中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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猪苓多糖对脐血造血干细胞体外扩增及干细胞移植后免疫重建的调节效应
目的:人脐血造血干细胞得以移植于小鼠体内,其理论基础是放射线照射使小鼠骨髓枯竭,龛位腾出,为移植的脐血造血干细胞提供空间,而猪苓多糖是从中药猪苓中提取的多糖成分,具有免疫调节抗肿瘤作用,也是一种非T细胞促有丝分裂素,对放射线照射有一定的防护作用.观察猪苓多糖埘脐血造血干细胞体外扩增及干细胞移植后免疫重建效应.方法: 实验于2004-06/2006-05在兰州大学基础医学院免疫研究所完成.①实验材料:清洁级BALB/c小鼠由兰州生物制品研究所提供,8周龄,体质耸约20g,雌雄各半,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.脐血样本由兰泰医院妇产科提供,产妇及家属对实验知情同意,并经医院伦理委员会批准.猪苓多糖由兰州大学第-医院提供.②实验方法:应用20,17.5,12.5,7.5 mg/L猪苓多糖体外扩增培养脐血造血干细胞,并测定细胞增殖率及CD34+细胞数.将BALB/c小鼠分为正常对照组:尾静脉、腹腔注射等量生理盐水:照射空白组:3.5C,y经60Coγ放射线照射联合尾静脉、腹腔注射等量生理盐水;照射药物组:3.5Gy经60Coγ放射线照射联合尾静脉注射等量生理盐水、腹腔庄射猪苓多糖;照射移植组(n=15):3.5Gy经60Coγ放射线照射联合脐血造血干细胞移植、腹腔注射等量生理盐水;照射移植药物组:35Gy经60Coγ放射线照射联合脐血造血干细胞移植、腹腔注射猪苓多糖.③实验评估:观察小鼠生存状况及血常规变化,流式细胞仪测定CD3、CD4、CD8、CD19水平.结果:57只小鼠均进入结果分析.①12.5 mg/L猪苓多糖增殖效率为显著(P＜0.01),流式细胞仪测定显示CD34+细胞数扩增了6.33倍.移植药物组小鼠死亡率低,死亡高峰集中在照射移植后7～14d左右.②移植药物组小鼠血象恢复正常,并且时间明显短于其他实验组(P＜0.05).③细胞及体液免疫恢复情况,移植药物组小鼠各项指标水平与正常小鼠无差别(P＞0.05),与其他各组小鼠比较,除CD4、CD19水平与照射移植小鼠无差别外均有差别(P＜0.05).结论:猪苓多糖对脐血造血干细胞有明显扩增作用,并能促进脐血造血干细胞移植小鼠免疫造血重建.
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人胎脑神经干细胞在年幼大鼠脑内的成神经元分化
目的:脑组织中不同部位的的神经元因功能不同具有特定的细胞形态,移植的神经干细胞能不能在相应部位分化成其相应的神经元还不明确.实验拟观察人胎脑神经干细胞植入年幼大鼠脑后的成神经元分化的作用,探讨神经干细胞替代治疗小儿脑病的可行性.方法:实验于2007-04/07在海军总医院细胞实验室内完成.①实验材料:16周孕龄的人胎脑组织由海军医院妇产科提供,实验经孕妇及家属知情同意,并经医院伦理委员会批准.14只出生后10d的同窝年幼SD大鼠,雌雄不分,由北京大学医学部实验动物中心提供,为二级清洁动物,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:自孕16周的人胎脑组织分离培养神经干细胞球,在脑脊液中培养诱导分化实验以证明其分化潜能.将培养14 d的神经干细胞球移植于10 d龄大鼠侧脑室内,于移植后第4,7,14天行人神经丝特异性标志的免疫荧光分析,显示神经元的分布和细胞形态.结果:①培养获得典犁神经干细胞球,呈漂浮生长,在小儿脑脊液中能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞.②采用抗人神经丝混合单抗检测移植物的成神经元分化,移植后第4天,观察到阳性反应细胞在颗粒层表现为颗粒性细胞,锥体细胞层则出现长突起的锥体细胞,还有连接神经元样中间神经元,小脑内有单层排列的浦肯野细胞.对比各时间点的观察结果,阳性细胞分布位置未变,随着移植后天数的后延,阳性细胞数量呈减少趋势,但锥体细胞的突起明显加长.结论:体外培养获得的人神经干细胞经脑室途径移植于年幼大鼠,在脑内发生迁移,并分化成形态上与其所在位置的宿主细胞一致的神经元.提示宿主脑组织微环境在引导移植物分化成神经元中发挥了重要作用,该结果对细胞替代治疗小儿脑病有重要启示意义.
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小鼠胚胎干细胞体外向血管平滑肌细胞的定向分化
目的:血管重建手术在多数情况下以自体血管作为替代品,但来源有限.胚胎干细胞具有发育全能性,目前其定向诱导机制尚不明确.通过选择适当的诱导剂,探讨胚胎干细胞体外向血管平滑肌细胞分化的趋势.方法:实验于2006-08/2007-02在南昌大学第二附属医院血液病研究所完成.①动物及细胞系:清洁级孕12.5d昆明小白鼠1只,由南昌大学医学院动物中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.小鼠胚胎干细胞系129X/SvJ编号为SCRC-1018,由American Type Culture Collection提供.②实验方法:取孕12.5 d鼠胚胎,去除头部、内脏及四肢,将组织块剪碎,胰酶消化,分离培养胚胎成纤维细胞,传至3-5代时史换为含体积分数为0.15胎牛血清的DMEM高糖培养基,24 h后收集培养液,加入2.0mmol/L L-谷氨酰胺,1×非必需氨基酸,0.1 mmol/L β-巯基乙醇,1000 U/mL白血病抑制因子,此即为条件培养基.常规复苏小鼠胚胎干细胞系129X/SvJ,以1 × 106密度接种,传代时用差速贴壁法分离去除已分化的胚胎干细胞,加入条件培养基5 mL,经过悬滴一悬浮培养,构建拟胚体分化模型.设立3组,各组均置于明胶包被的T25培养瓶中,每瓶加入50个拟胚体,使其均匀分布于培养瓶底.诱导组7～10 d加入10-9 mol/L全反式维甲酸和3 μ g/L转化生长因子β1,10～21 d加入20μg/L血小板源性生长因子.血清对照组仅加入去生长因子胎牛血清,全反式维甲酸组仅加入全反式维甲酸.诱导21 d的拟胚体,用胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ联合消化为单个细胞,再加入20μg/L血小板源性生长因子继续诱导7 d.③实验评估:应用RT-PCR法检测诱导细胞血管平滑肌肌动蛋白、血管平滑肌肌球蛋白重链基因的表达.通过免疫细胞化学技术检测血管平滑肌肌动蛋白的表达来鉴定细胞性质.结果:①胚胎干细胞牛长及拟胚体诱导分化:胚胎干细胞在体外能自发形成拟胚体,经过不同生长因子的分阶段联合诱导,拟胚体贴壁后球体略摊开,周围出现大量的梭形细胞.②RT-PCR检测:拟胚体血管平滑肌肌动蛋白和血管平滑肌肌球蛋白重链基因均呈强阳性表达.③免疫细胞化学检测:荧光显微镜下,罗丹明染色细胞浆呈红色荧光,并可见肌丝结构;DAPI染色细胞核呈蓝色荧光.诱导组血管平滑肌肌动蛋白阳性率明显高于血清对照组、全反式维甲酸组(P＜0.05).结论:胚胎干细胞经维甲酸、转化生长因子β1以及血小板源性生长因子分阶段联合诱导后,可分化为血管平滑肌细胞且纯度较高.随着细胞纯度和活性等问题的进一步解决,胚胎干细胞将有可能成为血管组织工程的种子细胞.
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小儿骨髓间充质干细胞生物学特性及多向分化潜能
背景:国内报道人骨髓间充质干细胞多取材于成人细胞,小儿骨髓间充质干细胞的研究较少.目的:拟分离培养小儿的骨髓间充质干细胞,观察其生物学特性以及向成骨、成脂肪、成神经分化的潜能.设计:观察对比实验.单位:华中科技大学同济医学院.材料:实验于2006-03109在武汉同济医院骨科实验室完成,小儿骨髓间充质干细胞取自5～8岁因髋关节发育不良行骨盆截骨术的患儿,男1例,女2例,实验经过医院伦理委员会批准许可,并征得所有患儿家属知情同意.地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠、甲基异丁酸黄嘌呤、胰岛素、吲哚醚辛、羟基丁酸苯甲醚均为Sigma公司产品,二甲基亚砜为Amersco公司产品.方法:经Percoll梯度分离接种获得小儿骨髓间充质细胞,倒置相差显微镜下观察细胞形态、排列分布情况.分别采用成骨细胞诱导剂(β-甘油磷酸钠,地塞米松,维生素C)、成脂肪细胞诱导液(地塞米松,甲基异丁酸黄嘌呤,牛胰岛素,吲哚美辛)及二甲摹亚砜和羟基丁酸苯甲醚无血清培养摹诱导剂干预细胞向成骨、脂肪、神经细胞分化,经免疫组织化学染色、PCR、免疫细胞染色方法检测成骨标志物(碱性磷酸酶、骨钙素mRNA、钙结节)、脂肪标志物(脂滴、PPAR Y-2mRNA)、以及类神经标志物(尼克氏体、神经烯醇化酶、神经丝蛋白).主要观察指标:①d,JL骨髓间充质细胞形态以及增殖情况.②成骨、脂肪及类神经标志物检测结果.结果:①小儿骨髓间充质细胞贴壁容易,细胞细长梭形,增殖能力强,融合后呈旋涡状分布.②骨髓间充质细胞分别经各诱导剂诱导后,细胞形态均发生相应的变化,用化学染色、PCR、免疫细胞染色等方法检测成骨标志物、脂肪标志物及类神经标志物有明显阳性表达.结论:小儿骨髓间充质细胞生长具有稳定增殖、传代的能力,具有成骨、成脂肪、成神经等多方向的定向分化潜能.
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大鼠骨骺干细胞免疫纯化和Sox9基因真核表达载体的克隆构建
目的:Sox9基因是一种重要的早期胚胎发育相关基因,是前软骨细胞浓聚所必需的因子,其促进成骨但同时可以抑制骨骺细胞的终末分化,以延长软骨发育成熟过程,延迟软骨发育,抑制软骨细胞凋亡,有利于骨骼在生长发育阶段形成复杂的形状和结构.从骨骺干骨细胞中克隆得Sox9基因,并构建其真核表达载体.方法:实验于2007-03/07在同济医学院矫形外科实验室完成.①实验材料:出生＜24h纯系清洁级新生SD大白鼠,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:参考游洪波等方法,采用免疫磁珠技术分离纯化具有FGFR-3特异性表面标志的大鼠骨骺干细胞,以FGFR-3抗体对骨骺干细胞的细胞爬片进行免疫细胞化学鉴定.提取骨骺干细胞总RNA,以RT-PCR方法获得Sox9基因的全长,插入pGEM(R)-T Easy Vector System克隆载体中进行序列测定,测序正确后将其亚克隆至表达载体pEGFP-IRE2构建重组复合质粒.结果:免疫组织化学证实,显微取材分离并纯化的细胞为骨骺干细胞.从骨骺干细胞中提取的总RNA经电泳可得28 s、18 s和5 s共3条带,测吸光度值为0.263 5,A 260/A 280为1.8741,说明提取的总RNA完整性较好,纯度高,符合RT-PCR的要求.PCR产物经电泳可得到约2000 bp的特异性条带,与预期大小一致.经限制性内切酶酶切图谱分析DNA序列测定证实的目的基因已经插入重组质粒,成功地构建了Sox9质粒.结论:成功地分离纯化了骨骺干细胞,克隆出Sox9基因并构建了Sox9基因的真核表达载体,为进一步研究Sox9的生物学功能及其在成软骨和成骨分化过程中的作用奠定了基础.
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低氧环境对骨髓间充质干细胞诱导分化的影响
目的:目前公认肾上腺素能β1受体含量和环磷酸腺苷水平在心肌细胞处于低氧状态时会发生改变,然而诱导分化的骨髓间充质干细胞经慢性低氧作用后能否表现与心肌细胞相同的特性还未知,故检测其β1受体mRNA表达及第二信使环磷酸腺苷活性变化.方法:实验于2006-02/2007-04在华中科技大学同济医学院附属协和医院心研所实验室完成.①动物:清洁级成年昆明小鼠10只,新生1 d龄昆明小鼠40只,均购自华中科技大学同济医学院实验动物中心,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:成年小鼠麻醉后于肱骨及胫骨骨折处吸取适量骨髓,加入含15%胎牛血清、100 U/mL青霉素G、80 U/mL链霉素的IMDM培养基,贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞.将新生鼠处死迅速取心脏,用Ⅱ型胶原酶消化离心,将生长较好的第1、2代心肌细胞制成1×109 L-1细胞裂解液,体外模拟心肌微环境诱导分化骨髓间充质干细胞.设立2组,空白对照组仅加入IMDM培养基,实验组加入IMDM培养基和心肌细胞裂解液,隔天换液.继续培养1周后又分为4个亚组:常氧组,常氧不加药物作用72 h;低氧组,用1%氧浓度作用72 h;异丙肾上腺素组,用1×10-5mmol/L异丙肾上腺素作用72 h;低氧+异丙肾上腺素组,用1%低氧和1×10-5mmol/L异丙肾上腺素联合作用72 h.⑨实验评估:RT-PCR法检测骨髓间充质干细胞β-受体mRNA水平,放射免疫法测定骨髓间充质干细胞环磷酸腺苷的活性.结果:①骨髓间充质干细胞β1受体mRNA水平的表达:空白对照组不表达β1受体mRNA.作用72h后,常氧组表达β1受体mRNA,低氧组β1受体mRNA水平升高100%,异丙肾上腺素组、低氧+异丙肾上腺素组β1受体mRNA水平均降低40%.②骨髓间充质干细胞环磷酸腺苷活件检测:与常氧组比较,低氧组环磷酸腺苷活性无明显变化(P＞0.05);异丙肾上腺素组环磷酸腺苷活性下降35%(P＜0.05);低氧+异丙肾上腺素组与异丙肾上腺素组水平相当(P＞0.05).结论:①采用心肌细胞裂解液体外模拟心肌微环境诱导分化的骨髓间充质干细胞表达β1受体.②单纯低氧作用可明显升高骨髓间充质干细胞β1受体mRNA水平,环磷酸腺苷活性无变化.经异丙肾上腺素作用后,低氧环境无法显著改变β1受体mRNA水平和环磷酸腺苷活性.
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人脂肪来源干细胞增强型绿色荧光蛋白质粒转染及体内示踪
目的:对于人脂肪来源干细胞的应用,目前已开始进行临床前期体内移植实验,细胞标记与示踪是证明移植细胞转归和生成组织来源的关键问题.实验观察了带有增强型绿色荧光蛋白的基因质粒转染人脂肪来源干细胞的效果及体内示踪效应.方法:实验于2007-03/12在沈阳军区总医院整形美容外科中心实验室(省级)、沈阳军区呼吸中心实验室(国家级)和全军神经外科中心实验室(国家级)完成.①细胞来源与动物:脂肪组织取自1例腹壁整形术女性患者,对治疗及实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.清洁级雄性裸鼠8只,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.大肠杆菌JM109由本室保存.转染质粒pEGFP-N3为美国Clontech公司产品.②实验方法:无菌条件下切取患者脂肪组织,采用酶消化法体外分离培养脂肪来源干细胞,传至第3代时以2.5×107L-1密度接种,分别加入200,300,400,500,600,700,800,900mg/L G418,确定G418杀死所有细胞的低浓度(C0).采用脂质体法对人脂肪来源干细胞进行pEGFP-N3质粒转染,C0浓度G418筛选,计数阳性细胞率.培养5代后制备单个细胞悬液,浓度为8×1010L-1,植入到裸鼠背部皮下,采用活体化学发光和荧光成像系统观察大鼠荧光表达情况.结果:①体外培养的人脂肪来源干细胞贴壁后为成纤维细胞样,细胞生长活性良好,传代后生长速度加快.②当G418浓度为600 mg/L时细胞全部死亡,故将此浓度设定为C0.③pEGFP-N3质粒-脂质体复合物转化脂肪来源干细胞24 h后,绿色荧光蛋白阳性细胞率为(13.0±3.5)%,经C0浓度G418筛选后高达(65.0±5.4)%.④裸鼠背部皮下注射脂肪来源干细胞8周后,可见移植区周围弥漫分布绿色荧光区,提示植入细胞存活并广泛分布.结论:增强型绿色荧光蛋白质粒可以有效转染人脂肪来源干细胞,并在裸鼠体内呈现良好的示踪效果.
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兔自体脂肪干细胞成骨诱导后经皮注射修复骨缺损
目的:探索兔自体脂肪干细胞、成骨诱导后的脂肪干细胞联合骨形态发生蛋白-2/纤维蛋白胶(bone morphogenetic proein-2/Fibrin glue,BMP-2/FG)经皮移植到骨缺损后体内成骨能力的差异.方法:实验于2006-0812007-11在北京军区总医院全军骨科研究所完成.①实验材料:清洁级日本大耳白兔,2.0～2.5 kg,雌雄不限,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:制作新西兰大白兔桡骨中段15 mm骨缺损模型35侧,随机分为5组,每组7侧:未诱导细胞组、诱导细胞组、未诱导细胞+BMP-2/FG组、诱导细胞+BMP-2/FG组、空白对照组.未诱导细胞组、诱导细胞组直接用生理盐水重悬未诱导脂肪干细胞和经成骨诱导的脂肪干细胞,未诱导细胞+BMP-2/FG、诱导细胞+BMP-2/FG组分别用含20 g/L骨形态发生蛋白-2、5 g/L纤维蛋白原的生理盐水重悬未诱导和经成骨诱导的脂肪干细胞.⑨实验评估:X射线片观察各组骨缺损修复情况,并进行生物力学榆测.结果:①12周时,未诱导细胞+BMP-2/FG组、诱导细胞+BMP-2/FG组在骨缺损区新生骨的数晕明显优于未诱导细胞组、诱导细胞组(P均＜0.05).②术后4周x射线显示,未诱导细胞+BMP-2/FG组、诱导细胞+BMP-2/FG组阻射密度值高于其他组(P均＜0.05),未诱导细胞组与诱导细胞组无差别.术后8,12周时,诱导细胞组高于未诱导细胞组,未诱导细胞+BMP-2,FG、诱导细胞+BMP-2/FG组均高于其他组,诱导细胞+BMP-2/FG组高于未诱导细胞+BMP-2/FG组(P均＜0.05).③生物力学检测显示,未诱导细胞+BMP-2/FG组、诱导细胞+BMP-2/FG组桡骨标本的四点弯曲断裂载荷均明显高于其他组,并且诱导细胞+BMP-2/FG组高于未诱导细胞+BMP-2/FG组(P均＜0.05).未诱导细胞组与诱导细胞组无差别.结论:成骨诱导脂肪干细胞及联合BMP-2/FG移植后8周和12周时具有更强的成骨能力,可作为种子细胞应用于骨组织工程.
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表皮生长因子对脑源性神经生长因子诱导体外培养大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的影响
目的:获得大量神经干细胞并且能够控制其向神经元定向分化可为进一步修复损伤大脑和治疗退行性神经系统疾病奠定种子细胞基础,实验观察了表皮生长因子对脑源性神经生长因子诱导神经干细胞向神经元分化过程中的影响.方法:实验于2007-08在中国医科大学神经解剖研究室完成.①材料:清洁级雄性成年SD大鼠3只,由中国医科大学实验动物部提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:无菌条件下分离大鼠脑海马组织,胰蛋白酶消化后采用无血清培养技术体外培养神经干细胞,传至第4代克隆球直径约为200 μ m时,滴加DMEM/F12+2%B27+20μg/L表皮生长因子+20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子+条件培养液(细胞原代培养第7天的上清液的过滤液),进行单细胞克隆培养,传代的神经干细胞分成空白对照组、表皮生长因子组、脑源性神经生长因子组、表皮生长因子+脑源性神经生长因子组.空白对照组培养液为含体积分数0.1胎牛血清的DMEM/F12,其余3组培养液在此基础上分别加入各自对应的细胞因子培养1周,表皮生长因子浓度为20 μg/L,肺源性神经生长因子浓度为50 μg/L.③实验评估:传代后的克隆球进行神经干细胞免疫细胞化学染色鉴定.计数神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率,检测神经干细胞向神经元的分化情况.结果:①单细胞克隆培养后,克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达.②与空白对照组神经干细胞分化为神经元的比例比较,表皮生长因子组有所降低:脑源性神经生长因子组、表皮生长因子+脑源性神经生长因子组均明显提高(t=2.309～2.779,P＜0.05),且后者提高幅度尤为显著(t=2.309,P＜0.05).结论:表皮生长因子可以提高脑源性神经生长因子诱导成年大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的比例.
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单倍体相合造血干细胞移植后慢性移植物抗宿主病小鼠模型的建立及其评价
目的:因供受者主要或次要组织相容性抗原存在差异而引起的移植物抗宿丰病是影响异基因造血干细胞移植效果的关键因素,目前国内尚缺乏研究此领域的实验动物模型及其评价体系.本实验拟建立半相合异基因造血干细胞移植后慢性移植物抗宿主病小鼠模型,并制定半定量评价体系.方法:实验于2007-03/08在南方医科大学实验动物中心完成.①动物:供鼠为近交系Balb/CH-2d小鼠40只,雄性,8～10周龄,体质量18～22 g;受鼠为CB6F1小鼠(Balb/c×C57BL/6 F1H-2d/b)48只,雌性,10～12周龄.体质量18～24 g,随机数字表法分为3×107,6×107,9×107个脾细胞移植组及空白对照组,12只/组.小鼠均由南方医科大学实验动物中心提供,SPF级,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:Balb/CH-2d小鼠颈椎脱臼处死,取脾脏研磨后制成脾单细胞悬液,离心弃上清,加入Tris-NH4Cl裂解红细胞,用RPMI 1640调整细胞浓度为1.2×108 L-1,锥虫蓝染色计数脾细胞拒染率为95.6%.3×107,6×107,9×107个脾细胞移植组分别经尾静脉输入对应数量的MHC半相合脾细胞悬液0.5 mL,空白对照组输入等体积RPMI 1640培养液.③实验评估:脾细胞移植后2,5,8,12周,光镜下计数20个分裂相,检查骨髓细胞中的Y染色体数量,进行嵌合体分析.脾细胞移植18 d后,每3 d观察受体小鼠的临床表现,包括体质量、体形、体位、毛发变化及生存情况,并予以评分.输注脾细胞后100 d观察皮肤、肝脏、回盲端小肠靶器官的病理变化,并进行评分.结果:48只受体小鼠均进入结果分析.①嵌合体榆测:6×107个脾细胞移植组可形成较为稳定的低水平供受者混合嵌合体;9×107个脾细胞移植组起初可形成较高水平的供受者混合嵌合体,随时间的推移水平降低;3×107个脾细胞移植组未能形成稳定的供受者混合嵌合体.②慢性移植物抗宿主病的临床及病理评分:移植物抗宿主病发生时间多集中在供鼠脾细胞输注后30～80 d,临床表现以皮肤改变、体质量减轻、弓背体态为主,病理损害以皮肤、肠道及肝脏明显.与3×107个脾细胞移植组比较,6×107,9×107个脾细胞移植组临床和病理评分均显著升高(P＜0.05).慢性移植物抗宿主病发生率均显著升高(P＜0.01);后2组临床和病理各项指标之间差异均无显著性意义(P＞0.05).结论:输注6×107和9×107个脾细胞的小鼠成功诱导出半相合异基因造血干细胞移植慢性移植物抗宿丰病,其临床和病理评价体系具有较高的一致性和实用性,为进一步分析慢性移植物抗宿主病的发病机制和评价干预因素的优劣奠定实验学基础.
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神经干细胞移植对老年痴呆模型鼠基底前脑小白蛋白阳性神经元和学习记忆能力的影响
目的:基底前脑是老年性痴呆患者脑皮质下神经元丢失严重的区域,实验拟验证经神经干细胞移植治疗后老年痴呆鼠基底前脑小白蛋白阳性神经元的变化以及对其空间学习记忆能力方面的影响.方法:实验于2005-12/2006-07在广州医学院解剖学教研室完成.①动物:清洁级SD雄性大鼠28只,随机数字表法分为3组:正常对照组8只、模犁对照组8只、细胞移植组12只.另取10只新生SD鼠用于神经干细胞的分离培养.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:模型对照组、细胞移植组大鼠切断左侧穹降海马伞,建立老年性痴呆动物模型.利用无血清培养技术获得鼠基底前脑神经干细胞,吸取2.5 × 1010L-1细胞悬液4 μ L,术后即刻细胞移植组损伤侧行细胞移植,坐标为前囟+0.6 mm,外侧+0.6mm插入,腹侧-5.5mm.③实验评估:移植后4周,采用Y犁迷宫对各组动物进行学习记忆能力检测.麻醉后取脑制备组织切片,ABC法免疫组化染色结合图像分析观察各组大鼠基底前脑小白蛋白阳性神经元的变化.结果:①对空间学习记忆能力的影响:细胞移植组空间学习能力、记忆能力均显著高于模型对照组(P＜0.05或P＜0.01),基本达到正常水平(P＞0.05).②对小白蛋白阳性神经元的影响:与正常对照组比较,模犁对照组损伤侧内侧隔核和斜角带核的小白蛋白阳性神经元数目分别减少62.5%和30.4%;细胞移植组降低幅度明显小于模型对照组(P＜0.01).与正常对照组比较,模型对照组损伤侧内侧隔核、斜角带核小白蛋白阳性神经元的面积、周长、灰度均显著降低(P＜0.05或0.01);细胞移植组上述指标较模犁对照组均显著增加(P＜0.05或0.01).③相关性分析:小白蛋白阳性神经元数日与大鼠在Y型迷宫中的学习次数呈显著负相关(r=-0.76～-0.79,P＜0.01),与记忆能力呈显著正相关(r=0.78～0.84,P＜0.01).结论:神经干细胞移植对老年性痴呆模型鼠基底前脑退变的小白蛋白阳性神经元具有补充和保护作用,并能够明显改善其学习记忆能力,二者呈正性相关.
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人胚胎原始生殖细胞移植治疗大鼠急性肝损伤
目的:胚胎原始生殖细胞能以原始胚胎状态无限增殖,并可通过异体移植或适宜的体外环境自然分化为胚胎生殖层.实验拟进一步观察体外培养的胚胎原始生殖细胞对急性肝损伤大鼠的治疗效果,及其能否在大鼠体内分化为肝细胞.方法:实验于2003-09/2005-05在中南大学肝病研究所完成.①细胞及动物:经中南大学湘雅二医院医学伦理委员会批准,取孕4～12周流产人胚胎,其双亲3代内无遗传性疾病,孕妇对流产胚胎用于实验均签署知情同意书.清洁级健康成年SD大鼠50只,随机数字表法分为5组:培养基对照组、单纯人胚原始生殖细胞组,人胚原始生殖细胞+环磷酰胺组、单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞+环磷酰胺组,10只/组.另选取健康成年SD孕鼠4只用于分离鼠胚原始生殖细胞.动物均由中南大学湘雅二医院动物实验中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:从人胚胎中分离出原始生殖嵴组织,悬浮培养获取人胚原始生殖细胞,用含15%胎牛血清的高糖DMEM基础培养基调节细胞浓度至1×108L-1.取SD孕鼠胚胎分离牛殖嵴,消化离心培养鼠胚原始生殖细胞,浓度1×108L-1.各组大鼠均于腹腔内注射D-氨基半乳糖建立急件肝损伤模型,造模后48 h,培养基对照组自尾静脉输注基础培养基,其余4组给予对应细胞悬液及免疫抑制荆环磷酰胺.③实验评估:从细胞形态、表面标记及体外分化等方面检测人胚原始生殖细胞的生物学特性;比较各组大鼠肝功能、增殖细胞核抗原阳性率、糖原染色阳性率、肝脏病理改变;检测各组大鼠肝脏病理切片中人白蛋白、甲胎蛋白的表达.结果:①人胚原始生殖细胞的生物学特性:培养1d后单个原始生殖细胞形成细胞集落,以后集落逐渐增大并隆起,形成鸟巢状,周边界限清晰,内部细胞排列紧密.传代后原始生殖细胞集落呈自发分化趋势,周边出现成纤维样细胞,后分化为梭形细胞、多边形细胞等.原代全第3代未分化的人胚原始牛殖细胞集落碱性磷酸酶染色均呈阳性,分化的细胞及成纤维细胞呈阴性.②肝功能榆测:细胞输注前各组内氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、总胆红素水平均基本相似(t=0.361～1.183,P均＞0.05).输注后7 d与培养基对照组比较,单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞+环磷酰胺组上述3项指标水平均明显降低(t=2.532～8.361,P均＜0.05):后两组间比较差异无显著性意义(t=0.340～1.712,P均＞0.05).③增殖细胞核抗原阳性率:细胞输注后7d与培养基对照组比较,单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞+环磷酰胺组的增殖细胞核抗原阳性率均明显升高(t=9.020～10.747,JP均＜0.001):后两组间比较差异无显著性意义(t=0.752,P=0.462).④糖原染色:细胞输注后7 d,培养基对照组着色相对浅淡,呈细颗粒状,;单纯鼠胚原始牛殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞+环磷酰胺组着色相对深粗,呈斑块状聚集.⑤病理检测:细胞输注后7 d,培养基对照组肝索、肝窦结构排列欠规则,坏死区可见少量肝细胞再生,汇管区有大量炎症细胞浸润;单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞+环磷酰胺组各项病理情况均显著改善.⑥大鼠肝组织人白蛋白、甲胎蛋白的表达:细胞输注后14,21 d,单纯人胚原始生殖细胞组、人胚原始生殖细胞+环磷酰胺组表达人白蛋白及甲胎蛋白阳性细胞,培养基对照组未见表达.结论:①胚胎原始生殖细胞移植有利于激发急性肝损伤大鼠肝细胞的增殖,改善肝功能,加速受损肝细胞的病理修复.②胚胎原始生殖细胞可在受体肝脏组织中生存,并分化为具有合成白蛋白及甲胎蛋白功能的肝细胞样细胞.
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体外分离培养人皮下脂肪干细胞的生物学特性及影响因素
目的:研究证实脂肪组织提取物中存在脂肪源性干细胞,并表现出向多谱系细胞分化的特点.对来源于人皮下脂肪组织的脂肪干细胞进行体外培养,观察其形态特点、生物学特性及间充质来源细胞表面相关标志的表达.方法:实验于2005-11/2007-02在泸州医学院医学分子生物学实验室完成.①对象:行切疤植皮术的正常体质量患者8例,年龄16～45岁,均无传染性疾病,来源于泸州医学院烧伤整形科,实验前征得患者同意.②实验方法:人脂肪干细胞的分离、培养与传代:无菌条件下取患者新鲜的皮下脂肪,Ⅰ型胶原酶消化+贴壁法获取原代脂肪干细胞,生长至70%融合时传代,观察细胞的形态学变化.当原代细胞的胞质中出现较多透亮液滴后,行油红O染色.将第3代脂肪干细胞冻存,1个月后复苏,观察细胞的生长情况.选择生长状态良好的第3代脂肪干细胞,苏木精-伊红染色观察细胞形态,SABC法检测间充质来源细胞特异性标志波形蛋白的表达,SP法检测间充质干细胞表面相关抗原CD44的表达.取处于对数生长期的细胞,绘制细胞生长曲线,计算细胞倍增时间.结果:①原代和传代过程中人脂肪干细胞的形态学变化:原代和传代培养的细胞均为长梭形贴壁生长.当原代细胞达到50%融合后,部分细胞由梭形逐渐变为多角形或椭圆形,胞质内出现油红O染色阳性的脂滴.传代细胞中此现象逐渐消失,且经冻存后复苏的活细胞率达80%以上,细胞生长、增殖能力未受影响.②间充质来源细胞表面标志的鉴定:第3代人脂肪干细胞的胞质丰富,HE染色弱嗜碱性,呈淡蓝色;波形蛋白阳性率为(97.1±2.3)%,CD44阳性率为(85.4±3.22)%.③人脂肪干细胞的生长曲线及倍增时间:传代培养的脂肪干细胞生长曲线呈"S"形,群体倍增时间为62.38h.结论:从人皮下脂肪组织分离培养出的脂肪干细胞,在体外扩增和冷冻保存后生物学特性稳定,且具有良好的增殖能力,表达间充质来源细胞表面标志波形蛋白和表面抗原CD44.
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P19胚胎癌细胞体外定向心肌细胞分化模型的构建
目的:如何在体外将胚胎干细胞培育转化为大量的心肌细胞并进行移植,使之成为具有成熟心肌细胞功能?实验采用不同诱导剂对P19胚胎干细胞进行诱导,拟构建体外定向心肌细胞分化模型.方法:实验于2006-09/2007-03在日本东京工业大学生体分子机能工学研究室完成.①材料:P19细胞由日本东北大学加龄医学研究所提供.钙粘素融合蛋白N-cad-Fc由本研究室合成.②实验方法:P19细胞按1×107 L-1密度接种进行悬浮培养,分别以终浓度1,5,10,50,100 nmol/L视黄酸及0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%二甲基亚砜各自诱导4 d,将形成的细胞聚集体分别接种于预铺有0.1%明胶、2.5mg/LN-cad-Fc、10mg/LN-cad-Fc基质的24孔板中培养10d.③实验评估:观察不同诱导条件及不同基质上的细胞跳动情况,免疫荧光染色检测心肌特异性蛋白Troponin T的表达,RT-PCR法检测心肌细胞标志性基因cardiac actin、gata-4的表达.结果:①P19细胞经1,5,10 nmol/L视黄酸或0.5%、0.75%、1%二甲基亚砜诱导后,均出现可自主节律跳动的细胞.P19细胞聚集体悬浮培养至20d,预铺有0.1%明胶、2.5mg/L N-cad-Fc及10mg/L N-cad-Fc基质的培养板上节律跳动细胞团的出现率分别为44.6%、71.3%和70.1%.②药物诱导后,P19细胞心肌特异性蛋白Troponin T呈阳性表达.③与传统预铺有明胶的培养板比较,在预铺有N-cad-Fc的培养板上心肌标志性基因cardiacacdn、gata-4的表达均明显升高,但10mg/LN-cad-Fc的表达量略低于2.5 mg/L N-cad-Fc.④分别在上述不同基质上单层培养的P19细胞,二甲基亚砜诱导14 d后均仍呈上皮样细胞形态,未见跳动细胞出现.RT-PCR检测无心肌标志性基因表达.结论:①使用0.5%～1%二甲基亚砜或1～10 nmol/L视黄酸可成功诱导P19细胞心肌分化,心肌特异性蛋白Troponin T的表达早于心肌跳动的出现.②作为一种基质模犁来模拟细胞间黏附,2.5 mg/L N-cad-Fc是较适宜P19细胞心肌分化的条件.③P19细胞心肌分化有赖于药物诱导和细胞成团的共同作用,细胞间黏附分子对其分化有促进作用.
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骨髓基质干细胞和神经干细胞移植治疗帕金森病大鼠的效果比较
目的:目前对应用神经干细胞和骨髓基质干细胞移植治疗帕金森病效果进行对比的研究很少,实验观察比较同种异体来源的中脑神经干细胞和骨髓基质干细胞对帕金森大鼠行为学及损伤脑组织形态学的影响.方法:实验于2006-03/2007-09在河北医科大学第一医院脑老化与认知神经科学实验室完成.SD大鼠麻醉后建立右侧帕金森病模型,随机分为神经干细胞组14只、骨髓基质干细胞组10只、空白对照组10只.选取右侧纹状体2个坐标点(in mm:A+0.6:R+4.0;V-5.0)、(in mm:A-0.7;R+3.0:V-5.0),前两组每个坐标点分别注入经Brd-U标记的神经干细胞悬液、骨髓基质干细胞悬液5 μL,约1×106个细胞,空白对照组注射等量磷酸盐缓冲液.细胞移植后各组大鼠腹腔注射阿朴吗啡诱导旋转.结果:①行为学改变:与空白对照组比较,移植2～8周神经干细胞组和骨髓基质干细胞组大鼠的旋转次数均明显减少(P＜0.01).②纹状体切片免疫组织化学荧光染色鉴定:移植8周后,神经干细胞组和骨髓基质干细胞组均可见一定数量双标的神经元、星形胶质细胞和酪氨酸羟化酶阳性细胞,且后者的双标细胞相对多于前者.空白对照组未发现Brd-U阳性细胞、微管相关蛋白2阳性细胞及酪氨酸羟化酶阳性细胞的表达.各组损毁侧黑质酪氨酸羟化酶阳性细胞残存率基本相似(P＞0.05).结论:神经干细胞和骨髓基质干细胞移植均可改善帕金森病大鼠的旋转行为,且至少在脑内存活8周,并可分化成神经元、星形胶质细胞和多巴胺能神经元.
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全骨髓贴壁法获纯化骨髓间充质干细胞向神经干细胞的诱导分化
目的:来源于骨髓间充质干细胞的神经干细胞是近研究的一个热点.实验拟进一步验证通过全骨髓贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞并诱导分化为神经干细胞的效率,并对其的体内外标记进行了观察.方法:实验于2006-11/2007-05在青岛大学医学院附属医院脑血管病研究所完成.①实验材料:选取出生4周左右Wistar大鼠,雌雄不拘,SPF级,体质量200 g左右,由青岛市实验动物和动物实验中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:选用出生4周左右Wistar大鼠,由其股骨和胫骨分离纯化骨髓间充质干细胞,加碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子诱导其分化为神经干细胞,并进行免疫组织化学鉴定.以5.溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记神经干细胞,在24孔板中进行细胞免疫组织化学和免疫荧光鉴定.将标记的神经干细胞定位注入大鼠基底节区,1周后取脑作石蜡切片,进行免疫组织化学和免疫荧光染色.结果:获得了较纯化的骨髓间充质干细胞,经诱导72 h后,部分细胞增殖分裂成小圆形,呈团簇状半悬浮状态.继续培养72 h可见细胞呈现典型神经元样改变,细胞伸出两个或多个突起,胞体呈多角形或不规则形,折光性较强,细胞突起之间相互连接成网状,可见细胞核及核仁,经诱导后有巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达.采用BrdU掺入DNA合成期的神经干细胞,1周后体内外标记阳性率＞85%.结论:采用全骨髓贴擘法可获得较纯化的骨髓间充质干细胞,其在适宜的诱导分化条件下可诱导分化神经干细胞.BrdU可作为神经干细胞体内示踪的理想标记物.
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胎儿骨髓间充质干细胞的生物学特性
目的:间充质干细胞是普遍存在于人体各组织中的一种成体干细胞,可从骨髓、外周血、脐血、脂肪组织、骨外膜、骨小粱、肌肉、胎肺、胎肾等组织中分离出来.实验观察了人胎儿骨髓间充质干细胞体外分离和培养的方法,观察其生物学特性,以及向各胚层分化的可行性.方法:实验于2006-07/2007-08在苏州大学附属第二医院血液科实验室完成.①实验材料:4个月胎龄的流产胎儿由苏州大学附属第二医院妇产科提供,产妇及家属均签署知情同意书,实验经医学伦理委员会批准.②实验方法:采用Ficoll法分离胎儿骨髓腔冲洗液,离心后取单核细胞层培养、扩增、传代,观察细胞生物学特性,采用MTT法观察细胞生长曲线及分裂指数曲线.取第3代细胞,在含新生牛血清、地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸的DMEM-LG培养基中诱导其成骨分化;在含新生牛血清、地塞米松、胰岛素的DMEM-LG培养基中诱导其成脂分化:在含bFGF、N2、DMEM-LG培养液中诱导其成神经分化.③实验评估:于3周后行von Kossa染色、油红0染色和免疫组织化学检测Nestin、NES、NF的表达以鉴定诱导后的细胞.结果:①接种48 h后,贴壁细胞呈梭形、多角形、成纤维细胞样形态.1周后开始传代,传代培养的潜伏期为24～36 h,对数增殖期约为二三天,第6天进入平台期.传代至8代后生长速度变慢.②FCM榆测显示,细胞高表达CD29、CD44及CD49e分子,低表达CD106、CD54、CD11b,而不表达CD34.③成骨、成脂培养基诱导3周后,Von-Kossa染色呈黑色,油红染色成橘红色.诱导后的胎儿骨髓间充质干细胞于第4天进行免疫组织化学染色显示Nestin、NF、NES表达阳性.结论:采用Ficoll密度梯度离心、贴壁筛选法及单克隆培养法,分离、培养、扩增出具有高度同源性的胎儿骨髓间充质干细胞,并在体外成功的诱导其向成骨细胞、脂肪细胞和神经元细胞分化.
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经冠状动脉自体骨髓单个核细胞移植治疗急性前壁心肌梗死:12个月疗效评价
目的:经冠状动脉自体骨髓单个核细胞移植有助于急性心肌梗死后左心室功能的恢复,但关于移植后远期疗效的临床报道较少.采用随机、对照、前瞻性的临床实验,随访12个月,评价经冠状动脉自体骨髓单个核细胞移植治疗急性前壁心肌梗死远期疗效.方法:实验于2005-05/2006-09在复旦大学附属华山医院心导管室完成.①实验分组:入选华山医院心内科26例ST段抬高的急性前壁心肌梗死住院患者,随机分组:骨髓单个核细胞移植组(n=14)行经皮冠状动脉介入治疗联合经冠状动脉自体骨髓单个核细胞移植,经皮冠状动脉介入术当天,选取左髂后上棘为穿刺点行骨髓单个核细胞的分离纯化:对照组(n=12)仅接受经皮冠状动脉介入治疗.患者对治疗知情同意,治疗经医院伦理委员会批准.②实验评估:术后6,12个月,应用超声心动图评价心脏收缩功能和几何构犁参数改变;应用电化学发光免疫学方法检测血清氮末端脑钠素前体水平,间接评价心功能的变化;明尼苏达心力衰竭问卷评价患者生活质量.结果:①超声心动图显示,经冠状动脉自体骨髓单个核细胞移植6个月后,骨髓单个核细胞移植组左室射血分数明显升高(P＜0.05),而随访至12个月时,移植组左事射血分数有进一步增加的趋势,但与6个月时比较则无统计学意义,心脏几何构型参数改变均无统计学意义.②骨髓单个核细胞移植术后6个月,骨髓单个核细胞移植组血清氮末端脑钠素前体水平明显降低(P=0.001):而术后6个月与12个月比较,血清氮末端脑钠素前体水平仍有进一步下降的趋势,但无统计学意义.③心力衰竭问卷评分提示,骨髓单个核细胞移植有利于急性前壁心肌梗死患者生活质量的改善.结论:经冠状动脉自体骨髓单个核细胞移植治疗急性前壁心肌梗死,可以改善患者临床症状,由于样本量较小,对心肌梗死后心力衰竭的远期疗效仍然尚不确定.
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白细胞介素6和肝细胞生长因子体外诱导人脐血间充质干细胞向肝样细胞分化
目的:在适宜的诱导条件下,脐血间充质干细胞能够分化为肝样细胞,但其诱导的佳条件还处于摸索阶段.实验拟验证白细胞介素6和肝细胞生长因子体外诱导脐血间充质干细胞向肝样细胞分化的可行性,为肝组织工程提供一种新的细胞来源.方法:实验于2007-03/09在兰州大学第一医院中心实验室进行,实验室属于二级生物实验室.①实验材料:足月孕产妇脐血3份,产妇及家属对实验知情同意,并实验经医院伦理委员会批准.②实验方法:采用密度梯度离心法联合贴壁筛选法获脐血间充质干细胞,采用流式细胞仪检测细胞表面分子.选取培养第3代的脐血间充质干细胞,分4组培养:含有肝细胞生长因子培养基组、含白细胞介素6培养基组、含肝细胞生长因子+白细胞介素6培养基组、不加牛长因子的低糖DMEM培养基对照组.③实验评估:应用显微摄像和四甲基偶氮唑盐观察细胞增殖及生长特征,应用流式细胞仪、免疫组织化学法鉴定细胞表型,采用酶联免疫吸附法检测培养上清液中清蛋白水平.结果:①从脐血获得的间充质干细胞生长良好,诱导培养后的细胞均可在21～28 d时,形态变为三角形、多角型或类圆形.②诱导后7 d检测到了甲胎蛋白抗体的表达.诱导21,28 d时检测见CK18阳性,诱导分化的间充质干细胞以时间依赖方式产生清蛋白.肝细胞生长因子+白细胞介素6诱导组肝系细胞标志阳性细胞率均高于单独细胞因子诱导组(P＜0.05).无细胞因子诱导组在以上时间点均未榆测到上述指标.结论:肝细胞生长因子、白细胞介素6均能诱导脐血间充质干细胞分化为具有肝系细胞表型和功能的细胞,两者联合效果更佳.
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VEGF基因修饰兔骨髓间充质干细胞的研究
背景:血管内皮生长因子的应用是组织工程组织血管化的有效手段.但是,血管内皮生长因子价格昂贵,并且半衰期非常短.很难在体内保持有效的作用浓度.故本实验将其转入组织工程的种子细胞--骨髓间充质干细胞中,使骨髓间充质干细胞能够有效地分泌血管内皮生长因子,从而达到促进血管生成的目的.目的:探讨应用人血管内皮生长因子165进行基因修饰的可行性,为血管化组织工程组织的构建及缺血性疾病的治疗奠定实验基础.设计:观察对比实验.单位:吉林大学第一医院和吉林大学再生医学科学研究所.材料:实验于2003-06/2004-08在吉林大学再生医学科学研究所吉林大学重点实验室(生物安全实验室二级)完成.健康新西兰大耳白兔由吉林大学实验动物中心提供.4.0～5.0月龄,体质量215～315 kg,雌雄兼用,实验过程中对动物处置均在麻醉状态,无菌条件下完成,符合动物伦理学标准.实验药品及试剂:Ham F12培养基(GIBCO公司),噻唑蓝(MTT)(Sigma公司),pLXSN-KDRp-VEGF165与pcDNA3.0载体由本实验室自备,ELISA检测试剂盒(深圳晶美生物公司),感受态大肠杆菌DH5α、限制性内切酶BamH Ⅰ、Xho Ⅰ、HandⅢ、EcoR Ⅰ和标准DNA分子(Promega公司).方法:分离、培养新西兰大白兔骨髓间充质干细胞.构建并鉴定pcDNA3.0-VEGF165真核表达载体,利用脂质体介导其转染骨髓间充质干细胞.采用ELISA方法检测转基因骨髓间充质干细胞的人血管内皮生长因子蛋白表达,MTT法检测转基因骨髓间充质干细胞表达物对血管内皮细胞增殖活性的影响,设单纯培养骨髓间充质干细胞及pcDNA3.0转染骨髓间充质干细胞组为对照组.主要观察指标:①重组质粒双酶切和基因测序分析.②ABC.ELISA法观察质粒转染后的骨髓间充质干细胞的人血管内皮细胞生长因子蛋白表达.③通过MTT法检测人血管内皮生长因子165基因转染骨髓间充质干细胞培养上清对血管内皮细胞增殖的影响.结果:①构建的质粒用Hind Ⅲ和Xho Ⅰ双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定结果与预期完全相同,PcR和酶切鉴定正确后行测序鉴定,测序结果正确,证明所构建的质粒为pcDNA3.0-VEGF165重组质粒.②ABC-ELISA法检测结果表明,人血管内皮生长因子165基因重组载体转染骨髓间充质干细胞后24 h,即有较高水平的人血管内皮生长因子165蛋白表达,48及72 h呈下降趋势,但与对照组比较,差异显著(P＜0.05).③MTT法检测人血管内皮生长因子165基因转染骨髓间充质干细胞培养上清对血管内皮细胞增殖的影响,结果显示,含2%,4%,8%,16%和32%转染人血管内皮生长因子165基因的骨髓间充质干细胞培养上清促血管内皮细胞增殖率均高于对照组(P＜0.05).结论:人血管内皮生长因子165基因可成功地转染至骨髓间充质干细胞中,并可进行有效地表达.
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牛磺酸对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响
目的:有研究发现,喂食牛磺睃的糖尿病鼠脂肪细胞摄糖的能力增加,但牛磺酸是否能影响脂肪细胞分化,目前还尚不清楚.本实验观察牛磺酸对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响,并探讨牛磺酸影响3T3-L1前脂肪细胞分化的机制.方法:实验于2006-07/09在中南大学湘雅三医院实验中心完成.①实验材料:实验中应用的3T3-L1细胞由中国科学院上海细胞库提供.②实验方法:将3T3-L1细胞用含体积分数为0.10胎牛血清的高糖DMEM培养液培养,内含108 u/L青霉素,80×1010U/L链霉素.细胞达汇片后,按5×107L-1密度接种于培养瓶中,应用0.5mmol/L IBMX、0.5mg/L胰岛素和1μmol/L地塞米松诱导分化,实验组加入牛磺酸,对照组未实施牛磺酸干预.油红O染色观察脂肪细胞分化情况.10, 20 mmol/L牛磺酸分别干预C3T3-L1前脂肪细胞24,48 h,抽提实验组和对照组细胞RNA及蛋白.③实验评估:采用RT-PCR及Western-blot方法观察脂肪分化相关基因的表达变化.结果:①10 mmol/L牛磺酸干预后14 d,实验组油红O染色阳性脂肪细胞明显少于对照组.②10,20 mmol/L牛磺酸分别干预3T3-L1前脂肪细胞24.48 h后,对脂肪分化相关基因Insig-2蛋白、PPAR、Insing-2、脂联素、脂联素受体、GLUT-4、AP-2 mRNA表达无明显影响.结论:牛磺酸可抑制前脂肪细胞分化,但具体机制还需要进一步研究.
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ABO血型不合异基因造血干细胞移植治疗恶性血液病
背景:由于移植技术的提高,供受者ABO血型不合已不再是异基因造血干细胞移植的障碍,但是由于宿主血凝素抗体的持续存在,ABO血型不合异基因造血干细胞移植后常出现红细胞系统恢复的延迟.目的:观察ABO血型不合异基因造血干细胞移植患者红细胞系统恢复情况,评价血型不合、人类白细胞抗原配型不相合对造血功能重建的影响.设计:回顾性分析.单位:南京大学医学院附属鼓楼医院血液科.对象:选择2002-05/2007-09在南京大学医学院附属鼓楼医院血液科行ABO血型不合异基因造血干细胞移植的恶性血液患者(受者)14例,男11例,女3例;年龄15～60岁.14例患者中7例供受者人类白细胞抗原配型完全相合.7例供受者人类白细胞抗原配型半相合.纳入同期ABO血型相合的造血干细胞移植患者11例为对照.受者在接受异基凶造血干细胞移植前签署移植同意书,供者为同胞姊妹、胞弟、儿子、母亲,均同意提供用于移植的骨髓.实验经医院伦理委员会批准.方法:①预处理方案:人类白细胞抗原配型全相合组采取马利兰和环磷酰胺为主的方案.人类白细胞抗原配型半不合组采用北京人民医院的GlAC方案.②造血干细胞输注:沉降供者骨髓.取上层有核细胞输给受者.主要观察指标:观察ABO血型不合异基因造血干细胞移植的副反应、并发症及造血重建情况.结果:14例ABO血型不合患者仅1例发生单纯红细胞再生障碍性贫血未进入结果分析.①造血功能重建情况:与对照组比较,ABO血型不合组血红蛋白恢复时间明显延迟(t=2.352,P＜0.05),ABO血型相同与ABO血型不合组中性粒细胞和血小板恢复情况差异无显著性意义(P＞0.05).ABO血型不合的人类白细胞抗原配型半不合造血干细胞组血红蛋白恢复和血型转换时间迟于全相合,但其差异无显著性意义(P＞0.05).②并发症:14例ABO血型不合患者移植后成分输血过程未出现溶血反应,移植后也均未发生迟发性溶血反应.结论:ABO血型不合不影响造血干细胞移植的效果,且较为安全.
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神经干细胞移植对脑出血模型大鼠神经功能的影响
背景:外源性神经干细胞具有神经修复作用,可能对脑出血后的神经功能恢复起到一定的作用.目的:观察胎鼠神经干细胞的体外生长、分化及移植到脑出血大鼠后的存活、迁徙、分化情况,探讨神经干细胞对脑出血模型大鼠受损神经功能的修复作用.设计:完全随机分组设计,对照动物实验.单位:复旦大学附属华山医院神经外科材料:选用健康雄性成年SD大鼠18只为受体,体质量280～320 g,由中国科学院上海实验动物中心提供.实验用鼠抗BrdU为Neomarkers产品,鼠抗胶质纤维酸性蛋白和兔抗微管相关蛋白2为Chemicon产品.方法:实验于2006-02/12在复旦大学附属上海医学院解剖组胚实验室完成.从胎龄14 d的胎鼠海马中分离、培养、鉴定神经干细胞.16只受体SD大鼠被随机分为3组:对照组,PBS组和移植神经干细胞组.均通过尾状核内注射自体动脉血制作大鼠脑出血模型.移植NSC组在造模后30min在血肿腔周围四点分别移植浓度为2X1011L-1神经干细胞悬液5μ L;PBS组于相同时间点在脑内相同部位注射PBS:PBS和神经干细胞的移植方法同自体血的移植方法.对照组大鼠在造模后30 min只造成四点损伤,不注射任何物质.主要观察指标:在造模后立即,1,3,5,14,21.28 d采用前肢评分和转身评分对大鼠神经功能进行评估.大鼠于造模后28 d麻醉后取脑,并通过双标胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2、BrdU免疫组化来检测移植入脑的神经干细胞在体内的分化情况.结果:①神经功能评分:造模后5 d,各组差异无显著性意义(P＞0.05).造模后14～28 d,干细胞移植组较其他3组明显改善(P＜0.05).②脑组织切片双免疫组织学双标染色结果:干细胞移植组血肿周围凋亡细胞少于PBS组.受体大鼠脑组织切片显示有BrdU,微管相关蛋白2,胶质纤维酸性蛋白阳性细胞,说明神经干细胞可以在宿主脑内存活、迁徙和分化,可以分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞.结论:神经干细胞移植可能通过分化为神经元样细胞和神经胶质细胞促进大鼠脑出血的神经功能恢复.
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人胚胎干细胞的保存方法
目的:胚胎干细胞经传代长期培养后会导致核型出现异常、未分化细胞的克降数减少,因此经低温保存后复苏的胚胎干细胞必须要保持其未分化状态及生物学特性.实验拟比较程序降温法、改良慢速冻存法及传统慢速冻存法对人胚胎干细胞冷冻保存的效率,以及解冻后细胞生长与分化的状态.方法:实验于2006-07/2007-04在解放军军事医学科学院野战输血研究所完成.①材料:清洁级孕13.5 d的ICR小鼠由军事医学科学院动物中心提供,用于制备鼠成纤维细胞饲养层,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.人胚胎干细胞系PKU由北京大学第三医院生殖中心建立并提供:kryo-550.16程序降温仪为英国planner公司产品,由液氮压力泵、液氮罐、层流冷冻箱、温度传感器组成.②实验方法:将人胚胎干细胞系PKU接种在胚胎鼠成纤维细胞饲养层上,胶原酶Ⅳ消化传代,分3组冷冻保存人胚胎干细胞.程序降温法:用吸管将消化后人胚胎干细胞吹成若干团块,取65个团块移入配制的冻存液中,装入麦管进行三段式降温,即22℃～-7℃,每分钟降温2.5℃→-7℃置核后停留5min→-7℃～-30℃,每分钟降温0.3℃ 30℃～-150℃,每分钟降温10℃.降至-150℃时置液氮中保存.改良慢速冻存法:A管含人胚胎干细胞培养基和血清替代品,B管含人胚胎千细胞培养基和二甲亚砜,将60个团块置入A管,再将B管液体移入A管,混匀后-70℃过夜,第2天移入液氮中保存.传统慢速冻存法:将60个团块直接放入添加二甲亚砜的人胚胎干细胞培养基中混匀,分装入冻存管,-4℃放置1 h,-70℃过夜,第2天移入液氮长期保存.③实验评估:解冻后,将保持完整形态且细胞未散离的人胚胎干细胞团块回收,比较3组细胞复苏率、复制生长状态、克隆分化程度.鉴定程序降温组人胚胎干细胞的生物学特性.结果:①复苏率:程序降温组、改良慢速冻存组、传统慢速冻存组的细胞复苏率分别为78.5%、56.7%和23.3%,组间比较差异有显著性意义(x2=6.81～13.89,P＜0.01).②复制生长与克隆分化程度:解冻后第7天与传统慢速冻存组比较,程序降温组及改良慢速冻存组细胞克隆均明显增大(t=7.36,P＜0.05:t=6.89,P＜0.05),且解冻后克隆不易分化(x2=20.47,P＜0.01:x2=9.69,P＜0.01).③生物学特性鉴定:程序降温组解冻后第10代人胚胎干细胞染色体核型正常,人胚胎干细胞特异性表面抗原SSEA-4及TRI-1.81表达呈阳性,RT-PCR可检测到nanog基因表达,SSEA-4及OCT-4阳性表达率分别为83.44%、89.38%.结论:①程序降温法是冷冻保存人胚胎干细胞的有效方法,解冻后的干细胞在继续培养过程中仍可保持其正常核型和生物学特性.②在不具备程序降温仪的条件下,采用改良慢速冻存法保存胚胎干细胞也是可行的.
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髓芯减压加自体骨髓干细胞移植治疗股骨头坏死的早期随访结果
目的:早期股骨头缺血性坏死日前多采用髓芯减压术式,临床证明自体骨髓移植治疗骨不连可促进骨的修复与愈合.回顾性总结分析髓芯减压联合自体骨髓干细胞移植治疗早期股骨头坏死的效果.方法:①对象:选取2005-05/2006-08中日友好医院骨坏死与关节保留重建中心医院收治的股骨头缺血性坏死患者52例/71髋作为髓芯减压联合自体骨髓干细胞移植组,其中ARCO分期Ⅰ～Ⅱ期37例/49髋,Ⅲ期8例/9髋.因干细胞抽取困难或失败,以同期收治的股骨头缺血十牛坏死患者15例/20髓作为单纯髓芯减压组,其中ARCO分期Ⅰ～Ⅱ期10例/13髋,Ⅲ期3例/4髋.两组患者对治疗及实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:两组患者术前常规Harris评分,拍摄双髋关节正位、蛙式侧位X片、CT平扫加二维重建及MRI.髓芯减压联合自体骨髓干细胞移植组自患者双侧髂前上棘连续抽取骨髓300～400mL,分离采集中间层单个核细胞2.16×1010L-1.在C臂X光透视机引导下用2～3枚1.5 mm导针钻入,对照术前X线和二维CT反复确认坏死病灶后,以3mm空心钻钻入,于骨坏死区的股骨头软骨下骨5mm处用50mL注射器将浓缩的细胞悬液缓慢注入股骨头内.单纯髓芯减压组仅行空心钻钻入坏死区.术后随访12个月.结果:髓芯减压联合自体骨髓干细胞移植组45例/58髋、单纯髓芯减压组13例/17髋完成12个月以上随访.①术前两组Harris评分基本相似(P＞0.05):术后与单纯髓芯减压组比较,髓芯减压加自体骨髓干细胞移植组Harris评分明显升高,优良率显著提高(F=3.149,P＜0.05).②髓芯减压加自体骨髓干细胞移植组58髋中.9髋出现新月征和塌陷加重,其中6骸为术前ARCO分期Ⅲa期,1髋行人工关节置换.单纯髓芯减压组17髋中,6髋出现新月征和塌陷加重,其中4髋为术前ARCO分期Ⅲa期,1髋行人工关节置换.两组比较差异有显著性意义(F=3.032,P＜0.05).结论:髓芯减压联合自体骨髓干细胞移植是治疗ARCO分期Ⅰ～Ⅱ期股骨头缺血性坏死安全有效的方法,临床Harris评分和病理影像学观察均优于单纯髓芯减压术式.对于ARCO分期Ⅲ期患者,两种方法治疗效果均欠佳.
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人神经干细胞移植到缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑内的存活及分布
目的:新生儿缺氧缺血性脑病是导致脑性瘫痪的重要原因,至今缺乏有效疗法.将体外培养的人神经干细胞经脑室移植入缺氧缺血性脑损伤新生鼠,观察植入细胞在宿主脑内的存活、迁移及分化.方法:实验于2005-01/09在解放军海军总医院儿科实验室完成.①对象:神经干细胞来源于孕12周流产的人胎儿脑组织,孕妇签署知情同意书,符合医院伦理委员会规定.清洁级SD新生鼠80只,随机数字表法分为细胞移植组、模型对照组,40只/组,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:取人胚胎脑组织,机械分散法分离单个核细胞,接种于添加表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子的N2培养基中,获取生长旺盛的人神经干细胞球,制成单细胞悬液,浓度约为5.0×1011L-1,培养6 d后行PKH标记用于植入后示踪.两组新生鼠均建立缺氧缺血性脑损伤模型,造模后3 d,细胞移植组损伤侧脑室缓慢注入5 μL人神经干细胞悬液,模型对照组于相同部位注入等量生理盐水.③实验评估:取未经PKH标记的细胞球, 通过免疫细胞化学染色鉴定巢蛋白的表达及其向神经元、星形胶质细胞的分化情况.分别于细胞移植后1,2,4周及3个月,常规取脑组织,行免疫组织化学和荧光分析,观察植入后细胞存活及分布情况.结果:在造模及细胞移植过程中,因麻醉、出血细胞移植组新生鼠死亡5只,模型对照组死亡7只,存活率85%～90%.①神经干细胞的鉴定及分化:80%活细胞巢蛋白呈阳性表达,并可分化为神经元、星形胶质细胞.②神经干细胞植入后存活及分布情况:植入后1周,神经丝蛋白阳性细胞多位于损伤侧皮质及海马处,纹状体、脑干、小脑、嗅球也有少量分布.植入后2周,海马和皮质可见神经丝蛋白阳性细胞,胞体伸出的神经微丝更长,细胞数量与1周时基本相似.植入后4周及3个月时PKH阳性细胞数量明显减少.结论:在含有表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子的N2培养基中形成的人神经干细胞球,具有良好的增殖能力,可分化为神经元,移植至缺血缺氧新生鼠脑中能够向损伤区迁移,分布范围广.
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人参皂甙单体Rh2诱导髓性白血病细胞株凋亡的时效与量效
目的:已发现人参中某些有效组分能增强和激活机体免疫系统,具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物活性作用.选取人髓性自血病细胞株HL60为模型,探讨人参皂甙单体Rh2抑制其增殖和诱导凋亡的时效量效关系.方法:实验于2006-07108在吉林医药学院临床检验实验室进行.①材料:人参皂甙单体Rh2购自吉林省宏久生物科技股份有限公司,批号050801,溶于pH 7.4磷酸盐缓冲液中配成50 g/L母液.人髓性白血病细胞株HL60购自中国科学院上海生物细胞研究所.②实验方法:取处于对数生长期的HL60细胞制备3×108L-1细胞悬液,接种后6 h分别加入终浓度为5,10,20,40,80 mg/L的人参皂甙单体Rh2 100 μL,于加药48 h后采用MTT比色法检测人参皂甙单体Rh2对HL60细胞生长的抑制作用,计算抑制率和半数抑制浓度.选择半数抑制浓度的人参皂甙单体Rh2处理HL60细胞,分别于作用 6,12,24,48,72 h后采用MTT比色法测定抑制率,并与未加药对照组进行比较.半数抑制浓度的人参皂甙单体Rh2作用48 h时倒置显微镜下观察HL60细胞形态,吉姆萨染色观察细胞凋亡情况.结果:①量效关系:人参皂甙单体Rh2浓度为5,10,20,40 meJL时,处理48 h后HL60细胞牛长抑制率呈升高趋势(F=9.45,P＜0.01),具有明显的剂量依赖性;至80mg/L时抑制率与40mg/L基本相似.加药48 h后半数抑制浓度为13.0mg/L.②时效关系:13.0mg/L人参皂甙单体Rh2处理HL60细胞6,12,24,48,72 h后,抑制率逐渐升高(F=9.32,P＜0.01),呈时间依赖性.③HL60细胞形态观察:与未加药对照组比较,经13.0 mg/L人参皂甙单体Rh2处理后HL60细胞数量明显减少,细胞分散,体积缩小,细胞核呈碎片状.④凋亡细胞吉姆萨染色检测:经13.0 mg/L人参皂甙单体Rh2处理后,HL60细胞出现核染色质浓缩、呈周边凝聚,核膜裂解形成凋亡小体、胞质出现空泡但胞膜完整的典型细胞凋亡形态学改变.结论:人参皂甙单体Rh2能有效抑制体外培养HL60细胞的增殖,并诱导其凋亡,干预效果呈时间和剂量依赖.
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小鼠胚胎干细胞NT3基因转染后移植对脊髓损伤的恢复作用
目的:由胚胎干细胞分化的神经细胞移植能够在一定程度上恢复脊髓损伤模型动物的功能,此发现使胚胎干细胞成为一种用于移植学研究的重要工具.观察经NT3基因转染修饰的小鼠MESPU35(ES-NT3)胚胎干细胞株移植对脊髓损伤动物脊髓结构和功能重建的恢复效果.方法:实验于2004-09/12在解放军第三军医大学组织胚胎学教研室实验室完成.①材料:清洁级成年Wistar大鼠36只,随机数字表法分为模型对照组、未转染细胞移植组、基因转染细胞移植组,12只,组,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.移植所用MESPU35细胞株和ES-NT3细胞株均由本室冻存.②实验方法:复苏MESPU35和ES-NT3细胞株,采用经典维甲酸4-/4+法诱导两种胚胎干细胞神经定向分化,收集分化9 d后的细胞,调整细胞终浓度至5×1010L-1备用.各组大鼠均建立L4脊髓损伤模型,在脊髓完全横断后10 min内,基因转染细胞移植组分多点缓慢注入ES-NT3胚胎干细胞悬液,2μ L/点,细胞总数约4×105个,注射位置为损伤区域白质与灰质交界处;未转染细胞移植组同法注射MESPU35胚胎干细胞悬液,模型对照组注射等量生理盐水.③实验评估:各组大鼠分别于术前、术后即刻、术后15 d和30 d进行后肢运动功能Tarlov评分检测,分数越低表示运动功能恢复越差.后肢运动功能检测30 min后进行斜板实验,检测大鼠抓握和维持姿势能力.微型注射器将25%的辣根过氧化物酶2μL注入大鼠坐骨神经内,2d后取L1-L4脊髓常规冰冻切片,参照Mesulam法进行过氧化物酶逆行追踪.结果:因细菌感染,模型对照组、未转染细胞移植组、基因转染细胞移植组各死亡2只、1只、2只.①后肢运动功能检测:各组大鼠术后即刻后肢运动功能评分为0.术后15 d,30d与模型对照组比较,未转染细胞移植组后肢运动功能评分升高(P＜0.01),但未达到正常水平;基因转染细胞移植组恢复程度高,后肢运动功能评分基本接近正常水平,明显高于未转染细胞移植组(P＜0.05).②斜板试验:与后肢运动功能检测结果基本相似.③辣根过氧化物酶逆行追踪情况:模型对照组未见阳性神经元.术后30 d基因转染细胞移植组阳性神经元增至多,脊髓结构恢复情况优于未转染细胞移植组.结论:经NT3基因转染修饰的鼠MESPU35胚胎干细胞向神经定向诱导分化后,移植治疗脊髓损伤大鼠能更好地促进脊髓功能恢复和结构重建.
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与胎鼠胰腺干细胞共培养保护大鼠胰岛活性
目的:如何保护胰岛功能一直是胰岛移植中一个重要的研究内容.很多研究表明,干细胞除了自身具有较强的增殖分化能力之外,还可通过分泌一些细胞因子或者通过细胞一细胞接触、融合等方式促进损伤组织的修复,维持正常组织细胞功能.本实验利用胎鼠胰腺干细胞与大鼠胰岛共培养,观察其在保护胰岛功能、延长胰岛体外存活时间方面的作用.方法:实验于2006-07/2007-04在深圳人民医院中心实验室完成.①实验材料:选取体质量500 g、孕16 d的雌性SD大鼠1只,10周龄、体质量200～250 g SD大鼠20只,雌雄不限,均由广东省实验动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:分离纯化孕16 d SD大鼠胎鼠的胰腺干细胞,并应用免疫细胞化学法及流式细胞术鉴定;采用胶原酶V消化、不连续密度梯度法分离纯化SD大鼠胰岛,并应用双硫腙鉴定.按随机对照表法将胰岛培养分单纯胰岛培养、胰岛与胰腺干细胞联合培养两组,15孔/组.③实验评估:观察胰岛形态变化及胰岛存活率,应用酶联免疫吸附法检测胰岛素分泌量并计算刺激指数.结果:①胎鼠胰腺干细胞培养传代3代后免疫细胞化学可见巢蛋白阳性细胞,流式细胞术测定巢蛋白阳性细胞含量占74.1%.②单纯培养组培养3 d时,胰岛生长状况较好,轮廓清楚,培养7 d时.胰岛结构变松散,边界不清,培养超过14 d后,胰岛结构均己破坏.联合培养组培养3 d时.胰岛生长良好,大部分胰岛悬浮生长,部分胰岛与贴壁干细胞松散黏附,培养7 d后大部分胰岛仍完整,培养14d时仍可见完整胰岛.③联合培养组培养7,14d时胰岛存活率明显高于单纯培养组(P＜0.01);④高糖刺激下联合培养组培养7 d时胰岛素分泌刺激指数明显高于单纯培养组(P＜0.01).结论:胎鼠胰腺干细胞与胰岛联合培养可以明显延长胰岛体外存活时间,并保持良好的活性.
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兔心肌梗死后自体骨髓干细胞移植时机的确立
背景:心肌梗死发生后心肌组织将经历炎症反应、心肌纤维化等复杂病理过程,在此期间移植的骨髓干细胞其分化及存活情况均会受到影响.目的:实验选择兔心肌梗死后不同时间点行自体骨髓干细胞移植,通过心脏病变区域组织学变化分析佳移植时机.设计、时间及地点:随机对照细胞观察,于2005 06/2006-04在东南大学试验动物中心完成.材料:清洁级雄性青紫蓝兔36只,随机分成细胞移植组、模型对照组,每组又设立造模后即刻、造模后2周、造模后4周3个亚组,6只/时间点.方法:两组兔均采用液氮冷冻法建立心肌梗死模型.细胞移植组自双侧髂骨抽取骨髓,FICOLL法分离骨髓单个核细胞,加入5-氮杂胞苷予以诱导,移植前行Brdu标记,分别于造模后即刻、2周、4周在心肌梗死部位与正常心肌交界处分4点注入制各好的骨髓干细胞悬液,细胞总数1.0×107个.模型对照组按同样方式于对应时间点注入等量DMEM培养液.主要观察指标:移植后4周心肌组织病理学变化.结果:免疫组织化学染色结果显示,造模后2周、4周细胞移植组均可见Brdu标记细胞,造模后即刻细胞移植组呈阴性.苏木精一伊红染色结果显示,造模后2周细胞移植组出现心肌样细胞,造模后即刻、4周细胞移植组均呈阴性.模型对照组于各时间点仅观察到瘢痕、纤维组织的出现,未见特异性结构.结论:兔心肌梗死后第2周是比较适宜的移植时机,植入后的自体骨髓干细胞可向心肌样细胞方向分化.
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大鼠骨髓基质细胞体外培养向神经干细胞的诱导分化
目的:已证实骨髓基质细胞可分化为中胚层组织细胞,实验予进一步探讨体外分离培养的骨髓基质细胞向神经干细胞分化的可能性,以及是否能继续定向分化为神经细胞及神经胶质细胞,为神经系统疾病细胞移植治疗提供种子细胞.方法:实验于2007-02/09在泸州医学院神经生物学研究室进行.①动物:选择5只普通级SD大鼠,由泸州医学院实验动物中心提供,实验过程中对动物的处胃符合动物伦理学标准.②实验方法:大鼠戊巴比妥钠腹腔麻醉,取双侧胫骨和股骨,磷酸盐缓冲液冲洗骨髓腔.采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞,胰蛋白酶与EDTA联合消化,传至第4代,用含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μ g/L表皮生长因子、N2辅助因子的DMEM/F12培养液向神经干细胞诱导分化.③实验评估:观察原代、传代培养及诱导分化后的骨髓基质细胞生长情况和形态变化,采用SABC法进行免疫细胞化学榆测神经细胞特异性标志的表达.结果:①骨髓基质细胞形态观察:原代细胞接种l d后开始贴壁增殖,3 d后多数贴壁,贴壁细胞呈梭形或扁平形;10 d后90%细胞融合,以长梭形为主,突起粗大,形成网状、片状;传代后细胞贴壁速度加快,增殖能力更强,7 d左右达到融合.②诱导分化后细胞生长情况和形态变化:第4代骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化7 d,成球的细胞脱离瓶底,悬浮在细胞液中.将细胞离心弃上清,换成血清分化液后,细胞球逐渐贴壁,球周围很快发出突起,分化为星形胶质细胞样细胞、神经元样细胞及少突胶质细胞样细胞.③神经细胞特异性标志的表达:骨髓源性细胞球表达巢蛋白,呈棕黄色,为神经干细胞:从细胞球分化的细胞抗胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2及半乳糖脑苷脂均呈阳性.结论:骨髓基质细胞能在体外诱导分化出神经干细胞,且骨髓源性神经干细胞可进一步定向分化为神经细胞及神经胶质细胞.
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脑缺血再灌注损伤后神经细胞巢蛋白和干细胞因子基因的表达
背景:干细胞因子是缺氧诱导的神经再生因子,可能刺激动物的神经再生.目的:观察大鼠脑缺血再灌注损伤后神经细胞巢蛋白和干细胞因子基因表达的变化,分析两者变化的时间规律.设计:随机对照动物实验.单位:青岛大学医学院附属医院超声诊断科.材料:实验选用成年健康雌性SD大鼠36只,由中国科学院上海实验动物中心提供.实验所用巢蛋白和干细胞因子mRNA原位杂交试剂盒、DAB试剂盒均由武汉博士德生物工程有限公司提供.方法:实验于2005-01/06在山东省脑病防治重点实验室完成.选取32只大鼠,应用线栓法经左侧颈外一颈内动脉插线建立左侧大脑中动脉阻塞再灌注模型,在缺血1.5 h再灌注后2,6,1 2,24 h,2,3,7,14 d进行观察,每个时间点4只.其余4只为假手术组:除不插线外,其余步骤同实验组.应用原位杂交技术检测脑缺血再灌注后皮质、纹状体和室旁区巢蛋白和干细胞因子mRNA的表达.主要观察指标:大鼠皮质、纹状体和室旁区神经细胞巢蛋白和干细胞因子基因表达.结果:进入结果分析数量保持为36只.①巢蛋白mRNA表达:假手术组皮质、纹状体和审旁区巢蛋白mRNA表达很弱.缺血再灌注后,在皮质中的表达除再灌注后2 h、纹状体除再灌注后2,6 h以外,室旁区除2,6 h,14 d以外各时间点均明显高于假手术组,差异有显著性意义.(P＜0.05).②干细胞因子表达:假手术组皮质、纹状体和室旁区干细胞因子表达很弱.缺血再灌注后,在皮质中的表达除2,6,12 h以外,纹状体除2,6 h以外,室旁区除2 h,14 d以外各时间点均明显高于假手术组,差异有显著性意义(P＜0.05).结论:干细胞因子表达的时间规律与神经干细胞增殖的时间规律基本一致,可以提示脑缺血再灌注后干细胞因子mRNA表达可能具有促进神经干细胞增殖作用.
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基因转染促骨髓间质前体细胞体外向软骨的分化
目的:骨髓中包含的间质前体细胞在适宜的条件下可以被许多细胞因子诱导分化为软骨.采用基因转染技术观察转化生长因子β2对体外培养的骨髓间质前体细胞向软骨分化的影响.方法:实验于2005-12/2007-01在中日友好医院临床研究所骨科实验室完成.①骨髓标本来源于6名志愿者,对治疗及实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:志愿者局麻下行骨髓穿刺,抽取7.0～10.0 mL骨髓抗凝,以密度梯度离心法分离人骨髓间质前体细胞,通过脂质体介导转染技术,将pcDNA3.1(+)TGF-β2载体导入骨髓间质前体细胞中,体外单层培养.③实验评估:利用RT-PCR、Western Blotting和免疫组化法检测转化生长因子β2和软骨相关基因、蛋白的表达情况.结果:①转染后48 h,可检测到明显的转化生长因子β2 mRNA表达,Ⅱ型胶原A1和Aggrecan mRNA均有轻微表达;转染后4周,转化牛长因子β2 mRNA表达稍有降低,Ⅱ型胶原A1和Aggrecan mRNA表达均明显上调.②转染后48 h和4周,间质前体细胞培养上清液中均有转化生长因子β2蛋白的表达.③转染后48 h部分细胞显示Ⅱ型胶原蛋白免疫组化阳性信号,转染后4周Ⅱ型胶原蛋白阳性细胞数增加.结论:pcDNA3.1(+)/TGF-β2真核表达载体在骨髓间质前体细胞内可获得短暂和长期表达.在单层培养的情况下,骨髓间质前体细胞可被转化生长因子β2诱导向软骨方向分化.
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电穿孔介导外源性基因转染大鼠骨骼肌卫星细胞的可行性
目的:电穿孔的原理是应用短暂高压电脉冲使细胞膜形成纳米级的微孔,外源DNA通过这些微孔或者伴随微孔关闭时膜成分的再分布而直接进入细胞内.实验拟验证电穿孔法介导外源性基因转染大鼠骨骼肌卫星细胞的可行性和转染效率,以获得基因治疗自体移植的载体.方法:实验于2006-10/2007-09在暨南大学医学院中心实验室完成.①材料:清洁级1～3 d龄SD大鼠3只,购于广东省医学实验动物中心,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.基因转染过程应用的pEGFP-N1质粒由本课题组保存.②实验方法:大鼠颈椎脱臼处死,在无菌条件下分离四肢肌组织,剪碎成1 mm×1 mm×1 mm组织块,采用改良酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,再以差速贴壁和非连续梯度离心法分两步进行纯化,细胞均匀增殖至培养面80%或局部增殖过度密集时胰酶消化传代.取第3代处于对数生长期的骨骼肌卫星细胞,消化离心后调整细胞数为2.0×107L-1,取400 μL注入4 mm电击杯中,再加入pEGFP-N1质粒15 μg混匀,将电击杯放入电转槽静置5 mim.电击条件为电容1050 μF,电压180 V,脉冲时间20 ms,脉冲数2次,脉冲间隔时间1 min,电击缓冲液为不含钙镁的磷酸盐缓冲液.放电后电击杯冰浴,并用不含血清的DMEM清洗,将清洗液转入培养瓶中,4h后换用体积分数为0.1胎牛血清的完全培养基,于37℃、体积分数为0.05的CO2无菌细胞培养箱中培养.同时设不加质粒的空白对照.③实验评估:倒置显微镜下观察细胞生长状况.免疫细胞化学检测肌动蛋白的表达.随机计数多个低倍视野,计算电穿孔pEGFP-N1质粒转染卫星细胞的效率.绘制细胞生长曲线,并用流式细胞仪测量细胞周期.结果:①骨骼肌卫星细胞的形态:原代培养48～72 h细胞完全贴壁,呈梭形或纺垂形,长轴平行排列,胞核圆形,核仁明显.5 d时细胞町伸出一个或数个突起.随培养时间的延长,卫星细胞连接成网状.当延迟分瓶或使用分化培养基,相邻的细胞会融合成肌管,继而形成串联,且能看见肌管的跳动.传代后细胞形态旱更加一致的梭形,6 h即完全贴壁,细胞增殖速度明显加快,生长更为旺盛.传至8代卫星细胞出现老化现象.②免疫细胞化学检测:骨骼肌肌动蛋白呈阳性表达.③转染效率:pEGFP-N1质粒电转染8 h后即可看见散存发绿色荧光的卫星细胞,48～72 h达高峰,阳性表达率约35%.④细胞生长曲线及细胞周期检测:电转染细胞接种后第3天进入对数生长期,第7天由于接触抑制导致增殖速度减慢,81.5%处于G0/G1期,19.3%处于S+G2+M期.未转染细胞生长曲线、细胞周期均与其相似.结论:电穿孔法介导外源性基因表达于大鼠骨骼肌卫星细胞具有较高的转染效率,操作简便,重复性好,且对卫星细胞生物学行为无明显影响.
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神经营养素3基因转染神经干细胞及其表达
背景:应用包括神经营养素3的神经营养因子促进周围神经再生是当今周围神经再生研究的热点之一,但是临床应用上缺乏安全、有效的给药途径.基因转染技术为神经营养因子的临床应用提供了新的思路和途径.目的:用神经营养素3基因修饰神经干细胞,并观察在转染后的神经干细胞内的表达情况.设计:完全随机试验.单位:广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科和华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科.材料:实验选用健康SD大鼠3只,鼠龄4个月,雌雄不拘,由华中科技大学同济医学院动物房提供.用于转染神经干细胞的重组腺病毒表达载体由华中科技大学同济医学院协和医院骨科实验室构建,浓度为0.15 g/L.方法:实验于2002-12/2004-03在华中科技大学同济医学院协和医院骨科实验室和同济医院中心实验室完成.采用阳离子脂质体介入法,将含绿色荧光蛋白(GFP)基因的组组质粒pAd-神经营养素3转染原代培养的神经干细胞,转染72 h后采用荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白在神经干细胞上的表达,测定转染率.采用免疫细胞化学染色法和反转录-聚合酶链反应检测转染72 h,1,5周后神经营养素3基因在神经干细胞中的表达和转录情况.主要观察指标:神经营养素3基因在转染后的神经干细胞内的表达情况.结果:①重组质粒pAd-神经营养素3转染神经干细胞:转染72h绿色荧光蛋白在部分神经干细胞上有表达,转染率为40%.5周后仍可见绿色荧光蛋白的表达.②神经营养素3基因在神经干细胞中的转录与表达:转染72 h,1,5周后神经干细胞中均有神经营养素3 mRNA的转录,转染5周后仍有神经营养素3 mRNA的表达.结论:神经营养素3基因以阳离子脂质体为载体,通过腺病毒的介导,可有效的转染培养的神经干细胞并长期表达.
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小鼠LRP16基因打靶载体的构建和同源重组型胚胎干细胞筛选
背景:LRP16基因是一个雌激素反应基因,其表达水平与乳腺癌细胞增殖及侵袭密切相关.目的:构建针对小鼠LRP16基因的打靶载体,转染胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell)并筛选同源重组克隆.设计:通过SA-PIES-βgeo插入小鼠LRP16基因组DNA构建插入失活型打靶载体.单位:日本九州大学第三内科生物调控研究室与解放军总医院分子生物室.材料:本实验所用主要材料由日本九州大学生物调控研究室提供.实验所用鼠基因组文库(mouse genomic library in pBeloBAC11 Vector)购自invitrogen公司,TopF10感化态细菌购自北京天为时代公司,pCDNA3.1(+)由本室保存.鼠胚胎干细胞株由日本九州大学提供.方法:实验主要工作于2004-11/2005-05在日本九州大学生物调控研究室与解放军总医院分子生物室完成.PCR方法筛选129品系小鼠基因组文库中LRP16克隆,在第5外显子内插入SA-RIES-βgeo序列,构建捅入失活型打靶载体并转染胚胎干细胞,经G418筛选,挑取抗性克隆,Southern blot方法鉴定同源重组胚胎干细胞克隆.主要观察指标:具有同源重组的胚胎干细胞克隆.结果:将包含第5至11外显子的LRP16基因组片段亚克隆到pBluescript SKⅡ+载体.SA.IRES-βgeo序列的正确插入第五外显子中,打靶载体成功转染胚胎干细胞,Southern blot结果显示具有一个打靶序列同源重组型插入的胚胎干细胞克隆.结论:成功构建了第五外显子插入失活型LRP16基因打靶载体并筛选到同源重组犁胚胎干细胞.
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骨髓间充质干细胞的生物学特性及其临床治疗应用
学术背景:骨髓间充质干细胞是来源于骨髓基质的一类具有自我更新能力、可分化为中胚层细胞系的干细胞.可分化为组成组织功能细胞的内在能力,使它们成为细胞和基因治疗的潜在来源.目的:综述骨髓问充质干细胞的生物学特性和治疗应用的研究进展.检索策略:应用计算机榆索Pubmedl999-01/2006-12期间相关文章,检索词为"Bone marrow mesenchymal stem cells,gene therapy,transplant",并限定文章语占种类为English.同时机检索万方数据库1999-01/2006-12期间相关文章,检索词为"骨髓间充质干细胞,基因治疗,移植".对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文.纳入标准:文章所述内容应与骨髓间充质干细胞生物学特性、治疗中应用相关进展研究.排除标准:重复研究或Meta分析类文章.共收集到95篇相关文献,78篇文献符合纳入标准,排除的45篇为内容陈旧或重复文献.文献评价:文献的来源主要是骨髓间充质干细胞的各种生物学特性、细胞移植、基因治疗等基础和临床相关研究.选用符合纳入标准78篇文献中的33篇,4篇关于骨髓间充质干细胞分离,3篇关于骨髓间充质干细胞的表面标志,6篇关于骨髓间充质干细胞生物学特性,3篇关于骨髓间充质干细胞移植与宿主间的免疫反应,17篇关于骨髓间充质干细胞在疾病治疗中的运用.资料综合:骨髓间充质干细胞在合适条件下可分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、神经样细胞、心肌细胞、支持造血干细胞的基质细胞等多种细胞.研究表明,由于骨髓间充质干细胞具有免疫抑制性和非常低的免疫原性,骨髓间充质干细胞被用于实验和临床的治疗研究中,主要包括4个方面的应用:局部移植:系统移植;结合干细胞的基因治疗:组织工程领域中的应用.尽管目前的研究大部分在动物实验中,但部分临床运用已取得了成功,这些有效的结果尚需临床足够的随机患者的研究.结论:对骨髓间充质干细胞生物学特性已有了一定的认识,这对其运用于临床治疗提供了坚实基础,随着对其特性的不断揭示,骨髓间充质干细胞在临床治疗应用中有着理想前景.
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干细胞移植治疗脊髓损伤研究进展
学术背景:目前治疗脊髓损伤应用比较多的方法是细胞移植治疗和神经营养因子的应用.移植的细胞可在损伤部位存活、整合入宿主组织中,分化出神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,并且和宿主细胞之间可形成突触样结构,使中枢神经系统的功能得到部分恢复.目的:总结神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的研究进展.检索策略:应用计算机检索Pubmed数据库1985-01/2007-10期间的相关文献,榆索词为"Spinal Cord Inluries,Neural,Stem Cell Transplantation".并限定文章语言种类为English.吲时计算机榆索中文科技期刊数据库1989-01/2007-06期间的相关文章,检索词为"脊髓损伤,神经干细胞,神经元,干细胞移植",并限定文章语言种类为中文.对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文.纳入标准:文章所述内容应与移植干细胞后脊髓损伤后神经轴突的再生与修复等研究进展中的应用相关.排除标准:重复研究或Meta分析类文章.共收集到66篇相关文献,31篇文献符合纳入标准,排除的35篇为内容陈旧或重复文献.文献评价:符合纳入标准的31篇文献中,23篇涉及移植后损伤脊髓神经元和轴突、髓鞘的再生及功能修复的研究,8篇涉及存在的问题与展望.资料综合:①在脊柱骨折中约有16%～40%并发脊髓损伤.脊髓损伤传统治疗仅限于脊柱骨折脱位的复位固定、解除脊髓压迫、对症及康复治疗,疗效较差.②近年来随着神经病理生理及神经发育学研究的不断深人,神经组织或非神经组织移植逐渐应用于脊髓损伤并取得了肯定的成绩.③干细胞具有自我更新能力,植入受损部位后,其释放的营养因子能促进神经元的再生,且再生轴突能快速穿越移植物与宿主组织的边界,重建轴突的连续性.④关于干细胞及营养因子在损伤脊髓修复方面的研究虽已取得较大进展,但仍存在对神经再生的不利因素,如髓鞘相关抑制分子和胶质瘢痕形成,免疫排斥等.结论:干细胞移植是治疗脊髓损伤的理想方案,可恢复损伤大鼠脊髓的部分功能.
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骨髓间充质干细胞在软骨缺损修复中的应用
学术背景:骨髓间充质干细胞由于其易于获取,并可以在体外短期内大量扩增,是目前有希望应用于软骨组织工程的干细胞.目的:对骨髓问充质干细胞在软骨缺损修复中的应用状况进行综述.检索策略: 由该论文的研究人员应用计算机检索1982-10/2006-12Pubmed数据库与骨髓间充质干细胞修复软骨缺损相关文献,检索词"Marrow;Mesenchymal stem cells:cartilage defect",限定语言种类为English,同时检索1982-10/2006-12中国科技成果数据库检索词"骨髓;间充质干细胞;软骨缺损",并限定文章语言种类为中文.共检索到126篇文献,对资料进行初审,纳入标准:①综述类及实验类文章;②中文核心期刊收录文献.排除标准:重复性研究.文献评价:文献的来源主要来自Pubmed数据库及中国科技成果数据库.文献类型为综述类及实验研究.资料综合:骨髓间充质干细胞在体内具有分化产生软骨的能力已被证明,而在体外培养条件下软骨表型的分化却是一个受多种因素限制的复杂过程,目前调控机制仍不明确.动物实验表明,骨髓间充质干细胞能够修复具有临床意义的骨和软骨缺损.虽然近年来对骨髓间充质干细胞及其在软骨组织工程方面的研究已取得较大进展,但对骨髓间充质干细胞分化各阶段细胞标志物、骨髓间充质干细胞的增殖、分化的控制及基因转染技术及临床应用的评估结果都有待进一步研究.结论:动物实验表明,骨髓间充质干细胞能够修复具有临床意义的骨和软骨缺损,虽然近年来对骨髓间充质干细胞及其在软骨组织工程方面的研究已取得较大进展,但对骨髓间充质干细胞的基础和临床研究中仍存在诸多问题需要解决.
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干细胞移植在糖尿病足治疗中的应用
目的:探讨干细胞移植治疗糖尿病足过程中的相关因素.方法:对干细胞移植治疗糖尿病足移植过程中的处理方法、移植效果、辅助方法及移植的安全性进行分析.结果:①自体干细胞经过24-48 h低温净化的方法处理后,恶性干细胞明显减少.在移植过程中加入纤维蛋白基质比单纯干 细胞移植组织再生程度和新牛血管形成增多.②利用骨髓干细胞移植治疗下肢缺血性疾病的患者踝肱指数、经皮氧分压明显提高,静息痛以及间歇性跛行症状明显缓解,有新的侧枝循环形成,动脉血流明显增加.③采用益气活血中药千预干细胞移植,充分发挥了细胞崮子的生物反应调节效应:超声消融术等辅助方法结合干细胞移植治疗,使腘动脉断端下侧支循环较移植前明显增多.④自体干细胞移植短期内均未发现明显的不良反应和严重后果.结论:①自体干细胞经低温净化的方法处理后,能够有效净化骨髓十细胞移植中的恶性干细胞;在移植过程中加入纤维蛋白基质可提高移植效果.②干细胞移植治疗过程中采用适当的辅助方法可增强疗效.③干细胞移植治疗糖尿病足已取得可喜的成果,但仍存在一定问题.
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肝干细胞的分离培养和诱导分化及应用
近年来,肝干细胞的基础研究已取得重大进展,肝干细胞可分化为肝细胞和胆管细胞已经得到了共识.目前多用两步胶原酶灌流消化法、密度梯度离心法、离心淘洗技术、荧光激活细胞筛选法及免疫磁珠细胞筛选法进行肝干细胞的分离纯化.然而肝干细胞的定向分化是一个复杂的过程,是在一些细胞内外因素及肝脏微环境的作用下完成的.肝脏微环境有利于干细胞的生长、分化与功能发挥.肝细胞牛长因子能够促进肝干细胞生长增殖,并且促进其向成熟肝细胞分化,肝细胞转录因子在肝干细胞的分化调控中也起重要作用.肝癌可能是肝干细胞分化不全或分化异常所致,肝干细胞可望作为靶向基因治疗肝癌极具潜力的载体细胞.
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胚胎嗅鞘细胞移植治疗Friedreich共济失调:疗效分析及安全性评价
选择2005-08/2007-04收治的根据Geoffroy和Harding等制定的标准及DNA检测确诊的Friedreich共济失调患者6例,男1例,女5例,年龄14～28岁,病程5-14年.患者及家属对治疗知情同意,并经医院伦理委员会批准.4例于全麻下手术,选取脊髓变细处上、中下3点或2点为细胞注射部位.每例注射嗅鞘细胞2×105.2例于局麻下手术,选取双顶放射冠为注射细胞靶点,每侧注射嗅鞘2x 105.术前和术后2～4周采用世界神经病联合会国际合作共济失调量表比较其治疗结果,分数越高表示神经功能损害越严重.采用SPSS13.0统计软件进行数据处理及分析,2～4周后患者均有不同程度的神经功能改善,6例患者世界神经病联合会国际合作共济失调量表评分较术前F降(P=0.009),改善丰要表现在行走能力、步态、站立平衡方面.术后无发热、头痛、头晕、恶心及呕吐等神经系统并发症发生.对2例患者进行半年以上的远期随访,平衡及行走功能继续改善,例1共济失调量表评定总分术前38分降至35分,术后随访7个月,共济失调量表评分降至22分.
