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骨组织脱钙技术应用进展
脱钙是制作骨组织切片的重要环节.骨组织含钙量多,一般不能直接制作切片.除了骨组织之外其他组织也可发生钙化,在组织中形成钙化区,所以需要经过脱钙过程.目前,主要使用单纯酸类、复合酸类、螯合剂类、离子交换树脂、电解、低温-微波等方法进行脱钙处理,特别是近年来微波技术的发展和应用,明显缩短了脱钙的时间,改善了HE、组织化学、免疫组织化学染色和原位杂交的过程.现将临床常用脱钙技术的相关内容综合阐述如下.
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三种不同脱钙液对乳腺癌骨转移标本染色效果的对比研究
目的 探讨硝酸、乙二胺四乙酸(EDTA)和RapidCal三种不同脱钙液在乳腺癌骨转移标本的免疫组织化学和HER2荧光原位杂交(FISH)检测中的表现.方法 选取28例乳腺癌骨转移标本,建立统一的前处理方案,分别用不同的脱钙液(10%硝酸、10%EDTA、RapidCal脱钙液)进行分组脱钙,观察HE染色和Ki-67、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、GATA3、核因子κB受体活化因子(RANK)、核因子κB受体活化因子配体(RANKL)、HER2等免疫组织化学检测及HER2 FISH结果,并进行比较及评估.结果 HE染色结果表明三组形态学无明显差异.RapidCal组对免疫组织化学各类定位的抗原保存均完好,具有和标准脱钙液EDTA相似的染色效果明显优于硝酸组(P<0.05).硝酸组核计数缺失严重,Ki-67几乎为0,胞质抗原(RANK、RANKL)及胞膜抗原(HER2)丢失幅度小于核抗原.RapidCal组与EDTA组FISH结果一致,且与HER2免疫组织化学结果相符合,而硝酸组HER2蛋白表达信号明显下降,第17号染色体信号缺失(P<0.05).结论 硝酸脱钙液处理后的标本染色效果较差,新型进口脱钙剂RapidCal和EDTA脱钙液处理的乳腺癌骨转移标本,在形态学、常用免疫组织化学和FISH的应用上表现出优秀的标本质量,但由于EDTA脱钙液脱钙时间过长,使用新型进口脱钙剂RapidCal将有利于质量控制及临床推广.
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改良脱钙液在骨骼组织切片中的应用
在日常病理工作中,骨骼组织做病理切片之前,要进行脱钙处理.通常用的脱钙液有硝酸、盐酸、甲酸为主配制的脱钙液,还有铬酸和螯合剂配制的脱钙液[1].现介绍一种对脱钙组织损伤较小而且配制简便的脱钙液,固定脱钙组织时不需要配制专用固定液,只用10％中性甲醛液即可,方便了脱钙组织和其他组织共同进行固定、脱水,经过这种脱钙液脱钙后的组织制作出的切片完整,染色效果好,组织形态结构清晰,是一种适合于日常骨骼组织病理制片工作的脱钙液.
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注射式脱钙骨基质修复大鼠颅骨缺损的研究
目的 通过改良脱钙方法制备注射式脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM),对其理化性质和修复骨缺损能力进行观察评估.方法 采用改良的动态脱钙和二次换酸等工艺制备DBM,通过扫描电镜对其表面形貌进行观察,连续光源原子吸收光谱仪测定钙含量,利用赋形剂将DBM颗粒制备成可注射式DBM.在大鼠颅骨缺损模型中,分别植入传统方法制备的注射式DBM 1和改良方法制备的DBM 2,并设定空白对照组.在术后4周和8周分别将大鼠颅骨取材,通过Micro-CT影像学检查以及组织病理切片来观察颅骨缺损部位骨修复情况,对新生骨进行定量比较.结果 改良脱钙的DBM 2与传统方法制备的DBM 1相比,其表面形貌无明显改变,钙含量百分比均明显低于行业要求的标准值.术后4周和8周的Micro-CT提示:DBM 2组新骨形成量为(4.6±0.8)mm3和(7.6±1.4)mm3,百分比为(30.5±5.3)%和(51.4±9.5)%;DBM 1组新骨形成体积为(3.6±0.6)mm3和(6.2±0.9)mm3,百分比为(23.8±4.0)%和(41.9±6.1)%;空白组新骨形成体积为(1.3±0.4)mm3和(2.1±0.8)mm3,百分比为(8.6±2.6)%和(14.2±5.4)%,DBM 2组明显优于DBM 1组和空白组(P<0.05).术后8周的HE染色提示:DBM 2组中新生骨的形成量明显多于DBM 1组和空白组.结论 利用动态脱钙等改良工艺制备的注射用DBM 2较传统方法制备的DBM 1,更有利于修复骨缺损,工艺耗时短,更有利于工业化生产.
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牙及牙周组织联合切片的脱钙方法探讨
目的 研究牙和牙周组织联合切片脱钙方法.方法 成年犬磨牙及牙周组织标本21块,分成7组,分别用6种甲酸及EDTA脱钙,测定脱钙液的pH值、脱钙时间、标本重量、体积和脱出的钙量及各种染色效果等指标判定.结果 脱钙液pH值低脱钙快,脱钙后标本重量减轻37.54%、体积缩小25.97%,每克湿重标本脱出的钙量为174.49 mg.EDTA脱钙染色效果佳,脱钙慢.Plank-Rycho脱钙液较迅速,切片质量和染色效果不佳.以氯化铝为保护剂的甲酸脱钙液,切片质量和染色效果优良,比EDTA脱钙迅速.结论 以氯化铝为保护剂的50%甲酸是较理想的脱钙液.
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两种组织脱钙法对免疫组织化学染色影响比较
目的:了解1%(体积分数)盐酸和10%(体积分数)硝酸脱钙液对多种抗原免疫组织化学染色效果的影响.方法:选择伴有灶状钙化的软组织标本包括甲状腺乳头状癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和淋巴结各3例,骨组织标本包括活检和尸检病例共9例,将样本分为3组,一组分别用10%(体积分数)硝酸处理24、42和48 h,另一组分别用1%(体积分数)盐酸处理1、2和3 h,还有一组不用酸处理作为对照组,同时进行多种抗原免疫组织化学染色,其中乳腺癌组织作ER、PR和Ki-67染色,甲状腺癌组织作TTF-1染色,前列腺癌作34βE12和P504s染色,结肠癌作AE1/AE3、P504s和Ki-67染色,淋巴结作CD3、CD20和Ki-67染色,骨组织作CD3、CD20、CD68、CD235a、MPO、Ki-67、AE1/AE3和TTF-1染色.结果:伴有钙化的软组织和骨组织内多种抗原免疫组织化学染色阳性程度均随酸处理时间的延长而有不同程度的下降,骨组织对酸处理的耐受力比软组织强;不同抗原对酸处理的敏感性不同,TTF-1和Ki-67为敏感,ER、CD3、和CD20耐受性较好.结论:大多数情况下,盐酸和硝酸处理都会降低组织免疫组织化学染色的敏感性,但是对不同抗原的影响程度不同.大块骨组织可以采用10%(体积分数)硝酸脱钙,软组织比例较高的骨组织和骨髓活检组织尽可能使用1%(体积分数)盐酸脱钙.
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抗原修复技术在脱钙组织冰冻切片免疫组化染色中的应用
目的探讨抗原修复技术在脱钙组织冰冻切片免疫组织化学染色中的作用,并寻找佳的抗原修复方法.方法将"低温微波-硝酸快速脱钙方法"处理的骨及其软组织冰冻切片分为4组:Ⅰ对照组(不处理)、Ⅱ组(胰蛋白酶)、Ⅲ组(微波-枸椽酸)、Ⅳ组(微波-Triton X-100).应用LSAB技术检测ANP、5-HT、S-100、NF、GFAP、Vimen-tin、CD31、CD34、FⅧ和VEGF和10种抗体在Ⅰ～Ⅳ组中的表达,图像分析各组阳性细胞的平均吸光度(A)值,结果进行统计处理.结果Ⅱ～Ⅳ组的吸光度值(分别为0.87±0.41、2.43±0.35、和2.49±0.43)明显高于Ⅰ组(0.41±0.37);Ⅲ～Ⅳ组明显高于Ⅱ组,差异有非常显著性(P＜0.01);Ⅲ、Ⅳ组间差异无显著性(P＞0.05).结论用微波-Triton X-100或微波-枸椽酸缓冲液对脱钙组织冰冻切片进行微波抗原修复是必要的,能明显提高免疫组化染色的敏感性.
关键词： 脱钙技术 冰冻超微组织切片技术 微波 抗原 免疫组织化学 -
光波-微波辐射技术在骨组织快速脱钙与免疫组化染色中的应用
目的 探讨光波-微波辐射技术在骨组织快速脱钙与免疫组化染色中的作用.方法 用8%硝酸分别在单纯微波、单纯光波、光波-微波组合Ⅰ和光波-微波组合Ⅱ的条件下脱钙,同时以室温脱钙作为对照;应用光波-微波-LSAB免疫组织化学染色技术检测不同脱钙条件下ANP、CD31、CD34、5-HT、S-100、NF、GFAP和Vimentin的表达.结果 8%硝酸室温脱钙时间长,光波-微波组合脱钙时间短;微波组、光波组、光波-微波组合Ⅰ组、Ⅱ组脱钙的免疫组化染色均明显比对照组好;光波-微波组合Ⅰ组、Ⅱ组脱钙的免疫组化染色均明显优于单纯微波、单纯光波法;光波-微波组合Ⅱ-LSAB免疫组织化学染色技术比常规免疫组织化学染色所用时间短、染色效果好.结论 光波-微波辐射脱钙及免疫组化染色所用的时间明显缩短,染色效果好.
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骨组织脱钙技术及在免疫组化染色中的应用
与一般的软组织不同,骨组织石蜡切片在脱水、透明等制片前需要使用脱钙剂除去骨组织中的钙盐才能制备成4～5μm厚的切片.为了更好地了解脱钙技术对骨组织免疫组织化学染色质量的影响,本文根据骨组织及其免疫组织化学染色的特点,结合文献对影响骨组织免疫组织化学染色质量的组织的固定、常用的脱钙方法及脱钙液、低温-微波快速脱钙技术及注意事项等方面进展进行了综合分析.
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光波-微波-硝酸快速脱钙技术对骨组织免疫组织化学染色的影响
目的:探讨光波-微波-硝酸快速脱钙技术对骨及软组织抗原活性的影响.方法:用8%硝酸分别在单纯微波、单纯光波、光波-微波组合Ⅰ和光波-微波组合Ⅱ条件下脱钙,同时以室温脱钙作为对照;应用标记的链霉菌素卵白素-生物素(LSAB)免疫组织化学(免疫组化)染色技术检测不同脱钙条件下心钠素(ANP)、5-羟色胺(5-HT)、S-100、神经微丝蛋白(NF)、神经胶质酸性蛋白(GFAP)和波形蛋白(Vimentin)的表达,并对其染色结果进行图像分析和统计学处理.结果:8%硝酸室温脱钙时间长,光波-微波组合脱钙时间短;微波组、光波组、光波-微波组合Ⅰ组、Ⅱ组的免疫组化染色均明显比对照组好(P＜0.01);光波-微波组合Ⅰ组、Ⅱ组均明显好于单纯微波组(P＜0.01)或单纯光波组(P＜0.01);光波-微波组合Ⅰ组与Ⅱ组,单纯光波组与单纯微波组之间的免疫组化染色无显著差异(P＞0.05).结论:光波-微波-硝酸脱钙所用时间比室温常规脱钙、单纯光波、微波脱钙时间明显缩短,免疫组化染色效果好.
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微波-EDTA脱钙技术在免疫组织化学染色中的应用研究
目的探讨微波(MW)-乙烯二胺四乙酸钠(EDTA)快速脱钙技术对骨及软组织抗原活性的影响.方法根据实验条件将待脱钙组织分为4组,即MW-EDTA(15℃),Jenkins脱钙-固定液(20℃),10%EDTA(20℃)和10%硝酸(20℃),其中MW-EDTA方法中EDTA的浓度分别是4%、7%、10%、13%和16%.应用免疫组织化学LSAB染色,光镜观察免疫组织化学染色结果.结果MW-EDTA脱钙的免疫组织化学染色阳性细胞显著高于Jenkins脱钙-固定液(20℃)、10%ED-TA(20℃)及10%硝酸脱钙(20℃)3种脱钙方法,其时间明显缩短.其中用10%和13%浓度的EDTA脱钙的组织,其免疫组织化学染色阳性细胞又明显多于EDTA浓度为4%、7%和16%者.结论以MW-10%EDTA技术进行组织脱钙,其脱钙时间短、免疫组织化学染色效果好.
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骨组织脱钙技术及其应用
骨组织不同于一般的软组织,是一种坚硬的结缔组织,由粘多糖和一些胶原纤维样骨胶纤维构成的骨样组织和沉着于其中的无机盐(骨盐)形成的.
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应用微波辐射脱钙技术改善骨组织免疫组化染色效果
应用微波辐射EDTA脱钙技术,革新传统的强酸脱钙法,缩短了脱钙时间,达到了完全保存骨组织形态结构及抗原物质的传统方法难以达到的目的,增强了免疫组化染色效果.
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部分去蛋白脱钙骨复合成骨细胞体内植入形成软骨或骨的可能性实验
背景:采用理化技术制备的天然生物骨衍生材料具有天然网状孔隙系统,具有良好的细胞相容性,有利于成骨细胞的附着及生长,可用于成骨细胞的支架材料.目的:观察部分去蛋白脱钙骨作为成骨细胞支架材料体内植入的成骨作用.设计:随机对照实验.单位:昆明医学院第一附属医院中心实验室.材料:部分去蛋白脱钙骨;人胎骨膜成骨细胞;4周龄BALB/c裸小鼠20只,体质量25～28 g,雌雄不限.方法:实验于2003-01/06在昆明医学院第一附属医院中心实验室完成.将部分去蛋白脱钙骨与人胎骨膜成骨细胞体外复合培养1周后植入裸鼠体内,每只裸鼠共植4块材料,脊柱左侧植入材料与细胞的复合物,作为实验侧,右侧单纯植入材料,作为空白对照侧.于术后4周及8周取出材料行碱性磷酸酶活性及常规组织学检查.主要观察指标:裸鼠植入材料取出后行一般观察、碱性磷酸酶活性及常规组织学检查.结果:20只裸鼠均进入结果分析.①裸鼠植入材料一般观察:植入材料的周围组织未见坏死、化脓、积液等迹象,材料内有软组织长入、包裹.②碱性磷酸酶活性测定结果:部分去蛋白脱钙骨复合成骨细胞体内植入8周时碱性磷酸酶活性比4周时强[(22.854±6.018),(11.286±4.268)nkat/g],并比单纯植入的材料强得多[(1.217±0.083),(2.717±0.583)nkat/g].③常规组织学检查结果:实验侧4周见有软骨形成,8周时部分软骨形成骨组织,并见有髓腔,且软骨或新骨形成增多,而对照侧未见软骨或骨形成.结论:部分去蛋白脱钙骨复合成骨细胞体内植入后能形成软骨或骨,并随植入时间的延长,软骨或新骨形成增多;部分去蛋白脱钙骨可用于成骨细胞的支架材料.
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不同胚胎起源骨质贴附骨移植后宿主骨变化的计量学分析
目的:应用荧光素双标记和不脱钙骨切片,以骨计量学指标对宿主骨变化进行组织学和动态计量分析,以进一步探明不同胚胎起源骨质贴附移植后宿主骨的变化.方法:实验于2002-07/2003-03在军事医学科学院国家二级动物实验室完成.选取新西兰兔10只,分别截取5 mm×10mm大小的颅骨(膜内成骨)和髂骨(软骨成骨)各一块,植入兔口鼻部骨膜下,于术后第33,41天分别肌注四环素50 mg/(kg·次),进行荧光素双标记,术后第45天处死动物,将移植骨与宿主骨一同取下,制成5 μm的不脱钙骨切片,保留平片,其余行Giemsa和Von Kossa染色.选用类骨质宽度、骨矿化沉积率指标,对宿主骨变化进行组织学观察和计量学分析.结果:实验纳入新西兰兔10只,全部进入结果分析.①膜状骨和软骨成骨贴附移植后组织学观察:膜状骨移植区宿主骨侧可见明显的成骨细胞排列,宿主骨内及界面类骨质沉积部位较多,可见明显的荧光双标记线及标记区,荧光双标记线距宽.而软骨成骨移植区宿主骨侧可见部分成骨细胞活动,类骨质沉积及荧光标记区少,双标计线窄,增生活跃程度明显较低.②膜状骨和软骨成骨贴附移植后宿主骨区骨计量学的比较:膜状骨移植宿主骨区的骨矿化沉积率、类骨质宽度均明显优于软骨成骨移植区宿主骨区[(3.19±0.37),(2.18±0.36);(14.35±3.48),(5.92±1.68);P均＜0.01].结论:不同胚胎起源骨质移植后的宿主骨,在骨质修复再生速度与成骨量上产生了明显不同的变化,膜内成骨优于软骨成骨,提示膜状骨在口腔颌面部应用时对宿主骨有着更为明显的诱导成骨作用.
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微波-EDTA快速脱钙技术及其在免疫组化染色中的应用
在临床病理诊断和一些动物实验研究中,常常需要对骨组织进行脱钙处理,硝酸脱钙液的pH值低,对骨组织的抗原性影响大,给免疫组织化学染色造成不良影响[1,2],乙烯二胺四乙酸(ethylene diamine tetraceticacid,EDTA)脱钙液的pH值近中性,对组织结构、抗原性等保存都较好,但因脱钙时间长[3～5],而使该技术的广泛应用受到很大限制.
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介绍一种牙齿组织的制片方法
我们采用不同方法处理60例牙体组织,总结出一种既能较顺利地制成4 μm牙齿切片,又能清晰显示牙髓微细结构而无损于细胞和组织的理想制片方法.
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微波技术在制作牙体组织切片中应用
牙体组织由牙釉质、牙本质、牙骨质3种钙化的硬组织和1种牙髓组织组成.因其十分坚硬,渗透性极差,脱钙、浸蜡时间均较长,制作完整的切片较困难.我们在制作牙体组织切片的实际工作中体会到采用微波技术处理牙体组织,制作常规石蜡切片及进行免疫组化染色过程中,注意在关键环节上的处理,可缩短制作周期,并获得令人满意的效果.
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免疫组化染色中骨组织脱钙方法
由于骨组织的特殊性,制备好的骨组织标本免疫组化并不是一件容易的事.由于骨组织中60%以上为钙盐组成的羟基磷灰石结晶,因而脱钙是制备标本的重要一环.一些强酸如盐酸,硝酸等虽能快速有效除去骨组织中钙盐,但对其中的抗原蛋白也产生了致命性破坏[1,2].本实验仿照目前国外利用EDTA低温脱钙方法[3],取得了比较满意的结果.
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Formical-4脱钙剂在骨组织脱钙中的应用
在骨组织病理制片中,脱钙是至关重要的步骤之一.目前使用的脱钙剂多为无机强酸类制剂[1],虽脱钙效果较好,但常造成组织形态,特别是细胞结构的破坏,使得病理形态观察受到影响.笔者使用一种快速脱钙剂Formical-4,不仅能够保持组织形态良好,亦能用于特殊染色和免疫组化标记,现介绍如下.
关键词： 脱钙技术 Formical-4脱钙剂 骨组织
