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乙酰胆碱对人表皮细胞冷存的影响
目的：探讨乙酰胆碱（Ach）对人表皮细胞冷存活力的影响。方法：应用人表皮细胞的分离、培养技术，并进行MTT检测、病理切片以及电镜检测等手段进行观察。结果：不同浓度的Ach对冷存的表皮细胞均有一定的保存活力作用，其中以10－8～10－10mol/L的浓度为佳。结论：认为Ach对冷存中的人表皮细胞有一定的保护作用，它可提高表皮细胞的保存活力。
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人骨髓细胞长期低温保存的研究
细胞保存有重要价值,骨髓细胞保存的价值主要在于为骨髓细胞移植提供可靠保证.传统的骨髓细胞低温保存是采用二甲基亚砜为保护剂,以慢速率“二步”法降温至-80℃, 直接投入液氮.理论上讲,细胞在这种温度下,一切代谢停止,可以永远保存.本文对20例人骨髓细胞持续低温保存15年的情况进行分析.
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人胚胎干细胞的保存方法
目的:胚胎干细胞经传代长期培养后会导致核型出现异常、未分化细胞的克降数减少,因此经低温保存后复苏的胚胎干细胞必须要保持其未分化状态及生物学特性.实验拟比较程序降温法、改良慢速冻存法及传统慢速冻存法对人胚胎干细胞冷冻保存的效率,以及解冻后细胞生长与分化的状态.方法:实验于2006-07/2007-04在解放军军事医学科学院野战输血研究所完成.①材料:清洁级孕13.5 d的ICR小鼠由军事医学科学院动物中心提供,用于制备鼠成纤维细胞饲养层,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.人胚胎干细胞系PKU由北京大学第三医院生殖中心建立并提供:kryo-550.16程序降温仪为英国planner公司产品,由液氮压力泵、液氮罐、层流冷冻箱、温度传感器组成.②实验方法:将人胚胎干细胞系PKU接种在胚胎鼠成纤维细胞饲养层上,胶原酶Ⅳ消化传代,分3组冷冻保存人胚胎干细胞.程序降温法:用吸管将消化后人胚胎干细胞吹成若干团块,取65个团块移入配制的冻存液中,装入麦管进行三段式降温,即22℃～-7℃,每分钟降温2.5℃→-7℃置核后停留5min→-7℃～-30℃,每分钟降温0.3℃ 30℃～-150℃,每分钟降温10℃.降至-150℃时置液氮中保存.改良慢速冻存法:A管含人胚胎干细胞培养基和血清替代品,B管含人胚胎千细胞培养基和二甲亚砜,将60个团块置入A管,再将B管液体移入A管,混匀后-70℃过夜,第2天移入液氮中保存.传统慢速冻存法:将60个团块直接放入添加二甲亚砜的人胚胎干细胞培养基中混匀,分装入冻存管,-4℃放置1 h,-70℃过夜,第2天移入液氮长期保存.③实验评估:解冻后,将保持完整形态且细胞未散离的人胚胎干细胞团块回收,比较3组细胞复苏率、复制生长状态、克隆分化程度.鉴定程序降温组人胚胎干细胞的生物学特性.结果:①复苏率:程序降温组、改良慢速冻存组、传统慢速冻存组的细胞复苏率分别为78.5%、56.7%和23.3%,组间比较差异有显著性意义(x2=6.81～13.89,P＜0.01).②复制生长与克隆分化程度:解冻后第7天与传统慢速冻存组比较,程序降温组及改良慢速冻存组细胞克隆均明显增大(t=7.36,P＜0.05:t=6.89,P＜0.05),且解冻后克隆不易分化(x2=20.47,P＜0.01:x2=9.69,P＜0.01).③生物学特性鉴定:程序降温组解冻后第10代人胚胎干细胞染色体核型正常,人胚胎干细胞特异性表面抗原SSEA-4及TRI-1.81表达呈阳性,RT-PCR可检测到nanog基因表达,SSEA-4及OCT-4阳性表达率分别为83.44%、89.38%.结论:①程序降温法是冷冻保存人胚胎干细胞的有效方法,解冻后的干细胞在继续培养过程中仍可保持其正常核型和生物学特性.②在不具备程序降温仪的条件下,采用改良慢速冻存法保存胚胎干细胞也是可行的.
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海藻糖在哺乳动物细胞保存中的作用机制及应用现状
哺乳动物的细胞保存研究作为低温生物学领域的一个重要分支,近年来已经获得了长足的发展.
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对70%冷乙醇固定单细胞悬液保存时间的观察
在用流式细胞仪对细胞进行周期分析时,为了防止细胞的自溶和破坏,通常要对样品进行固定.而使用多也是方便的固定液便是70%冷乙醇.但人们一般认为用此固定液固定的样品保存时间不宜过长,一般为1～2周[1].我们对70%冷乙醇固定的样品进行了为期5个月的观察测定,固定5个月后和固定2 d的样品相比较,CV值及周期分布都无明显的变化,说明70%冷乙醇固定的样品至少可以保存5个月以上.
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超声波在电镜样品制样过程中的应用
骨组织尤其是密质骨 ,其矿物质(又称骨盐)干重约占骨的65%～75%.其中95%是固体钙和磷,钙磷固体以结晶的羟基磷灰石形式存在,不溶于水,它使骨质十分坚硬,采用常规电镜样品制样方法 ,超薄切片困难,因此用于电镜观察的骨组织通常都需经过脱钙处理.络合剂乙二胺四乙酸 (ethylene diamine tetraacetic acid,简称EDT A)是常用的脱钙剂.对于1×3×0.2mm3体积的骨片,在常温下EDTA常规的脱钙时间需20d左右,致使骨标本的电镜制样周期很长.实验过程中我们发现应用超声波对骨组织进行脱钙,可大大缩短骨标本的电镜制样周期.取正常SD大鼠股骨中段,剪成面积约1×3mm2的小骨片,迅速投入4%甲醛-5 %戊二醛混合固定液中(0.1mol/L磷酸缓冲液配制,pH7.4),4℃固定2h 以上,再用0.1mol/L磷酸缓冲液漂洗3次,每次15min,分成二组进行脱钙. ①超声实验组:样品投入5%脱钙液,并用21kHz超声波,水浴内对浸泡在脱钙液内的样品进行连续辐照,持续时间为20min,随后静置在室温.如此超声辐照每天一次,持续7d.每隔24h更换脱钙液一次.②对照组:依常规脱钙程序,样品投入脱钙液于室温静置,每隔24h更换脱钙液一次,持续20d.脱钙后的样品,经磷酸缓冲液漂洗,1% 四氧化锇后固定2h,梯度乙醇逐级脱水,丙酮置换,国产618环氧树脂浸透后包埋,L eica公司 Reichert Ultrcut E超薄切片机切片(切片厚度约60n m),醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色,后经JEOL公司JEM-1200EX透射电镜观察、摄片.实验结果表明,经超声脱钙7d实验组的骨组织在切片过程中未遇困难,电镜下观察,间质胶原微纤维上未见无机盐结晶,周期性横纹清晰可辨,骨陷窝内的骨细胞保存完好,未发现线粒体与内质网的形态改变.细胞核卵圆形,核膜完整,基本达到了与常规方法脱钙相同的实验效果.说明超声EDTA方法是一种简便、有效的骨组织脱钙技术.因而克服了常规骨组织电镜样品制备周期长的缺点.
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不同保存方法对“临床即用型”脂肪源性干细胞活性影响的评估
背景：脂肪源性干细胞（Adipose derived stem cells, ADSCs）因其具备来源丰富、取材容易、具有多向分化潜能特点而成为现今成体干细胞研究的热点，同时其在临床研究及应用中也拥有广阔的前景。完善的提取设施及符合临床使用规范的细胞使用及保存方法，是ADSCs能更安全有效的应用于临床的关键所在。目的：通过对现有的细胞保存介质、保存方法及保存时间进行综述，为临床即用型脂肪源性干细胞的短期运送及保存提供理论基础。方法：广泛查阅近年相关文献，对脂肪源性干细胞的研究历史、临床应用及其他成体干细胞的保存方式及临床转化应用进行综合论述。结果：4℃条件下保存细胞，对短期内细胞的活性和生物学特性影响小，相对室温条件下有明显优势；血清是细胞培养中重要的成分之一，包含各种血浆蛋白、生长因子、碳水化合物等多种物质，能提供氨基酸、维生素、无机物等细胞生长必需物质，对脂肪源性干细胞的存活力及细胞增殖亦有促进作用；富血小板血浆（Platelet-rich plasma,PRP）内含丰富的血小板，是全血中血小板数量3倍以上，能释放出多种生长因子，如血小板衍生生长因子（Platelet derived growth factor,PDGF）、表皮生长因子（Epidermal growth factor,EGF）、类胰岛素生长因子（Insulin like growth factor,IGF）等，对脂肪源性干细胞的细胞增殖及分化功能有明显的促进作用。结论：4℃条件下使用含丰富的生长因子及无毒性的血清及PRP可能是较好的保存细胞活性及能安全使用的保存介质。
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胰岛细胞与神经细胞和胶质细胞的共同培养研究
目的验证神经细胞和胶质细胞(NG)对胰岛细胞的营养和生长促进作用.方法采用SD大鼠NG与SD大鼠及新生猪胰岛样细胞团(ICCs),进行同种属和异种属细胞间的共同培养.用倒置显微镜、透射和扫描电镜观察两种细胞的生长状况, MTT法测定细胞的活力,放免法和比色法测定胰岛素和淀粉酶的含量,免疫组化鉴定共同培养的细胞. 结果共同培养能显著延长同种属及异种属胰岛细胞的生存期(＞1月),增加ICCs的活力和胰岛素的分泌(P＜0.05),减少胰淀粉酶的分泌(P＜0.05).抑制成纤维细胞的过度增生.结论共同培养能为胰岛细胞的生长提供一个优良的微环境.这为脑内胰岛移植提供了一个新依据;为胰岛细胞的体外保存提供了一个新方法.在移植前与NG共同培养以消除外分泌部细胞的影响,也是一个好策略.
