下经尾静脉注入已放疗的受体鼠体内,注射悬液量为0.2 mL/只,细胞数1.2×107个/只,于移植后不同时间取肝脏标本制备切片.主要观察指标:荧光倒置显微镜下观察CM-Dil标记细胞情况,流式细胞仪测定荧光标记率.供体细胞移植后在受体鼠肝脏的示踪.PCR半定量分析供体细胞在受体鼠肝脏中的比例.结果:荧光显微镜下CM-Dil标记的骨髓干细胞呈红色荧光,CM-Dil标记率为99.9%.在受体鼠肝脏组织内,CM-Dil的荧光在移植后第1天即可看到,渐增多,第4周达高峰,后渐下降.移植后第7天可检测到Sry基因,随后其变化趋势同CM-Dil荧光.结论:CM-Dil是良好的骨髓干细胞移植示踪剂,第4周时示踪效果为显著.

经冠状动脉移植自体骨髓单个核细胞修复犬梗死心肌

背景:细胞移植治疗心肌梗死为重建受损心肌带来希望,但移植后的细胞分化以及细胞移植能否长期持久地改善心脏功能等问题均不明确.目的:观察骨髓单个核细胞经冠状动脉移植入犬梗死心肌后,在心肌组织的分布、分化情况以及对心功能的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-07/2008-03在泰达国际心血管病医院完成.材料:成年杂种犬16只,随机分为细胞移植组10只、模型对照组6只.方法:细胞移植组于髂前上嵴或髂后上棘穿刺抽取骨髓,经Ficoll密度梯度离心法分离获取骨髓单个核细胞,行CM-Dil标记.两组犬均结扎冠状动脉前降支建立急性心肌梗死模型,于心肌梗死后2 h,细胞移植组向心肌梗死区注射骨髓单个核细胞悬液1 mL(3×107～1×108个细胞),模型对照组注射等量生理盐水.主要观察指标:血流动力学指标及超声心动图指标的变化,免疫荧光染色观察骨髓单个核细胞在心脏的迁移、分布及分化.结果:与模型对照组比较,细胞移植后6周细胞移植组血流动力学指标左室舒张末压显著降低(P<0.01),心排出量明显升高(P<0.05);超声心动图指标左室收缩末容积、左室舒张末容积均得到显著改善(P<0.01),射血分数、每搏输出量亦明显改善(P<0.05).自体骨髓单个核细胞经冠状动脉移植后,可分布于心肌梗死区及梗死周边区,并表达肌球蛋白重链、连接蛋白43.结论:自体骨鼬单个核细胞经冠状动脉移植后可分化为心肌样细胞,改善急性心肌梗死后的心功能.

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞的分化

背景:目前骨髓间充质干细胞已经应用于多种组织血管的修复,但涉及尿道血管组织的报道甚少.目的:探讨体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-07/2008-01在苏州大学附属儿童医院儿科研究所完成.材料:清洁级4周龄SD大鼠4只,由苏州大学实验动物中心提供.作为诱导剂的血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞因子为Sigma公司产品.方法:密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,待细胞达80%～90%融合时消化传代.传至第3代,细胞按1×109L-1密度接种,加入含血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞因子的DMEM培养基向血管内皮细胞诱导分化.主要观察指标:MTT测定细胞生长曲线,免疫荧光法检测细胞表面CD44与Vimentin的表达,光学倒置显微镜下观察诱导后细胞形态变化,电镜观察细胞超微结构.结果:骨髓间充质干细胞生长曲线呈倒"S"型,第3代细胞表面CD44和Vimentin表达阳性率分别为89.3%和85.6%.向血管内皮细胞诱导1～3 d细胞争梭形或纺锤形,7 d后变成不规则的圆形或椭圆形,胞浆淡染,胞核较大,核染色质粗,且部分细胞死亡,14 d后整瓶细胞呈漩涡状生长,21～25 d后细胞密集处呈内皮细胞特有的铺路石样排列.诱导后第21天,细胞浆内可见微管、微丝及W-P小体.结论:血管内皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞因子联合诱导条件下,骨髓间充质干细胞在体外可分化为血管内皮细胞.

超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞的体外标准化实验

背景:超顺磁性氧化铁颗粒标记成像可在体观察标记细胞移植后情况,但结合临床细胞治疗剂量,其标记浓度及标记时间对细胞标记率、标记活性及标记后成像效果的综合影响还需进一步分析.目的:筛选超顺磁性氧化铁体外标记大鼠骨髓间充质干细胞的标准化剂量,拟为体内成像提供佳标记"浓度-时间".设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2008-02/10在山西医科大学完成.材料:清洁级Wistar大鼠10只,由山西医科大学动物实验中心提供.Resovist中含超顺磁性氧化铁铁颗粒28 g/L,为德国Schering公司产品.方法:全骨髓法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞.取Resovist,分别配制含终浓度为0,25,50,75,100,150 mg/L超顺磁性氧化铁的培养基,加入P3代骨髓间充质干细胞中进行孵育标记.主要观察指标:普鲁士蓝法检测细胞标记率,锥虫蓝拒染法检测标记细胞活性,观察标记细胞体外磁共振成像情况.结果:细胞标记率达100%,随着标记时间的延长,胞质内蓝染颗粒逐渐减少.标记1 d和3 d时,与0 mg/L超顺磁性氧化铁组比较,25,50 mg/L组锥虫蓝拒染率无明显差异(F=0.28～3.15,P0.05);与25 mg/L超顺磁性氧化铁组比较,50 mg/L组锥虫蓝拒染率无明显差异(F=0.28～0.79,P0.05).体外磁共振成像示标记3 d时,标记浓度为50 mg/L组的T2WI及T2·WI信号降低明显.结论:超顺磁性氧化铁"50 mg/L-3 d"体外标记效率高,对细胞活性无影响,且磁共振成像信号降低明显,为适"浓度-时间"组合.

人脐血基质细胞的体外培养及向成骨细胞诱导分化

背景:研究证实婴儿脐带血里含有类似骨髓间充质细胞的细胞,但在培养过程中其成功率很低且难度高.目的:拟在体外分离培养人脐血基质细胞,并观察其分化潜能.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-03/2008-06在辽宁医学院中心实验室完成.材料:健康足月新生儿脐带血12份,每份30～60 mL,由锦州市妇婴医院提供.方法:取采集的脐带血,使用淋巴细胞分离液离心后取界面上的白色混浊状细胞层,加入含体积分数为10%胎牛血清、20 μ g/L碱性成纤维细胞生长因子、0.3 g/L L-谷胺酰胺、100 U/mL青霉素和100 g/L链霉素的L-DMEM培养液悬浮细胞,按2×109L-1密度接种于25cm2培养瓶中,待细胞达70%汇合时消化传代.取处于对数生长期的脐血基质细胞,将其培养基更换为含有地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基成骨诱导21～30 d.主要观察指标:倒置显微镜观察细胞形态学特征,描绘生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期,碱性磷酸酶染色和Von-Kossa染色检测成骨能力.结果:原代培养的人脐血基质细胞呈长梭形,需21～30 d长满瓶底,传代后细胞增殖缓慢并逐渐死亡,细胞平均倍增时间为42 h,处于G0/G1期的细胞达(86.54±2.31)%.在成骨诱导培养基里,脐血基质细胞增殖速度减慢,细胞形态无明显变化,成骨诱导14 d后碱性磷酸酶阳性率为(46.0±2.1)%,成骨诱导21 d形成钙化结节.结论:应用体积分数为10%胎牛血清、20 μ g/L碱性成纤维细胞生长因子的L-DMEM培养液可在体外成功分离培养出入脐血基质细胞,但细胞增殖能力有限,诱导后可向成骨细胞方向分化.

人胎盘与骨髓源性间充质干细胞体外培养及生物学特性对比

背景:组织工程修复大块组织缺损需要高浓度、大量的细胞接种,骨髓间充质干细胞是种子细胞的主要来源,但存在数量上的局限性及长期传代后细胞功能老化的问题.目的:体外分离培养、扩增人胎盘源性间充质干细胞与人骨髓间充质干细胞,并对其生物学性状进行比较.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2008-09/2009-02在东直门医院实验室完成.材料:胎盘由解放军空军总医院妇产科提供,骨髓来源于健康成人献髓者.方法:采用密度梯度离心法从胎盘中分离、纯化和传代培养人胎盘源性间充质干细胞;骨髓肝素抗凝后,采用密度梯度离心法分离、纯化和传代培养入骨髓基质干细胞.主要观察指标:用倒置相差显微镜观察两种细胞形态及细胞生长情况,流式细胞仪分析检测第5代细胞表面标志的表达,Von Kossa染色及油红O染色检测分化能力.结果:镜下两种细胞均为贴壁生长,形态为均一成纤维细胞样,传5代后细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降,体外培养10代后细胞生长速度减慢,但人胎盘源性间充质干细胞扩增倍数较人骨髓基质干细胞平均高出两三个数量级.两种细胞具有均一的细胞衷型,均表达CD29,CD44,CD166,不表达CD34,CD45,HLA-DR.两种细胞都具有成骨、成脂分化潜能,但人胎盘源性间充质干细胞分化潜能更强.结论:人胎盘源性间充质干细胞与人骨髓基质干细胞具有相似的生物学特性,且前者具有更强的增殖能力.

p44/p42激酶磷酸化在丹参注射液定向诱导成肌细胞分化为神经元样细胞过程中的作用

背景:睫状神经因子通过细胞表面的受体可以使成肌细胞去分化而转变为多能性干细胞,而p44/p42激酶可以进一步激活睫状神经因子下游基因的表达,与细胞去分化密切相关.目的:观察丹参注射液诱导成肌细胞分化成神经元的细胞模型中p42/p44激酶磷酸化的情况.设计、时间及地点:细胞分子水平实验,于2008-03/06在辽宁医学院附属第二医院口腔科学实验室完成.材料:清洁级新生1周SD大鼠1只,由辽宁医学院实验动物中心提供.丹参注射液为四川三精升和制药有限公司产品,批号080717.主要成分为丹参.睫状神经营养因子为Sigma产品.方法:体外分离培养大鼠成肌细胞,传至第5代接种于6孔板内,诱导组使用50μg/L睫状神经因子预诱导72 h,再更换含复方丹参注射液的无血清DMEM培养基诱导10 h;对照组使用不含复方丹参注射液的无血清DMEM培养基处理.取诱导后的成肌细胞,加入p44/p42激酶抑制剂PD98059进行干预处理.主要观察指标:western blotting法检测诱导后成肌细胞蛋白标记物MyoD,Myf5的表达,神经元蛋白标记物酪氨酸羟化酶、神经丝的表达,以及p44/p42激酶在成肌细胞蛋白标记物下调过程中的作用.结果:与未诱导的对照组比较,培养的成肌细胞经睫状神经因子预诱导、再加入丹参注射液诱导的过程中,成肌细胞蛋白标记物MyoD,Myf5的表达均明显下调;而诱导后期神经元特异蛋白标记物酪氨酸羟化酶、神经丝的表达增高.丹参诱导后成肌细胞p44/p42激酶发生磷酸化,同时MyoD和Myf5的表达量下调:在p44/p42激酶抑制剂PD98059存在情况下,p44/p42激酶磷酸化及MyoD,Myf5表达量下调均被抑制.结论:经睫状神经因子预诱导后逐渐去分化的成肌细胞,在丹参注射液的诱导下能够成功分化为表达神经元特异蛋白标记物的神经元样细胞,p44/p42激酶通过磷酸化参与了成肌细胞的再分化过程.

黄芪对人皮肤表皮干细胞增殖活性的影响

背景:利用干细胞技术修复创面是当前医学领域治疗伤口愈合的重要策略,黄芪具有扶正固本、益气活血、延缓衰老等作用,被广泛应用于临床各科多种病证的治疗.目的:探讨黄芪对人皮肤表皮干细胞增殖活性的调控作用.设计、时间及地点:细胞分子生物学实验,于2005 09/2008-06在南昌大学第一附属医院完成.材料:烧伤整形患者植皮剩余皮片来源于南昌大学第一附属医院烧伤中心.黄芪注射液为正大青春宝药业有限公司产品,批号0207114,每毫升含黄芪甲苷≥1.0 mg,相当于含生药2 g.方法:采用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸联合消化法分离表皮,Ⅳ型胶原快速贴附法纯化培养人表皮干细胞.实验组以含黄芪、表皮生长因子和角质细胞无血清培养基组成的表皮干细胞培养液进行体外培养,对照组不含黄芪,其余培养条件相同.主要观察指标:计算细胞克隆形成率,流式细胞仪测定细胞周期,免疫细胞化学染色法和图像定量分析法观察端粒酶反转录酶表达的变化.结果:表皮干细胞呈贴壁生长,10 d左右有大的细胞克隆形成,实验组人表皮干细胞克隆形成率、G0/G1期细胞比例均明显高于对照组(t=3.17,P<0.01;t=2.83,P<0.05).两组细胞端粒酶反转录酶均呈阳性表达,定量分析结果显示实验组平均吸光度值和阳性面积值均明显高于对照组(t=2.25,P<0.05;t=4.12,P<0.01).结论:黄芪可有效增强人皮肤表皮干细胞端粒酶反转录酶的表达和体外增殖活性.

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞的分化特点

背景:黄芪提取物有较好的抗氧化、清除氧自由基的作用,加之骨髓间充质干细胞的多向分化潜能及其自体移植的优越性,可能为神经退行性疾病的治疗提供新的方式.目的:探讨黄芪诱导后大鼠骨髓间充质干细胞的分化特点.设计:细胞学体外观察.材料:清洁级6周龄雄性大鼠1只,购自中国医科院实验动物中心.黄芪注射液批号060105,为大理药业有限公司产品.方法:全骨髓法体外分离培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传至第4代时,按4×108L-1密度接种于置有盖玻片的12孔板内,制备细胞爬片.盖玻片上细胞达80%～90%融合后全量换液,加入含200 g/L黄芪注射液、体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基连续诱导6 d;对照组DMEM培养基中不加入黄芪注射液.主要观察指标:倒置显微镜观察诱导前后骨髓间充质干细胞的形态变化,诱导后免疫细胞化学染色鉴定特异性标志物的表达.结果:原代培养的骨髓间充质干细胞多呈圆形,扩增至第4代后细胞形态多呈梭形或成纤维细胞状,诱导后细胞形态发生改变,自胞体长出突起,随诱导时间延长,长出突起的细胞数量逐渐增多,部分突起末端呈分叉状,可见网络状连接.免疫细胞化学染色结果显示,诱导第3天巢蛋白阳性细胞、神经元特异性烯醇化酶阳性细胞和神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞较多,诱导第6天微管相关蛋白2阳性细胞较多.结论:黄芪首先诱导骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化,然后促进其向神经元或神经胶质细胞的非特异性分化,并能够使已分化细胞的进一步成熟、老化.

骨髓源性肝样细胞门静脉移植大鼠肝纤维化模型

背景:研究已证明,骨髓间充质干细胞在体内、体外均可转化为肝细胞样细胞,并具有肝细胞的合成和分泌功能.目的:将骨髓间充质干细胞诱导分化的肝样细胞移植到同种大鼠已纤维化的肝脏,观察其分布、分化情况及对肝功能的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-06/2008-03在泸州医学院附属医院实验室完成.材料:100 g清洁级雄性SD大鼠10只用于分离培养骨髓间充质干细胞并诱导分化为肝样细胞.200～250 g清洁级雄性SD大鼠75只,随机分为肝样细胞移植组30只,模型对照组30只,正常对照组15只.肝样细胞移植组及模型对照组大鼠腹腔注射四氯化碳制备肝纤维化动物模型.方法:模型对照组和正常对照组大鼠门静脉输注不含血清的低糖DMEM培养基,肝样细胞移植组输入DAPI标记的肝样细胞,移植后第1,2,3,4周处死大鼠,留取肝脏和血清标本.主要观察指标:肝组织Masson三重染色分期评估纤维化程度.肝脏冰冻切片荧光显微镜下观察肝样移植细胞定居情况.以全自动生化分析仪与放射免疫法检测血清肝功能指标和血清肝纤维化指标.结果:肝样移植细胞逐渐从血管进入肝脏实质,终散布于肝细胞间,移植3周后,荧光衰减明显.移植后第2周,肝组织中的假小叶逐渐吸收或消散,纤维化程度明显轻于模型对照组,胶原染色变浅,分布于纤维间隔和汇管区,肝细胞呈气球样变性.移植后第4周肝细胞排列接近正常,偶见点状坏死,无纤维间隔,血清肝功能指标和肝纤维化指标与正常对照组相比,差异无显著性意义(P0.05).结论:诱导的肝样细胞植入纤维化的肝组织后,细胞可停留于汇管区和肝细胞素,植入细胞早可见于移植后第7天,血生化检查结果提示植入诱导的肝样细胞能够部分替代肝细胞的功能.

骨髓间充质干细胞胰腺包膜下移植与静脉移植治疗大鼠糖尿病的效果比较

背景:目前多数研究集中于探讨骨髓间充质干细胞移植后的转分化及其调控机制,而缺少干细胞移植治疗糖尿病的方法学和功能学研究.目的:观察不同途径移植骨髓间充质干细胞对糖尿病模型鼠的治疗效果.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-03/11在深圳市人民医院临床研究中心完成.材料:1周龄雄性SD大鼠4只,用于制备骨髓间充质干细胞.8周龄雌性SD大鼠32只,随机分为胰腺包膜下移植组、静脉移植组、糖尿病对照组、正常对照组,8只,组.方法:全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁法纯化扩增.胰腺包膜下移植组、静脉移植组、糖尿病对照组大鼠通过腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型.造模后,胰腺包膜下移植组取5×106个第3代骨髓间充质干细胞,重悬于0.2 mL PBS中,多点注射至胰腺包膜下;静脉移植组经股静脉注射等量骨髓间充质干细胞悬液;糖尿病对照组及正常对照组不接受仟何处理.主要观察指标:动态观察移植后血糖、胰岛素、C-肽水平变化,以及糖耐量实验结果.结果:与糖尿病对照组比较,移植后30 d内胰腺包膜下移植组和静脉移植组血糖值均明显降低(P<0.05),且胰腺包膜下移植组下降幅度更为显著(P<0.05):移植后第2,4,6周胰腺包膜下移植组与静脉移植组的胰岛素、C-肽水平均明显升高(P<0.05),且胰腺包膜下移植组升高幅度更为显著(P<0.05),但仍低于正常对照组(P<0.05).糖耐量实验中腹腔注射葡萄糖后,胰腺包膜下移植组血糖水平30 min达峰值,90 min降低至空腹水平,接近正常对照组的葡萄糖处理能力;静脉移植组对葡萄糖的处理能力略强于糖尿病对照组(P<0.05),但此2组在180 min内均未能恢复到正常血糖水平.结论:骨髓间充质干细胞移植途径与糖尿病的治疗效果有直接关系,胰腺包膜下移植效果优于静脉移植.

5和5/F35型腺病毒载体对人骨髓间充质干细胞转染效率的比较

背景:在以人骨髓间充质干细胞为基础的基因治疗中,提高腺病毒载体对人骨髓间充质干细胞的转染效率尤为重要.目的:对比观察5和5/F35型腺病毒载体对体外培养的人骨髓间充质干细胞的转染效率.设计、时间及地点:对比观察,于2008-03/10在解放军北京军区总医院血液科实验室完成.材料:骨髓来源于解放军北京军区总医院血液科异基因造血干细胞移植中健康供者,均无造血系统疾病.方法:采用密度梯度离心和贴壁筛选的方法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,传至第3代后用流式细胞仪检测人骨髓间充质干细胞表型;按1×104/孔密度接种于24孔板,细胞贴壁后分别换用成骨、成脂诱导液培养,以碱性磷酸酶、油红O染色检测其分化特性.用不同滴度编码增强型绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体Ad5增强型绿色荧光蛋白和Ad5/F35增强型绿色荧光蛋白按5,20,100,400感染复数转染体外培养的人骨髓间充质干细胞,荧光显微镜下观察.主要观察指标:流式细胞仪检测增强型绿色荧光蛋白阳性表达率,并用锥虫蓝拒染法检测不同病毒滴度感染后人骨髓间充质干细胞活细胞比例.结果:人骨髓间充质干细胞表面CD166、CD29、CD73、CD31、CD45、CD34和CD14阳性率分别为95.08%、99.53%、72.26%,1.50%,2.02%,3.80%和4.94%.人骨髓间充质干细胞成骨诱导后14 d碱性磷酸酶染色为阳性,成脂诱导后14 d油红O染色均为阳性.Ad5增强型绿色荧光蛋白和Ad51F35增强型绿色荧光蛋白按5,20,100,400感染复数分别感染人骨髓间充质干细胞,2 d后前者增强型绿色荧光蛋白阳性牢分别为(0.72±0.14)%,(4.97±0.46)%,(9.80±3.43)%和(45.53±6.32)%:后者增强型绿色荧光蛋白阳性率分别为(24.31±10.55)%,(55.19±13.73)%,(87.68±9.5)%和(96.57±5.64)%.在5,20,100的感染复数,各组细胞存活率均在95%以上.在400的感染复数,细胞存活率明显降低,在90%以下.结论:Ad5/F35对体外培养的人骨髓间充质干细胞的转染效率明显优于Ad5载体.

周期性压力培养对免骨髓间充质干细胞增殖的影响

背景:各种外界应力对细胞增殖有重要作用,但涉及骨髓间充质干细胞佳压力及加载时间的力学研究尚少.目的:探讨周期性压力培养对兔骨髓间充质干细胞增殖活性及细胞周期的影响.设计、时间及地点:细胞学体外对照实验,于2008～01/08在南昌大学重点分子生物实验中心完成.材料:健康6周龄雄性新西兰大白兔4只,由南昌大学实验动物中心提供.自行改制的细胞压力加载装置专利号ZL2006-2-0097266.3. 方法:使用密度梯度离心法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,取生长良好的第3代细胞,按4×104个/孔接种于6孔板,设立5组:5.32,10.64,21.28,29.26 kPa压力组分别给予对应的压力,每日加压6h×3d;正常培养组细胞只接受正常大气压力学刺激,不予额外加压.主要观察指标:力学干预后,观察细胞形态及生长状况,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪测量细胞周期变化.收集细胞培养上清液,检测基质金属蛋白酶2的质量浓度.结果:6 h/d压力干预骨髓间充质干细胞,3d后细胞形态无异常变化,呈集落样生长.随着周期性压力的增加,细胞吸光度值逐渐升高,以21.28 kPa压力组为佳,但升高至29.26 kPa压力时吸光度值明显降低(F=-3.731,P=0.008).与正常培养组比较,5.32,10.64,21.28 kPa压力组细胞周期发生改变,增殖指数均明显升高(P<0.05或0.01),但29.26 kPa压力组增殖指数则明显下降.细胞培养上清液基质金属蛋白酶2质量浓度21.28 kPa压力组低,29.26 kPa压力组高,组间比较差异有显著性意义(t=213.214,P<0.001).结论:5.32-21.28 kPa周期性压力可以提高骨髓间充质干细胞的增殖能力,特别是21.28 kPa压力刺激促增殖作用尤为明显,但压力过强则抑制细胞增殖.

重组人粒细胞集落刺激因子对脑出血大鼠脑水肿及血管再生的影响

背景:研究表明重组人粒细胞集落刺激因子可以减轻脑缺血后的脑水肿,并且可动员内皮前体细胞增加脑缺血区域新生血管生成,促进患者神经功能恢复.目的:探讨重组人粒细胞集落刺激因子对大鼠脑出血后脑水肿及新生血管的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-03/11在泸州医学院中心实验室完成.材料:健康雄性SD大鼠144只,随机分为假手术组、脑出血组、治疗组,48只,组.重组人粒细胞集落刺激因子为深圳新鹏生物工程有限公司产品.方法:脑出血组与治疗组大鼠采用断尾取自体血方式建立脑出血模型,假手术组仅经注射点注入生理盐水.造模1 h后,治疗组大鼠腹腔注射重组人粒细胞集落刺激因子60 μ g/kg.分别于干预后6 h,12 h,24 h,48 h,72 h,7 d时间点,每组各取8只大鼠,采用干湿重法测定大鼠组织脑含水量,采用SP、DAB显色法免疫组化检测CD34+血管的表达.主要观察指标:脑组织含水量动态变化,CD34+血管免疫组化结果.结果:与假手术组比较,脑出血组大鼠脑组织含水量显著升高(t=4.49,P<0.05),在48 h,72 h明显;各时间点治疗组脑组织含水量均明显低于脑出血组(t=6.74,P<0.05).与假手术组比较,脑出血组CD34+血管数明显增加(t=3.42,P<0.05);治疗组CD34+血管数明显多于脑出血组(t=6.07,P<0.05),且在72 h,7 d时差异尤为明显.结论:重组人粒细胞集落刺激因子作用于脑出血大鼠后,可减轻脑水肿程度,促进血肿周围新生血管生成.

基质细胞衍生因子1及其受体CXCR4对人骨髓间充质干细胞向脑缺血损伤区迁移的影响

背景:近年研究发现移植的骨髓间充质干细胞能向颅内创伤、脑卒中、炎症和变性疾病等病灶部位迁移,进而发挥治疗作用,但对于其向病灶定向迁移的具体机制还不十分清楚.目的:探讨基质细胞衍生因子1及其受体CXCR4在移植的骨髓间充质干细胞趋向缺血脑组织迁移中的作用.设计、时间及地点:细胞学体内实验.于2008-02/2009-02在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室进行.材料:骨髓标本取自解放军第三军医大学附属新桥医院血液科收治的15～40岁正常或原发病未累及骨髓患者,三四月龄健康雄性SD大鼠72只由解放军第三军医大学野战外科研究所实验动物中心提供.方法:密度梯度离心贴壁筛选法分离纯化、体外培养人骨髓间充质干细胞.54只大鼠参照Nagasawa线栓法制备局灶性脑缺血再灌注模型,剩余18只作为假手术组,仅插入线栓10 mm.模型组及假手术组大鼠各取9只,分别于造模后第2,4,8天,采用Real-time PCR和免疫组织化学法定量分析缺血脑组织基质细胞衍生因子1表达变化.剩余36只脑缺血再灌注模型鼠随机分为细胞移植组、溶液对照组,18只/组,于再灌注后24 h分别从尾静脉缓慢注入1 mL入骨髓间充质干细胞悬液(含2×109 L-1个细胞)或1 mL PBS.主要观察指标:人骨髓间充质干细胞CXCR4 mRNA和蛋白的表达,缺血再灌注后脑组织基质细胞衍生因子1 mRNA和蛋白表达变化,免疫组织化学检测人骨髓间充质干细胞向缺血脑组织的迁移和分布.结果:RT-PCR结果发现人骨髓间充质干细胞表达CXCR4 mRNA,免疫细胞化学染色发现CXCR4主要表达于人骨髓间充质干细胞的胞膜和胞浆.脑缺血再灌注损伤后2,4,8 d,趋化因子基质细胞衍生因子1 mRNA水平呈上升趋势,与假手术组比较差异有显著性意义(P<0.05).经静脉移植的人骨髓间充质干细胞定向迁移到脑损伤区域,并大量分布于基质细胞衍生因子1高表达的缺血半暗区,损伤侧大脑半球人骨髓间充质干细胞数量显著高于对侧半球(P<0.01).结论:基质细胞衍生因子1及其受体CXCR4参与并促进人骨髓间充质干细胞向脑缺血再灌注损伤区的迁移.

骨髓间充质干细胞联合茶黄素治疗兔激素性股骨头坏死

背景:股骨头坏死形成机制中,脂代谢紊乱学说受到许多学者的重视.茶叶提取物茶黄素具有降脂作用,在骨髓间充质干细胞培养中可抑制激素诱导的成脂分化,加强其成骨能力.目的:观察骨髓间充质干细胞联合茶黄素治疗激素性股骨头坏死的效果.设计,时间及地点:随机对照动物实验,于2008-03/06在安徽医科大学实验中心完成.材料:洁净级健康成年新西兰大白兔24只,随机分为4组:模型对照组、单纯减压组、细胞移植组、细胞联合茶黄素组,6只/组.实验所用茶黄素为茶黄素单体,纯度60%,由上海嘉会生物科技有限公司生产,批号20040828.方法:体外分离培养兔自体骨髓间充质干细胞,传至第3代后调整细胞密度为2×1010L-1复合于3 cra×2 cm明胶海绵上,每块明胶海绵含细胞悬液60μL,在细胞培养箱中孵育4 h备用.各组兔均采用液氮冷冻法建立激素性股骨头坏死模型,自然复温后钻孔,模型对照组不作任何处理,单纯减压组植入明胶海绵,细胞移植组、细胞联合茶黄素组植入复合有兔自体骨髓间充质干细胞的明胶海绵,同时细胞联合茶黄素组每天分3次灌服茶黄素250 mg,直至处死.主要观察指标:动物一般情况,髋部MRI扫描观察股骨头坏死区信号变化,以及股骨头标本组织学观察、扫描电镜观察结果.结果:造模后8周,细胞移植组、细胞联合茶黄素组兔活动明显增加,走路姿势逐步好转.造模后4周,各组均未见明显坏死区信号改变;造模后8周,模型对照组坏死低信号区明显扩大,单纯减压组低信号区无明显变化,细胞移植组低信号区范围略微缩小,细胞联合茶黄素组低信号区明显缩小,骨密度信号接近正常.与其余3组比较,造模后4,8周细胞联合茶黄素组空骨陷窝阳性数均明显减少(P<0.05).扫描电镜下,造模后8周模型对照组骨小梁多处断裂塌陷,髓腔内有大量脂肪细胞堆积;单纯减压组部分骨小梁可见裂痕;细胞移植组骨小梁不致密;细胞联合茶黄素组骨小梁结构规整致密,成骨细胞多,骨细胞及基质胶原纤维正常,髓腔规则.结论:茶黄奈能促进骨髓间充质干细胞成骨,在髓芯减压并骨髓间充质干细胞移植的基础上灌服给予茶黄素治疗兔激素性股骨头坏死的效果较好.

经冠状动脉移植自体骨髓单个核细胞治疗犬急性心肌梗死

背景:近年的研究表明,细胞移植可以修复受损的心肌组织,促进缺血区域新生血管的形成,改善缺血心肌的灌注和收缩功能.目的:观察白体骨髓单个核细胞经冠状动脉移植至犬心肌梗死模型后在体内的分化及对心功能的影响.设计、时间及地点:随机列照动物实验,于2006-09/2008-04在天津泰达国际心血管病医院动物实验室完成.材料:成年杂种犬16只,体质量15～25 kg,通过结扎冠状动脉前降支中段建立急性心肌梗死模型.方法:16只杂种犬投币法随机分为移植组(n=10)和对照组(n=6),移植组于心肌梗死后2 h经冠状动脉内移植CM-Dil标记的骨髓单个核细胞:对照组注射等量生理盐水.冠状动脉结扎后2 h及6周时行超声心动图检查,移植后6周处死所有动物于梗死区及其邻近部位取材.主要观察指标:①心肌梗死后6局两组心功能指标比较.②荧光显微镜下观察骨髓单个核细胞在心肌组织中的分化情况.③透射电镜观察移植组梗死区心肌组织的变化.结果:纳入杂种犬16只,全部存活.左前降支结扎2 h后可见结扎点远端心肌组织变紫,室壁活动减弱,心电图出现ST段弓背样抬高.①对照组心肌梗死后6周和心肌梗死后2 h相比各项指标均无显著改善(P0.05).移植组术后6周时左心室射血分数、左心室收缩期末内径及左心室短轴缩短率均较心肌梗死后2 h有明显改善(P<0.01),其中左心室射血分数与对照组相比亦有明显改善(P<0.05),移植组射血分数较对照组提高7%左右.②荧光显微镜下可见移植组自体骨髓单个核细胞经冠状动脉移植后可分布于梗死区及梗死周边区.并表达肌球蛋白重链:正常心肌组织及对照组心肌组织内未见移植细胞.③透射电镜下可见移植组分化完全的血管内皮细胞及类心肌样细胞.结论:骨髓单个核细胞可在梗死区梗死周边区存活并逐渐分化成心肌样细胞,促进缺血心肌血管新生,改善心功能.

兔脂肪组织来源干细胞体外生长特性及培养的适宜条件

背景:脂肪组织来源干细胞是位于脂肪荩质内的一种细胞,具有多向分化潜能,可以定向分化成多种细胞类型.目的:探索兔脂肪组织来源干细胞体外生长特性及胶原酶消化适宜条件.设计、时间及地点:细胞分子生物学实验,2008 05/09在解放军南京军区福州总医院比较医学科及实验科完成.材料:日本大耳白兔5只.Ⅰ型胶原酶为美国Worthington公司产品,低糖DMEM/F12培养液为美国Gibco公司产品.方法:兔颈后部皮下脂肪取材,采用Ⅰ胶原酶消化法获取细胞,按Ⅰ型胶原酶消化质量浓度分为1.0,1.5,2.0 g/L 3组,每组再按消化时间分为0.5,1,1.5 h3个亚组.脂肪组织剪碎混匀后均分为9等分,后重悬细胞终体积均定为2mL并计数,每个亚组计数6次,共取5次脂肪组织,采用含血清的DMEM培养液体外培养细胞.主要观察指标:细胞体外生长特性并比较不同胶原酶浓度、胶原酶消化时间对兔脂肪来源干细胞体外培养的影响.结果:采用1.0,1.5,2.0 g/L三种不同胶原酶浓度进行消化,发现在消化时间为0.5 h和1 h时,2.0 g/L组消化细胞总数多,细胞总数与其他组比较.差异有显著性意义(P<0.01).在消化时间为1.5 h时,消化细胞总数较0.5 h和1 h均有增加,同时,1.0,1.5,2.0 g/L组消化细胞总数无统计学差异,活细胞比值1.0g/L组高,但与其他组无统计学差异,观察第3代细胞生长特性,1.0 g/L消化1.5 h组别具有更好的增殖活性.结论:脂肪来源干细胞具有较强的自我更新能力,对于兔脂肪组织来源干细胞,胶原酶浓度1.0 g/L、消化时间1.5 h是佳的抉取条件.

氯化锂对脊髓损伤大鼠内源性神经干细胞的影响

背景:对于脊髓损伤的治疗,移植外源性神经干细胞仍面临着诸多难题,因此激活内源性神经干细胞的"补充治疗"策略成为近来研究热点.已发现氯化锂可以明显抑制神经干细胞的分化而促进其增殖,其效应与Wnt信号通路有关.目的:探讨氯化锂对大鼠脊髓损伤后内源性神经干细胞的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-03/08在珠江医院中心实验室进行.材料:Wistar成年雌性大鼠55只,分为3组:正常对照组5只、单纯损伤组25只、氯化锂治疗组25只.氯化锂为广州光华化学试剂厂产品.方法:单纯损伤组、氯化锂治疗组大鼠采用经典Aliens重物坠落法在T10段制作急性脊髓损伤模型.从造模后1 h开始,氯化锂治疗组经腹腔注射氯化锂3 mmol/(kg·d),直至取材:单纯损伤组同法给予等量生理盐水;正常对照组不作任何处理.各组取材前24 h腹腔注射Brdu溶液进行标记,每8 h注射1次,共3次.对距离损伤中心5mm处的脊髓进行Brdu、连环蛋白免疫组化检测.主要观察指标:BrdU阳性细胞数及连环蛋白阳性表达面积.结果:正常对照组脊髓中央管周围及外膜可见少量Brdu阳性细胞,几乎无连环蛋白阳性表达.单纯损伤组造模后24 h即可见大量Brdu阳性细胞及微量连环蛋白表达,1周时两者达高峰,主要分布于损伤脊髓周围的灰质和室管膜区,2周后开始明显减少,4周时仅见少鞋Brdu阳件细胞及连环蛋白阳性表达.与单纯损伤组比较,造模后24 h氯化锂治疗组Brdu阳性细胞及连环蛋白的表达无显著性差异,1周时往中央管周围、外膜、灰质中Brdu阳性细胞数及连环蛋白表达量明显增多(P<0.05),至2周时仍处于较高水平,4周时仍有大量Brdu阳性细胞及连环蛋白表达.结论:脊髓损伤后氯化锂的应用可以明显提高损伤脊髓组织内连环蛋白的表达,伴随着连环蛋白浓度的提高及持续表达,促进内源性神经干细胞的增殖,其作用机制与Wnt信号通路有关.

血管生成素1基因修饰骨髓间质干细胞移植后心肌梗死大鼠的心功能变化

背景:基因修饰的骨髓间质干细胞在表达自身特性的同时,可促进骨髓间质干细胞的分化并提高其存活率.以慢病毒为载体的血管生成素1(angiopoietin 1,Ang1)基因转导的骨髓间充质干细胞移植对大鼠心肌梗死心功能的影响目前尚无报道.目的:探讨Ang1基因修饰的大鼠骨髓间质干细胞(rat mesenchymal stem cells,rMSCs)移植对急性心肌梗死后血管再生和心功能的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-08/2009-08在福建医科大学附属第一医院中心实验室完成.材料:清洁级雄性近交系F344大鼠48只,由中科院上海实验动物中心提供.慢病毒载体质粒pNL-IRES2-EGFP、包装质粒pHELPER、包膜质粒pVSVG和293T细胞由美国杜兰大学陈一平教授惠赠;Ang1基因修饰质粒pNL-Ang1-IRES2-EGFP、rMSCs由福建省神经病学研究所张志坚教授惠赠.方法:包装、浓缩慢病毒,将携带Ang1基因慢病毒转导的rMSCs命名为Ang1-rMSCs,将未携带目的基因(空载体)慢病毒转导的rMSCs命名为Mock-rMSCs.48只大鼠结扎冠状动脉左前降支制作心肌梗死模型,2周后随机分为3组,分别于心肌梗死区注入5×1010L-1的Ang1-rMSCs,Mock-rMSCs,rMSCs.主要观察指标:RT-PCR检测Ang1 mRNA的表达,取心脏组织切片观察移植细胞的存活情况,通过超声心动图检测心功能,免疫荧光检测新生血管密度.结果:成功构建Ang1基因修饰的rMSCs,Ang1 mRNA在移植后28 d仍稳定表达.移植后28 d荧光显微镜下Angl-rMSCs组和Mock-rMSCs组心脏组织冰冻切片均可见大量EGFP阳性细胞,而rMSCs组未见EGFP阳性细胞,即移植的Ang1-rMSCs存活率明显增高.与Mock-rMSCs、rMSCs组比较,移植后7,28 d Ang1-rMSCs组左室射血分数、短轴缩短速率均显著增加(P<0.05),心功能明显改善;心肌梗死区毛细血管数明显增多(P<0.05).结论:Ang1基因修饰的rMSCs移植治疗大鼠心肌梗死后可促进血管再生,改善心功能.

人生长激素基因修饰成肌细胞移植对心肌梗死细胞凋亡及心功能的影响

背景:骨骼肌细胞移植于损伤心肌可以改善心脏功能,但大部分细胞在移植早期因损伤心肌的缺血及炎性氧化应激环境而发生死亡.研究证实通过细胞预处理或联合基因治疗可以改善移植细胞的生存.目的:探讨人生长激素基因修饰的成肌细胞移植对心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡和心功能的影响.设计、时间及地点:细胞学体内实验,于2007-05/2008 12在山西省长治医学院和华中科技大学同济医学院附属协和医院完成.材料:SD大鼠30只,随机分为3组:人生长激素组、绿色荧光蛋白组、模型对照组,10只,组.另取1-3 d龄SD乳鼠用于骨骼肌成肌细胞培养.pLghGHSN质粒、pLgGFPSN质粒由本实验室提供.方法:分别取携带人生长激素基因的pLghGHSN质粒和携带绿色荧光蛋白基因的对照质粒pLgGFPSN,用二步转染法转染E86和PT67包装细胞,G418筛选并扩增阳性克隆.各组大鼠均结扎左冠状动脉前降支制作心肌梗死模型,2周后人生长激素组将转染pLghGHSN的成肌细胞悬液150 μ L(含6×106个成肌细胞)分3点注射于心肌梗死区边缘,绿色荧光蛋白组同法注射等量转染pLgGFPSN的成肌细胞悬液,模型对照组沣射等体积无血清培养基.主要观察指标:细胞移植4周后,超声心动图和血流动力学检查各组心功能变化:苏木精一伊红染色检测心肌梗死面积,天狼星红染色检测胶原纤维容积分数:western blot法检测心肌组织Bax,Bcl-2,人生长激素和caspase3蛋白的表达.结果:与模型对照组比较,人生长激素组左室腔变小,左室游离壁厚度增加,左室舒张末期内径和左室收缩末期内径均显著减小(P<0.05),短轴缩短率显著增加(P<0.05).与绿色荧光蛋白组、模型对照组比较,人生长激素组大鼠左室压力大上升速率、左室压力大下降速率绝对值、左室收缩末压均显著升高(P<0.05),左室舒张末压显著降低(P<0.05):血清中类胰岛素样生长因子1质量浓度显著升高(P<0.05);心肌梗死面积明显减小(P<0.05);bax,caspase3蛋白表达水平降低,Bcl-2蛋白表达水平增加,人生长激素蛋白呈阳性表达.结论:人生长激素基因修饰的成肌细胞移植可以抑制心肌细胞凋亡,与单独成肌细胞移植相比能够更有效地缩小心肌梗死面积,更好地改善心肌梗死大鼠的心功能.

淫羊藿苷促进羊骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化

背景:寻找一种简单有效、安全价廉且可替代生长因子的生物活性物质,是骨组织工程的客观要求,中药来源的植物黄酮淫羊藿苷可通过提高成骨细胞功能促进成骨,但是对骨髓间充质干细胞的作用尚未明确.目的:探讨淫羊藿苷对羊骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-09/2009-02在南方医院创伤骨科实验室完成.材料:清洁级成年雄性中国青山羊3只,由南方医院实验动物中心提供.淫羊藿苷标准品由中国药品生物制品检定所提供,批号110737-200312,纯度98.3%.方法:体外分离培养羊骨髓间充质干细胞,传至第3代后,按2×103/孔接种至96孔板,分别加入100,10,1,0.1μmol/L淫羊藿苷培养基150μL进行培养;设立对照组,仅加入等量普通DMSO培养基.主要观察指标:采用MTT法检测细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期,通过碱性磷酸酶试剂盒测定细胞碱性磷酸酶活性,放免法检测细胞骨钙素表达,茜素红染色观察钙化结节形成能力.结果:0.1 μ mol/L淫羊藿苷可明显促进羊骨髓间充质干细胞增殖,增加S期和G2/M期细胞数量:随着淫羊藿苷浓度的增加,促细胞增殖活性降低,100 μmol/L淫羊藿苷表现为明显的抑制细胞增殖作用.淫羊藿苷呈剂量依赖性促进羊骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素表达.10,100 μ mol/L淫羊藿苷诱导钙化结节形成能力优于0.1和1μmol/L淫羊藿苷,对照组羊骨髓间充质干细胞未形成钙化结节.结论:淫羊藿苷对羊骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化具有促进作用,可被视为一种良好的骨诱导活性因子.

干细胞贴膜治疗脊髓损伤

背景:目前人们较多采用的成体干细胞移植,移植方式多形成再次损伤,且体内神经元分化的效率不高.目的:在以往分步诱导分化高效获得神经元前体细胞的基础上,制成干细胞贴膜,观察其贴敷移植治疗脊髓损伤功能恢复的效果.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-05/10在郑州大学医学院实验中心完成.材料:酶、化学法制作膜样基质:分离培养、扩增羊膜间充质干细胞,BrdU标记,调整部分细胞浓度为1×1011L-1成细胞悬液备用.余分步诱导并制成干细胞贴膜.方法:健康成年雄性SD大鼠88只,体质量220～250 g,以自制打击器制作急性脊髓损伤模型.模型成功后6 h,抽签法随机分为4组,每组22只.干细胞贴膜组:在T11进行椎板切除术,打开硬膜充分显露损伤脊髓,止血,将干细胞贴膜贴敷在损伤脊髓表面,手术显微镜下固定于硬膜,分层缝合肌肉皮肤:细胞移植组:损伤脊髓头尾端移植1×1011L-1细胞悬液共5 μ L,余同上;基质组:贴敷膜样基质在损伤脊髓表面,余同上;对照组:仅行椎板切除术,并打开硬膜.主要观察指标:术后第1天及其后1周1次共10周,进行BBB评分和斜板实验等运动功能检测:术后2,4,6周观察移植细胞存活及形态学变化,免疫组织化学SP法检测胶质纤维酸性蛋白、突触素及神经元特异性烯醇化酶的表达.结果:①运动功能检测:各组BBB积分在4周及以后达到稳定,以10周时BBB评分12及以上为重要的恢复指标,则干细胞贴膜组为100%,细胞移植组为33%,基质组和对照组仅为17%.斜板实验的顺位实验,干细胞贴膜组第10周时的角度与第4周相比有显著改善(P=0.027),而同组同时间点的BBB分值间差异无显著性意义(P=0.286).②干细胞贴膜组和细胞移植组远端损伤边缘BrdU阳性细胞计数差异无显著性意义(P=0.089).干细胞贴膜组BrdU阳性细胞多呈神经元形态,细胞移植组BrdU阳性细胞多呈小胶质细胞形态.⑨各组突触素、胶质纤维酸性蛋白表达均逐渐增强,神经元特异性烯醇化酶表达则呈减少趋势.干细胞贴膜组各时间点的突触素、神经元特异性烯醇化酶表达高于其他各组(P<0.05);胶质纤维酸性蛋白表达则低于其他各组且保持稳定(P<0.05).细胞移植组、基质组和对照组不同时间点的胶质纤维酸性蛋白表达差异有显著性意义且逐渐增高(P<0.05).结论:干细胞贴膜上的神经元前体细胞可以在早期整合到损伤脊髓中,长期存活,并且具有高效的神经元分化特性;干细胞贴膜脊髓表面贴敷移植有助于脊髓损伤区突触素的表达、神经网络重建和神经功能恢复:干细胞贴膜移植较单纯干细胞移植史能有效促进神经功能恢复.

基因转染骨髓间充质干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞

骨髓间充质干细胞在体外一定条件下分化成为胰岛细胞,既可以解决胰岛移植中供体紧缺的问题,又能够通过自体移植避免免疫排斥,还将避开胚胎干细胞研究所涉及的伦理道德问题,是治疗糖尿病的理想干细胞来源.研究发现可以将胰岛素基因及其他必需的基因直接导入来自糖尿病患者的原代细胞或其他成体干细胞如肝细胞、肠道上皮K细胞、成纤维细胞及肝脏肿瘤细胞等,使其转变为胰岛素分泌细胞即转基因的胰岛素分泌细胞.目前国际上主要的研究方向是如何将胰岛素基因有效地导入靶细胞,并使之呈生理模式表达.

干细胞移植治疗缺血性脑卒中的研究与现状

近年来,随着成年个体神经系统内神经干细胞的发现以及对其研究的不断深入,应用干细胞治疗缺血性脑卒中受到各国学者的广泛关注.大量的实验研究表明,干细胞可从不同程度上改善脑卒中后的神经功能,具有良好的临床应用前景.目前此类研究主要集中于2种途径,其一是利用内源性神经干细胞的激活治疗脑卒中,其二是利用外源性干细胞移植治疗脑卒中.文章就近年来应用各种干细胞治疗缺血性脑卒中的动物及临床实验研究现状进行综述,并对其存在的问题进行了分析和展望.

贵州省肿瘤医院血化中心王伟主任