中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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脐带血血清培养体系扩增人骨髓间充质干细胞及其生物学特征
背景:骨髓内的间充质干细胞含量极少,因此课题立项设计之一即如何得到足够数量的骨髓间充质干细胞,并避免细胞培养过程中因动物血清造成的病原体污染和异种血清所致的过敏反应.目的:拟建立脐带血血清培养系统,以实现体外扩增人骨髓间充质干细胞的目标.设计、时间及地点:开放性实验,于2006-09/2007-10在中南大学湘雅二医院细胞生物实验室完成.材料:12份骨髓标本由中南大学湘雅二医院和湖南省湘潭市中心医院提供,6例采自正常供者,6例采自拟行造血干细胞移植的肿瘤患者.方法:无菌条件下抽取未抗凝的脐带血,静置待血凝块完全析出后吸取血清,离心弃沉淀,取各项病原微生物检测均呈阴性的脐带血血清用于细胞培养,临用前56℃水浴灭活30min.抽取正常供者和肿瘤患者的骨髓液100mL/份,采用Ficoll Paque分离液分离骨髓单个核细胞,加入含体积分数为0.1脐带血血清的DMEM/F12进行传代培养.传至第3代低温、液氮冻存,4～8周后予以解冻复苏,胰蛋白酶消化传代.取第4代骨髓间充质干细胞,锥虫蓝染色后,加入成骨诱导体系培养14d,碱性磷酸酶染色;加入脂肪诱导体系培养14d,油红O染色.主要观察指标:绘制细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期及表面抗原的表达,骨髓间充质干细胞定向分化情况.结果:骨髓间充质干细胞扩增培养至第4代,接种后两三天为生长潜伏期,3～5d为对数增殖期,5～7d细胞生长缓慢进入平台期.采自正常供者和肿瘤患者的骨髓间充质干细胞,冻存前后扩增数量均基本相似(P0.05),细胞存活率均96%,CD29、CD73、CDl05阳性率均90%,CD31、CD34、CD45阳性率均5%,诱导2周后成骨细胞和脂肪细胞的阳性率均85%.结论:应用灭活脐带血清培养体系可成功扩增人骨髓间充质干细胞,且冻存前后骨髓间充质干细胞生物学特性没有明显改变.
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多种生长因子诱导小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞
背景:以往研究已证明胚胎干细胞可被诱导分化为胰岛素分泌细胞,但诱导时间较长,大部分需要1个月左右.目的:体外联合应用激活素A、全反式维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子和烟酰胺4种生长因子,观察能否在较短的时间内将小鼠胚胎干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞.设计:细胞观察实验.单位:上海市内分泌及代谢病研究所,上海交通大学医学院附属瑞金医院.材料:实验于2004-10/2006-02在上海市内分泌研究所完成.清洁级孕12.5～14.5d龄昆明小白鼠2只,由上海斯莱克实验动物有限公司提供,动物质量合格证号2004A034,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.小鼠胚胎干细胞株由法国里昂CNRSUMR5641实验室张昌贤教授提供.激活素A为R&D公司产品;全反式维甲酸,烟酰胺由Sigma公司提供;碱性成纤维细胞生长因子由Gibco公司提供.方法:取孕鼠胚胎,除去头部和内脏,将剩余组织剪碎,胰酶消化后制备细胞悬液,取上层离心重悬,按3×108L-1接种培养,传2～3代时作为滋养层细胞.将鼠胚胎干细胞接种到新鲜滋养层上,加入含白血病抑制因子的knockout DMEM培养基,常规培养两三天后按1:3～1:6传代,当细胞与细胞之间分开时加入含血清的培养液终止消化,离心弃上清,制成单细胞悬液按2.5×104密度接种,加入不含白血病抑制因子的培养液,24～48h后收集形成的胚胎体,铺于Matrigel铺底的培养皿中.胚胎体贴壁后,在含有100μg/L激活素的10% FBS/DMEM中培养24h,再将培液换为10% FBS/DMEM培养6~8h作为间隔,然后把分化的胚胎体在含10-6mol/L全反式维甲酸的10% FBS/DMEM中培养24h,在含10μg/L碱性成纤维细胞生长因子的10% FBS/DMEM中培养3～5d,在含N2、 B27、1μg/L层粘连蛋白、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子、10mmol/L烟酰胺的DMEM/F12培液中培养3～5d.诱导结束后,采用双硫腙染色、免疫荧光染色、RT-PCR检测分化细胞胰岛素的表达.主要观察指标:[1]胚胎干细胞的诱导情况.[2]双硫腙染色及免疫荧光染色.[3]RT-PCR检测.结果:[1]滋养层上的小鼠胚胎干细胞呈集落状态贴壁生长,集落边缘清晰,细胞之间的界限不明显.胚胎体形成后转至matrigel板上2d即贴壁.激活素A和全反式维甲酸间歇诱导后,碱性成纤维细胞生长因子培液中的细胞大部分变为上皮细胞样;经含N2、B27、层粘连蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、烟酰胺的DMEM/F12培液作用后,细胞形成小的簇状结构.[2]诱导生成的胰岛素分泌细胞经双硫腙染色呈暗红色,免疫荧光染色呈红色,均为阳性反应.[3]经激活素A、全反式维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子、烟酰胺四种生长因子诱导2周后,分化细胞不表达Insulin 1mRNA,表达Insulin 2, Pdx1, Nkx6.1, Nkx2.2, PP, LAPP, Glutt2, Somastatin, Hnf3 β及Neuro D mRNA.结论:体外联合应用激活素A、全反式维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子和烟酰胺4种生长因子,能够将小鼠胚胎干细胞成功诱导分化为胰岛素分泌细胞,且诱导时间缩短至2周.
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大鼠骨髓间充质干细胞诱导为类肝细胞移植修复急性肝损伤
背景:对于肝衰竭或肝功能支持替代方法来讲,原位肝移植供体来源有限,肝细胞移植受供体缺乏和免疫排斥反应的困扰,肝脏干细胞存在数量少且体外增殖困难等限制.目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞经肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子联合诱导为类肝细胞后移植对损伤肝脏的形态学修复效果.设计、时间及地点:细胞观察,于2006-10/2007-09在解放军总医院第一附属医院创伤实验室完成.材枓:清洁级Wistar大鼠48只,随机分为诱导组、对照组,24只/组.另取Wistar大鼠3只用于分离制备骨髓间充质干细胞.肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子由Sigma公司生产.方法:贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,胰酶消化传代,传至第3代向细胞中加入含20μg/L肝细胞生长因子、10g/L表皮细胞生长因子的D/F12培养液悬浮诱导,调整细胞密度为108L-1.两组大鼠均腹腔注射D-氨基半乳糖建立肝脏损伤模型,造模后24h,诱导组门静脉移植诱导后的骨髓间充质干细胞悬液1mL,对照组移植等量未经诱导的骨髓间充质干细胞.主要观察指标:移植后第1,7,14天,免疫组化检测CKl8、CD34阳性细胞的分布迁移情况.透射电镜观察汇管区新增生细胞的超微结构.结果:[1]与对照组比较,诱导组汇管区CKl8、 CD34阳性细胞明显增多,并从汇管区向肝小叶内迁移,不断分化为成熟的肝细胞;同时汇管区新生的小胆管数量亦明显增多,且有部分向坏死区迁移,参与肝脏的修复.[2]透射电镜下对照组卵圆形细胞数量较少,而诱导组汇管区有新生内源性细胞,可发现数个细胞排列成的小胆管,并逐渐演变为体积较大的肝细胞.结论:从形态学角度看,骨髓间充质干细胞向类肝细胞诱导分化后移植于受损伤的肝脏,可一定程度上修复肝脏损伤.
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牵拉应力在5-氮杂胞苷诱导骨髓间充质干细胞成肌过程中的动态效应
背景:国内外研究发现在一定力学环境下,体外培养的间充质干细胞其增殖分化等一系列生物学特性会发生相应变化.目的:体外观察5-氮杂胞苷与牵拉应力对大鼠骨髓间充质干细胞向肌细胞分化的调控作用.设计、时间及地点:2006-01/2007-06在上海交通大学牛物力学实验室完成的细胞观察实验.材料:清洁级3-4周龄雄性SD大鼠30只用于分离培养骨髓间充质干细胞,1～3d龄SD新生鼠4只用于建立骨骼肌阳性细胞株.化学诱导剂5-氮杂胞苷为Sigma公司产品,牵拉设备Fx-4000 Flexercell由美国Flexcell Int公司生产.方法:将传至第4代的骨髓间充质干细胞接种于Flex 6孔板.[1]设立5组行成肌家族因子表达Western-Blot检测:第1组细胞单纯经10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导1周;第2～4组细胞以10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导1周后,在1Hz频率、15%幅度应力条件下分别牵拉12,24,36h;第5组以新生鼠骨骼肌细胞作为阳性对照.[2]设立5组行诱导剂及牵拉应力作用的RT-PCR检测:第1组细胞给予1Hz频率、15%幅度应力牵拉24h;第2、3组分别经10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导1,2周;第4组细胞经10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导2周后,给与同等应力牵拉24h;第5组以新生鼠骨骼肌细胞作为阳性对照.主要观察指标:不同诱导条件及应力牵拉状态下骨髓间充质干细胞成肌家族因子的表达.结果:[1]第1组表达成肌因子MyoD与Myf5,成熟肌细胞标志MHC表达不显著;第2～4组MyoD与Myf5的表达明显增强(P<0.05),且随牵拉时间延长因子的表达逐步增强,MHC表达不显著.[2]第1组不表达成肌家族因子;第2组表达MyoD、 Myf5,第3组表达MyoD、 Myf5、 desmin,第4组几乎表达所有检測的肌细胞特异性标记.结论:经5-氮杂胞苷诱导可启动骨髓间充质干细胞向肌细胞分化,单独的牵拉应力不能诱导成肌.牵拉应力可调控5-氮杂胞苷对骨髓间充质干细胞的诱导分化进程,并且与牵拉作用时间成正性相关.
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三种细胞因子体外联合诱导兔骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞的分化
背景:已证实血管内皮细胞种植于组织工程材料上在体内可增殖分化形成血管,但获取内皮细胞时创伤较大,且来源极其有限.目的:观察在血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1体外联合诱导下,兔骨髓间充质干细胞能否向血管内皮细胞分化.设计、时间及地点:2006-11/2007-06在辽宁医学院附属第一医院中心实验室完成的细胞对照观察.材料:清洁级8周龄日本大耳白兔1只用于骨髓间充质干细胞的分离培养.血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1均为Peprotech公司产品.方法:兔麻醉后抽取骨髓液,贴壁法+胰酶消化分离培养获得足够数量的骨髓间充质干细胞,分为两组,诱导组向含10%胎牛血清的DMEM培养液中加入10μg/L血管内皮细胞生长因子、1μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2μg/L胰岛素样生长因子1,诱导2周.对照组单纯加入含10%胎牛血清的DMEM培养液.主要观察指标:对诱导后细胞进行形态观察、NO含量测定、Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色以及电镜观察Weibel-Palade小体形成情况.结果:诱导5d后细胞呈集落样分布,形态趋于圆形;未诱导细胞均匀散在分布,呈长梭形和三角形.诱导14d后,诱导组细胞培养上清液中NO含量明显高于对照组(t=3.75, P<0.05).诱导组表达血管内皮细胞特有表面标志Ⅷ因子,超微结构可见Weibel-Palade小体;对照组Ⅷ因子相关抗原呈阴性表达.结论:兔骨髓间充质干细胞经上述3种细胞因子体外联合诱导后,可向血管内皮细胞方向分化.
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人胎盘组织来源造血干/祖细胞及其特性
背景:近年来的研究表明,除已知的人骨髓、外周血和脐带血中存在造血干/祖细胞外,人胎盘组织中也有造血干/祖细胞存在.目前为止,还缺乏对人胎盘组织造血干/祖细胞的增殖分化特性及人胎盘组织淋巴细胞亚群组成和免疫原性等的深入研究.目的:探究人胎盘组织是否含有比脐带血更丰富的造血干/祖细胞,并对其造血祖细胞系增殖分化能力进行检测,同时对人胎盘组织淋巴细胞亚群组成及表型特征进行分析.设计、时间及地点:开放性实验,于2004-01/2006-12在贵州省细胞工程重点实验室完成.材料:经产妇知情同意,无菌采集遵义医学院附属医院产科健康足月分娩新生儿胎盘和脐带血共12份.淋巴细胞亚群检测试剂盒,CD34绝对计数试剂盒(Becton Dickinson公司):CD34磁珠分选试剂盒,FITC标记的CD38单克隆抗体,抗FITC磁珠和MS/LS免疫磁式细胞分选柱(Miltenyi Biotec).方法:脐带血与RPMI-1640培养基(含体积分数为0.1的胎牛血清)按1:1的比例混合,采用Ficoll-Histopaque分离液离心30min,吸取界面层细胞,PBS洗涤一次,获得脐带血单个核细胞.采用机械法加0.25g/L胶原酶消化制备胎盘组织单个细胞悬液,之后同脐带血单个核细胞分离步骤分离胎盘单个核细胞.流式细胞仪检测胎盘单个核细胞中CD34+CD38-, CD34+CD38+造血干/祖细胞(HSPCs)和淋巴细胞亚群的组成比例.免疫磁珠分选法分选人胎盘CD34+CD38-,CD34+D38+造血干/祖细胞,并分别进行粒细胞-单核细胞集落生成单位、红细胞爆裂型集落生成单位、混合集落生成单位系集落形成培养,以评价其造血祖细胞系增殖分化能力.实验全程用脐带血作平行比较分析.主要观察指标:胎盘和脐带血CD34+造血干/祖细胞组成百分率、祖细胞系集落形成能力、淋巴细胞亚群表型及组成特点.结果:[1]胎盘CD34+造血干/祖细胞百分率是脐带血的8.8倍,差异有显著性意义(P<0.01).[2]胎盘中的淋巴细胞总数、T细胞(CD3+CD2+)、B细胞(CD19+)、Th(CD3+CD4+)细胞及Th/Ts比值均明显低于脐带血,而CD8+CD28-T抑制细胞则明显高于脐带血,差异有显著性意义(P<0.01).[3]胎盘CD34+CD38+造血干/祖细胞亚群培养形成的粒细胞-单核细胞集落生成单位、红细胞爆裂型集落生成单位、混合集落生成单位集落数明显高于CD34+CD38-造血干/祖细胞亚群(P<0.01);胎盘与脐带血造血干/祖细胞中相同表型细胞亚群形成的各系集落数比较,差异无显著性意义(P0.05).结论:人胎盘组织富含CD34+造血干/祖细胞,其CD34+CD38+、CD34+CD38-两个造血干/祖细胞亚群均具有增殖分化为粒细胞-单核细胞集落生成单位、红细胞爆裂型集落生成单位、混合集落生成单位的能力,并且人胎盘组织具有淋巴细胞亚群低比例和抑制性T细胞高比例的特点,使其有望成为造血干/祖细胞移植的新来源.
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Wnt信号通路在大鼠气管干细胞增殖分化过程中的时空表达
背景:实验前期项目己协同有关人员创立了体外观察气管干细胞的模型,并解决了气管干细胞的定位、分离及性状分析.但在气管干细胞的增殖分化过程中,究竟有哪些基因参与及其各自作用、气管干细胞可产生功能细胞的分化程序至今仍不清楚.目的:利用氟尿嘧啶诱发离体气管上皮损伤,检测气管干细胞增殖分化损伤重建过程中Wnt信号途径成员的时空表达变化.设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-06/2007-06在沈阳医学院中心实验室完成.材料:清洁级2周龄Wistar大鼠18只,用于制备离体气管环.氟尿嘧啶由天津人民制药厂生产.方法:将镜下观察纤毛摆动情况良好的气管环分为两组:损伤组将气管环置于含12.5mg/L氟尿嘧啶的HamsF-12液中,作用12h后去除氟尿啼啶,换成新鲜的HamsF-12液继续培养,分别于3,6,12,24,48h取部分等量组织块.对照组用等体积HamsF-12液代替氟尿嘧啶,其余培养条件及取材时间同损伤组.主要观察指标:RT-PCR法检测气管上皮中Wnt-1、β-连环蛋白、T细胞因子、c-myc基因表达的变化.结果:氟尿嘧啶作用12h后,光镜下可见少数间隔分布、近于裸核的细胞,呈钉状位于基底膜上,前期实验己证明其为气管干细胞.RT-PCR结果显示,对照组气管上皮无Wnt-1和T细胞因子mRNA的表达,β-连环蛋白与c-myc mRNA轻度表达.损伤组经氟尿嘧啶作用后,可检测到Wnt-1 mRNA的表达,β-连环蛋白mRNA一时性轻度下降:Wnt-1、β-连环蛋白、T细胞因子、c-myc mRNA分别于去除氟尿嘧啶后3,6,12h达到高峰;24h后三者mRNA表达水平均下调:至48h Wnt-1 mRNA无表达,后三者mRNA少量表达.结论:在整个气管上皮重建过程中,Wntl、β-连环蛋白、T细胞因子和c-myc mRNA的表达变化基本遵循相似的规律,提示Wnt信号通路作为一个整体参与气管干细胞增殖分化过程的调控.
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血小板裂解液对大鼠骨髓间充质干细胞生长的影响
背景:血小板裂解液是将浓缩血小板进一步裂解后所获得的液体成分,含有多种生物活性因子.有研究认为血小板裂解液可促进成骨细胞的增殖,而其对骨髓间充质干细胞生物学功能的影响还不太了解.目的:探讨血小板裂解液对大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖的影响.设计、时间及地点:独立样本观察,于2007-09/2008-01在山西省医用组织库完成实验.材料:清洁级成年健康Wistar大鼠8只.方法:取2只大鼠股骨,全骨髓培养法传代扩增骨髓间充质干细胞.自6只大鼠心内采血,采用3次离心结合反复冻融法制备血小板裂解液.取第5代骨髓间充质干细胞,以含10%胎牛血清的L-DMEM/F12作为基础培养基组,在此基础上分别加入血小板裂解液至终浓度为1%和5%作为条件培养基组.主要观察指标:ELISA法测定血小板裂解液中生长因子含量.CASY细胞分析仪计数活细胞.双缩脲法全自动生化分析仪检测细胞总蛋白含量.倒置显微镜动态观察细胞形态变化与生长状况.结果:[1]血小板裂解液中的血小板衍生生长因子、转化生长因子B 1、胰岛素样生长因子1和血管内皮细胞生长因子含量分别为(300±30), (140±25), (80±35), (70±20)ng/L.[2]自培养第3天开始,条件培养基组活细胞数均明显高于基础培养基组(p<0.05),且含5%血小板裂解液的条件培养基组升高幅度尤为显著,于第3天达到对数生长期,比基础培养基组提前约1d,细胞总数在第4,9天时达基础培养基组的近3倍.[3]培养1周后条件培养基组每106个细胞中的总蛋白含量均显著高于基础培养基组(P<0.05).[4]骨髓间充质干细胞在不同浓度血小板裂解液培养条件下,细胞形态基本一致,多为长梭形,类似于成纤维细胞.结论:血小板裂解液是多种生长因子的承载体系,具有丝裂原功效,可在体外促进大鼠骨髓间充质干细胞的生长增殖,且该效应存在一定程度的剂量依赖性.
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鼠尾胶在小鼠外周血间充质干细胞分离培养中的作用
背景:动物和人外周血中分离出的间充质干细胞生长繁殖受分离方法、培养条件等因素的影响.目的:采用重组人粒细胞集落刺激因子动员小鼠外周血间充质干细胞,体外培养条件中加入鼠尾胶包被,观察其对细胞分离、培养、增殖的影响.设计、时间及地点:开放性实验,于2005-05/2007-12在郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所完成.材料:昆明小鼠20只随机分为鼠尾胶包被组和不包被对照组,每组10只.方法:小鼠皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子80μg/(kg·d)连续动员5d,后一次注射后6h取外周血.肝素抗凝后,采用全血细胞分离培养,用含体积分数为0.15胎牛血清DMEM培养基,分别接种于包被和未包被鼠尾胶的12孔板,接种密度为1×105/孔,48h后半量换液以后每3天换液1次,培养10d.主要观察指标:[1]鼠尾胶包被的培养板对形成成纤维样细胞集落的影响.[2]成纤维样细胞集落中的间充质干细胞表面标记流式检测结果.[3]成纤维样细胞集落成骨、成脂肪诱导后嗜银法和油红O法染色鉴定.结果:[1]使用鼠尾胶包被的培养板可增加重组人粒细胞集落刺激因子动员后外周血成纤维样细胞集落出现的频率(P＜0.05).[2]经流式细胞术鉴定形成成纤维样细胞集落的细胞不表达CD34、CD133,表达CD90、CD105.[3]成骨、成脂肪诱导后细胞嗜银法和油红0法染色鉴定均呈阳性.结论:培养的细胞符合公认间充质干细胞的特征,鼠尾胶可增加培养皿的黏附性促进间充质干细胞分离.
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鸡血藤单体化合物对骨髓抑制小鼠造血祖细胞增殖的影响
背景:机体造血主要依靠造血祖细胞来扩增,当受到放射线、化学药物等损伤时,即会发生造血功能障碍.目的:观察从传统中药鸡血藤中提取的九个单体化合物对骨髓抑制小鼠造血祖细胞增殖的影响.设计: 随机对照实验.单位:中国人民解放军总医院临床药理研究室.材料:实验于2002-11/2003-02在中国人民解放军总医院药理研究室完成,选用348只健康昆明种小鼠,体质量22.25g,清洁级,雌雄各半,由解放军军事医学科学院实验动物中心提供,许可证号码为SCXK-2001-001.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.鸡血藤由中国人民解放军总医院中药房提供,单体化合物没食子儿茶素、芒柄花素、儿茶素、焦性粘液酸、丁香酸、Demethylvestitol、间苯三酚、芒柄花甙、表儿茶素由中国医学科学院药物研究所从鸡血藤乙酸乙酯部位中分离.TGL-16型离心机为上海医疗器械六厂生产,CO2培养箱为日本SANYO公司产品,MK型倒置显微镜为日本OLYMPUS公司产品.方法:[1]实验分组:随机抽签法将小鼠分为29组:鸡血藤九种单体化合物没食子儿茶素、芒柄花素、儿茶素、焦性粘液酸、丁香酸、Demethylvestitol、间苯三酚、芒柄花甙、表儿茶素高剂量组、中剂量组及低剂量组共27组,同时设立正常组及对照组,每组12只.[2]实验干预:除正常组外,小鼠均给予全身60Co γ射线照射,剂量为4Gy.照射后第3天,9种单体化合物高、中、低剂量组小鼠分别腹腔注射2,0.4,0.08g/L相应单体化合物药液0.5mL,正常组和对照组小鼠腹腔注射等体积的生理盐水.[3]实验评估:给药30min后分別取正常组及对照组各8只及其他组全部小鼠静脉血制备正常、对照及各单体含药血清,取对照组剩余4只小鼠的骨髓细胞进行造血祖细胞培养,培养分为对照组和九个单体化合物高、中、低剂量组,分别在各组培养体系中加入对照及各单体含药血清,另取正常组小鼠4只进行骨髓造血祖细胞培养作为细胞培养的正常组,通过计数各组CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-Meg集落数来观察九个单体化合物对骨髓抑制小鼠造血祖细胞增殖的影响.主要观察指标:各组CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-Meg集落数.结果:纳入小鼠348只,均进入结果分析,无脱失值.[1]CFU-E集落数:儿茶素、没食子儿茶素、丁香酸、表儿茶素高剂量组CFU-E显著高于对照组(P<0.05-0.01),儿茶素中、低剂量组及没食子儿茶素中剂量组CFU-E也显著高于对照组(P<0.05).[2]CFU-GM集落数:除焦性粘液酸、芒柄花甙各剂量组外,鸡血藤其余单体化合物各剂量组CFU-GM均较对照组明显增加(P<0.01).[3]BFU-E集落数:儿茶素、没食子儿茶素、丁香酸各剂量组及表儿茶素高、中剂量组的BFU-E较对照组明显增加(P<0.05).[4]CFU-Meg集落数:儿茶素和表儿茶素各剂量组、丁香酸高、低剂量组及没食子儿茶素低剂量组的CFU-Meg显著高于对照组(P<0.05).对照组所有集落数均明显少于正常组,差异有统计学意义(P<0.01).结论从中药鸡血藤中提取的单体化合物可刺激骨髓抑制小鼠造血祖细胞的增殖,其中儿茶素的刺激增殖活性相对强.
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昆明小鼠胚胎干细胞的分离培养方法
背景:目前已经建立了数百个小鼠的胚胎干细胞系,这些细胞系大多数来源于129,C57BL/6J和BALB/C品系的小鼠,而昆明株小鼠的胚胎干细胞建系的成功率很低.目的:探寻昆明小鼠胚胎干细胞分离培养的方法,以期提高昆明小鼠胚胎干细胞建株的成功率.设计、时间及地点:以细胞为对象的观察性实验,于2006-04/2007-06在重庆市神经病学重点实验室完成.材料:昆明白小鼠3.5d和4d胚龄的囊胚.方法:分别将昆明白小鼠3.5d和4d胚龄的囊胚培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,四五天后取隆起生长的内细胞团块分离后再培养,分别采用2.5g/L胰蛋白酶-0.4g/L乙二胺四乙酸与1g/L胰蛋白酶0.2g/L乙二胺四乙酸室温作用2～4min并辅以机械离散胚胎干细胞集落.主要观察指标:观察集落的生长情况,通过碱性磷酸酶染色、OCT-4染色、细胞核型分析等对细胞集落进行鉴定.结果:[1]4d胚龄胚胎的贴壁率、内细胞团出现率及克隆形成率高于3.5d胚龄(P<0.05).[2]采用1g/L胰蛋白酶-0.2g/L乙二胺四乙酸室温作用2～4min并辅以机械作用,分离克隆胚胎干细胞效果较好.[3]胚胎干细胞呈集落性生长,符合小鼠胚胎干细胞的一系列特性,悬浮培养胚胎干细胞能得到囊状胚体.结论:采用4d胚龄的囊胚和1g/L胰蛋白酶-0.2g/L乙二胺四乙酸室温作用2～4min,并辅以机械作用的消化方法,有助于提高昆明小鼠胚胎干细胞建株的能力.
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人脐血间质干细胞向神经元样细胞分化的诱导因素
背景:研究证明脐血间质干细胞可向神经元样细胞分化,要同时保证脐血间质干细胞的扩增能力与分化潜能.其培养和诱导分化条件的优化显得尤为重要.目的:分析筛选人脐血间质干细胞向神经元样细胞体外诱导分化过程的影响因素.设计、时间及地点:随机对照实验,于2006-08/2007-05在河南省红十字血液中心血液成分应用研究所完成.材料:脐血来自郑州市妇幼保健院正常足月分娩的胎儿,平均采血量95mL.重组人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子购自Sigma公司:分离细胞所用的四联袋为山东威高集团公司产品.方法:取采集6h内的脐血,采用四联袋密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,以5×109L-1接种于DMEM/F12培养基中.[1]细胞因子实验:单独细胞因子组加入20μg/L B27、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子:细胞因子联合组在此基础上加入5μg/L重组人表皮生长因子.[2]红细胞混入量实验:裂解组加入红细胞裂解液1mL,裂解后红细胞混入量为(0.44+±0.13)×108/份:少红细胞组红细胞混入量为(0.51±0.21)×108/份,多红细胞组红细胞混入量为(2.65±1.28)×108/份.[3]首次换液时间实验:分别于接种后48h、7d首次换液.[4]诱导分化:将碱性成纤维细胞生长因子、重组人表皮生长因子共诱导7d的细胞爬片进行巢蛋白免疫组织化学染色.主要观察指标:观察不同因素对脐血间质干细胞增殖分化的影响.检测诱导分化后神经干细胞巢蛋白的表达.结果:培养7d后,表皮生长因子与碱性成纤维细胞生长因子联合诱导促细胞增殖的效果优于单独应用碱性成纤维细胞生长因子(t=2.880,P<0.05);红细胞裂解液组、多红细胞组贴壁细胞数明显低于少红细胞组(t=7.332～7.550,P<0.05),即混入的红细胞总量不大于108/份对细胞增殖无影响:接种后7d首次换液所获贴壁细胞数明显多于接种后48h首次换液(P<0.05).两种细胞因子共诱导后,神经干细胞巢蛋白呈阳性表达.结论:在脐血间质干细胞向神经元样细胞诱导分化过程中,细胞因子、红细胞混入量及首次换液时间都是重要的影响因素.
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应用间期荧光原位杂交技术检测骨髓增生异常综合征第5,7,8号染色体异常
背景:常规细胞遗传学分析只能分析中期细胞,且受染色体数量和质量的影响.近年来发展的荧光原位杂交技术能在染色体制片和骨髓涂片上分析大量的中期或间期细胞,从而检测染色体的数目及其结构异常.目的:应用荧光原位杂交技术对骨髓增生异常综合征常见染色体异常情况进行检测,并与常规细胞遗传学分析结果作比较.设计、时间及地点:病例分析,于2006-08/2007-09在北京大学深圳医院进行.对象:选取同期在北京大学深圳医院初诊及随访并进行染色体检查的48例骨髓增生异常综合征患者,诊断和分型参照FAB标准.以同期住院的5例缺铁性贫血患者作为对照.实验所用双色探针及CEP8 SpectumAqua探针均购于Vysis公司.方法:患者骨髓标本均采用R显带技术进行常规细胞遗传学分析,以直接法或短期培养法制片,平均每例至少分析20个核型.剩余染色体标本进行荧光原位杂交检测,采用气干法滴片,按探针:水:杂交缓冲液=1:2:7配成工作液,加至玻片杂交区域内,应用荧光显微镜在滤色镜激发下观察间期细胞的红/绿色荧光杂交信号,每例分析200个细胞.主要观察指标:两种技术对骨髓细胞染色体异常阳性率的检测.结果:48例骨髓增生异常综合征患者随访24个月,共38例存活.[1]细胞遗传学分析检出染色体异常18例(37.5%),其中复杂异常4例(8.3%),5号染色体缺失或5号染色体长臂部分缺失5例(10.4%)、7号染色体缺失或7号染色体长臂部分缺失5例(10.4%)、8号染色体增加8例(16.6%)、20号染色体长臂部分缺失2例(4.6%)、不一致的易位3例(6.2%).[2]荧光原位杂交检测除证实细胞遗传学分析发现的5号、7号染色体异常各5例,以及8号染色体异常8例外,还检出2例5号染色体长臂部分缺失、5例7号染色体长臂部分缺失、1例7号染色体缺失,12例8号染色体增加,5号、7号、8号染色体异常阳性率分别增至14.5%,22.9%和41.7%.结论:采用组合探针的荧光原位杂交技术对于骨體增生异常综合征的5号、7号、8号染色体异常阳性检测率要高于细胞遗传学分析,但因其不能检出染色体易位而无法代替细胞遗传学分析.提示两种技术相结合可提高检测骨髓增生异常综合征染色体异常阳性率.
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体外培养基中加入细胞生长因子诱导大鼠骨髓单个核细胞向内皮细胞的分化
背景:内皮祖细胞在骨髓中的含量高于外周血,但也仅占骨髓单个核细胞的1%.因此,在一般实验室培养过程中也需要解决提高内皮祖细胞体外扩增数量并保持其低分化状态的问题.目的:观察在含胎牛血清的M199培养基中加入血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子诱导内皮祖细胞的定向分化能力.设计、时间及地点:以细胞为观察对象的开放性实验,于2007-09/2008-02在辽宁中医药大学教学实验中心bsl-2级实验室完成.材料:体质量(200±20)g的健康成年Wistar大鼠.方法:无菌采集健康Wistar大鼠股骨骨髓,应用Ficoll密度梯度离心的方法获得单个核细胞,加入含胎牛血清+肝素+血管内皮细胞牛长因子和碱性成纤维细胞生长因子的M199实验培养液和不含诱导生长因子与肝素的M199培养液为对照组.主要观察指标:诱导骨髓细胞向内皮样细胞生长过程中,应用表面抗原免疫细胞化学染色鉴定细胞,以Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光实验鉴定培养细胞向内皮细胞分化的程度.结果:贴壁细胞培养诱导后具有内皮细胞的形态学特征,细胞呈上皮细胞样铺路石状贴壁生长,贴壁时间相对缓慢.加入M199实验培养液诱导后的第9天Ⅷ因子、CD31阳性表达的细胞分别为(55.1±7.2)%、(45.64±5.8)%, Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色阳性率为(78.2±5.4)%,提示为正在分化的内皮祖细胞.对照组相关抗原表达阴性,提示为分化早期的骨髓细胞.结论:结果显示骨體单个核细胞培养出可稳定扩增的内皮祖细胞,在体外特殊诱导环境下定向分化为内皮样细胞,且效果优于对照组.
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成人骨髓间充质干细胞的鉴定与体外BrdU标记
背景:目前尚未发现骨髓间充质干细胞独有的标志分子,给其鉴定带来一定困难.BrdU标记不存在放射性污染,有研究认为在不受到紫外线照射的条件下,BrdU标记后对细胞功能无损害.目的:探讨成人骨髓间充质干细胞体外鉴定和标记的方法,并观察其生物学特性.设计、时间及地点:细胞观察,于2007-06/12在解放军兰州军区兰州总医院完成.材料:成人骨髓来自5例健康志愿者.BrdU为美国Sigma公司产品.方法:采集成人骨髓10mL,密度梯度法分离单个核细胞,加入含10%胎牛血清的DMEM培养基,调整细胞密度为2×108L-1进行扩增培养.取第3代骨髓间充质干细胞,加入成骨诱导培养基,行碱性磷酸酶染色;加入成脂诱导培养基,行油红O染色;加入终浓度为5,10,15μmol/L BrdU溶液,孵育12,24,48,72,96h后行免疫细胞化学染色.主要观察指标:倒置光学显微镜下观察细胞生长及增殖情况,流式细胞仪鉴定细胞表型,成骨及成脂诱导分化结果.BrdU阳性标记率及标记后细胞生长情况.结果:[1]体外培养的成人骨髓间充质干细胞形态均一,为梭形或纺锤形的成纤维细胞样外观;表达CD44和CD71,不表达CD34和HLA-DR;可定向诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞.[2]大部分骨髓间充质干细胞标记后核抗BrdU染色阳性,随着标记浓度的升高和标记时间的延长,BrdU阳性率逐渐增高,终浓度10μmol/L BrdU标记72h后阳性率达90%以上,且连续传9代均可检测到BrdU阳性细胞.第3代骨髓间充质干细胞90%处于G0/G1期,BrdU标记后88.62%处于G0/G1期,标记前后细胞生长周期无明显变化.结论:通过形态学特征、表面标记和多向分化潜能可以鉴定体外分离培养的细胞为成人骨髓间充质干细胞;BrdU标记可用于成人骨髓间充质干细胞移植入体内后存活、生长和分化的动态示踪观察;BrdU佳标记浓度和时间分别为10μmol/L和72h.
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自体外周血干细胞移植治疗糖尿病下肢血管病变与糖尿病足效果:89例自身对照观察
背景:骨髓干细胞在一定诱导条件下可分化成为血管性内皮细胞的特性,促进侧支循环的建立,从而改善缺血组织血供.目的:观察自体外周血干细胞移植治疗糖尿病下肢血管病变与糖尿病足的临床效果.设计:自身前后对照观察.单位:武汉市中心医院.对象:选择2005-07/2007-05在武汉市中心医院内分泌科收治的89例2型糖尿病下肢血管病变患者,均符合1999年WHO糖尿病诊断及分型标准,且合并糖尿病周围血管病变及糖尿病足.男61例,女28例.年龄45-90岁,平均67岁.病变部位主要为双下肢,伴足部溃疡者54例,伴坏疽者8例.所有受试对象均对检测项目知情同意,实验经过医院伦理委员会批准.实验用重组人粒细胞集落因子购自中国麒麟鲲鹏生物药业有限公司.方法:[1]干细胞动员:全部患者均皮下注射重组人粒细胞集落因子500～600μg/d,注射5d后采集外周血干细胞,采集物总量83～103mL,单个核细胞数量1.86～3.39×1011L-1,CD34+矿细胞为0.55%～1.36%.[2]外周血干细胞移植:患者均行静脉麻醉,将采集的外周血干细胞悬液按3cm2×3cm2间距进行缺血肢体肌间分层注射.主要观察指标:[1]自体外周血干细胞移植前及移植后1,3和6月患肢疼痛、冷感、间歇性跛行、踝肱指数、肢体皮温及深部感觉检测及评估.[2]应用彩色超声多普勒、CT及血管造影检测患者下肢血管形态学变化.结果:纳入患者89例,89例患者均进入结果分析,无脱落者.[1]临床症状评分:自体外周血干细胞移植后不同时间点患肢疼痛、冷感、间歇性跛行情况较移植前均有改善,且随着时间延长改善程度逐渐增加,差异有显著性意义(P<0.05).[2]踝肱指数:随自体外周血干细胞移植时间的延长患者踝肱指数均有不同程度增高,差异有显著性意义(P<0.05).[3]肢体皮温及深部感觉检测结果:移植后患者肢体皮温较移植前有所升高,差异有显著性意义(P<0.05),深部感觉检测肢体感觉功能有所改善,差异无统计学意义(P0.05).[4]影像学检测结果:移植后患者下肢血管彩色多普勒与移植前比较未见明显变化;CT及血管造影显示23例患者有不同程度新生侧支血管形成.结论:自体外周血干细胞移植可增加糖尿病下肢血管病变与糖尿病足患者的下肢血流,促进部分患者下肢血管新生.
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短程高剂量重组人粒细胞-集落刺激因子对小鼠外周血造血干细胞的动员作用
背景:外周血造血干细胞用于损伤组织的修复及再生需要快速有效的动员方法.常规的动员方案多采用重组人粒细胞-集落刺激因子或大剂量化疗联合重组人粒细胞-集落刺激因子,该方案耗时长、程序复杂.目的:对常规的外周血造血干细胞动员方案进行改进,观察短程高剂量重组人粒细胞-集落刺激因子动员KM小鼠外周血造血干细胞的效果.设计、时间及地点:于2006-09/2007-03在大连医科大学附属第二医院血液科实验室开展的随机对照动物实验.材料:雄性8周龄KM小鼠24只,以给药方式分为3组;常规给药组、短程高剂量给药组、生理盐水对照组.方法:常规给药组,皮下注射重组人粒细胞-集落刺激因子.0.2μg次,2次/d,共6d;短程高剂量给药组,前4d注射等量生理盐水,后2d皮下注射重组人粒细胞-集落刺激因子.2.5μg次,2次/d;生理盐水对照组,每日注射等量生理盐水,共6d.主要观察指标:各组小鼠外周血白细胞计数、粒-巨核细胞集落数.结果:常规剂量组及短程大剂量组小鼠外周血白细胞迅速增高,对照组无明显变化.粒-巨核细胞集落培养7d后,常规剂量组和短程高剂量组的粒-巨核细胞集落计数较对照组显著升高达50倍以上(P<0.01),常规剂量组和短程高剂量组两组间比较差异无显著性意义(P0.05).结论:短程高剂鼠重组人粒细胞-集落刺激因子动员小鼠外周血造血干细胞,有着良好的可行性及有效性,是对小鼠外周血造血干细胞动员模型的成功改进
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脊髓损伤大鼠内源性神经干细胞/前体细胞的增殖与分化
目的:目前认为大脑和脊髓中有内源性神经干细胞/前体细胞存在,但脑和脊髓损伤后这些内源性神经干细胞/前体细胞的活化、增殖、分化机制仍不清楚.应用5-溴2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo2-deoxyuridine, BrdU)体内标记的方法,观察了大鼠脊髓损伤后内源性神经干细胞/前体细胞的增殖、分化变化过程.方法:实验于2007-04/09在珠江医院中心实验室进行.[1]实验材料:36只同一窝别雌性SD大鼠由南方医科大学动物实验中心提供,体质量200～220g,按照随机数字表法将大鼠分为对照组、预标记组和损伤后标记组,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.[2]实验方法:采用Allen法建立脊髓损伤模型,损伤后连续10d腹腔注射Brdu来标记损伤后活化增殖的细胞;对照组采用Brdu连续10d腹腔注射,以标记脊髓内保持分化活力的细胞;预标记组在Brdu连续10d腹腔注射标记后,于第12天进行脊髓损伤.[3]实验评估:采用免疫组织化学法检测Brdu标记的内源性神经干细胞/前体细胞增殖情况.结果:[1]对照组可见整个脊髓切片均有大量的Brdu阳性细胞存在,这些细胞主要分布于脊髓外侧区域.[2]与对照组比较,预标记组Brdu阳性细胞在损伤后1d明显减少,7d后增多,21d后逐渐恢复并超过对照组水平.[3]损伤后标记组在损伤后1d即见大量Brdu阳性细胞增殖,阳性细胞数亦较预标后损伤1d时明显增多,损伤后7d Brdu阳性细胞数达到高峰,并超出对照组水平,这些细胞分布于损伤周围的灰质及室管膜区,但在损伤后21d, Brdu阳性细胞数未见继续增加.与对照组相比,损伤后标记组有较多的巢蛋白阳性细胞在室管膜区表达,1d即有增加,在7d达到高峰,21d减少.结论:脊髓损伤后出现明显的细胞增殖、分化反应,主要存在损伤后1周以内,1d即可见明显增生,尤以7d时明显,21d保持平稳,这些细胞主要分布在损伤脊髓中央管周围的室管膜区和损伤区域周围.
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卵圆细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞
背景:原代分离的肝卵圆细胞具有双向分化的能力和橫向分化的可塑性.目的:分离大鼠肝脏卵圆细胞,在化学诱导剂作用下使其定向分化为胰岛素分泌细胞.设计、时间及地点:对照观察细胞实验,于2007-05/2008-01在解放军总医院基础研究部,国家重点实验室完成.材料:SPF级SD大鼠,体质量(120±20)g.方法:采用改良梯度离心法分离、培养大鼠肝卵圆细胞,并行免疫组织化学鉴定.随后将卵圆细胞置于含有诱导剂Nicotimide和高浓度葡萄糖的RPMI 1640培养液继续培养,同时以不含诱导剂的RPMI 1640培养液培养的卵圆细胞作为阴性对照.主要观察指标:采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、酶联免疫吸附实验、放射免疫分析检测两组卵圆细胞胰岛素的表达.结果:改良的梯度离心方法分离的细胞具干细胞特点,可形成集落,并且OV6、CD34、Nestin染色呈阳性.分离的大鼠肝卵圆细胞,加入诱导剂Nicotimide和高浓度葡萄糖诱导培养l周后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、酶联免疫吸附、RIA检测均显示胰岛素分泌量远高于不含诱导剂细胞(P<0.05).结论:化学诱导剂Nicotimide和高浓度匍萄糖可以在短时期内作用肝卵圆细胞可启动胰十二指肠同源盒基因-1基因,使之定向分化为胰岛素分泌细胞.
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超声心动图评价自体外周血干细胞移植对心肌梗死并发心功能不全患者左室重构和心功能的影响
背景:血运重建虽能挽救缺血顿抑心肌及冬眠心肌,却无法促使已梗死的心肌细胞再生,已证实干细胞移植有可能取代受损坏死心肌,促进新生血管形成.目的:拟通过超声心动图进一步评价自体外周血干细胞移植对心肌梗死后并发心功能不全患者左室重构和心功能的影响.设计、时间及地点:于2005-03/2007-04在云南省第一人民医院心内科完成的病例分析.对象:心肌梗死并发心功能不全患者53例,年龄<75岁,心肌梗死病史4～12周,左室射血分数50%,对治疗均知情同意.干预:常规治疗组30例,给予支架置入+标准药物治疗;干细胞移植组23例,给予支架置入+标准药物治疗后,经皮冠状动脉内将分离的干细胞悬液经球囊导管中心腔注入梗死相关动脉远端,每次注射5～10mL,球囊封堵3min,间隔3min.主要观察指标:随访6个月,应用超声心动图仪观察两组左室容量、室壁运动情况及心功能的变化.结果:53例患者均进入结果分析.与术前比较,术后6个月干细胞移植组各项指标均显著改善(P<0.01),常规治疗组仅左室射血分数明显增高(P<0.01).术后6个月,干细胞移植组各项指标改善程度均显著优于常规治疗组(t=2.435～2.964, P<0.01).结论:超声心动图结果证实经皮经腔冠状动脉内自体外周血干细胞移植6个月后,心肌梗死并发左心功能不全患者左室容量及室壁运动情况得到明显改善,阻止或延续了左室重构.
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人脐带间充质干细胞向胰岛样细胞的分化
目的:前期实验采用药物诱导的方法将人脐带间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞,将人脐带间充质干细胞与大鼠胰岛细胞共同培养及移植入糖尿病大鼠体内,观察其在胰岛细胞生长的微环境及在体环境中向胰岛样细胞分化的潜能.方法:实验于2006-10/2007-09在汕头大学医学院生殖遗传实验室完成,属于广东省科技厅重点实验室.[1]实验材料:SD大鼠由广州中医药大学实验动物中心提供.对动物处置符合动物伦理学标准.脐带取自汕大附二妇产科健康足月妊娠剖宫产的胎儿,产妇及家属对实验知情同意,并经医院伦理委员会批准.[2]实验方法:分离培养人脐带间充质干细胞,并采用酶消法分离大鼠胰岛细胞.将人脐带间充质干细胞与大鼠胰岛细胞以半透膜相隔共同培养,在共培养的第3,7,14天采用放射免疫法检测胰岛素水平,RT-PCR方法检测PDX-1基因的表达,以单独培养的脐带间充质干细胞为对照.经尾静脉将人脐带间充质干细胞移植入糖尿病模型大鼠体内,采用半定量RT-PCR方法检测人insulin基因表达.结果:[1]共培养条件下的人脐带间充质干细胞由长梭形逐渐变圆,并聚集成团.[2]放射免疫法结果表明,共培养组人脐带间充质干细胞随葡萄糖浓度的增高而分泌的胰岛素量也增加,与对照组相比差异显著(P<0.05).[3]未经共培养诱导的人脐带间充质干细胞不表达PDX-1,共培养3d的人脐带间充质干细胞表达PDX-1,共培养7d的人脐带间充质干细胞仍表达PDX-1,共培养14d的人脐带间充质干细胞未表达PDX-1.[4]未经移植人脐带间充质干细胞的大鼠胰腺不表达人insulin基因,而移植人脐带间充质干细胞的大鼠胰腺在第60天时能够检测出人insulin基因.结论:人脐带间充质干细胞具有在体内外的微环境中向胰岛样细胞分化的潜能.
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静脉注射骨髓基质细胞后局灶性脑缺血大鼠胶质细胞源性神经营养因子的表达
背景:骨髓基质细胞移植对局灶性脑缺血的治疗作用,一个更为合理的解释是进入脑内的骨髓基质细胞与宿主大脑相互作用导致其自分泌或旁分泌大量的神经营养因子,这些因子可能有助于损伤神经功能的恢复.目的:观察局灶性脑缺血大鼠静脉移植骨髓基质细胞后胶质细胞源性神经营养因子的表达.设计、时间及地点:随机对照动物观察,于2003-10/2004-09在中国医科大学完成.材料:清洁级健康2月龄Wistar大鼠45只,随机分为细胞移植组、盐水对照组、空白对照组,15只/组.另取Wistar大鼠1只用于骨髓基质细胞的分离培养.方法:贴壁+胰酶消化法分离培养大鼠骨髓基质细胞,取传至第8代前的细胞用于移植,接种前1d进行BrdU标记,制成单细胞悬液,调整细胞密度为3×109L-1.各组大鼠均采用改良Longa线栓法建立大脑中动脉栓塞模型,造模后24h,细胞移植组每只大鼠股静脉注射骨髓基质细胞悬液1mL,盐水对照组同法注射等量生理盐水,空白对照组不做任何处理.主要观察指标:分别在造模后3,7,14d,对各组大鼠进行神经功能损伤评分,分值越高代表损伤程度越重.采用免疫组化法检测梗死区胶质细胞源性神经营养因子及BrdU阳性细胞的表达.结果:[1]造模后各时间点,细胞移植组神经功能损伤评分均低于盐水对照组、空白对照组,至造模后14d差异有显著性意义(P＜0.05).[2]造模后各时间点,细胞移植组梗死区胶质细胞源性神经营养因子水平均明显强于盐水对照组、空白对照组(P＜0.05).在梗死半球可见大量BrdU阳性细胞,对侧半球BrdU阳性细胞数量较少.结论:骨髓基质细胞静脉移植治疗局灶性脑缺血,可能与其促进胶质细胞源性神经营养因子大量分泌密切相关.
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嗅鞘细胞移植对脊髓半横断大鼠骨骼肌的影响
背景:现有研究表明嗅鞘细胞移植可促进脊髓半横断损伤大鼠后肢运动功能的恢复,但多数实验是以动物行为学评分作为观察指标.目的:实验拟进一步观察嗅鞘细胞移植后6周脊髓半横断损伤大鼠后肢小腿三头肌组织形态学的变化.设计、时间及地点:细胞观察,于2006-10/2007-03在四川大学华西基础医学与法医学院神经生物学开放实验室完成.材料:清洁级2.5月龄雌性SD大鼠40只,由自四川大学华西医学中心提供.细胞培养过程中使用的阿糖胞苷为ROCHE产品.方法:5只大鼠麻醉后取出脑双侧嗅球,采用差速贴壁与阿糖胞苷抑制相结合的方法分离培养纯化嗅鞘细胞,第14天分别收集培养上清液和密度为1×1010L-1细胞悬液备用.剩余35只大鼠设立两组:正常组5只,不做任何处理;模型组30只,于T11～12节段建立脊髓半横断损伤模型后,又分为5个亚组:8只移植纯化的嗅鞘细胞悬液,6只移植纯化的嗅鞘细胞培养上清液,6只移植未纯化的嗅鞘细胞悬液(主要是嗅神经成纤维细胞),5只移植未纯化的嗅鞘细胞培养上清液,5只移植DMEM/F12培养液.移植量12μL/只,在脊髓半横断损伤上、下各1mm处多点注射移植4μL,同时在半横断处填充的明胶海绵内注入8μL.主要观察指标:移植后6周取左侧后肢小腿三头肌,苏木精-伊红染色观察肌细胞形态变化,图像分析软件测量肌细胞横截面积和直径.结果:[1]正常组肌细胞近似圆形或多边形,多核,核分布于外周.各移植组肌细胞均变小,核深染,其中移植DMEM/F12培养液组变化为明显.[2]各移植组肌细胞横截面积及直径较正常组均明显减少(P<0.05),其中移植纯化的嗅鞘细胞组减少程度轻(P<0.05),移植DMEM/F12培养液组减少程度严重(P<0.05),移植未纯化的嗅鞘细胞、纯化/未纯化的嗅鞘细胞培养上清液3组间无明显差异(P0.05).结论:移植纯化的嗅鞘细胞悬液脊髓半橫断损伤大鼠后肢小腿三头肌萎缩的程度轻,肌细胞组织学变化小.
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三种细胞因子与白血病异基因造血干细胞移植后移植物抗宿主病的关系
背景:目前转化生长因子α与移植物抗宿主病关系的报道较少,急、慢性移植物抗宿主病患者转化生长因子α与多种因子联合的检测值得研究.目的:分析血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素4和转化生长因子α在白血病患者异基因造血干细胞移植后的变化与发生移植物抗宿主病轻重程度的关系.设计:病例对照观察.单位:解放军总医院第二附属医院器官移植中心血液科及解放军总医院第二附属医院核医学科.对象:选择2005-06/2007-06在解放军总医院第二附属医院器官移植中心血液科及解放军307医院移植科住院首次接受异基因造血干细胞移植的42例白血病患者,男23例,女19例,年龄16～68岁,平均35岁.其中急性粒细胞性白血病12例,急性淋巴细胞性白血病15例,慢性粒细胞性白血病15例,移植患者中行外周血移植37例、骨髓移植5例.异基因造血干细胞移植后发生急性移植物抗宿主病20例(Ⅰ～Ⅱ度18例、Ⅲ～Ⅳ度3例),未发生急性移植物抗宿主病21例,发生慢性移植物抗宿主病14例(局限型5例、广泛型9例),未发生慢性移植物抗宿主病28例.选择30名同期到院健康体检者为正常对照组,男18名,女12名,年龄20～70岁,平均44岁.所有受试对象均对实验项目知情同意,实验经过医院伦理委员会批准.方法:用放射免疫分析法检测并比较白血病异基因造血干细胞移植患者及正常对照者血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素4和转化生长因子α水平,同时比较移植后发生或未发生急性移植物抗宿主病,发生或未发生慢性移植物抗宿主病及发生轻重程度的白血病异基因造血干细胞移植患者3种细胞因子水平.主要观察指标:血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素4、转化生长因子α水平比较.结果:白血病患者42例及健康对照者30名均进入结果分析.[1]急、慢性移植物抗宿主病患者血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素4、转化生长因子α水平均高于正常对照组,差异有显著性意义(P<0.05～0.01),未发生急性移植物抗宿主病患者血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素-4水平高于正常对照组,差异有显著性意义(P<0.01,0.05).急性移植物抗宿主病患者血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素4、转化生长因子α水平高于未发生者,差异有显著性意义(P<0.05).慢性移植物抗宿主病患者血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素4、转化牛长因子α水平高于未发生者,差异有显著性意义(P<0.05).[2]急性移植物抗宿主病Ⅲ-Ⅳ度或慢性移植物抗宿主病广泛型患者血清肿瘤坏死因子α及转化生长因子α水平均高于急性移植物抗宿主病Ⅰ-Ⅱ 0或慢性移植物抗宿主病局限型,差异有显著性意义(P<0.05～0.01).结论:异基因造血干细胞移植术后动态监测肿瘤坏死因子α、白细胞介素4和转化生长因子α水平变化有助于对发生急性或慢性移植物抗宿主病预测,对判断移植物抗宿主病的轻重程度有一定意义.
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重组hVEGFl65腺相关病毒载体构建及体外感染骨髓基质干细胞血管内皮生长因子的表达
背景:目前用于基因治疗的病毒载体对机体具有一定免疫原性,且存在潜在感染危险,限制了临床的应用.目的:拟构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒,以其作为基因载体感染兔骨髓基质干细胞,体外检测病毒生物学活性及功能.设计、时间和地点:开放性实验,于2007-03/11在陕西省疾病预防控制中心病毒室完成.材料:兔骨髓基质干细胞由试验者原代培养,取自成年新西兰大白兔;人脐静脉内皮细胞取自健康产妇婴儿脐带,产妇对本实验知情同意.方法:从含有hVEGF165基因的pUC18-hVEGF165质粒中扩增出hVEGF165片段,构建重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP.将此质粒和腺相关病毒包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper共转染AAV-293细胞,通过同源重组产生重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-GFP.应用该重组病毒感染体外培养的兔骨髓基质干细胞主要观察指标:荧光显微镜下监测病毒包装效率,感染AAV-HT1080测定病毒滴度,并通过病毒基因组外源基因扩增鉴定重组病毒的包装是否成功.检测重组病毒的感染效率.ELISA法检测培养上清中血管内皮生长因子含量,人脐静脉内皮细胞管状血管形成试验检测血管内皮生长因子蛋白活性.结果:扩增产物经DNA测序确定为hVEGF165cDNA片段,重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP经双酶切鉴定正确.病毒包装效率达95%以上,收获纯化病毒滴度达5.5×1011 vg/mL.提取重组病毒基因组成功扩增出外源目的基因片段,证实重组病毒rAAV-VEGF165-GFP包装成功.重组病毒rAAV-VEGF165-GFP感染骨髓基质干细胞效率为40%,感染72h后骨髓基质干细胞中血管内皮生长因子含量达(85.58±5.37)μg/L,分泌的血管内皮生长因子蛋白可以使人脐静脉内皮细胞拉长变形、出芽且相互交联成管状样结构.结论:成功构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒rAAV-VEGF165-GFP,该重组病毒能够高效感染兔骨髓基质干细胞并表达血管内皮生长因子,分泌的血管内皮生长因子蛋白具有良好的生物活性,可有效促进人脐静脉内皮细胞的增殖.
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晚期糖基化终产物对单核细胞产生炎性细胞因子作用的剂量与时间依赖性
目的:观察晚期糖基化终产物对单核细胞产生白细胞介素6、白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α的刺激作用.方法:实验于2007-02/06在长治医学院中心实验室完成.[1]血脂正常的健康成人外周血(由长治医学院附属和平医院血库提供);正常人AB血清(中国科学院上海细胞研究所,批号TBD0081HAB);内毒素和正常人血清白蛋(Sigma公司).[2]采用Lymphoprep密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,置于含体积分数0.1的人AB血清、2mmol/L的L-谷氨酰胺、25mmol/L Hepes的RPMI-1640中培养,选择性贴壁法纯化细胞.鼠抗人CD68 IgG1和羊抗鼠IgG1-Texas Red免疫荧光染色,阳性者为单核细胞.调整细胞浓度为1×109L-1备用.[3]将3.55g/L人血清白蛋白与200mmol/L葡萄糖在400mmol/L磷酸盐缓冲液中37℃孵育56d.pH7.4磷酸盐缓冲液透析,以除去未结合的葡萄糖.以Detoxi-Gel column去除晚期糖基化终产物修饰蛋白中可能污染的内毒素,即为晚期糖基化终产物修饰的人血清白蛋白.[4]将1×109L-1单核细胞接种于24孔板,1.0mL/孔.RPMI-1640中分别加入12.5,25,50,100,200mg/L晚期糖基化终产物修饰的人血清白蛋白,与单核细胞共同孵育12,24,48和72h.以同等剂量未加修饰的人血清白蛋白和单纯RPMI-1640作为阴性对照.酶联免疫吸附法检测单核细胞上清中白细胞介素6、白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α表达水平.结果:[1]与RPMI-1640阴性对照组、单纯人血清白蛋白100mg/L阴性对照组比较,孵育48h时100mg/L晚期糖基化终产物修饰的人血清白蛋白诱导单核细胞产生白细胞介素6达到大剂量和时间效应(F=2.68~2.93, P均=0.00).[2]与RPMI-1640阴性对照组、单纯人血清白蛋白100mg/L阴性对照组比较,孵育24h时50mg/L晚期糖基化终产物修饰的人血清白蛋白诱导单核细胞产生白细胞介素1α达到大剂量和时间效应(F=1.22~1.30, P均=0.00).[3]晚期糖基化终产物修饰的人血清白蛋白诱导单核细胞产生肿瘤坏死因子α情况与产生白细胞介素1β相似.结论:晚期糖基化终产物修饰的人血清白蛋白以剂量和时间依赖的方式刺激单核细胞合成白细胞介素6、白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α.
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多种细胞因子诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化
背景:肝细胞移植是治疗终末期肝功能衰竭的有效方法之一,却面临细胞来源缺乏、体外难以大量增殖、传代后无法保持其原有特性、免疫排斥等因素的限制,寻找新的肝细胞来源尤为迫切.目的:探讨肝细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子及抑瘤素M诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞的能力.设计、时间及地点:细胞对照观察,于2006-0612007-03在泸州医学院附属医院实验室完成.材料:清洁级雄性Wistar大鼠24只用于制备骨髓间充质干细胞.红细胞裂解液由泸州医学院附属医院传染免疫实验室配制重组鼠肝细胞生长因子、抑瘤素M为美国R&D产品,酸性成纤维细胞生长因子由美国Peprotech生产.方法:采用红细胞裂解+贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,胰蛋白酶消化后传代.传至第4代,以5×107 L-1接种,设立6组向肝细胞诱导分化:第1组作为对照,不加任何细胞因子;第2组加入肝细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子;第3组加入肝细胞生长因子、抑瘤素M;第4组加入酸性成纤维细胞生长因子、抑瘤素M;第5组加入肝细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、抑瘤素M;第6组于1～9d加入肝细胞生长因子,9～18d加入酸性成纤维细胞生长因子,9～21d加入抑瘤素M.每组所加入的各种细胞因子终末浓度均为20μg/L.主要观察指标:采用溴甲酚绿法、化学发光法、RT-PCR法检测肝细胞特异性标志物白蛋白、甲胎蛋白的表达.采用谷氨酸脱氢酶法检测尿素含量.结果:诱导0,7,14,21d,未加入诱导因子的对照组及酸性成纤维细胞生长因子+抑瘤素M组无白蛋白、尿素表达,肝细胞生长因子+酸性成纤维细胞生长因子+抑瘤素M组培养基上清液中甲胎蛋白、白蛋白、尿素含量均显著高于其余因子组(P<0.05).结论:酸性成纤维细胞生长因子与抑瘤素M共同作用无法诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化,二者联合肝细胞生长因子可成功诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞.分时段加入此三种细胞因子,可能影响了细胞因子间的相互作用而导致分化率降低.
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荷瘤兔骨髓间充质干细胞在射频消融自体血清诱导下向肝样细胞的分化
目的:鉴于目前对体外培养诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的条件掌握尚不成熟,尤其是无血清培养.实验拟将临床常用微创治疗同细胞移植结合,观察荷瘤兔骨髓间充质干细胞在射频消融兔肝肿瘤自体血清诱导下向肝样细胞的分化,寻求一种自体肝组织的修复方法.方法:实验于2006-09/2007-09在西安交通大学医学院中心实验室完成.实验室为教育部基因与环境研究重点实验室.[1]实验材料:健康新西兰大白兔,二三月龄,雌雄不限,体质量1.5～2.0kg,由西安交通大学医学院动物试验中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.荷瘤种兔包块由西安交通大学第一医院介入中心刘亚民教授馈赠.[2]实验方法:取荷瘤种兔瘤组织块,在兔在肝脏右叶做一直径为2~3mm的隧道,将肿瘤组织块植入隧道底部制备肝肿瘤动物模型.射频消融治疗灭活荷瘤兔肝脏肿瘤及边缘1cm正常肝脏组织,于72h后取全血及骨髓.应用体外细胞培养技术自骨髓血中分离、纯化兔骨髓间充质干细胞后,取P2细胞在4种不同培养基培育:对照组:含体积分数为0.1胎牛血清的低糖DMEM培养液;射频兔肝肿瘤治疗血清组:无血清低糖DMEM培养液加入射频兔肝肿瘤治疗血清;射频肝肿瘤治疗血清热灭活组:无血清低糖DMEM培养液加入射频肝肿瘤治疗灭活血清;生长因子组:含0.1胎牛血清的低糖DMEM培养液加入肝细胞生长因子及表皮细胞生长因子.[3]实验评估:倒置显微镜下观查细胞形态变化,流式细胞仪测定细胞周期并观察其增殖及生长特征,免疫荧光法检测肝细胞标志物白蛋白及CK18表达,鉴定细胞性质及功能.结果:[1]原代、传代培养及流式细胞仪结果显示,射频肝肿瘤治疗兔血清及肝细胞生长因子、表皮生长因子对兔骨髓间充质干细胞的诱导能明显促进细胞的增殖,S+G2+M期细胞百分数明显增高,2周后免疫荧光染色可见分化细胞表达肝细胞标志物CK18和白蛋白.[2]射频肝肿瘤治疗兔灭活血清及胎牛血清能使兔骨髓间充质干细胞生长,但不如射频肝肿瘤治疗兔血清及肝细胞生长因子、皮细胞生长因子促进细胞增殖明显(P<0.01),传代培养2周,细胞形态未见明显变化,未见肝细胞标志物CK18和白蛋白表达.结论:肿瘤射频消融兔血清可激活、诱导自体骨髓间充质干细胞增殖并向肝样细胞分化,使射频消融肿瘤治疗的同时行肝样细胞移植修复肝损伤成为可能.
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白细胞介素10基因体外转染大鼠骨髓基质细胞对内毒素休克的干预
目的:机体内前炎症递质肿瘤坏死因子α、白细胞介素6与抗炎症递质白细胞介素10之间的平衡出现严重紊乱,可导致内毒素休克及多脏器功能衰竭.实验拟进一步探讨含大鼠白细胞介素10基因重组复制缺陷型腺病毒体外转染骨髓基质细胞后,内毒素休克动物模型导入的白细胞介素10基因表达及其对机体肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平的调节.方法:实验于2006-05/2007-10在中山大学附属第一医院外科实验室完成.[1] 材料:清洁级SD雌鼠100只,选取10只用于骨髓基质细胞的分离培养,剩余90只随机数字表法分为细胞转染组、模型组、正常组,30只/组,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.含大鼠白细胞介素10基因的重组复制缺陷型腺病毒由中山大学附属第一医院烧伤外科朱家源教授惠赠.内毒素Escherichia coli 0111: B4为美国Sigma公司产品.[2] 实验方法:将含大鼠白细胞介素10基因的重组复制缺陷型腺病毒复苏后,加入到贴壁生长达80%的第3代骨髓基质细胞中,将转染后细胞、未转染细胞按5×105/孔接种,采用ELISA法和RT-PCR法检测体外白细胞介素10的含量变化.细胞转染组与模型组大鼠均经左侧股静脉注射内毒素5mg/kg建立休克模型,10min后细胞转染组在同侧股静脉注射转染后培养12h的5×108L-1骨髓基质细胞0.5mL,模型组与正常组均注射未转染的5×108L-1骨髓基质细胞0.5mL,分别于0,3,6,12,24,36,48h采用ELISA法检测体内各组大鼠外周血清白细胞介素10、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平,并记录以上各时相点大鼠存活数.细胞回输48h后,组织病理学检测大鼠肝、肺、肾的变化.结果:[1] 体外白细胞介素10的表达:体外转染后的骨髓基质细胞培养上清中可检测到白细胞介素10的表达,表达高峰位于转染后36h,于560bp处显示凝胶电泳条带;未经转染的骨髓基质细胞不表达白细胞介素10.[2] 体内白细胞介素10、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的表达:与模型组比较,转染后3,6,12,24,36,48h细胞转染组外周血清白细胞介素10水平均显著上升(t=15.51～30.98, P均<0.05),肿瘤坏死因子α和白细胞介素6水平均显著下降(t=14.78～36.75, P均<0.05; t=12.49～38.14, P均<0.05).[3] 大鼠存活情况:细胞回输后48h,细胞转染组大鼠存活率为50%,明显高于模型组20% (x2=5.93, P<0.05).[4] 组织病理学观察:模型组肝细胞肿胀、空泡样变性、汇管区大量炎性细胞浸润,中央静脉内有血栓形成,可见点片状肝窦结构被破坏;肺呈间质性肺炎改变,较多单核和中性粒细胞浸润,小血管壁内充血,局部可见坏死小灶;肾间质充血,肾小球体积增大,近曲小管上皮细胞肿胀、玻璃样变.细胞转染组肝、肺、肾损伤均明显减轻.结论:进行体外转染的骨髓基质细胞回输后,其所携带的白细胞介素10基因可实现体内外的高水平表达,对内毒素休克时肿瘤坏死因子α和白细胞介素6水平起到预期的下调作用,减轻了机体的炎症反应程度,并有效保护肝、肺、肾等主要脏器.
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骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后血管内皮生长因子表达的影响
背景:骨髓间充质干细胞移植可以促进脊髓损伤大鼠神经功能的恢复,但目前尚不能清楚阐述骨髓间充质干细胞移植促进神经功能恢复的相关机制.目的:观察骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后血管内皮生长因子基因和蛋白表达的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-09/2007-04在中国医科大学神经生物学实验室完成.材料:健康Wistar大鼠75只,3只用于骨髓间充质干细胞的分离培养,72只随机分为3组:假手术组(n=18)、DMEM组(n=27)、骨髓间充质干细胞组(n=27).方法:以贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞.参照Nystrom's压迫方法制作大鼠脊髓压迫损伤模型.假手术组仅咬除T8-10棘突和椎板,不损伤脊髓.模型制作后DMEM组、骨髓间充质干细胞组分别进行DMEM与骨髓间充质干细胞损伤区周围局部4点注射.主要观察指标:应用RT-PCR法和应用免疫组织化学技术检测损伤脊髓组织内血管内皮生长因子的表达和分布变化.结果:假手术组脊髓组织中仅见微量血管内皮生长因子表达.骨髓间充质干细胞组在细胞移植后l,3,5d,血管内皮生长因子mRNA表达趋势与DMEM组相同,但表达水平均明显高于相应时间点的DMEM组(P<0.05),移植后7,14d血管内皮生长因子表达仍明显高于DMEM组(P<0.01).结论:骨髓间充质干细胞移植增加了脊髓损伤后血管内皮生长因子基因和蛋白的表达,并延长其表达时间.
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同种异体胚胎神经干细胞移植修复脊髓损伤的时效性
背景:研究表明神经干细胞在脊髓损伤中具有潜在的治疗作用,但何时移植效果较好?目的:观察同种异体胚胎神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠双后肢运动功能的修复作用,并分析其移植时效性.设计:观察对比实验.单位:大连医科大学分子生物学实验室和大连理工大学环境与生命学院生物医学实验室.方法:实验于2003-07/08在大连医科大学分子生物学实验室和大连理工大学环境与生命学院生物医学实验室完成.[1] 取孕,14～16d的大白鼠1只,引颈处死,剖腹,取出胎鼠,钳取大脑皮质及皮质下脑室旁的脑组织,体外培养大鼠胚胎神经干细胞.[2]将30只成年SD大鼠按随机数字表法分为3组,即损伤对照组、早期移植组和延期移植组,每组10只.3组大鼠均制作脊髓横断损伤模型,造成大鼠下肢瘫痪,早期移植组、延期移植组大鼠分别在伤后3d及3周移植胎鼠脑组织神经干细胞.观察移植后大鼠双后肢的运动功能恢复情况.神经干细胞移植4周后,取出移植区脊髓,作切片进行免疫组织化学染色,观察比较各组大鼠的脊髓组织形态学变化.实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求.主要观察指标:[1]各组大鼠神经干细胞移植后双后肢的功能恢复情况.[2]神经干细胞移植4周后各组大鼠脊髓移植区的组织形态学变化.结果:脊髓损伤建模实验纳入大鼠30只,全部进入结果分析,无脱失.[1]各组大鼠神经干细胞移植后双后肢的功能恢复情况:早期移植组和延期移植组大鼠双后肢的运动功能均有明显改善,但早期移植组表现尤为显著.早期移植组和延期移植组细胞移植后五六天即可见瘫痪大鼠的后肢肌力开始恢复,两三周后可出现爬行,4周后后肢活动活跃;损伤对照组大鼠的瘫痪肢体无任何恢复.[2]移植4周后早期移植组大鼠移植区脊髓组织的形态学变化;脊髓移植区肉眼可见有增生的组织充填,镜下有大量新生的细胞,表现为神经元和神经胶质细胞阳性染色.损伤对照组肉眼见两断端间呈空腔状.镜下脊髓残端变性坏死明显,空泡变性等.延期移植组脊髓移植区的组织形态学变化介于早期移植组和损伤对照组之间,无典型的组织形态学变化特征,镜下有一定量的新生细胞,但数量较早期移植组明显少.结论:同种异体胚胎神经干细胞移植对脊髓横断大鼠运动功能恢复有促进作用,早期移植疗效更好.
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TGFβ3c2s2基因转染骨髓间充质干细胞对创面愈合中转化生长因子β表达的影响及意义
目的:外伤后病理性瘢痕的形成与创面的愈合过程有着密切的联系,创伤愈合时期引入细胞因子或生长因子及其他影响因素,调节创伤愈合机制,即可能改变细胞外基质结构,达到预防瘢痕形成的目的.实验拟观察TGF-β3c2s2基因转染的骨髓间充质干细胞在创面修复与重塑过程中对转化生长因子β1和转化生长因子β3表达的影响.方法:实验于2005-10/2007-03年在重庆医科大学附属儿童医院外科实验室、动物实验中心完成.[1]实验材料:四五周龄日本大耳白兔2只,体质量300～400g,雌雄不限;健康成年日本大耳白兔20只,体质量1.7～2.5kg,雌雄不限,均由重庆医科大学动物实验中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.[2]实验方法:选取四五周龄日本大耳白兔分离培养骨髓间充质干细胞.选取健康成年日本大耳白兔20只,每只兔耳腹侧制作2个皮肤、软骨全层缺损创面共80个,创面以自身对照为前提随机分为4组,每组20个创面:实验组:加入Ad-TGF-β3c2s2转染的骨髓间充质干细胞;空白对照组:加入消毒的DMEM/F12(不含胎牛血清):腺病毒组:加入Ad-TGF-β3c2s2腺病毒;骨髓间充质干细胞组:加入骨髓间充质干细胞.[3]实验评估:观察瘢痕形成情况,苏木精-伊红染色、免疫组织化学技术观察瘢痕组织的组织学形态和检测瘢痕组织中转化生长因子β1和转化生长因子β3表达和变化规律.结果:[1]实验组在整个过程中无明显高出周围皮肤的瘢痕形成,其他组上皮化后,创面均逐渐形成不同程度的瘢痕,伤后45d瘢痕增生程度达高峰,明显高出皮肤表面;持续至90d左右.[2]实验组和腺病毒组结构较接近正常皮肤,比正常皮肤胶原排列致密,略厚;空白对照组、骨髓间充质干细胞组伤后45d可见浅层组织结构排列紊乱,胶原纤维粗大呈交错网织状摔列.[3]实验组伤后21,45,90d转化生长因子β1表达明显低于其他组和正常皮肤(P<0.01),其表达随时间逐渐下降,转化生长因子β3表达高于其他组和正常皮肤(P<0.01),各组转化生长因子β3的表达随时间逐渐下降.结论:TGF-β3c2s2基因转染的骨髓间充质干细胞移植于局部创面,对创面修复过程中转化生长因子β1和转化生长因子β3表达有显著影响,通过这种影响减轻创面修复后增生性瘢痕的形成.
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两次过滤体外分离培养原代血脑屏障内皮细胞
背景:内皮细胞是血脑屏障结构和功能的主要基础,要了解血脑屏障的作用,就必须在体外建立血脑屏障模型.目的:利用幼鼠脑微血管片段模拟血脑屏障内皮细胞的生物学特性,拟建立一种血脑屏障内皮细胞的体外培养技术.设计、时间及地点:细胞观察,于2006-04在解放军总医院神经内科实验室完成.材料:清洁级1月龄SD大鼠2只,用于脑组织微血管内皮细胞的制备.方法:取大鼠脑组织,加入D-Hank's液培养基制备匀浆,149μm滤网过滤后收集滤液,以74μm滤网再次过滤.将滤网上的组织刮下,胶原酶消化后传代扩增.取传1代后的脑组织微血管内皮细胞用于指标检测.主要观察指标:细胞形态变化.锥虫蓝染色计数细胞活性.免疫组织化学染色鉴定.结果:[1] 培养12h后大部分脑微血管片段贴壁,两三天微血管片段周边有成簇的细胞团及单个细胞生长,7～10d细胞生长为致密单层并呈典型鹅卵石样排列.传代细胞4h开始贴壁,培养一两天变为多角形并呈致密单层.[2] 生长7～10d的细胞其活性96%.[3] 培养的细胞第Ⅷ因子多克隆抗体免疫组化染色显示胞膜和胞浆呈阳性,胞核为阴性,为血脑屏障内皮细胞.结论:采用两次过滤培养技术可成功分离培养出较理想的原代血脑屏障内皮细胞.
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两份人脐血间充质干细胞混合培养及向神经元样细胞的分化
背景:脐血间充质干细胞可诱导分化为神经样细胞,但在临床中发现干细胞培养细胞增殖的数量不足.目的:观察两份脐血间充质干细胞混合培养的生长情况,以及经碱性成纤维细胞生长因子诱导脐血间充质干细胞向神经元样细胞的分化.设计、时间及地点:于2007-01/10在郑州大学基础医学院微生物与免疫学实验室完成以细胞为对象的对照观察性实验.材料:健康分娩产妇自愿捐献的脐血60~180mL.方法:应用Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液以密度梯度法获取脐血间充质干细胞,加入碱性成纤维细胞生长因子诱导分化.当细胞传至第3代时,随机取培养的6份脐血间充质干细胞(半量)为A组,6份脐血间充质干细胞(半量)为B组,将A、B组各剩余的半量脐血间充质干细胞混合为C组.3组细胞密度均为1.0×104 L-1.主要观察指标:以活细胞计数和MTT比色法比较3组细胞扩增数量,免疫组织化学检测脐血间充质干细胞神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白的表达.结果:活细胞计数和MTT比色检测显示,将两份不同脐血间充质干细胞混合后,细胞贴壁比单份脐血间充质干细胞快(P＜0.05),增殖也非常快(P＜0.05).3组细胞经碱性成纤维细胞生长因子诱导后均表达神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白,并且巢蛋白阳性表达率无差别(P＞0.05).结论:混合脐血间充质干细胞之间有互相促增殖作用,应用碱性成纤维细胞生长因子诱导的脐血间充质干细胞可表达神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白.
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经人巨细胞病毒感染人脐血造血干细胞向粒-巨噬系和红系祖细胞增殖过程中HOXB6-mRNA及其基因表达
背景:造血祖细胞被人巨细胞病毒(HCMV)感染后增殖和分化能力受到抑制是否与受染细胞增殖的基因异常表达有关联?目的:观察经人类巨细胞病毒感染的人类造血干祖细胞向粒-巨噬系、红系祖细胞增殖过程中HOXB6mRNA表达.设计:观察对比实验.单位:泸州医学院附属医院分子生物学实验室.材料:所有脐血标本由泸州医学院附属医院产科提供,取自正常足月顺产新生儿断脐后的胎盘段脐血.所有新生儿母亲HBSAg阴性,常规ELISA检测抗HCMV-IgM及PCR检测HCMV-DNA均为阴性,且对本实验知情同意,实验经过医院伦理委员会批准.HCMV-AD169株由中国预防医学科学院病毒研究所提供.全反式维甲酸(ATRA)为重庆华邦制药股份有限公司产品,批号为20010126.方法:实验于2006-04/2007-04在泸州医学院附属医院分子生物学实验室完成.分离脐血单个核细胞,进行造血祖细胞培养.根据实验干预方式不同将细胞分为4组:[1]对照组:与HCMV组等量的IMDM培养液进行细胞培养.[2]HCMV组:HCMV-AD169滴度为105pfu,以0.1mL感染培养体系.[3]ATRA组:在培养体系分组中加入12μL ATRA,终浓度为60μmol/L.[4]HCMV+ATRA组:在HCMV感染组中加入ATRA,终浓度同ATRA组.主要观察指标:分别于培养后3,7,12天收获各组细胞,采用实时荧光定量PCR技术分别检测脐血粒-巨噬系祖细胞和脐血红系祖细胞HOXB6 mRNA表达水平.结果:[1]对照组红系祖细胞和粒-巨噬系祖细胞均表达HOXB6-mRNA,随着时间推移,表达水平增加,其中,脐血红系祖细胞表达HOXB6-mRNA于第12天达高峰,脐血粒-巨噬系祖细胞HOXB6-mRNA于第7天达高峰.[2]HCMV组脐血粒-巨噬系祖细胞、红系祖细胞感染人巨细胞病毒后各时间点HOXB6基因表达均低于对照组,差异有显著性意义(P<0.05).[3]ATRA组各时间点脐血粒-巨噬系祖细胞、红系祖细胞HOXB6-mRNA表达均高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05).[4]HCMV+ATRA组各时间点红系祖细胞及粒-巨噬系祖细胞的HOXB6-mRNA表达均高于人巨细胞病毒组,差异有显著性意义(P<0.05~0.01).结论:[1]人类造血干祖细胞向粒单系和红系祖细胞增殖分化过程中,HOXB6-mRNA呈现持续稳定的表达.[2]人巨细胞病毒能使HOXB6基因表达下调.[3]ATRA能上调HOXB6基因的表达.
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成骨细胞及血管内皮细胞与造血干细胞微环境的关系
造血干细胞微环境是指在成体组织中干细胞进行自我更新并能产生大量祖细胞的特定场所,已有实验证据表明成骨细胞及血管内皮细胞是造血干细胞微环境的重要组成部分.成骨细胞可以通过多种信号分子及黏附分子调节造血干细胞的功能.具有高浓度氧和生长因子的窦状隙内皮细胞,通过提供营养丰富的微环境促进干细胞增殖及分化,还可以辅助造血干细胞跨内皮迁移,在其归巢及动员过程中具有重要作用,此外可能分配一些细胞定位于脾等髓外场所,这些细胞能够在骨髓抑制情况下替代骨髓微环境.基于众多实验研究提出这样一个假说,即成骨细胞是维持造血干细胞自我更新特性的重要内环境,而血管内皮细胞等血管微环境则促进造血干细胞的增殖及分化.
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脐血间充质干细胞的研究发展与应用
检索Pubmed数据库和中国期刊全文数据库文献,总结脐血间充质干细胞的研究现状及新进展.脐血间充质干细胞作为一种多潜能干细胞,具有来源丰富、易于采集、保存和运输、无异体排斥、避免伦理争议等诸多优点.脐血间充质干细胞不仅支持造血系统,还可向中胚层和外胚层来源的组织分化,在一定的实验条件控制下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、神经细胞、肝细胞等.脐血间充质干细胞表面抗原无特异性,既有间质细胞,又有内皮细胞及上皮细胞的特征.脐血间充质干细胞可广泛用于治疗脑脊髓病变、心脏病、糖尿病、股骨头坏死、下肢血管闭塞等许多难治性疾病.
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骨髓基质细胞向神经样细胞的分化
目的:有研究表明,在诱导剂β-巯基乙醇或二甲基亚砜与丁羟茴醚的作用下,80%骨髓基质细胞可诱导分化成神经样细胞,并表达神经元特异性蛋白,一些神经营养因子也能诱导骨髓基质细胞分化为神经样细胞.实验拟以三磷酸胞苷二钠为诱导剂,验证其诱导骨髓基质细胞分化为神经样细胞的可行性.方法:实验于2006-03/12在白求恩国际和平医院实验室完成.[1]实验材料:SD大鼠,体质量50～60g,雌雄不限,由河北医科大学实验动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.[2]实验方法:分离大鼠骨髓基质细胞进行体外培养,传代至第3代时实验组加入三磷酸胞苷二钠诱导剂诱导,对照组不加诱导剂.[3]实验评估:观察细胞分化为神经样细胞的形态变化,并进行免疫组织化学染色鉴定,计算阳性细胞百分比.结果:刚分离的骨髓基质细胞呈圆形,胞体透亮.接种24h后,少量细胞贴壁,72h后大部分细胞贴壁,形态为梭形、圆形、多角形,8～10d细胞达到90%融合,细胞呈长梭形排列呈栅栏状,传代后的细胞约24h完全贴壁,3～7d基本铺满瓶底.诱导后的骨髓基质细胞胞体变圆,突起逐渐伸长,并互相连接成网状,10d后免疫组织化学染色鉴定实验组表达神经元特异性烯醇化酶、神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞百分比明显高于对照组.结论:三磷酸胞苷二钠在体外可诱导骨髓基质细胞分化为神经样细胞.
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骨髓与脐带血间充质干细胞的生物学特性比较
目的:为寻找佳的间充质干细胞来源,比较脐带血来源间充质干细胞与骨髓来源间充质干细胞在生长、细胞表型及多项分化功能方面的差别.方法:实验于2006-06/2007-03在南昌大学医学院第二附属医院分子实验室、江西省医学分子重点实验室,省级重点实验室完成.[1]实验材料:脐带血30份及正常骨髓30份均取自正常自愿捐献者,实验经医院伦理委员会批准.[2]实验方法:无菌条件下采集脐血及骨髓,分离单个核细胞.将脐血及骨髓单个核细胞以1×109L-1接种于培养瓶中,加入含体积分数0.20自体血清,1mmol/L氢化可的松的IMDM培养液,7d后换液,去除悬浮细胞,以后每三四天换液1次,待细胞90%融合后,经胰蛋白酶+乙二胺四乙酸混合消化,传代培养,取第3代细胞,采用流式细胞术鉴定脐带血来源间充质干细胞表面分子,并比较两种不同来源间充质干细胞的生长特点及向脂肪细胞分化能力的差别.结果:[1]骨髓来源间充质干细胞在较早阶段形态即成长梭形,第3代后与脐带血来源间充质干细胞形态无明显差别.[2]培养至第3代的间充质干细胞表面分子检测与脐血单个核细胞比较结果显示,CD166、CD29、CD54表达增高,CD13、CD34、CD45表达降低.[3]脐带血来源间充质干细胞培养的成功率低于骨髓来源间充质干细胞,在较早阶段脐带血来源间充质干细胞增殖快于骨髓来源间充质干细胞,但后期培养过程中脐带血来源问充质干细胞增殖慢于骨髓来源间充质干细胞,两种来源间充质干细胞均能分化为脂肪细胞,且分化能力无明显差别.结论:脐血来源间充质干细胞作为一种新来源的间充质干细胞在生长速度、培养成功率上虽然低于骨髓来源间充质干细胞,但在细胞表型及分化功能方面无明显差别.
