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免疫组织化学-激光显微切割-聚合酶链反应技术在胃癌石蜡切片中检测p53突变的应用
目的探索在石蜡切片中应用免疫组织化学-激光显微切割-聚合酶链反应(PCR)技术,检测进展期胃癌p53蛋白表达阴性或阳性的p53基因外显子5～8的突变情况.方法对41例进展期胃癌标本进行p53蛋白的免疫组织化学标记,再用激光显微切割(LMD)技术切取p53表达一致的癌组织及远离癌灶的正常胃黏膜腺体.经消化后直接进行p53基因外显子5～8的PCR扩增、单链构象多态性分析及直接测序.结果41例进展期胃癌标本均扩增出特异的目的条带.其中有11例p53蛋白表达阳性,15例p53基因检测到突变.蛋白表达阳性者中有8例突变(8/11);表达阴性者中有7例突变(7/30,23.3%).p53蛋白表达和p53基因突变具显著相关(P=0.004).结论免疫组织化学-LMD-PCR技术应用于石蜡切片可获得满意的结果,此技术可将细胞特定基因的结构状态和表达水平很好地结合起来检测分析.
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用显微切割技术定点检测诱发大鼠肺癌发生发展各阶段p53、K-ras基因突变与表达
目的探讨p53、K-ras基因突变、蛋白表达在3-甲基胆蒽(3-methylcholanthrene,MCA)和二乙基亚硝胺(diethylinitrosamine,DEN)诱发大鼠肺鳞癌发生演进中的作用,及其突变与蛋白表达的关系.方法将大鼠诱发肺癌石蜡标本连续切片,切片用于HE染色确定肺癌发生发展的病变阶段,及免疫组织化学(SP法)检测各阶段p53、K-ras蛋白表达,并用于显微切割,定点对位分别切割由正常支气管黏膜上皮细胞演变成癌细胞,癌浸润、转移各阶段病灶的主质,提取DNA,用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)检测各阶段p53、K-ras基因的突变.结果 30例正常支气管黏膜上皮未检测到p53、K-ras基因突变及其蛋白表达.在32例支气管黏膜增生和鳞状化生、21例不典型增生、12例原位癌、43例浸润癌及17例转移癌组织中,p53基因突变率分别为3.1%, 28.6%, 30.0%, 51.2%, 52.9%;p53蛋白阳性表达率分别为0, 42.9%, 50.0%, 60.5%, 64.7%;不典型增生阶段与增生、鳞状化生阶段相比,p53基因突变率及蛋白表达率增高,差异均有显著性意义(P<0.025,P<0.005),p53基因突变及蛋白阳性表达高度相关(P<0.005,Pearson′s R=0.599 6).K-ras基因突变率分别为0, 4.8%, 8.3%, 9.3%, 11.8%, 各阶段之间比较差异无显著性意义(P>0.05);K-ras蛋白阳性表达率分别为15.6%, 19.0%, 25.0%, 41.9%, 52.9%, 不典型增生阶段与正常黏膜相比及转移癌阶段与不典型增生阶段相比,差异均有显著性意义(P<0.05);K-ras基因突变与蛋白表达不相关(P>0.500).结论在MCA、DEN诱发的大鼠肺鳞癌发生发展中,p53基因的突变及K-ras基因的激活是早期事件,参与了癌的发生过程,而K-ras基因突变作用可能不大.
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改良脱钙液在骨骼组织切片中的应用
在日常病理工作中,骨骼组织做病理切片之前,要进行脱钙处理.通常用的脱钙液有硝酸、盐酸、甲酸为主配制的脱钙液,还有铬酸和螯合剂配制的脱钙液[1].现介绍一种对脱钙组织损伤较小而且配制简便的脱钙液,固定脱钙组织时不需要配制专用固定液,只用10％中性甲醛液即可,方便了脱钙组织和其他组织共同进行固定、脱水,经过这种脱钙液脱钙后的组织制作出的切片完整,染色效果好,组织形态结构清晰,是一种适合于日常骨骼组织病理制片工作的脱钙液.
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石蜡切片取材失误原因分析及对策
石蜡切片是病理诊断中重要的方法,取材是石蜡切片的第一步,取材的质量直接影响到切片的制作和病理诊断[1].从2004-2009年来,武汉市中心医院病理科和武汉市八医院病理科共取材近4万例,重新取材的81例,取材失误率约0.2％.其中20％是由于取材者责任心不强导致,30％是取材不规范导致,取材后没有及时固定及污染分别占4％和6％,多的是病例特殊,需要加取,以便全面的病理诊断,占重新取材比率的40％.
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探讨非霍奇金淋巴瘤骨髓实验诊断体系的临床应用价值
目的：探讨联合多种检测技术的骨髓实验诊断体系诊断非霍奇金淋巴瘤骨髓浸润的价值。方法以骨髓涂片检查、切片检查、流式细胞术、荧光原位杂交技术和染色体核型分析技术为基础，建立骨髓实验诊断体系。体系内容包括实验流程和诊断结果评价体系。实验流程的检验顺序为：（1）骨髓涂片、骨髓切片；（2）FCM分析和染色体培养分析；（3）FISH探针检测。诊断结果评价体系以骨髓涂片（BMA）和病理切片（BMB）作为定性诊断指标，特异性的FCM或免疫组织化学（IHC）的免疫表型和FISH探针的基因表型作为分型依据。CAA结果作为诊断及预后判断指标。各项检测技术的实验操作按常规进行。结果总例数为115例，BMA和BMB完成检查各115例，FCM完成74例，FISH 85例，CAA 23例。各单项检出阳性率分别为BMA 72.17%，BMB 89.96%，FCM 90.54%，FISH 54.12%。实验诊断体系综合分析检出率为100%。单项比较，BMB和FCM的阳性检出率明显高于BMA和FISH，差异显著。将75例淋巴结病理确诊为NHL患者的诊断结论在定性、免疫分型和病理分型3个层面上，做骨髓实验诊断结果与淋巴结病理诊断结果的对比分析，其吻合率分别为98.67%，91.94%，72.00%，说明骨髓诊断NHL在较精准的病理分型水平上还有差距。结论骨髓实验诊断的各单项技术对NHL-BMI的诊断有其临床价值，也有不足和局限。骨髓涂片和骨髓切片检查是基本方法，可以做出定性诊断。进一步做 FCM 或 IHC 可以明确免疫分型，配合FISH及CAA可以得到精细的病理分型诊断。多技术联合应用的实验诊断体系是诊断NHL的有效方法，可以提高NHL-BMI的诊断正确性和阳性率。
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MRI三维评价乳腺癌新辅助化疗后残余肿瘤范围的准确性
目的 基于三维测量技术分析MRI评价乳腺癌新辅助化疗(NAC)后残余肿瘤的准确性和临床价值.方法 选取2010年7月至2013年8月山东省肿瘤医院乳腺病中心接受6～8周期NAC的61例乳腺浸润性导管癌患者为研究对象进行前瞻性研究.患者年龄31 ～ 70岁,中位年龄49岁.NAC后行MRI检查.NAC后手术标本制作次连续病理大切片,显微镜下勾画残余肿瘤范围,Photoshop软件配准,3D-DOCTOR软件三维重建病理及MRI残余肿瘤,三维测量病理和MRI残余肿瘤的大径、大截面积和体积,分别采用Spearman秩相关检验和Bland-Altman法评价两者测量残余肿瘤范围的相关性和一致性.结果 病理和MRI对残余肿瘤的大径、大截面积和体积的测量结果呈正相关(r分别为0.942、0.941、0.903,均P=0.00),在残余肿瘤的大径、大截面积方面,病理与MRI的相关性优于超声二维测量(Z=6.48、6.18,均P=0.00).MRI对大径和大截面积的测量较病理略有低估,而对体积的测量较病理略有高估,两者一致性较好(大径平均差值0.3 cm,95％ CI:-1.43 ～1.90 cm;大截面积平均差值1.39 cm2,95％ CI:-9.55～12.34 cm2;体积平均差值-0.433 cm3,95％CI:-7.065～6.199 cm3).结论 NAC后MRI三维重建图像能准确评价残余肿瘤的立体空间范围,有助于选择NAC后降期保乳患者.
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多肿瘤组织芯片在评价肿瘤细胞增殖与凋亡状态研究中的作用
目的:研究多种常见肿瘤组织芯片在观察癌细胞增殖和凋亡中的作用.方法:在病理档案材料中选取10种常见恶性肿瘤及其癌旁或正常组织的石蜡包埋标本,HE染色切片定位穿刺部位,每一蜡块穿取直径0.6 mm大小组织柱,排布成196点列阵的芯片;用ki-67、p53、rasp21、bcl-2和bax单抗SP法进行免疫组化染色,对各切片阳性细胞进行计数观察.结果:组织芯片经染色后结构完整,在肿瘤组织中ki-67、p53和rasp21标记的阳性细胞比癌旁和正常组织明显增高;而大多数肿瘤中bcl-2和bax表达呈负相关, 即bcl-2阴性或低表达者,则bax呈不同程度阳性表达,反之则相反.结论:组织芯片技术可以同时用于评价多种不同类型肿瘤样本的增殖活性和凋亡状态,为临床预后判断提供资料.
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介绍一种提高淋巴结切片质量的方法
淋巴系统的病理诊断难度大,因此制备出优质合格的淋巴结HE切片,是保证正确诊断的先决条件.为此我们在工作实践中,对本科近5年来60例淋巴结活检的病例反复试作,总结出一种制作优质淋巴结切片的方法.介绍如下.1 材料与方法1.1 材料本院1995年1月～1999年12月60例淋巴结活检标本.
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病理三维重建研究新辅助化疗后乳腺原发肿瘤的退缩模式
目的：探索新辅助化疗后乳腺原发肿瘤的退缩模式。方法将86例ⅡA～ⅢC期乳腺浸润性导管癌患者分别行半疗程（25例）和全疗程（61例）新辅助化疗。新辅助化疗后手术标本制作次连续病理大切片，显微镜下勾画残余肿瘤范围，Photoshop软件配准，3D?Doctor软件三维重建残余肿瘤，评价新辅助化疗后原发肿瘤病理退缩模式。结合病理退缩模式，将临床?病理退缩模式分为向心性退缩（相比新辅助化疗前原发肿瘤长径，新辅助化疗后残余肿瘤长径≤2 cm且退缩比率≥50％）和非向心性退缩。结果半疗程组患者中，外科病理完全缓解（ pCR）1例，孤立状退缩1例，弥散状退缩23例；全疗程组患者中，外科pCR 18例，孤立状退缩3例，结节状退缩12例，团块伴散在状退缩21例，弥散状退缩7例，差异有统计学意义（ P＜0．001）。 Logistic多因素分析显示，新辅助化疗前原发肿瘤分期、新辅助化疗后淋巴结降期、新辅助化疗前钼靶恶性钙化灶和孕激素受体（ PR）表达为预测临床?病理退缩模式的独立影响因素（均P＜0．05）。结论病理组织学三维重建能够全面、立体、直观地展示新辅助化疗后乳腺原发肿瘤的退缩模式。全疗程新辅助化疗前原发肿瘤分期、新辅助化疗后淋巴结降期、PR表达和新辅助化疗前钼靶恶性钙化灶为新辅助化疗后乳腺原发肿瘤临床?病理退缩模式的独立影响因素。
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颞骨矢状位组织切片与CT图像对照研究
目的 制作颞骨矢状位数字化火棉胶薄层断层数据集,CT片与HE染色照片进行对照观察,为临床影像学诊断及手术入路设计提供参考.方法 用2例尸头标本进行螺旋CT扫描后制作侧颅底区标本,火棉胶包埋后,用大型轮式切片机沿矢状位切片,厚度100 μm,每切一片均采用SonyF-717数码照相机(500万像素)摄影并保存在计算机.选取代表性层面的切片进行HE染色.将断层数码照片与HE染色照片和CT片进行对照观察,对代表性层面结构特点进行描述,包括鼓窦入口层面、面神经锥曲层面、前庭窗层面、蜗窗层面、内耳道底层面.结果 获取颞骨完整矢状位数字化薄层断层数据集2套.火棉胶断层照片与CT图像有良好的对应关系,连续观察可以对结构毗邻关系深入理解.火棉胶组织学断层切片为影像学断层片结构的识别提供重要参考.矢状位可以较好显示面神经垂直段行程以及面神经锥曲段与水平半规管之间的关系,对锤砧关节、前庭导水管、颈静脉窝、颈内动脉、内耳道内神经等的显示有优势.结论 矢状位组织切片与CT对照研究有助于颞骨三维立体结构和中耳乳突手术入路的理解,HE染色照片可以帮助火棉胶断层图像结构的准确识别,二者结合可以指导CT读片,为影像诊断和手术定位提供有价值的参考.
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中耳三维有限元模型的建立与中耳实体模型质量属性分析
目的 根据中国健康人体颞骨组织切片数据建立中耳三维有限元模型,分析中耳腔鼓室各组件的几何尺寸,并通过附带软件计算出各听骨的质量属性.方法 根据解放军总医院耳鼻咽喉研究所提供的中国正常人颞骨组织切片数据,采用AutoCAD2005、UG软件建立了中耳三维实体模型,在ADINA有限元软件中使用手动和自动法对中耳三维实体模型进行网格划分.依据中耳解剖学、声学及生物力学等研究的文献数据对模型进行生理加载和边界约束,建立了包含鼓膜、听骨、韧带、肌肉的中耳三维有限元模型.后,利用软件附带功能测量出中耳实体模型大小以及质量属性两方面内容,并与已发表的正常中国人中耳解剖结构的测量数据比较验证其结果的几何相似性和可靠性.结果 重建了包含鼓膜、听骨、韧带、肌肉的中耳三维有限元模型.从测量中耳实体模型大小以及质量属性两方面的数据证实了此中耳三维有限元模型能良好的模拟正常人体中耳鼓室形态结构,具有良好的几何相似性.结论 应用本方法建立的正常人中耳腔三维有限元模型形态逼真,几何相似性好,为进一步的从声学、生物动力学方面测试此模型在不同频率特定声压作用下鼓膜及镫骨的振动反应、中耳传音结构的几何形态及负荷改变奠定了形态学基础.
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大鼠耳蜗切片螺旋神经元的红外可视膜片钳技术
目的 建立大鼠离体耳蜗切片技术,结合红外可视膜片钳技术探讨耳蜗螺旋神经元(spiral ganglion neuron,SGN)的电生理特性.方法 0～2日龄、3～6日龄及7～14日龄的健康SD大鼠各10只,快速制作耳蜗切片,应用红外微分干涉相差技术,结合膜片钳记录,观察SGN的基本电生理特性,并分析影响耳蜗切片制作质量及膜片钳记录成功的因素.结果 3～6日龄大鼠耳蜗切片的成功率高,每只耳蜗可制备2～4张切片;保持部分颅骨与耳蜗的连接及耳蜗骨壳的完整是影响切片成功的关键,切片时蜗轴与刀片的位置及切片取材的时间也是影响切片质量和细胞活性的重要因素.红外可视膜片钳技术可准确找到状态良好的SGN,有助于对封接过程的判断.全细胞记录SGN静息膜电位平均为(-45.6±5.3)mV(-x±s,n=52),可记录到Na+和K+电流.结论 耳蜗切片技术能够较完整地保持耳蜗结构以及各种构成细胞的活性及其相互之间的联系,红外可视膜片钳技术具有实时、直视的特点,可操作性强,二者结合能为深入研究SGN的电生理特性及听觉传导机制提供良好的手段和平台.
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牙及牙周组织联合切片的脱钙方法探讨
目的 研究牙和牙周组织联合切片脱钙方法.方法 成年犬磨牙及牙周组织标本21块,分成7组,分别用6种甲酸及EDTA脱钙,测定脱钙液的pH值、脱钙时间、标本重量、体积和脱出的钙量及各种染色效果等指标判定.结果 脱钙液pH值低脱钙快,脱钙后标本重量减轻37.54%、体积缩小25.97%,每克湿重标本脱出的钙量为174.49 mg.EDTA脱钙染色效果佳,脱钙慢.Plank-Rycho脱钙液较迅速,切片质量和染色效果不佳.以氯化铝为保护剂的甲酸脱钙液,切片质量和染色效果优良,比EDTA脱钙迅速.结论 以氯化铝为保护剂的50%甲酸是较理想的脱钙液.
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抗原修复在陈旧石蜡切片乳腺珠蛋白免疫组化检测中的应用
目的：探索一种简便有效的抗原修复方法，用于陈旧切片的人乳腺珠蛋白（human mammaglobin，hMAM）免疫组化检测。方法将乳腺癌患者陈旧乳腺组织石蜡切片脱蜡至水，按常规免疫组化步骤进行检测。其中，实验组直接将切片浸入pH 3．5的柠檬酸盐缓冲液中室温修复10～15 min；同时以微波和高压加热修复法处理相应患者石蜡切片作为对照，后以SP检测系统检测抗原修复及与抗体反应的效果。结果实验组与高压组和微波组比较，修复效果较好，且无组织脱片与折损现象。结论建立了一种利用陈旧组织切片检测乳腺珠蛋白的简便、有效的抗原修复方法，并能很好地防止脱片现象发生。
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重复+Gz暴露后大鼠心室肌的形态学改变
目的 探讨不同水平的持续1周的+Gz重复暴露后大鼠心室肌形态学的改变.方法 24只雄性SD大鼠随机分为对照组、+6 Gz组和+10 Gz组,每组8只.+6 Gz组和+10 Gz组大鼠分别暴露于+6 Gz/3 min和+10 Gz/3 min,1次/d,共1周;分别于末次暴露后即刻、1 d取心室肌做苏木精-伊红(HE)染色和透射电镜观察.结果 HE染色心室肌无明显变化.电镜下可见,+6 Gz重复暴露后心室肌肌丝排列基本整齐,肌浆网轻度扩张,细胞连接扩大,间质水肿,微血管扩张;+10 Gz重复暴露后心室肌细胞水肿,核内异染色质边集,肌浆网明显扩张,线粒体反应性增生,空泡化,闰盘连接完全破坏.重复暴露后1 d较即刻心室肌超微结构变化更明显.结论 +6 Gz/3 min重复暴露1周可引起大鼠心室肌超微结构轻微改变,而+10 Gz/3 min重复暴露1周可造成大鼠心室肌超微结构的明显改变.
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软硬组织切磨技术在口腔医学研究中的应用
软硬组织切磨技术是将不能用常规方法制备成组织切片的口腔特有的软硬组织标本制成组织切片,并保持软硬组织、组织与植入物之间的原有组织结构形态,如牙-骨-软组织、骨-种植体-软组织等.切磨技术与常规方法不同,组织标本经过固定及脱水处理后,用光固化树脂浸透、包埋,再行锯片、磨片、染色等步骤制成厚约10 μm的组织切片.软硬组织切磨技术能为口腔硬组织疾病的研究、口腔新材料的生物相容性研究和种植体研究等提供可靠的组织学评价依据.
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钌红染色对大鼠特发性肺间质纤维化的超微结构分析
目的:观察钌红染色方法标记大鼠特发性肺间质纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)的超微结构的特点.方法:180只SD大鼠随机分为6组,盐酸博莱霉素气管内注射造模,复方鳖甲片高、中、低剂量治疗.分别于7d、14d、28d取材,钌红染色电镜观察.结果:钌红明显标记基底膜和表浅层细胞周围的胶原纤维.使细胞轮廓和内部结构更清晰.7d纵断面既可显示成束的胶原纤维,特别是基膜和细胞之间有成束的胶原纤维堆积.14d上皮细胞外基膜区域性折叠、扭曲或缺损.基板处钌红沉积,呼吸膜增厚.28d基膜厚薄不均匀,完整性破坏.Ⅱ型细胞在三阶段不同病理时期有不同改变.细胞内前胶原增多,粗面内质网扩张,胶原纤维在间质大量堆积,排列纵横交错.结论:钌红染色更清晰显示基底膜和表浅层细胞周围的胶原纤维,更利于观察IPF的纤维分布和厚度.
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地高辛标记原位杂交在肾脏石蜡切片与冰冻切片中的应用
1 材料和方法1.1 标记探针的制备含血管紧张素Ⅱ受体1亚型A(AngiotensinⅡtype 1 receptor Subtype A,AT1A)基因的235-bp重组cDNA质粒由美国Vanderbillt大学郭登斌博士馈赠.由该质粒转录产生的cRNA探针能够与一种专一表达于肾脏组织中的mRNA互补结合.1.2 标本的制备 6～8周龄SD大鼠8只,拉颈处死后,分为两组,每组4只.第1组取出肾脏立即以O、C、T包埋剂包埋,液氮冷冻,冰冻切片机上切取6 μm厚的切片.第2组取出肾脏立即投入4%多聚甲醛(PFA)固定液中,4℃固定4 h后,进行脱水、浸蜡、包埋,制成4 μm厚的切片.
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舌鳞癌切片的原子力显微镜纳米操纵研究
目的利用原子力显微镜(AFM)进行人舌鳞癌组织和细胞切片原位纳米尺度的操纵,并发展样品制备及处理的方法,提高舌鳞癌切片AFM图像的反差和分辨率,以满足纳米定位、切割、分离和拾取等一系列操纵的需求.方法人舌鳞癌组织和培养细胞按常规的电镜超薄切片法和石蜡切片法制样后,将切片分别转移至云母表面或载玻片表面,在空气中以接触模式AFM观察.选择合适的针尖并控制力的大小和扫描范围,进行纳米级成像、定位、分离和拾取等操纵.结果选择合适厚度的超薄切片,AFM观察显示,细胞轮廓清晰,细胞膜、核膜等结构明显,核内可见核仁,围绕核膜有颗粒状的细胞器.双氧水和二甲苯处理切片提高反差及AFM成像质量.对石蜡切片能分辨细胞轮廓、核内结构以及细胞间的结构.经上述处理的舌癌切片,通过控制扫描方向和针尖力的大小,实现了范围在20 nm～1 μm之间的操纵,并利用针尖获取核内遗传物质.结论以人舌鳞癌组织和细胞切片AFM高分辨率成像和结构分辨为基础,实现了AFM原位纳米尺度的操纵,获得特定细胞核内部的遗传物质,进一步开展生化分析,用于肿瘤早期诊断.
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淋巴结切片的制作研究
目的 探讨制作淋巴结切片的方法.方法 将杭州市余杭区第一人民医院2009年1月-2010年1月门诊和临床送检的139例人体不同部位的淋巴结按照笔者所述之方法进行切片制作.结果 139例淋巴结切片其组织细胞分辨清楚,细胞核、浆对比清晰,红蓝分明,切片平整、无裂痕等现象.结论 高质量的淋巴结切片能够提高病理医生对淋巴结疾病诊断的正确率.
