中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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自体骨移植修补颅骨缺损的材料与方法
目的:探讨自体游离骨及组织工程技术在颅骨缺损修补中的应用.资料来源:应用计算机检索Pubmed 1985-01/2006-02和ProQuest1995-01/2006-02期间的相关文章,检索词"cranial bone graft,autologous bone flap,calvarial bone graft,autogenous bone graft,autograft,autotransplant,bone autograft,tissue-engineered bone repair,autologous bone,craniotomy defect repair,cranioplasty."限定语言种类为English.资料选择:筛除以上资料中非颅骨缺损的、非自体骨移植的、非自体骨组织修复的研究,剩余结果通过手工及光盘检索全文.资料提炼:共检索到88篇文献,内容涉及颅骨成型术、颅骨缺损、自体游离骨瓣、颅骨重建、颅骨修补、骨移植材料、组织工程等.删除重复文献55篇,纳入33篇.资料综合:修补材料与方法的选择是颅骨缺损修补手术成败的关键.自体骨移植材料修补颅骨缺损已在临床广泛应用,并随着组织工程技术与基因工程技术的发展,使颅骨骨移植向一体化骨整复方向发展.自体骨移植材料的应用进展:①常用自体游离骨瓣:包括胫骨、颅盖骨、肋软骨和肋骨、肩胛骨和胸骨和髂骨.②自体骨移植材料的选择:自体颅骨瓣为首选的修补材料,必要时可联合应用肋骨、髂骨修补缺损.③组织工程技术在颅骨修补术中的应用:大体可分为3个步骤:采集供体组织和分离成骨细胞;利用CT扫描资料构建基于图像分析设计组织工程支架;在预制的聚合体支架上种植细胞并移植于缺损区.结论:自体骨移植因无免疫反应,易于与受区骨整合,是颅骨重建的优先选择材料之一.组织工程技术在颅骨修补中的应用,有待于进一步深入研究.
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肌电测量技术的应用
目的:近些年来,肌电测量技术的发展非常迅速,带来了肌电研究的不断深入和肌电应用领域的不断扩大.对肌电测量技术的发展及应用现状进行分析,有利于明确肌电测量技术进一步的发展方向.资料来源:利用计算机检索中国期刊全文数据库(CNKI)2000-01/2006-03的相关文章,检索词"肌电",限定文章语言种类为中文;同时,手工查阅相关的专著书籍.资料选择:对资料进行初审,选取符合研究要求的有关文章找全文.纳入标准:①肌电信号的处理技术与方法.②肌电测量技术在各个领域中的应用.排除标准:重复研究.资料提炼:共收集到1 331篇有关肌电、心电等方面的文章,其中期刊全文1 261篇,学位论文69篇,会议论文1篇,选择具有代表性的12篇进行归纳.资料综合:①肌电测量的应用:肌电的电极分为针电极和表面电极,肌电测量分为在线测量和遥测,适合于不同的测试对象和条件.肌电指标分为时域指标和频域指标,可以帮助判定肌肉所处的不同状态、肌肉之间的协调程度、肌肉的收缩类型及强度、肌肉的疲劳程度及损伤、肌肉的素质等.②展望:目前,分形理论、小波分析、人工神经网络等现代数学方法均已被引入肌电信号的分析研究中,以寻找更为有效的指标来反映肌肉的生物力学特性.结论:肌电测量精度的提高、新肌电分析方法的开发、肌电应用领域的拓宽等仍然是肌电研究领域具吸引力和极富挑战性的研究课题.
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皮肤干细胞的生物性状及其临床应用
目的:干细胞特有的生物学特性开辟了临床多种疾病治疗的新思路,许多学者和临床工作者对皮肤干细胞的研究应用已经取得了初步进展,但是对其生物特性和临床应用还须进一步深入完善,因此有必要对近期国内外有关皮肤干细胞的研究做一较全面的综述.资料来源:应用计算机检索Medline数据库1990-01/2005-04有关皮肤干细胞的生物性状和临床应用的文章,检索词"epidermal stem cell,keratinocyte stem cell,biological character,clinical use",限定文章语言种类为English.同时计算机检索中国期刊全文数据库、万方数据库1994-01/2006-03期间的相关文章,检索词"皮肤干细胞、表皮干细胞,生物性状,应用",限定文章语言种类为中文.资料选择:对资料进行初审,选取符合研究要求的有关文章找全文.纳入标准:①有关皮肤干细胞的生物性状的研究.②有关皮肤干细胞的临床应用的研究.排除标准:重复研究.资料提炼:共收集到82篇有关皮肤干细胞的生物性状及临床应用的文章,排除重复或类似的同一研究,17篇符合研究要求.资料综合:①国内皮肤干细胞生物性状与临床应用研究:有研究利用干细胞的特性创建了原位干细胞培植技术(也称烧伤湿润暴露疗法),取得良好效果.②国外皮肤干细胞生物性状与临床应用研究:迄今,研究发现皮肤中有3种干细胞,在体外通过几种方法可以培养增殖;虽未发现特异性标记物,但还是可通过几种细胞表面标记物确定.③皮肤干细胞研究及应用展望:利用干细胞的生物性状及基因治疗、细胞治疗及皮肤组织工程技术等方法来开辟临床多种疾病治疗的新策略.结论:利用培养技术及多种细胞表面标记物,已能体外培养出皮肤干细胞,利用它强大的自我更新、自我增殖能力以及多种生物技术的飞速进步,将开辟多种临床疾病治疗的新策略.
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未成熟鼠缺氧心肌模型的建立
目的:建立一种简便易行、稳定有效、易于重复的心肌缺氧模型.方法:实验于2000-01/03在中国医科大学药理教研室完成.选用出生5～7 d,清洁级健康雄性Wistar大鼠10只,随机数字表法分为2组,即缺氧组和对照组,每组5只.将缺氧组大鼠5只喂养于含低浓度氧气的混合气体(气体成分:体积分数为0.07 O2,体积分数为0.05 CO2,体积分数为0.88 N2)中5 h,对照组不予处理.观察缺氧前后呼吸频率、活动状态、心肌颜色、心率、心律等的变化,分别测血气、心肌组织ATP酶、心肌含水量,观察心肌细胞线粒体等心肌超微结构的改变.结果:实验大鼠10只全部进入结果分析.①两组大鼠缺氧前后呼吸频率、活动状态、心肌颜色、心率、心律变化:实验前呼吸平均112次/min.缺氧组置于缺氧环境1 min后呼吸频率明显增快;3 min后呼吸急促;缺氧30 min后呼吸平均178次/min;120 min后呼吸次数无明显增加(150～220次/min);缺氧5 h后开胸见心率快而不易数清,心肌收缩无力,节律不十分规则,偶有二联律出现,心肌及血液颜色呈暗红色,血液类似静脉血.对照组大鼠直接开胸取血时可见窦性心律250次/min,心搏有力,血液颜色鲜红.②两组大鼠血气分析和电解质测定结果:缺氧组pH,PaO2,PaCO2,SaO2,HCO3-低于对照组,缺氧组K+高于对照组(pH为7.27和7.37,PaO2为3.95和13.56 kPa,PaCO2为3.20和5.00 kPa,SaO2为65%和99%,HCO3-为19.6和21.9 mmol/L,K+为5.3和4.5 mmol/L,P＜0.05).③两组大鼠心肌组织ATP酶活性:对照组高于缺氧组(0.57,0.42 μkat/g,P＜0.05).④两组大鼠心肌组织CK-MB含量:对照组与缺氧组间没有统计学差异(P＞0.05).⑤两组大鼠心肌组织超微结构改变:对照组可见线粒体分布均匀整齐,排列紧密,双层膜结构清晰,无明显肿胀;缺氧组可见线粒体轻度肿胀,密度降低,核膜清晰,核仁明显,染色质有边集.结论:单纯缺氧并不能导致心肌细胞的损伤.建立的模型技术操作容易,设备要求简单,各项指标易于控制,效果比较稳定、可靠,具有很好的可重复性,在一定程度上能够模拟临床缺氧患者的心肌损伤状况而以作为未成熟紫绀型先天性心脏病的实验基础.
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脱细胞猪主动脉基质重建犬颈段食管的实验
目的:探索用脱细胞猪主动脉基质重建食管缺损的可行性.方法:实验于2005-02/2006-02在解放军第二军医大学长海医院胸心外科研究所完成.选用健康杂种犬7只,清洁级,雌雄不拘,体质量16.5～19.4kg,采用酶消化法制备脱细胞猪主动脉基质,以脱细胞猪主动脉基质置换7只犬颈段2 cm的食管缺损.分别于术后1,2,3个月各处死实验犬1只,取出新生食管.大体观察新生食管愈合、肉芽生长及黏膜爬行再生情况,常规法行光镜检查和扫描电镜检查,观察食管再生和改建情况.结果:7只实验犬除实验犬1因化脓性腹膜炎术后3 d死亡外,其余6只均存活.①大体观察结果:所有实验犬术后未出现吻合口瘘,存活犬术后45～60 d出现不同程度的狭窄症状,3只术后狭窄经扩张治疗后进食改善,体质量恢复到术前水平,1只在行狭窄扩张治疗时新生食管撕裂死亡.②食管再生和改建情况:脱细胞猪主动脉基质能诱导新生血管的形成,达到生物学固定;实验犬术后1个月新生食管完全上皮化,并可见血管平滑肌再生;术后2个月时黏膜上皮分化为8～10层,上皮下可见有序排列的胶原纤维;术后3个月时上皮进一步分化为8～12层,上皮下有序排列的胶原纤维较前增厚,并可见横纹肌岛状再生.脱细胞猪主动脉基质逐步降解吸收.结论:①脱细胞猪主动脉基质原位替代食管后未因排异反应和假体感染而脱落.②诱导了宿主食管组织上皮细胞、平滑肌和横纹肌细胞的再生,有望成为人工食管的理想替代材料.
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第一磨牙处横向牵张成骨对上颌骨复合体应力分布和位移的影响
目的:为了解决临床上颌宽度不足问题,在上颌骨复合体三维有限元模型上模拟横向牵张成骨术,分析上颌骨应力分布与位移趋势.方法:实验于2005-01/03在西安交通大学机械学院实验室完成,在已建立的上颌骨复合体三维有限元模型上模拟相当与第一磨牙处行横向牵张成骨术.①在腭中缝相当于第一磨牙部位放置牙支持式牵张器,以第一磨牙根部腭侧为加力点,平行于腭穹隆进行单侧0.5 mm位移加载.②计算加载条件下各点的应力,应力＞0时,为张应力,表明此处受牵拉,应力＜0时,为压应力,表明此处受压缩;计算加载条件下各点X,Y,Z轴位移.结果:①第一磨牙处加载时:第一前磨牙点、尖牙点、上齿槽座点处产生较大张应力,分别为1 672.00,551.850,387.540 MPa.②X轴方向的位移:横向大位移在第一磨牙基骨,为-20.783μm;从冠状面观察:上颌骨从中线向两侧呈楔形扩张,楔形底朝向口腔,顶朝向鼻腔.③Y轴方向的位移:鼻腔整体轻微后移;颧骨整体前移.④Z轴方向的位移:腭平面在下降的同时伴前上旋转趋势;鼻腔整体向下移动;整个颧骨向上移动.结论:第一磨牙处加载时,在牙弓前段产生明显的骨牵张作用.牙弓后部增宽明显.鼻腔宽度增加.腭平面在下降的同时伴前上旋转趋势,容易引起开牙合.
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血小板衍生生长因子促进鼠骨早期修复中增殖细胞核抗原与c-Jun蛋白的表达
目的:将重组人血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor AB,PDGF-AB)注入大鼠桡骨骨缺损模型,同体双侧对照,运用免疫组织化学染色方法,从细胞分子水平观察和分析血小板衍生生长因子对骨折愈合期间软骨骨痂发生、生长的刺激作用及其刺激信号的传导机制.方法:实验于2004-12/2005-08在解放军总医院三○四临床部烧伤研究所完成.①SD大鼠30只,造成双侧上肢平均约3 mm的桡骨骨缺损模型.将重组因子PDGF-AB分别于术后第1,3,5,7天分4次注入大鼠右侧桡骨骨缺损区内(血小板衍生生长因子组),左侧骨缺损区内注入生理盐水作为对照组.②两组分别于术后第1,2,4周各取10只大鼠骨痂组织做成切片,分别进行增殖细胞核抗原与c-Jun免疫组织化学观察并对阳性结果作定量分析.结果:30只大鼠全部进入结果分析.①增殖细胞核抗原蛋白与c-Jun蛋白在软骨骨痂形成与转归中的表达规律有比较一致的相似性,且增殖细胞核抗原能刺激间充质细胞、软骨细胞合成这两种蛋白.②术后1周,血小板衍生生长因子组间充质细胞内增殖细胞核抗原蛋白与c-Jun蛋白表达均高于生理盐水组[(6.07±2.09)×10-3比(3.78±1.84)×10-3,(8.62±2.10)×10-3比(4.89±1.74)×10-3,P值均小于0.01].③术后2周,血小板衍生生长因子组非肥大软骨细胞内增殖细胞核抗原蛋白与c-Jun蛋白表达均高于生理盐水组(4.33±1.26)×10-3比(3.05±1.14)×10-3,P＜0.05;(6.84±1.45)×10-3比(5.00±1.18)×10-3,P＜0.01).结论:血小板衍生生长因子能刺激动物体内间充质细胞和软骨细胞的增殖,加速软骨骨痂的形成,促进骨愈合.血小板衍生生长因子能诱导这两种细胞表达c-Jun,它或许能通过C-FOS/JUN蛋白来传递其生长作用信号,从而实现其刺激间充质细胞和软骨细胞增殖的目的.
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胶原性眼内接触镜眼内植入后的生物相容性评价
背景:有晶体眼后房型人工晶体(又称眼内接触镜)植入术是近年来兴起的一种矫治高度近视的晶体屈光性手术.Starr公司将Ⅳ型胶原与水凝胶聚合而成的新型材料Collamer,是研制眼内接触镜的理想材料,但国外产品价格昂贵,一定程度上限制了该手术的开展.目的:通过兔眼动物实验摸索理想的胶原性眼内接触镜植入方法,观察眼内接触镜植入术后炎症反应和炎症递质的变化,并对其植入眼内的生物相容性进行评价.设计:单一样本,开放性实验.单位:上海交通大学医学院附属新华医院眼科.材料:实验于1999-08/2000-03在上海交通大学医学院附属新华医院和上海南洋放射免疫测试中心完成.选取成年新西兰纯种白兔20只,随机数字表法分为3组:眼内接触镜植入组8只、手术对照组6只、空白对照组6只.方法:①眼内接触镜植入组右眼行眼内接触镜植入+虹膜周切术,手术对照组右眼单纯行虹膜周切术,手术由专人按同一方式施行.术后两组术眼滴用激素抗菌素眼药水,4次/d,共10 d.均于术后1,4,7 d结膜下注射地塞米松2.5 mg+庆大霉素4万U.空白对照组不进行手术.②分别于术后1,4,7,14 d和1个月对眼内接触镜植入组、手术对照组的术眼进行眼压波动、角膜损伤、前房蛋白细胞渗出、前房深度、前房出血、虹膜后粘连、眼内接触镜偏位以及晶体混浊等监测.③分别于术后1,4,7,14 d和1个月对眼内接触镜植入组、手术对照组的术跟进行房水取样,空白对照组也在相应时间取样,采用放射免疫分析法测定前列腺素E2浓度.主要观察指标:①术前及术后各时间点前房反应检测结果.②术后各组房水中炎症递质前列腺素E2浓度检测结果.结果:实验选取新西兰纯种白兔20只,全部进入结果分析.①术前及术后各时间点眼压的变化:与术前比较,眼内接触镜植入组、手术对照组术后各时间点眼压均无明显变化(P＞0.05).②术后角膜损伤和前房渗出情况:眼内接触镜植入组:5只兔眼术后第1天出现不同程度的前房变浅,1周内均恢复正常;2只兔眼出现少量前房出血,2周后吸收;2只兔眼分别出现虹膜前粘连和后粘连,瞳孔轻度变形;2只兔眼出现不同程度眼内接触镜偏位;1只兔眼术后1个月出现晶体前囊膜下点状混浊.手术对照组:6只兔眼术后第1天前房出现1～2级渗出,1周后均吸收;各兔眼角膜透明,无前房出血、前房变浅、虹膜后粘、晶体混浊等变化.③术后各组房水中炎症递质前列腺素E2浓度检测结果:眼内接触镜植入组术后1～4 d房水中前列腺素E2含量高,以后含量逐步递减.术后14 d和1个月,各组均基本相似(P＞0.05).结论:眼内接触镜植入术后前房无明显慢性葡萄膜炎发生.房水中前列腺素E2浓度逐步降低,表现了眼内接触镜植入后典型的异物肉芽肿炎症过程,反映其良好的眼内耐受性.
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羟基磷灰石/胶原/聚乳酸三维多孔储存式药物控释载体的制备及其表征
背景:在骨科病的临床治疗中传统的给药方式容易引起血药浓度的较大波动和副作用,而植入式药物载体材料羟基磷灰石的机械性能较差使之难以应用于人体的承重部位,聚乳酸又易降解成酸性产物.研究制备羟基磷灰石/聚乳酸药物载体能仅对病患部位直接持续释放药物同时减少对其他部位的副作用,另外可获得羟基磷灰石和聚乳酸相互补强的功能,并消除组织炎症反应,促进骨组织再生.目的:观察可吸收靶向式药物控释载体的制备及模拟药物的应用情况.设计:观察试验.单位:重庆工学院与武汉理工大学.材料:大白鼠鼠尾及聚乳酸(武汉理工大学生物中心提供),胃蛋白酶(1:10 000,Sigma公司),Ca(OH)2、浓磷酸、NaOH、冰醋酸、磷酸盐缓冲液(pH=7.4配制)、1,4-二氧六环、无水乙醇等均为市购分析纯.方法:实验于2004-05/2006-03在重庆工学院及武汉理工大学完成.①采取酸溶法和碱提纯法制备鼠尾Ⅰ型胶原蛋白,在体外模拟天然骨的生物矿化过程,利用材料的自组装机制合成纳米羟基磷灰石/胶原类骨仿生复合材料,并采用X射线衍射分析和透射电镜观察对材料进行了结构、形貌的表征.②采用热致分相技术将制得的羟基磷灰石/胶原复合材料进一步与聚乳酸复合制备了具备特殊几何形状的三维多孔生物可吸收储存式药物控释载体,同时采用扫描电镜、材料试验机和比重测试法对比下观察孔结构形貌及其力学性能等.③将制得的羟基磷灰石/胶原/聚乳酸药物载体装填模型化合物溴百里酚蓝,在模拟体液中进行体外释放实验研究了其控释特性.主要观察指标:①羟基磷灰石/胶原类骨仿生复合材料制备后结构、形貌的表征.②羟基磷灰石/胶原/聚乳酸药物载体制备后的性能及制备工艺评估.③模型化合物体外控释试验结果评估.结果:①薄针片状纳米羟基磷灰石在胶原基质上生成并以其晶格c轴择优取向排列.②羟基磷灰石/胶原/聚乳酸药物载体具有适合药物控释的孔结构和和物理性能.③模型药物的体外释放试验表明药物在达到85%释放率之前近似为零级缓慢释放.结论:羟基磷灰石/胶原复合材料与天然骨类似,羟基磷灰石/胶原/聚乳酸储存式载体能达到控制释放的目的.
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内皮抑制素相互作用蛋白HT036基因的全长克隆及其促血管上皮细胞凋亡的分子机制
目的:克隆与内皮抑制素(endostatin)相互作用蛋白HT036基因的全长,进一步验证其与内皮抑制素的相互作用,初步阐明其促血管上皮细胞凋亡的分子机制.方法:实验于2004-10/2006-03在解放军总医院呼吸科实验室、军事医学科学院放射医学和生物工程研究所实验室完成.①根据已知HT036的EST序列设计引物,应用RACE技术,从人胎肝cDNA文库获取该基因全长.②采用免疫共沉淀和Western Blot验证HT036蛋白与内皮抑制素在真核细胞内存在相互作用.③利用真核瞬时表达载体pCDNA3.1(+)在EVC304细胞中瞬时表达HT036蛋白,转染了HT036基因的EVC304细胞为试验组(重复两次);没有转染HT036基因的细胞为对照组,用流式细胞仪检测HT036基因对细胞凋亡和细胞周期的影响.结果:①HT036基因全长克隆及生物信息学分析结果:利用RACE技术成功获得HT036基因的全长,并在GENEBANK进行了注册,注册号AY775560.②免疫共沉淀和Western-blot的验证结果:证实HT036蛋白能与内皮抑制素在真核细胞中相互作用.③HT036基因对细胞凋亡和细胞周期的影响:成功构建了表达HT036基因的真恢表达载体,两次试验转染ECV304细胞后24 h的凋亡率平均为23.63%,而对照组仅为0.10%.结论:获得了一与内皮抑制素相互作用的新的蛋白HT036基因的全长,初步表明HT036参与了内皮抑制素调节的血管生成过程,并对血管上皮细胞具有促进凋亡的作用.
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低强度激光血管照射对模拟失重兔显微红细胞聚集性的影响
目的:观察低强度激光血管照射对模拟失重兔显微红细胞聚集性的影响.方法:实验于2006-04/05在航天医学工程研究所生理学实验室完成.取32只健康雄性大耳白兔,数字表法将其随机分为激光照射组和对照组各16只.2组均以头低位倾斜20°悬吊法模拟失重,连续4 d.激光照射组应用GX-2000A型铝镓铟磷半导体激光治疗仪(桂林康兴医疗器械公司),在悬吊同时给予功率5 mW(波长650nm)激光耳腔照射,30 min/次,1次/d,连续4 d;对照组不给激光照射.悬吊前和悬吊第4天观察显微镜下两组兔红细胞聚集情况,按照红细胞聚集数目进行评分,聚集数越多,分值越高,红细胞黏度越高.结果:30只兔进入结果分析.悬吊前激光照射组显微红细胞黏度评分与对照组比较差异无显著性意义(1.375 0±0.842 7,1.145 8±0.198 2,P＞0.05);悬吊4 d后激光照射组显微红细胞黏度评分显著低于对照组(1.520 8±0.815 0,4.020 8±0.991 2,P＜0.01).结论:低强度激光血管照射可以显著改善模拟失重兔显微红细胞聚集性,提示低强度激光血管照射可用于改善航天失重状态下的"血瘀症".
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流体剪切应力对骨肉瘤成骨样细胞核结合因子α1基因的表达作用
背景:机械应力在成骨细胞功能调控中的作用是近年骨组织生物力学研究的一个重点.流体剪切应力是否可以诱导成骨细胞内核结合因子α1的表达,其规律如何?目前少见报道.目的:观察流体剪切应力对骨肉瘤成骨样细胞(MG-63)核结合因子α1基因表达的作用.设计:对比观察实验.单位:解放军第四军医大学航空航天医学系航空航天生物动力学教研室完成.材料:MG-63人源骨肉瘤成骨样细胞.方法:实验于2004-11/2005-04在解放军第四军医大学航空航天医学系航空航天生物动力学教研室完成.①对MG-63细胞进行培养,传代60 h后,将细胞置于流室系统中进行刺激实验.流体剪切应力分别为0.5 Pa(0.5 Pa应力刺激组)和1.5 Pa(1.5 Pa应力刺激组),作用时间分别为15,30和60min.同时取盖玻片置于含培养基的培养皿中,作为流体剪切应力刺激组的即时对照(对照组).②提取细胞总RNA,进行反转录聚合酶链反应,检测细胞内核结合因子α1 Mrna的表达,并计算与内参照GAPDH Mrna的比值.主要观察指标:不同流体剪切应力及不同作用时间核结合因子α1mRNA的表达值.结果:①与对照组相比,流体剪切应力刺激组的核结合因子α1 Mrna的表达在作用30 min和60 min均显著增强,且在一定的时间范围内(15～60 min),核结合因子α1mRNA的表达水平随着作用时间的延长、应力水平的增加而增强.②1.5 Pa应力刺激组在作用30 min和60 min核结合因子α1 Mrna的表达比0.5 Pa应力刺激组均显著增强(P＜0.01).结论:流体剪切应力可以促进成骨细胞内核结合因子α1的表达.
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重组人粒细胞集落刺激因子对药物性皮肤溃疡愈合的影响
背景:粒细胞集落刺激因子对成纤维细胞、角质细胞、皮肤黏膜细胞均有不同程度的刺激作用.目的:观察粒细胞集落刺激因子对药物性外渗所致皮肤溃疡的愈合作用.设计:随机对照动物实验.单位:解放军第四军医大学西京医院呼吸内科.材料:实验于2004-06/2004-11在解放军第四军医大学西京医院呼吸内科实验室完成.取雄性昆明种小白鼠20只,体质量18～24 g.方法:将制备好的皮肤溃疡动物模型随机分为对照组和治疗组,每组10只.对照组给予酚妥拉明1 mg,利多卡因20 mg,地塞米松1 mg,用生理盐水稀释至0.5 mL,封闭,1次/d,共7 d;治疗组在溃疡周围注射粒细胞集落刺激因子25 μg,用生理盐水稀释至0.5 mL,隔日给药1次,共7 d.观察溃疡处皮肤组织的愈合时间和组织学变化.主要观察指标:观察粒细胞集落刺激因子对药物性外渗所致皮肤溃疡、糜烂的愈合时间和组织学变化.结果:20只小白鼠均进入结果分析.①愈合时间:对照组糜烂、溃疡的愈合时间明显长于治疗组[(20～24,8～12)d,t=2.264,P=0.01];②组织学观察:对照组治疗7 d后肉芽组织增生不明显;治疗组治疗7 d后肉芽组织增生,新生血管丰富.结论:粒细胞集落刺激因子能促进药物性糜烂、溃疡的创伤愈合.
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计算机辅助的EBRA-FCA法分析半髋表面置换治疗股骨头缺血性坏死假体生物力学变化
背景:对于中晚期(FicatⅢ,Ⅳ期)股骨头缺血性坏死且髋臼基本完好的患者,单纯股骨头表面置换是一种较好的治疗方法.股骨假体位置、下沉影响全髋关节置换术的治疗效果,但假体位置、下沉对半髋表面置换术疗效的影响尚需进一步研究.目的:观察钴铬合金半髋表面置换对中晚期(FicatⅢ,Ⅳ期)股骨头缺血性坏死且髋臼基本完好患者髋关节功能的影响,并分析疗效与股骨假体柄干角、下沉的关系,评估计算机辅助X射平片分析对假体失败的预测价值.设计:病例分析.单位:广西医科大学第一附属医院脊柱骨病科.对象:选择1997-06/2002-07广西医科大学第一附属医院脊柱骨病科收治的中晚期(FicatⅢ,Ⅳ期)股骨头缺血性坏死行半髋表面置换患者41例(48髋),患者手术时的年龄29～49岁,平均(37±9)岁,其中男30例,女11例.其中Ficat Ⅲ期35髋,Ficat Ⅳ期13髋,髋臼均相对正常.所有患者病变部位病理检查均为股骨头缺血性坏死;且均签署知情同意书.方法:①于术前和随访时采用UCLA(University of California Los Angeles)髋关节功能评分标准对患者手术前后疼痛、步行、功能、活动进行评分,每一项记分为1～10分,10分为佳.优,35～40分,好29～34分,一般22～28分,差＜22分.术后评分为随访时评分平均值.②运用计算机辅助的EBRA-FCA法,在术后骨盆的X射线平片上测量股骨假体的柄干角、下沉,并对半髋表面置换术治疗股骨头缺血性坏死的疗效与股骨假体的柄干角、下沉的关系进行分析.③采用复诊的方式进行随访,于术后2个月开始第1次随访,每年随访1次,共随访8年.④两组样本间均数比较采用独立样本t检验(并做方差齐性检验).在对临床结果的析因分析(post hoc analysis)基础上,比值比(odds ratio)分析用来确定假体早期失败的相对危险性.主要观察指标:①纳入患者半髋表面置换术前后UCLA评分比较.②Ficat Ⅲ期和Ⅳ期患者术后疗效比较.③不同疗效患者随访期间股骨假体柄干角和下沉程度比较.结果:全部病例均获随访,其中8例随访3年,8例随访4年,8例随访5年,7例随访6年,6例随访7年,4例8年.①UCLA髋关节功能评分:疼痛、步行、功能、活动评分别由术前的(3.1±1.2),(4.4±1.7),(5.8±2.3),(5.5±2.7)分提高到术后的(9.1±2.5),(9.2±2.9),(9.1±3.4),(7.1±3.1)分,差异明显(P＜0.01).②疗效:Ficat Ⅲ期35髋术后的满意率为89%与Ficat Ⅳ期13髋术后的满意率相近(69%,P＞0.05),其中疗效差8髋为失败组,其余40髋为成功组.③计算机辅助的X射线平片检查结果:失败组6个髋的股骨假体有明显下沉(其柄干角小于130°),2个髋的髋臼有破坏(1个柄干角为128°,1个柄干角为136°).成功组平均柄干角明显大于失败组,分别为139°±6.2°,127°±5.3°,差异明显(P＜0.01).失败组中,6髋假体头中心和假体柄尖的下沉分别为(5.02±1.3)mm和(4.85±1.1)mm明显大于成功组[(1.48±0.2)和(1.04±0.2)mm,P＜0.05];小于130°的柄干角其发生不良后果的机会增加了7.1倍.④股骨假体下沉时间:计算机辅助的X线片分析显示股骨假体下沉超过2 mm的时间为(19.5±3.2)个月,明显早于临床出现症状的时间和X射线平片异常的时间[(35.6±4.2),(24.8±2.5)个月,P＜0.01].结论:①钴铬合金半髋表面置换是一种可供选择的向全髋关节置换术过渡的较好的治疗方法,可以恢复中晚期(Ficat Ⅲ,Ⅳ期)股骨头缺血性坏死的且髋臼基本完好的患者的髋关节功能.②假体的松动下沉与假体的位置有关.③用来评估假体柄在骨盆平片上的下沉程度的计算机辅助的平片分析可以预测假体的失败.
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磷酸钙骨水泥对股骨颈骨折内固定辅强作用的组织学评价
背景:将磷酸钙骨水泥作为一种内固定辅强材料可提高骨折固定的稳定性,特别是对伴有骨质疏松、骨质较脆弱的骨折可发挥长期良好的固定作用.目的:从组织学方向分析磷酸钙骨水泥对股骨颈骨折内固定的辅强作用,并同非辅强及聚甲基丙烯酸甲酯辅强进行对比评估.设计:随机对照、重复观察、开放性实验.单位:吉林大学第一医院骨科与基本外科,吉林大学基础医学院病理室,日本爱知医科大学整形外科.材料:实验于1999-01/2004-01在吉林省洮南市医院、吉林大学、日本爱知医科大学完成.选用45只成熟中国绵羊,平均年龄12.5个月,随机分成3组:非辅强组、磷酸钙骨水泥辅强组、聚甲基丙烯酸甲酯辅强组,15只/组.分别于术后3,6,12周取材,每个时间点5只/组.磷酸钙骨水泥由粉剂和固化液组成(粉剂包括75%α-磷酸三钙、18%磷酸四钙、5%磷酸氢钙和2%Hydroxyapatite;固化液包括5% sodium chondroitin sulphate、12%sodium succinate和83%水),粉液比为3:1.聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥包括97.4% methylmethacrylate、2.6% N dimethyl-paratoluidine和hydroquinone.方法:①将各组绵羊采用pentobarbital sodium静脉麻醉后,进行截骨、钻孔、攻丝和固定.截骨部位均在右股骨颈基底部,用2枚直径4mm松质骨螺钉经大转子下固定.骨水泥则在螺钉拧入前填充.②磷酸钙骨水泥辅强组向孔中注射调配好粉剂和固化液比例的磷酸钙骨水泥,聚甲基丙烯酸甲酯辅强组向孔中注射聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥,非辅强组不给予任何材料.③各组标本首先进行大载荷测试,然后均在40%,70%,90%,100%乙醇中梯度脱水、染色、聚甲基丙烯酸甲酯包埋.后用锯切片机沿股骨颈方向连续切片,厚度为150～200 μm.硬组织切片在接触显微X线照相机上进行拍摄,分别于术后3,6,12周显微镜下观察各组标本骨水泥周围新骨形成情况及宿主骨的改变.主要观察指标:术后不同时间各组骨水泥周围新骨形成情况及宿主骨的变化.结果:实验选用45只成熟中国绵羊,全部进入结果分析.术后不同时间各组骨水泥周围新骨形成情况及宿主骨的变化:①非辅强组:术后3周在螺钉周围产生少量纤维组织,且宿主骨骨床有显微破坏,但显微破坏在术后6及12周时可见修复.②磷酸钙骨水泥辅强组:术后3,6,12周磷酸钙骨水泥充满于螺钉和宿主骨之间,而且磷酸钙骨水泥表面有新骨形成,在新骨和磷酸钙骨水泥之间没有纤维组织介入.在术后12周可见大量新骨形成,且见许多骨小管.③聚甲基丙烯酸甲酯辅强组:术后3周在骨床与聚甲基丙烯酸甲酯之间产生大量纤维组织,可见明显骨吸收,术后6及12周尤为明显.结论:由于磷酸钙骨水泥具有良好的组织相容性、骨传导性及自身改建能力,因此对股骨颈骨折提供了长期有益的辅强作用.
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骨髓间充质干细胞体外诱导分化软骨细胞表型的可行性
目的:探讨在体外特定培养条件下诱导绵羊骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞表型的可行性.方法:实验于2005-09/2006-02在首都医科大学细胞与遗传实验室完成.选择1岁龄骨骼成熟的健康绵羊,雌雄不拘,体质量20～30kg.①采用Percoll分离液,经密度梯度离心法自成年绵羊髂骨骨髓分离得到间充质干细胞,体外培养至第3代时,将骨髓间充质干细胞分为2组,实验组细胞贴壁后更换培养液,以无血清H-DMEM特定培养液诱导(内含转化生长因子β3 10μg/L、地塞米松10-7 mol/L、胰岛素样生长因子Ⅰ10μg/L、维生素C 50 mg/L),对照组加含10%胎牛血清的L-DMEM培养液,3 d换液一次.②在相差显微镜和透射电镜下观察细胞形态和超微结构,分别在诱导后的第7天、14天取出玻片,进行细胞形态学、组织化学和免疫组织化学分析,甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定间充质干细胞诱导后的软骨细胞表型.结果:①相差显微镜观察实验组诱导14 d后,细胞形态由梭形逐渐向多角形、多边形转变,并出现聚集成堆现象,而对照组细胞仍保持均一的梭形,增殖能力非常旺盛.②透射电镜可见实验组诱导14 d后的骨髓间充质干细胞周边绒毛增多,胞浆内富含粗面内质网、高尔基体和线粒体,表明细胞合成代谢旺盛.而对照组的骨髓间充质干细胞的细胞壁较光滑,胞核呈条状,核壁有许多皱襞和突起,细胞器也比较丰富.③免疫组织化学观察实验组诱导14 d后甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原染色阳性.而对照组诱导14 d后甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化染色则为阴性.结论:骨髓间充质干细胞在特定的诱导条件下能够分化为软骨细胞表型,可为软骨组织工程提供较为理想的种子细胞来源.
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钛表面粗糙度对牙周韧带细胞骨钙素表达的影响
目的:以骨钙素为细胞分化指标,观察牙周韧带细胞在不同粗糙度纯钛表面的分化特征.方法:实验于2005-01/12在赣南医学院科研中心完成.①将纯钛棒制备成直径10 mm、厚2 mm的钛片,共24个,分为A、B、C、D 4组,每组6个样品.4组样品分别采用100目、280目、400目、800目水砂纸进行打磨,然后采用如下方法对钛片进行处理:A组:单纯的机械处理;B组:单纯的机械处理+65%的硝酸(100℃,1 h)处理;C组:单纯的机械处理+100 μm的Al2O3,喷砂处理;D组:单纯的机械处理+100μm的Al2O3喷砂处理后+65%的硝酸(100℃,1 h)处理.所有样品均经过灭菌处理.②取无龋坏、无牙周病的正畸牙,磷酸盐缓冲液冲洗3遍,采用组织块培养法进行体外培养.刮取牙根中1/3处的牙周膜,剪成大小为1 mm3的组织块,均匀地铺于培养瓶底面.待组织块贴牢瓶底后轻轻翻转培养瓶,继续培养.待细胞从组织块边缘游离出后,胰蛋白酶分散,消化传代.观察牙周韧带细胞的体外培养特征.③将传至第3代的牙周韧带细胞,以2×108 L-1的浓度分别接种于4组样品表面,免疫荧光技术观察在不同粗糙度的商用纯钛表面的牙周韧带细胞骨钙素的表达.结果:①4组样品的粗糙度分别是(0.599 5±0.008 3),(0.406 5±0.004 6),(0.358 8±0.011 8),(0.008 7±0.002 2)μm,经方差分析,P＜0.01.组与组之间比较经q检验,P＜0.01.②牙周韧带细胞在形态上为长梭形的成纤维细胞样细胞.5～6 d后,细胞从组织块边缘游离出来,游离细胞呈长梭形.传代后的牙周韧带细胞呈长梭形,少量呈多角形.③免疫学显示细胞抗角蛋白抗体阴性,抗波形蛋白阳性,证实细胞为中胚层来源的结缔组织成纤维细胞.牙周韧带细胞在纯钛表面培养第7天,细胞在各组样品的纯钛表面增殖良好.在每组纯钛表面上的细胞均形成与钛片的条形生长,生长方向与钛片终打磨方向一致.A组纯钛表面上的细胞形态清晰,部分荧光染色呈颗粒状,细胞表达骨钙素;B组纯钛表面上的细胞以树突状突起融合在一起,细胞表达骨钙素;C组纯钛表面上的细胞密度增加.D组纯钛表面上的细胞间隙难以区分,呈片状生长,细胞染色增强.结论:纯钛表面粗糙度越小,牙周韧带细胞可能表达骨钙素越高,牙周韧带细胞矿化能力可能越强.
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应用基因调控方法抑制软骨细胞生成一氧化氮的可行性
目的:探讨用基因调控的方法抑制软骨细胞生成一氧化氮的可行性,为通过抑制一氧化氮生成治疗骨关节炎寻找新的途径和方法.方法:实验于2001-09/2002-03在华中科技大学同济医学院协和医院骨科实验室完成.根据基因调控和基因诱捕理论,培养大鼠软骨细胞,人工合成大鼠诱生型一氧化氮合酶基因上能够与核因子κB序列识别和结合并带有荧光标记的特异性序列核因子κB诱捕性双链寡核苷酸,同时合成诱生型一氧化氮台酶基因上不能够与核因子κB识别和结合的非特异性序列假诱捕性双链寡核苷酸作为对照,将假诱捕性双链寡核苷酸及1,2,4,8,10 μm诱捕性双链寡核苷酸转染入培养的大鼠软骨细胞,通过荧光显微镜观察其转染效率及降解情况,应用一氧化氮检测试剂盒及反转录聚合酶链反应的方法观察其对白细胞介素1诱导的软骨细胞一氧化氮生成及诱生型一氧化氮合酶mRNA转录的影响.结果:①双链寡核苷酸转染软骨细胞的观察结果:核因子κB诱捕性双链寡核苷酸及假诱捕性双链寡核苷酸能转染入软骨细胞胞核并能维持一定时间(48 h左右降解).②一氧化氮的检测结果:以重组人白细胞介素1β刺激的软骨细胞分泌量为100作对照,在未受白细胞介素1β刺激的情况下,软骨细胞分泌少量的一氧化氮(13.6±5.4);以白细胞介素1β刺激软骨细胞后,转染核因子κB诱捕性双链寡核苷酸为1μm,2μm时,软骨细胞分泌的一氧化氮与对照组相比无显著性;而在达到4μm时,一氧化氮分泌量差异即具有显著性(63.8±13.3,P＜0.01);此后,随诱捕性双链寡核苷酸浓度增加,软骨细胞分泌的一氧化氮的含量逐渐减少(寡核苷酸浓度为8μm和10 μm时);而在转染10μm的假诱捕性双链寡核苷酸后,软骨细胞合成一氧化氮的量并未减少.③诱生型一氧化氮合酶mRNA的表达结果:反转录聚合酶链反应测定诱生型一氧化氮合酶mRNA的相对表达量显示,软骨细胞未受白细胞介素1β刺激时,软骨细胞表达诱生型一氧化氮合酶mRNA为0.02±0.01,软骨细胞受白细胞介素1β刺激时,诱生型一氧化氮合酶mRNA高表达为1.2±0.16,在转染10 μm的假诱捕性双链寡核苷酸和1μm,2 μm的诱捕性双链寡核苷酸,诱生型一氧化氮合酶mRNA表达量与对照组无显著差异.而在浓度达到4μm时,差异即具有显著性(0.6±0.11,P＜0.01).此后,随诱捕性双链寡核苷酸浓度增加,诱生型一氧化氮合酶mRNA表达量逐渐减少.结论:双链寡核苷酸能够转染入软骨细胞,达到一定浓度的诱捕性双链寡核苷酸(4 μm)能抑制白细胞介素1β诱导的软骨细胞一氧化氮生成及诱生型一氧化氮合酶mRNA表达.应用诱捕性双链寡核苷酸通过基因调控的方式阻止了诱生型一氧化氮合酶基因上的一致性序列与核因子κB的结合,从而抑制了诱生型一氧化氮合酶mRNA的转录及诱生型一氧化氮合酶生成,为抑制诱生型一氧化氮合酶的生成提供了新的思路和方法.
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微囊化兔坐骨神经组织细胞移植对大鼠损伤脊髓胶质纤维酸性蛋白表达的作用
目的:观察脊髓损伤大鼠进行微囊化兔坐骨神经组织细胞移植后胶质纤维酸性蛋白表达的变化.方法:实验于2004-03/2005-02在江西医学院人体解剖学教研室应用解剖研究室完成.①选取健康成年家兔10只,用于制备坐骨神经组织细胞.②选取健康成年SD大鼠130只,随机分为4组:正常对照组10只、损伤对照组40只、细胞悬液组40只、微囊组40只.③损伤对照组、细胞悬液组、微囊组大鼠均建立脊髓半横断伤模型,于损伤处分别植入明胶海绵、明胶海绵吸附的10μL细胞悬液、明胶海绵吸附的10μL微囊化坐骨神经组织细胞.移植前后均不使用免疫抑制剂.正常对照组未给予材料移植.④损伤对照组、细胞悬液组、微囊组大鼠分别于术后3,7,14,28 d取材,每时相点10只,行免疫组织化学染色,观察胶质纤维酸性蛋白表达的变化.结果:实验选取健康成年SD大鼠130只,全部进入结果分析.①术后各组脊髓切片炎性反应苏木精染色结果:脊髓损伤后3 d,损伤对照组和细胞悬液组可见明显核固缩,部分神经元萎缩变小,神经元数量减少,细胞边界模糊不清,并有大量巨噬细胞浸润;第7天损伤对照组和细胞悬液组炎性反应进一步加剧,有大量的噬中性粒白细胞浸润,但微囊组少见;第14天损伤对照组和细胞悬液组胶质细胞明显增生、肥大,炎性反应减轻,神经元的形态有所恢复,而微囊组炎性反应较轻,胶质细胞增生减少.②术后各组脊髓切片胶质纤维酸性蛋白免疫组化染色结果:正常对照组可见胶质纤维酸性蛋白染色阳性细胞,空白及阴性对照染色未见阳性反应.损伤对照组和细胞悬液组术后3,7,14 d内胶质纤维酸性蛋白的表达呈进行性增高趋势,28 d回落.微囊组术后7,14,28 d胶质纤维酸性蛋白的表达显著低于损伤对照组、细胞悬液组(P＜0.01).结论:微囊化异种坐骨神经组织细胞移植能抑制损伤脊髓胶质纤维酸性蛋白的表达,减轻由反应性胶质化所形成的胶质瘢痕.
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可注射硫酸钙植入治疗跟骨关节内骨折
目的:通过观察可注射硫酸钙植入治疗累及距下关节跟骨骨折的临床预后,探讨该手术适应证及其优点.方法:选取2001-06/2006-01上海中医药大学附属普陀医院骨科收治的29例累及距下关节的严重跟骨关节内粉碎性骨折患者作为实验对象.采用连续硬膜外麻醉,手术切口采用跟骨外侧"L"切口,分别切开皮肤、深筋膜,注意防止损伤腓肠外侧皮神经.采取跟骨外侧手术入路,对跟骨骨折移位行撬拨复位后植入可注射硫酸钙骨替代物,再予跟骨解剖钢板内固定.结果:29例累及距下关节的严重跟骨关节内粉碎性骨折患者均获得12个月随访.①术后患者足部疼痛、足行走功能、足跟部畸形矫正评估结果:29例患者中,优15例,良11例,差3例,优良率达89.7%.②手术前后相关指标测量结果的比较:与术前比较,术后B(o)hler角、Gissane角、跟骨轴长、丘部跟骨高度、跟骨水平长度及结节部高度均明显增加(P＜0.05),跟骨宽度明显减小(P＜0.05).③累及距下关节的跟骨骨折手术前后X线片对比:术前跟骨粉碎性骨折,骨折累及距下关节面,跟骨短缩、增宽畸形;术中对距下关节面进行撬拨复位,关节面近似平整,采用可注射硫酸钙骨替代物植入充填,随后采用可塑性跟骨钛台金钢板内固定,术后3个月跟骨长度、宽度以及丘部高度基本恢复正常.结论:可注射硫酸钙植入+内固定术是治疗累及距下关节跟骨骨折的一种有效方法,能恢复后足外形及功能,缓解后足疼痛,促进跟骨骨折愈合.
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机械压力诱导人牙周膜成纤维细胞表达白细胞介素6与p38丝裂原激活蛋白激酶阻断剂的影响
背景:牙周膜细胞对于维持牙周组织的形态和功能起着关键作用,不良应力可能引起其合成过量炎症因子从而终引起牙周组织破坏.目的:分析p38丝裂原激活蛋白在压力诱导人牙周膜成纤维细胞合成炎症因子白细胞介素6过程中所起的作用.设计:观察对比实验.单位:解放军第四军医大学口腔生理实验室.材料:牙周膜成纤维细胞:取自因正畸需要拔除的20颗健康恒前磨牙的12～16岁青少年牙根中1/3牙周膜组织.试剂和仪器:白细胞介素6 ELISA试剂盒(第四军医大学免疫学教研室);酶联免疫检测仪(华东电子管厂);p38p38丝裂原激活蛋白阻断剂特异阻断剂SB203580(Biochemical公司生产,第一军医大学病理生理教研室姜勇教授惠赠).方法:采用常规组织块法将牙周膜组织细胞进行原代培养至第4、5代,将细胞随机分为4组:加压对照组:不对细胞加压及预处理;加压组:以200 kPa持续加压细胞,不加预处理;预处理对照组:细胞加压前1 h上清中加入10 g/L二甲基亚砜,加压方式、时间同加压组;预处理组:细胞加压前1 h预处理,即在上清中加入p38丝裂原激活蛋白阻断剂的特异阻断剂SB203580,浓度为1μmol/L,加压方式、时间同加压组.各组分别在持续加压后16,24 h采集标本,通过酶标记免疫吸附测定法测定不同时间点各组细胞中白细胞介素6表达量.主要观察指标:压力对人牙周膜成纤维细胞产生的白细胞介素6的量的影响结果及p38丝裂原激活蛋白阻断剂对压力诱导人牙周膜成纤维细胞产生的白细胞介素6量的影响结果.结果:加压组细胞经持续加压16,24 h后的白细胞介素6表达量分别为(143.1±0.42),(49.46±1.01)ng/L,明显高于加压对照组[(18.36±0.43),(18.78±0.50)ng/L,P＜0.05];预处理组经持续加压16,24 h后的白细胞介素6表达量分别为(56.39±0.72),(21.52±1.39)ng/L明显低于预处理对照组[(137.96±0.54),(48.74±0.79)ng/L,P＜0.05].结论:p38丝裂原激活蛋白是机械压力诱导人牙周膜成纤维细胞产生白细胞介素6的重要环节.
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纳米晶羟基磷灰石与兔骨髓间充质干细胞复合培养回植体内的成骨性能
背景:骨髓间充质干细胞具有自我更新及多向分化的能力,经诱导后能够向成骨细胞分化,与基质材料结合可以具备形态功能良好的骨缺损修复效应.目的:观察骨髓间充质干细胞与基质材料复合后同体移植修复节段性骨缺损的成骨性能.设计:开放性实验.单位:无锡市第三人民医院细胞实验室.材料:实验于2004-05/2005-03在无锡市第三人民医院细胞实验室完成.选取清洁级6月龄新西兰兔18只,随机数字表法分为细胞支架复合组、单纯支架组、空白对照组,6只/组.支架材料由清华大学材料系生物组提供纳米晶羟基磷灰石胶原材料,具备天然骨微结构特征(组成:羟基磷灰石约57%,胶原约30%,聚乳酸约13%).方法:①分离培养兔骨髓间充质干细胞,取生长良好的第2代细胞应用EPICS-ALTRA流式细胞仪检测细胞表面抗原表达.②支架材料按实验需求切割成6 mm×6 mm×4 mm大小,60Co辐照灭菌,使用前DMEM-LG浸润.收集培养两三代的细胞,调整浓度为109 L-1,与纳米晶羟基磷灰石胶原材料于体外联合培养.③各组均建立兔桡骨节段性缺损模型.细胞支架复合组将已备好的复合物采用同体移植的原则嵌入骨缺损中,单纯支架组将空白支架材料嵌入骨缺损中,空白对照组不植入任何材料.各组动物均不作内外固定,严密缝合软组织、皮肤.④扫描电镜下观察各组材料表面结构及细胞附着情况.⑤各组分别于术后4,8,16周行大体观察、组织学分析及X光摄片,了解成骨情况.主要观察指标:①骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定情况.②各组扫描电镜观察结果.③术后各组放射学检测结果.④术后各组大体形态观察结果.⑤术后各组组织学检测结果.结果:实验选取清洁级新西兰兔18只,全部进入结果分析.①原代培养4 h后可见有贴壁细胞,静置培养48 h后贴壁细胞呈克隆样生长,细胞多为不规则鳞片状,胞体大,核居中.流式细胞仪检测可见CD29,CD44,CD105呈阳性,3种阳性细胞比率分别为97.4%,98.1%,86.2%.②单纯支架组表面不规则,孔隙较多.细胞支架复合组材料表面及孔隙内均有细胞附着.③术后4,8,16周各时间点细胞支架复合组X线片吸光度均高于单纯支架组、空白对照组,且16周时细胞支架复合组可见骨性愈合.④术后16周细胞支架复合组骨痂已能环包植入物,单纯支架组植入物中段仍有部分未被骨组织覆盖,空白对照组没有成型骨痂形成.⑤细胞支架复合组术后各时间点的成骨能力均强于单纯支架组,且16周时有骨小梁形成,成骨细胞排列有序.单纯支架组骨组织大多集中于材料表面,材料吸收少.空白对照组缺损近端有少许新生骨样组织形成,中段则未见.结论:兔骨髓间充质干细胞在体外可以大量增殖,与纳米晶羟基磷灰石胶原材料复合培养具有很强的成骨作用,是一种较好的组织工程种子细胞.
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烤瓷熔附金属修复材料实验力学与计算力学的比较
背景:烤瓷熔附金属的物理性质同其各组分的性质明显不同又受到其影响,大多复合材料的力学性质可用混合律来预测,但烤瓷熔附金属力学性质的影响因素非常多,预测的结果明显偏大,因此有必要将其力学性质与材料力学的理论分析通过数学模型联系起来,以指导其使用.目的:探讨对烤瓷熔附金属修复材料进行力学分析的实验与计算方法,分析其相关程度和内在联系.设计:分别利用三点弯曲实验,参照复合材料混合律测试并计算材料的强度和模量,将实验与计算所得结果进行比较.单位:四川大学华西口腔医学院口腔修复科.材料:制作不同金瓷比,外形为26 mm×4 mm×1.5 mm的烤瓷熔附金属试件15个,分5组,每组3个.方法:采用三点弯曲实验测量烤瓷熔附金属弯曲强度及弹性模量,观察其变化规律,并与理论计算值比较,讨论其相关性.主要观察指标:烤瓷熔附金属材料实验及理论计算结果及二者的比较.结果:实验测量结果与理论计算结果有明显相关性,可以通过修正的理论公式来预测烤瓷熔附金属的力学性质.结论:烤瓷熔附金属各组分的几何形态参数和力学参数与其总体力学性质有规律关系,可以用通过校正的理论公式进行预测和改进.
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牙胚组织中成釉蛋白表达免疫组织化学和原位杂交的特点
目的:观察人牙胚组织中成釉蛋白的表达特点.方法:实验于2002-02/04在解放军第四军医大学口腔内科实验室完成.取孕5个月流产男性胎儿(产妇知情同意),截取上、下颌骨,常规方法制备人牙胚组织石蜡切片.用兔抗人AMBN多克隆抗体,对人牙胚组织石蜡切片和正常狗牙周组织石蜡切片进行免疫组织化学染色.标记人成釉蛋白cDNA探针,对人牙胚组织石蜡切片进行原位杂交.结果:①免疫组织化学染色发现成釉蛋白由内釉上皮细胞在分化为成熟成釉细胞前开始表达,分泌期成釉细胞高度表达并持续整个釉质形成期,新形成的牙釉质染色阳性;成牙本质细胞在分泌牙本质基质之前开始表达成釉蛋白,在牙本质形成过程中成牙本质细胞持续表达成釉蛋白,呈弱阳性,前期牙本质中呈弱阳性染色;上皮根鞘细胞染色阳性.狗牙周组织染色发现牙骨质表层细胞呈强阳性染色,新形成的牙骨质中可见阳性染色颗粒,呈网状分布.②对人牙胚组织石蜡切片的原位杂交显示,成釉蛋白在成釉细胞、成牙本质细胞、上皮根鞘细胞中有表达,表达部位与免疫组织化学结果一致.结论:内釉上皮首先表达成釉蛋白,之后前成牙本质细胞达成釉蛋白.成釉细胞、成牙本质细胞、上皮根鞘细胞表达成釉蛋白.
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猪→人异种心脏移植中相关血管的生物力学特性
背景:同种心移植器官来源有限,短缺问题日益突出.目的:观察正常成人与不同月龄猪升主动脉一维载荷下的力学特性,为猪→人异种心脏移植吻合血管提供必要的生物力学实验基础.设计:开放性实验.单位:郧阳医学院解剖教研室.材料:实验于2002-04/2003-07在郧阳医学院医用生物力学实验室完成.人升主动脉取自无心血管疾病、18～30岁意外死亡的6例成年男性尸体(由郧阳医学院遗体捐赠中心提供).选取1月龄同种猪42头(由郧阳医学院实验动物中心提供,动物质量合格证号:QN0202),普通食料饲养,分别于1,2,3,4,5,6,7月龄时屠宰,6头/次.解剖分离、原位测量各自体内长度后从主动脉瓣环基底平面至无名动脉起始处取下升主动脉(所有标本均未见到动脉粥样硬化表现),分5等份,取第2,4管段用于一维载荷的力学试验.方法:应用生物软组织力学试验机,刘6例成年男性尸体和42头1～7月龄猪升主动脉进行一维载荷的力学试验,所有的血管段试样均以相同的应变率于室温32℃进行预处理10次(载荷范围0～0.5 N).血管受到周期性的匀速的加载和卸载后滞后现象消失,得到可重复性的力-变形数据.用相同的载荷范围和应变率对血管进行1次加载和卸载,记录力-变形数据后,供计算机分析.每次结束后均用标准砝码和百分表对力和位移量进行标定.由实验数据来拟合材料常数α与弹性模量dT/dλ.主要观察指标:①人与不同月龄猪升主动脉一维载荷下力学特性常数的测定结果比较.②人与不同月龄猪升主动脉一维载荷下弹性模量的测定结果比较.结果:①人与不同月龄猪升主动脉一维载荷下力学特性常数的测定结果比较:随着月龄的增长,猪血管的材料常数虽有所增加,但差异无显著性意义(P＞0.05).人与1～7月龄猪升主动脉一维载荷下力学材料常数比较基本相似(P＞0.05).②人与不同月龄猪升主动脉一维载荷下弹性模量的测定结果比较:随着月龄的增长,7月龄猪升主动脉的弹性模量较其他月龄猪明显升高(P＜0.05);人与各月龄猪的相应血管相比,弹性模量差异无显著性意义(P＞0.05).结论:人与1～7月龄猪升主动脉力学特性常数和弹性模量无明显差异,至少在某些区段二者相应血管的力学特性是相近的.从力学角度分析,猪→人异种心脏移植过程中人与猪相应升主动脉的吻合具有一定的可行性.
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两种抗生素复合骨水泥体外药物释放的规律
目的:观察抗生素复合骨水泥体外释药规律,以及有效的检测方法.方法:实验于2005-10/2006-01在解放军第四二五医院外二科完成.将骨水泥固体相分别与万古霉素和庆大霉素按照1:25(g:mg)的比例混合,再按2 g:10mL:50mg(固相:液相:抗生素)比例加入骨水泥液相,搅拌成糊状,注入模具中铸型,采用K-B制片扩散法,对两种抗生素各浓度梯度的抑菌环直径平均值与药物浓度之间的关系进行相关分析.以金黄色葡萄球菌为敏感细菌,检测1,3,5,7,10,14,22,26,30 d 9个时间点抗生素骨水泥制件浸泡液,观察骨水泥中抗生素的释放效果,并根据结果绘制释药曲线,计算释药效率.结果:①万古霉素浓度-抑菌环直径标准方程Y=2.71+5.59X(r=0.989),庆大霉素浓度-抑菌环直径Y=0.17+7.87X(r=0.977).②骨水泥早期爆发释药,中期平稳释药,26 d释药浓度大于对应细菌低抑菌浓度.骨水泥释药复合Higuchi方程.30 d抗生素释放率分别是83.73%和89.38%.结论:①骨水泥具有缓释模型特点,为感染性人工髋关节翻修术中的应用提供实验依据.②K-B法可简单有效检测抗生素骨水泥的释药效果.
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液相蛋白芯片法测蜕膜细胞与滋养层细胞共培养体系中基质金属蛋白酶的表达
目的:探讨蜕膜基质细胞与绒毛外滋养层细胞共培养体系中细胞滋养层细胞侵入过程中基质金属蛋白酶表达水平的变化及在母胎界面间基质金属蛋白酶对细胞滋养层细胞侵袭行为的调控.方法:实验于2005-09/12在南方医科大学南方医院生殖中心及病生实验室完成.①分别进行蜕膜基质细胞与绒毛外滋养层细胞的体外分离培养与纯化.②在Transwell-Col Insert细胞培养板内进行蜕膜细胞与滋养细胞体外共培养及直接混合培养.③利用Luminex xMAP对培养上清液中多种基质金属蛋白酶蛋白表达的含量变化进行分析.结果:①与绒毛外滋养层细胞相比,基质金属蛋白酶1,3在共培养体系与混合培养体系中的表达依次升高,差异有显著性(P＜0.05),基质金属蛋白酶2,7,9在共培养体系与混合培养体系中的表达依次降低,差异有显著性(P＜0.05),且在共培养体系中以基质金属蛋白酶2,9表达尤为显著,基质金属蛋白酶8,12,13在各培养体系中均为低表达.②两种共培养体系中,除基质金属蛋白酶-13变化不显著外,其余基质金属蛋白酶均在Tranwell共培养体系下显著升高(P＜0.05).③基质金属蛋白酶1,3,7,8两两之间正相关,基质金属蛋白酶2,7,9两两间正相关,相关关系均显著(P＜0.05),且关系较密切(r＞0.554 8).结论:共培养条件下滋养层细胞侵入过程中基质金属蛋白酶量的变化及之间的相互关系与胚胎着床关系密切.
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重组人甲状旁腺素(1-34)影响兔骨髓间充质干细胞增殖及向成骨细胞分化的量效关系
目的:分析重组人甲状旁腺素(1-34)影响兔骨髓间充质干细胞增殖、向成骨细胞分化与其作用时间及剂量的关系,认识重组人甲状旁腺素(1-34)作为骨形成促进剂的部分作用方式.方法:实验于2004-11/2005-04在云南省天然药物药理重点实验室完成.选用日本大耳兔,无菌取出双侧股骨、胫骨,分离骨髓间充质干细胞并进行原代培养、传代及诱导培养.将骨髓间充质干细胞分为8组:空白对照组(完全培养基)、阳性对照组(地塞米松10-11 mol/L,β-甘油磷酸10 mmol/L,维生素C 50 mg/L)及重组人甲状旁腺素(1-34)4 000,400,40 μg/L组,3个剂量组又分两种给药方式,即以48 h为1个循环,药物作用时间分别为6 h(间歇给药,6 h后换为不含药培养基)和48 h(连续给药,48 h换液),共作用14 d.于给药后第1～7天,用改良MTT法测各组细胞吸光度值(570nm),并绘制细胞生长曲线.分别于给药后第4,7,14天用超声粉碎仪粉碎细胞,取上清液用全自动生化分析仪进行碱性磷酸酶活性测定.结果:①各组骨髓间充质干细胞的生长增殖情况比较:重组人甲状旁腺素(1-34)4 000,400,40μg/L 6 h组间充质干细胞在给药6 d后,生长速度明显高于空白对照组、阳性对照组及重组人甲状旁腺素(1-34)4 000,400,40μg/L 48 h组(P＜0.05).②各组骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性比较:给药第14天,重组人甲状旁腺素(1-34)4 000,400μg/L 48 h组碱性磷酸酶活性显著低于空白对照组(P＜0.05).结论:重组人甲状旁腺素(1-34)促进骨形成的作用与剂量及作用时间有关.间歇性给药有利于骨髓间充质干细胞的增殖,而连续大剂量给药则抑制骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化.
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成纤维细胞生长因子18对兔骨髓基质干细胞体外增殖的影响
目的:构建可稳定表达成纤维细胞生长因子18蛋白的真核表达载体,在体外观察成纤维细胞生长因子18对兔骨髓基质干细胞体外增殖的影响.方法:实验于2002-10/2004-03在西安第四军医大学全军骨肿瘤研究所及口腔医学院完成.①将pGEM-T-成纤维细胞生长因子18-3和pSecTag2B表达载体分别用Kpn Ⅰ和Not Ⅰ酶切后重组pSecTag2B-成纤维细胞生长因子18质粒.②脂质体介导下转染哺乳动物细胞COS-7,获得稳定表达后用细胞上清刺激骨髓基质干细胞.③通过噻唑蓝检测细胞增殖情况.结果:①成功构建pSecTag2B-成纤维细胞生长因子18真核表达载体(电泳可见540 bp的特异条带).②转染哺乳动物细胞COS-7用夹心酶联免疫吸附法检测到了成纤维细胞生长因子18蛋白质的稳定表达(夹心酶联免疫吸附方法检测450 nm处吸光度值,原液及1:10稀释度细胞上清大于阴性对照组2.1倍以上).③用细胞上清刺激骨髓基质干细胞后,实验组骨髓基质干细胞较对照组吸光度值明显增高,在24～72 h其增高具有明显的统计学差异(P＜0.01).结论:成纤维细胞生长因子18显著促进兔骨髓基质干细胞体外增殖,提示成纤维细胞生长因子18对于骨髓基质干细胞增殖及分化有调节作用.
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人参总皂苷在神经干细胞移植治疗帕金森病模型小鼠中的作用
目的:将人参总皂苷或人参总皂苷与白细胞介素1联合处理的神经干细胞移植到帕金森病模型小鼠纹状体内,观察人参总皂苷在移植治疗帕金森病模型小鼠中的作用.方法:实验于2004-09/2005-07在重庆医科大学基础医学研究所重庆市生物化学与分子药理重点实验室完成.①从7～12周龄流产胚胎脑中分离皮质细胞,体外培养,纯化,分别用鼠抗人nestin抗体行免疫细胞化学染色,鉴定神经干细胞,并用4,6-二乙酰基-2苯基吲哚标记细胞.②人参总皂苷与人神经干细胞的体外培养,实验分组:神经干细胞组,常规培养神经干细胞;人参总皂苷组,常规培养体系中加入人参总皂苷(终浓度200mg/L);人参总皂苷+白细胞介素1组,在人参总皂苷组培养体系中加入白细胞介素1(终浓度200ng/L),均培养3 d,待移植用.③健康清洁级小鼠20只,腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四羟吡啶(30 mg/kg),建立帕金森病小鼠模型.记录小鼠震颤麻痹评分,自发活动和记忆功能,对模型进行评价.④将经人参总皂苷处理的神经干细胞,按所分实验组注入帕金森病小鼠纹状体内,同时设立磷酸盐缓冲液组(注入同体积磷酸盐缓冲液),移植后60 d观测模型鼠行为学改变情况;荧光显微镜下观察移植的神经干细胞在帕金森病模型鼠脑内分布和迁移;酪氨酸羟化酶免疫组织化学染色,对移植的神经干细胞在脑内分化为多巴胺能神经元样细胞进行检测.结果:①从流产人胚胎脑组织中分离、纯化的神经干细胞细胞,经3代以上的传代纯化培养,神经球nestin呈阳性表达,所有神经干细胞细胞核标记上蓝色荧光,标记率达100%.②20只小鼠均建模成功.③神经干细胞组、人参总皂苷组、人参总皂苷+白细胞介素1组神经干细胞移植后帕金森病小鼠5 min自发活动的次数均多于对照组(52.0±1 6,81.0±2.8,98.0±3 7,P＜0.05或0.01).④震颤麻痹评分(每组对照均为2分1只,3分4只),磷酸盐缓冲液组2分1只,3分4只;神经干细胞组2分3只,3分2只;人参总皂苷组2分4只,3分1只;人参总皂苷+白细胞介素1组1分2只,2分2只,3分1只.⑤移植的神经干细胞在帕金森病模型鼠脑内分布和迁移以及分化多巴胺能神经元样细胞的检测显示,人参总皂苷+白细胞介素1组优于人参总皂苷组,人参总皂苷组优于神经干细胞组,磷酸盐缓冲液组无作用.结论:人参总皂苷在神经干细胞移植治疗帕金森病中发挥促进作用.
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干细胞因子促进骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化
背景:骨髓间质干细胞体内、外均能分化为心肌细胞,但数量少且定向分化率较低.目的:探讨干细胞因子促进骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的作用.设计:开放性实验.单位:咸宁学院心血管疾病研究所,华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科.材料:实验于2003-10/2004-08在咸宁学院心血管疾病研究所实验中心完成.选取出生1～2 d的SD新生大鼠20只,用于心肌细胞的培养.另选取清洁级成年SD大鼠25只,随机数字表法分为干细胞因子组、空白对照组,12只/组,剩余1只大鼠用于骨髓间充质干细胞的提取、培养及纯化.方法:①在共培养前用4,6-联脒-2-苯基吲哚标记骨髓间充质干细胞.干细胞因子组对大鼠进行体内动员,连续5 d皮下注射重组鼠干细胞因子,20μg/(kg·d),然后提取其骨髓间充质干细胞于心肌细胞培养第3天进行共培养.空白对照组皮下注射相等剂量的生理盐水,未施加任何干预的骨髓间充质干细胞于心肌细胞培养第3天进行共培养.②用数码显微摄像及免疫荧光技术分别记录和检测MHC α/β、肌钙蛋白T的表达,测定4,6-联脒-2-苯基吲哚-骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的百分率.主要观察指标:①骨髓间充质干细胞生长情况.②检测4,6-联脒-2-苯基吲哚对骨髓间充质干细胞的核标记率.③拟做共培养的心肌细胞活力、纯度分析.④共培养后骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化情况.结果:①骨髓细胞悬液接种于塑料培养皿,细胞呈圆形散在分布于瓶底,24h换液后可见稀少的长梭形贴壁细胞,4 d后梭形贴壁细胞开始增多,进入对数增长期,8～12 d达到80%的融合.传代细胞增殖更加迅速,随着换液与传代,骨髓间充质干细胞逐渐得到纯化.②4,6-联脒-2-苯基吲哚对骨髓间充质干细胞的胞核标记率为100%.③心肌细胞体外培养第3天,搏动细胞的百分比为63%,搏动频率40～60次/min.免疫细胞化学技术检测肌钙蛋白T表达的阳性细胞百分比为75%.④在共培养的第2,3天,干细胞因子组4,6-联脒-2-苯基吲哚-骨髓间充质干细胞表达MHC α/β的阳性百分率均显著高于空白对照组(P＜0.01);在共培养的第3,4,5天,干细胞因子组4,6-联脒-2-苯基吲哚-骨髓间充质干细胞表达肌钙蛋白T的阳性百分率亦均显著高于空白对照组(P＜0.01).结论:干细胞因子对骨髓间充质干细胞具有明显的促增殖分化作用.
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人胚嗅鞘细胞与鼠胚胎脊髓组织联合移植对大鼠脊髓损伤的治疗
背景:脊髓损伤高发且后果严重,至今尚无有效措施挽救丧失的神经功能.哺乳动物嗅觉系统的一类特殊胶质细胞的移植引起关注.目的:观察人胚嗅鞘细胞和大鼠胚胎脊髓共同移植在促进大鼠横断脊髓轴索再生方面是否产生协同作用.设计:开放性实验.单位:无锡第三人民医院细胞室,苏州大学附属第一医院神经外科,东南大学附属中大医院神经外科. 材料:实验于2002-09/2004-10在无锡市第三人民医院细胞实验室完成.①选取清洁级成年雌性SD大鼠36只,随机数字表法分成4组:人胚嗅鞘细胞组10只、鼠胚胎脊髓组10只、联合移植组10只,模型组6只.②取12周左右的流产新鲜人胚胎(产妇知情同意)用于嗅鞘细胞的培养纯化.③取孕14 d的SD大鼠1只,施行剖腹手术将胎鼠连同胎膜一同取出,用于新鲜胚胎脊髓的制备.方法:①4组大鼠均建立脊髓半切洞模型.模型组在损伤洞腔内填塞明胶海绵加全培养基8 μL,在损伤上下各1 mm处注射相同培养基2 μL;人胚嗅鞘细胞组明胶上给予嗅鞘细胞悬液8μL,损伤上下各1 mm处注射细胞悬液2μL;鼠胚胎脊髓组将组织碎块直接填塞在洞腔内,外覆明胶;联合移植组将同样大小的胚胎脊髓填塞在洞腔内,然后用微量加样器将8 μL的嗅鞘细胞悬液注入洞腔,外覆明胶,在洞腔上下各1 mm处注射细胞悬液2 μL,按层缝合肌层皮肤.②定期对各组大鼠进行行为学评定,结合病理学观察,并通过辣根过氧化物酶-四甲基联苯胺逆行示踪技术,评价嗅鞘细胞和胚胎脊髓对神经元存活、纤维再生的影响.主要观察指标:①人胚嗅鞘细胞体外培养及纯化.②体外免疫细胞化学分析.③大鼠后肢运动功能BBB评分测定结果.④移植物及受损脊髓修复的免疫组化检测结果.⑤辣根过氧化物酶-四甲基联苯胺示踪对各组被标记的皮质及中脑红核神经元的定量分析情况.结果:①人胚嗅鞘细胞大部分呈双极纺锤型,培养5～7 d左右,细胞相互交织成网状,可见大量细胞分裂相.纯化后的细胞纯度为85%.②P75阳性细胞率为(83±7)%,大约(81±6)%的细胞呈胶质纤维酸性蛋白阳性,(91±9)%的细胞呈Vimentin阳性,Nestin阳性率为(77±5)%.③术后3～5 d,模型组伤肢开始挛缩,正常侧下肢活动稍受限,其余3组少见明显挛缩症状.从术后2周开始,各组动物行为功能的恢复幅度明显增快,联合移植组BBB评分明显高于人胚嗅鞘细胞组、鼠胚胎脊髓组、模型组[(6.2±1.13),(5.0±1.15),(3.9±0.88),(3.3±1.03)分,P＜0.05].④人胚嗅鞘细胞组、联合移植组均在移植部位及移植区2.0～5.0 mm范围内见到P75及胶质纤维酸性蛋白阳性双极或多极细胞,同时多极细胞中发现碱性蛋白(+)颗粒.鼠胚胎脊髓组、联合移植组脊髓缺损灶内存在大量MAP2阳性反应的细小神经元.人胚嗅鞘细胞组、鼠胚胎脊髓组、联合移植组在脊髓缺损区内都不同程度观察到神经丝阳性纤维存在,尤以联合移植组为明显,模型组未能找到神经丝阳性纤维存在.⑤模型组损伤侧神经元基本无辣根过氧化物酶标记,而联合移植组标记的皮质、中脑红核神经元的数量均显著高于人胚嗅鞘细胞组、鼠胚胎脊髓组(P＜0.05).结论:嗅鞘细胞和胚胎脊髓联合移植对损伤脊髓具有明显保护作用且促进宿主脊髓轴突再生,在加快大鼠的功能恢复中起到了互补和协同的作用.
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微载体技术与普通方法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的比较
目的:比较微载体法与普通培养瓶法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞,建立一种大量、快速获得骨组织工程种子细胞的方法.方法:实验于2003-12/2004-10在西南医院中心实验室完成.取在西南医院检查的15名健康自愿者骨髓组织进行梯度离心,采用普通培养法培养.将普通培养瓶培养的第3代人骨髓间充质干细胞分别应用搅拌式生物反应器和微载体成骨诱导培养,分别于培养的第2,4,6,8,10,12,14天检测诱导培养细胞的碱性磷酸酶活性,观察细胞增殖情况,作出生长曲线,比较两种方法细胞增殖速度(收获细胞数除以接种细胞数,为细胞扩增倍数,以之除以培养天数为增殖速度).结果:①微载体法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的增殖动力学并与普通法的比较:培养微载体法接种24 h后约87%的人骨髓间充质干细胞细胞贴附于微载体并铺展,3 d后生长加速,10～11 d后细胞生长达大值,终细胞收获密度为接种时的15～20倍,微载体法诱导培养人骨髓间充质干细胞的速度是普通培养法的3～5倍,两者差异有显著性(P＜0.01).②微载体法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性并与普通成骨诱导培养法比较:两种方法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性均在培养的第12天达大值.微载体成骨诱导细胞的碱性磷酸酶活性与普通成骨诱导方法差异无显著性(P＞0.05).结论:应用微载体技术可以成功地进行人骨髓间充质干细胞的成骨诱导,更快地扩增,利于满足骨组织工程量和质的需要.
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含胎牛血清胶原酶消化法培养兔成骨细胞
背景:成骨细胞原代培养技术已经很成熟,然而各种消化酶单纯作用于原代组织时对成骨细胞膜蛋白有一定影响.目的:为尽可能避免酶对细胞的损害,用含胎牛血清的胶原酶消化胎兔颅盖骨骨组织,进行体外成骨细胞培养,观察加入胎牛血清后胶原酶对成骨细胞消化的效果.设计:对照实验.单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院骨外科研究室.材料:实验于2004-03/12在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨外科研究室完成.妊娠28 d日本大耳白种孕兔2只.方法:将同一个批号的Ⅰ型胶原酶分别用含体积分数为0.15胎牛血清的培养基和DMEM溶液配制成0.1%的含胎牛血清的胶原酶和0.1%不含血清的胶原酶,分别作为实验组和对照组的酶消化液A液和B液.妊娠28 d的孕兔,无菌条件下剖腹取出胎兔,然后取胎兔的颅盖骨,剔净、漂洗、剪碎.实验组和对照组分别加5 mL 37℃的A液和B液消化,两组均用含体积分数为0.15胎牛血清的培养液分别成梯度稀释为0倍、l倍、2倍和4倍后继续消化-培养成骨细胞.锥虫蓝染色测定细胞的存活率,细胞内碱性磷酸酶染色鉴定和测定成骨细胞的纯度,显微镜下观察细胞生长情况.主要观察指标:①用锥虫蓝染色来检测两组细胞的存活率.②以细胞内碱性磷酸酶染色来检测两组细胞的纯度.③用显微镜观察细胞形态来区别两组细胞的生长情况.结果:①细胞锥虫蓝染色结果:通过记数计算,实验组拒染率高达98%,细胞存活率高;对照组拒染率也高达95%,细胞存活率也较高.②细胞内碱性磷酸酶染色结果:实验组碱性磷酸酶染色阳性区域不少于95%,细胞纯度高;但对照组碱性磷酸酶染色阳性区域不超过75%细胞纯度较低.③显微镜下观察结果:实验组细胞饱满凸起,有立体感,细胞生长旺盛,营养充足;而对照组细胞凸起不明显,立体感较差,细胞生长营养较实验组差.结论:用含胎牛血清胶原酶消化胎兔颅盖骨骨组织,培养出的成骨细胞具有典型的成骨细胞特征,且成分单一,存活率高.
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新生小鼠脊髓神经干细胞体外增殖及其多潜能分化特性
目的:观察新生小鼠脊髓神经干细胞的体外增殖及其分化特性.方法:实验于2005-11/2006-02在安徽医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室完成.①在无菌条件下,利用显微解剖分离新生小鼠(出生后2 d内)脊髓,采用原代机械吹打使其成为单细胞悬液,离心,弃去上清液,加入干细胞培养液(含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子,20 μg/L表皮生长因子,B27辅助培养液),以1×108 L-1密度接种于25 mL培养瓶中,进行原代培养.②将原代培养7 d左右的细胞再次离心,弃去上清,加入干细胞培养液,机械吹打成单细胞悬液,以5×107 L-1密度进行传代培养,每六七天传代1次.③机械吹打制成的单细胞悬液,经过传代培养,重新增殖为神经球,采用巢蛋白抗体鉴定培养细胞,用体积分数为0.1的胎牛血清诱导神经干细胞分化后,用神经元和星型胶质细胞标志物微管相关蛋白,胶质纤维酸性蛋白相应抗体检测神经干细胞分化情况.结果:①脊髓源性神经干细胞形态学观察:在细胞培养第3,4天即可见培养基中出现由几个或十几个细胞组成的结构紧密、大小不等的悬浮细胞团块,称之为"神经细胞球";随着培养时间的延长和多次传代换液,细胞增殖迅速,神经细胞球数目明显增多.②脊髓神经干细胞的分化与鉴定:将神经球转入含体积分数为0.1的胎牛血清的培养液中,数小时内迅速贴壁并开始分化,5 d后分化的细胞呈现出3种典型的神经细胞形态;免疫细胞化学检测神经细胞球巢蛋白染色阳性及其分化的神经元和星型胶质细胞微管相关蛋白、胶质纤维酸性蛋白分别染色阳性.结论:新生小鼠脊髓存在具有多分化潜能的神经干细胞,它们可以在体外大量增殖,经过诱导可朝神经元和胶质细胞的方向分化.
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不同冻存复苏条件影响K562细胞的生物学特性
目的:观察不同冻存复苏条件对白血病K562细胞株生物学特性的影响,并优化培养条件与方法.方法:实验于2006-02/2006-04在吉林医药学院临床检验实验室进行.①将欲冷冻保存的细胞调整到良好的生长状态,即对数生长期.将细胞分成密度相同的4个组.离心收集后分别加入冻存保护液二甲基亚砜,其终浓度依次为5%、10%、15%、20%分装于冻存管.冻存15 d后,每组取出1支复苏并接种于细胞培养板培养.培养12 h后吸取少量实验细胞,加入等体积的0.1%台盼蓝染液,5 min后在血球计数板上计数,被染成深蓝色的细胞为死细胞;染色很淡、边缘光滑且胞体透明的细胞为活细胞.每个标本计数500个细胞,计数2次取平均值,计算细胞的复苏率.②选择冻存条件和冻存细胞密度相同的2支冻存细胞,采用2种不同的方法进行复苏.第1组:立即将冻存管置37℃水浴中,待融化后1 000 r/min离心5 min,吸去上清液,加入含10%小牛血清的RPMI-1640培养基,混匀后接种于细胞培养板继续培养.第2组:将冻存细胞于40℃水浴中迅速溶解后转入37℃水浴箱,融化后离心、加培养基等操作同第1组.复苏细胞培养12 h后采用台盼蓝染色计算细胞的平均存活率.③用无血清RPMI-1640培养基制备3×104/mL的K562细胞悬液接种于细胞培养板中,每孔1 mL,然后分别加入5%、10%、12%、15%、20%的灭活小牛血清,每种血清浓度设置4个试验孔并于培养12,24,36,48,60,72,84,96 h后每种浓度各取1孔计数细胞量,绘制细胞生长曲线.结果:①5%、15%、20%二甲基亚砜组冻存K562细胞复苏率分别与10%二甲基亚砜组比较,差异显著(86.70%,82:03%,63.09%,88.13%,P均＜0.01).②传统37℃水浴方法复苏后的细胞平均存活率,与40℃溶解后37℃恒温方法比较,差异非常显著[(69.13±1.01)%,(87.50±2.24)%,P＜0.01].③在5%血清含量培养基中,K562细胞基本不生长,且有逐渐死亡的趋势;在10%血清含量培养基中K562细胞生长趋势明显,但生长速度相对较慢;在12%、15%、20%血清含量培养基中K562细胞生长迅速,但3种血清浓度之间细胞生长趋势无明显差异.结论:以10%二甲基亚砜作为K562细胞冻存保护剂并采用改良复苏方法可使细胞保持佳生物学特性,12%血清为K562细胞常规培养的适浓度.
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人脂肪组织分离培养基质干细胞的方法及其表型鉴定
目的:分离培养人脂肪基质干细胞,鉴定其表型.方法:实验于2005-03/2005-12在华中科技大学同济医学院血研所实验室完成.脂肪组织取自华中科技大学同济医学院附属协和医院普通外科阑尾炎及腹股沟斜疝的14例手术患者,排除了冠心病、高血压病及糖尿病等.手术前均与本人谈话并征得其同意获取脂肪组织进行实验.分离人脂肪组织,胶原酶消化后制备细胞悬液并培养,消化传代以纯化细胞.传代的脂肪基质干细胞进行细胞生长曲线绘制,流式细胞术及免疫荧光法检测其表型.结果:14份标本均成功培养出脂肪基质干细胞并生长良好,平均传至20～25代.①原代细胞培养72 h后可见细胞贴壁,5 d后可见细胞呈纺锤形、多角形改变,9 d后细胞生长明显增加,排列密集并呈涡旋状生长,随着培养时间的延长,梭形细胞逐渐占据优势.到第12天后可见细胞铺满瓶底80%.传代后细胞增殖速度明显加快,于第3天开始数量明显增多,五六天后细胞即已长满培养瓶底,融合成片状,细胞排列更加整齐有序.多次传代后细胞呈更均匀有序的分布.②脂肪基质干细胞倍增时间约为48 h.③第5代的脂肪基质干细胞细胞表型,呈CD31-,CD34-,CD45-,HLA-DR-,CD29+,CD105+.④免疫荧光法鉴定脂肪基质干细胞表达CD13和CD44.结论:本实验成功从人脂肪组织中分离培养出基质干细胞,通过流式细胞术和免疫荧光检测,培养后的细胞表达CD13、CD29、CD44、CD105,而不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR.
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同种异体骨髓间质干细胞移植在大鼠肝内的定居能力
背景:骨髓间充质干细胞具有极强的自我复制能力和多向分化潜能,但当体外分离培养的骨髓基质干细胞移植到体内后,其分布和定居情况不明,这关系到骨髓基质干细胞是否可以作为靶细胞治疗应用于临床.目的:探索绿色荧光蛋白标记的大鼠骨髓间质干细胞(MSCs),经不同途径移植到同种异体大鼠,其定居于肝脏的能力.设计:析因设计.单位:广东省第二人民医院普外科/中山大学博士后科研基地,南方医科大学珠江医院普通外科,中山大学附属第三医院器官移植科.材料:实验于2003-01/2004-12在解放军第一军医大学基础部药理教研室完成.选取清洁级成年SD大鼠36只,随机分为5组:CCL4+门静脉移植组(6只)、门静脉移植对照组(6只)、CCL4+尾静脉移植组(6只)、尾静脉移植对照组(6只)、混合组(12只).方法:①从大鼠骨髓中分离培养获取骨髓间充质干细胞,以绿色荧光蛋白进行标记,体外扩增后,以细针移植骨髓间充质干细胞悬液,移植量为0.5 mL/100 g.②CCL4+门静脉移植组:骨髓间充质干细胞移植前3 d,每天按20g/L的CCL4 2.5 mL/kg体质量灌胃饲养,首次计量加倍,标记的骨髓间充质干细胞从门静脉移植.门静脉移植对照组:骨髓间充质干细胞移植前正常饲养,标记的骨髓间充质干细胞从门静脉移植.CCL4+尾静脉移植组:骨髓间充质干细胞移植前3 d,每天按20 g/L的CCL4 2.5 mL/kg体质量灌胃饲养,首次计量加倍,标记的骨髓间充质干细胞从尾静脉移植.尾静脉移植对照组:移植前正常饲养,标记的骨髓间充质干细胞从尾静脉移植.混合组:前4组条件下,各设2只大鼠移植未标记的骨髓间充质干细胞;另设CCL4喂养3 d和正常喂养大鼠各2只,不行骨髓间充质干细胞移植.③于移植后的第3,7天,通过荧光定量PCR检测各组移植的骨髓间充质干细胞在大鼠肝脏的表达.主要观察指标:①骨髓间充质干细胞的分离纯化、体外扩增及表型鉴定结果.②绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞结果.③移植同源异体骨髓间充质干细胞后大鼠的生长情况观察.④各组肝脏组织中绿色荧光蛋白阳性DNA数的定量检测结果.结果:实验选取SD大鼠36只全部进入结果分析.①Percoll梯度分离液分离大鼠骨髓,所获得的细胞传代、扩增后,形态呈基本一致的梭性.细胞表面不表达CD34与CD45,而表达CD29,CD44,CD90等骨髓间充质干细胞的表面标志,是骨髓中区别于造血干细胞的另一群处于未分化状态的非定向干细胞.②骨髓间充质干细胞转染24 h后即可见发绿色荧光的细胞.48～72 h阳性细胞明显增多,强度增强,高倍视野下转染率达20%～30%,多为明亮的绿色荧光的细胞.作为对照的骨髓间充质干细胞中未发现发绿色荧光的细胞.③所有大鼠从不同途径移植标记或未标记的同源异体骨髓间充质干细胞后,第1天精神、食欲差,少活动;移植后第2天基本恢复正常饮食和精神,各组大鼠之间无明显差异.④除混合组外,其余各组于移植术后第3,7天,肝脏内均可检测到含绿色荧光蛋白阳性细胞.且CCL4+门静脉移植组、CCL4+尾静脉移植组肝脏组织中的绿色荧光蛋白阳性DNA数显著高于门静脉移植对照组、尾静脉移植对照组升高(P＜0.05).结论:干细胞定居于肝脏的时间与细胞数量可能与肝脏是否受损有关,与移植途径关系不密切.正常动物肝脏未受损情况下,干细胞可定居于肝脏,定植的细胞量与移植途径、移植后时间相关.
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葛根素抑制乙醇诱导骨髓基质细胞成脂分化的实验
背景:动物实验证明乙醇可引起股骨头内脂肪积聚,导致骨坏死.分子生物学实验证明乙醇能够诱导骨髓基质细胞成脂分化.若某种药物能够对抗乙醇诱导骨髓基质细胞的成脂分化作用,则可能防治酒精性骨坏死.目的:从细胞生物学角度观察葛根素对抗酒精诱导骨髓基质细胞成脂分化作用,探讨葛根素对酒精性骨坏死的防治作用.设计:随机对照实验.单位:郑州大学第一附属医院骨科和郑州大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室.材料:实验于2000-04/2002-12在郑州大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室实验室完成.选用清洁级健康昆明小鼠50只,6～8周龄,雌雄不拘.获取双侧股骨骨髓细胞,细胞接种密度1.5×106/cm2,置入6孔及24孔培养板内,随机分组,每孔作为1个样本,每组为24个样本.方法:分离培养小鼠骨髓基质细胞,随机分为3组:模型组(给予乙醇0.09 mol/L处理细胞),实验组(乙醇0.09 mol/L和葛根素终浓度为0.01g/L),对照组(无乙醇和葛根素).苏丹Ⅲ染色,光镜下脂肪细胞计数;测定细胞内三酰甘油含量、碱性磷酸酶活性和细胞培养液中的骨钙素含量.主要观察指标:①3组小鼠骨髓基质细胞分化为脂肪细胞结果.②3组小鼠骨髓基质细胞内三酰甘油含量.③3组小鼠骨髓基质细胞内碱性磷酸酶活性值.④3组细胞培养液中骨钙素含量.结果:①处理细胞并培养21 d后,实验组、对照组中脂肪细胞均比模型组显著为少.模型组中脂肪细胞数是实验组的8.9倍,是对照组的15.6倍[(319.17±19.92),(35.92±23.77)(20.42±12.15)个/cm2,P＜0.001].②处理细胞并培养21 d后,实验组和对照组中三酰甘油含量均明显低于模型组[(4.15±1.92)和(3.42±1.60),(11.55±4.42)μg/孔,P＜0.001].③处理细胞并培养12 d后,实验组和对照组细胞内碱性磷酸酶活性均明显高于模型组[(9.51±2.96),(11.18±3.11),(4.84±2.23)μkat/g,P＜0.001].④处理细胞并培养14 d后,实验组和对照组培养液中的骨钙素含量分别是模型组的2.2倍和2.7倍,与模型组间的差异均非常显著[(11.11±4.57),(13.43±5.29),(4.95±2.31)μg/g,P＜0.001].结论:葛根素能够抑制酒精诱导骨髓基质细胞分化为脂肪细胞,维持其成骨分化,可能预防骨坏死.
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60Coγ射线半身照射对小鼠非照射区域骨髓造血功能的影响
目的:观察局部电离辐射对小鼠非照射区域骨髓造血功能相关指标的影响.方法:实验于2003-10/2004-03在解放军第三军医大学辐照中心和全军复合伤研究所完成,选择雄性昆明小鼠180只,采用次序随机分组法分4组,即正常对照组、全身照射组、左半身照射组及全身屏蔽照射组,每组45只.正常对照组不作其他处理;全身照射组固定于照射架内;左半身照射组麻醉固定体位,用铅砖屏蔽右半身;全身屏蔽照射组麻醉固定,用铅砖屏蔽全身.应用8.0Gy 60Coγ射线照射,剂量率68.46 cGy/min.照射后不同时相检测各组小鼠血清超氧化物歧化酶活性及丙二醛、肿瘤坏死因子α含量变化,观察骨髓细胞凋亡情况和骨髓有核细胞数、粒细胞巨细胞集落形成单位等骨髓造血功能的变化.结果:全身照射组照射后第8天死亡2只,第9天死亡4只,其余各组无脱失.①非照射区域骨髓细胞有核细胞数照射后24 h和48 h显著低于正常对照组(P＜0.01),但显著高于半身照射组照射侧(左侧)(P＜0.01).②非照射区域骨髓细胞凋亡率照射后2 d和9 d均显著高于正常对照组(P＜0.01),但显著低于半身照射组照射侧(左侧)(P＜0.01).③非照射区域照射后24 h和48 h粒细胞巨细胞集落形成单位数均显著低于正常对照组(P＜0.01),但显著高于半身照射组照射侧(左侧)(P＜0.01).④照射后12 h和24 h左半身照射组小鼠血清肿瘤坏死因子α含量显著高于正常对照组(P＜0.01),但显著低于全身照射组(P＜0.01).⑤照射后2 d和9 d左半身照射组小鼠血清丙二醛含量显著高于正常对照组(P＜0.01),但显著低于全身照射组(P＜0.01);血清超氧化物歧化酶活性显著低于正常对照组(P＜0.01),但显著高于全身照射组(P＜0.01).结论:局部电离辐射作用后,可导致非照射区域骨髓造血功能损伤,肿瘤坏死因子α增加和氧自由基激活可能参与了该损伤过程.
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血管内皮生长因子基因转染促进骨髓间质干细胞增殖的实验
目的:以基因转染为平台,利用脂质体将血管内皮生长因子基因转入骨髓间质干细胞,使其可以在作为种子细胞的同时,作为基因治疗的载体将血管内皮生长因子基因导入缺血组织,从而为探索一种更加有效的缺血性心脏病治疗方法提供实验室基础.方法:实验于2004-07/2005-03在解放军第二军医大学医学遗传实验室及上海交通大学附属第一人民医院心内科实验室完成.①分离、培养、鉴定大鼠骨髓间质干细胞.②试验组用构建好的PcDNA3.1-VEGF进行基因转染,阳性对照组用PcDNA3.1空质粒进行转染,阴性对照组只加入培养液.③收集各组第1,3,5,7,9,11天的上清液,用ELISA法测定培养上清液中血管内皮生长因子的浓度;提取阳性克隆的细胞蛋白;进行Western blot分析;用四甲基偶氮唑盐法检测转染后血管内皮生长因子的表达对骨髓间质干细胞增殖的影响.结果:①免疫组织化学示所培养细胞CD106+,CD34-.②ELISA方法示质粒转染细胞后第2天,上清液中即可出现血管内皮生长因子浓度的增高,第5天时达到高峰,以后逐渐降低,10 d后趋于稳定,但其浓度仍高于对照组.③Western b1ot示转染组血管内皮生长因子蛋白浓度明显高于空质粒转染组和未转染组.④四甲基偶氮唑盐示转染后血管内皮生长因子的表达可以促进骨髓间质干细胞的增殖.结论:血管内皮生长因子成功转染骨髓间质干细胞,血管内皮生长因子的表达促进了骨髓间质干细胞的增殖,从而可以将促血管生长因子治疗和干细胞移植有效的结合起来.
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新生小鼠海马源性神经干细胞体外分离培养细胞群的增殖分化
目的:从新生小鼠脑海马部取材进行大量细胞克隆,对体外分离培养的神经干细胞进行鉴定,检测所分离细胞群的增殖分化特性.方法:实验于2005-07/10在解放军第三军医大学解剖学教研室实验完成.选用清洁级昆明种新生24 h内小鼠12只,利用神经干细胞条件培养基和单细胞克隆技术,从小鼠脑海马分离并体外培养神经干细胞.连续传代20代后,以免疫荧光细胞化学方法及免疫组织化学方法检测克隆细胞Nestin、BrdU、NeuN、NF-200、MOSP及胶质原纤维酸性蛋白的表达.结果:实验选用昆明种新生24 h内小鼠12只,全部进入结果分析.①神经干细胞的培养及分化:神经干细胞以神经球的方式悬浮生长,无明显突起,原代细胞接种后于第3天开始形成神经球.组成细胞球的细胞圆润饱满,活力状态好,绝大多数在1 d内贴壁,并从细胞球边缘伸出突起,加入含血清的培养基后克隆球48 h内即可见到明显的细胞分化,克隆球周围有细胞移出,7 d后原有的细胞球消失.②神经干细胞的鉴定结果:原代克隆及其亚克隆行Nestin免疫荧光染色,证实克隆内细胞均为Nestin抗原阳性;细胞经BrdU标记后,行BrdU免疫细胞化学染色,部分细胞呈阳性.③神经干细胞的分化鉴定:对诱导分化的细胞分别行NeuN、NF-200、MOSP及胶质原纤维酸性蛋白免疫细胞化学检测,表达均呈阳性.结论:成功分离并获得新生小鼠脑海马神经干细胞,该细胞可连续传代,具备多向分化潜能.
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半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂在大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导失巢凋亡过程中的作用
目的:利用预先铺被琼脂糖的方法抑制骨髓间充质干细胞贴壁,在体外模拟细胞离体后的悬浮状态,从而诱导细胞发生失巢凋亡,初步探讨半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂在骨髓间充质干细胞失巢凋亡过程中的作用.方法:实验于2005-04/2006-01在华中科技大学同济医学院医学实验技术公共平台细胞工程实验室以及华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成.取体质量约150 g的SPF级大鼠,雌雄不限,颈椎脱臼法处死.用DMEM培养液冲洗股骨和胫骨髓腔,应用全骨髓贴壁法进行原代培养.细胞铺满整个培养瓶底面80%时,进行传代接种培养,实验选用传第2代细胞.收集细胞随机分为3组:诱导凋亡组、抑制凋亡组、对照组.诱导凋亡组进行实验前,将无菌培养皿预先铺被已消毒的琼脂糖溶液,并待其凝固;抑制凋亡组除预处理培养皿外,在植入细胞的同时,加入半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂;对照组无任何干预措施.于试验开始后2,6,12,24h分别收集三组细胞,应用荧光比色法和蛋白质印迹法检测各样本半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性和表达水平的变化;借助流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞失巢凋亡率的改变,实验重复两次.结果:①在对照组和抑制凋亡组中,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的活性维持在较低的水平(P＞0.05),两组间差异无显著性;诱导凋亡组中,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的活性随着诱导持续时间的延长而明显增加,由2 h的9.22上升到24 h的22.74;诱导凋亡组与其他两组比较,差异具有显著性(P＜0.001).②对照组半胱天冬酶3蛋白的表达水平稳定;抑制凋亡组半胱天冬酶3蛋白的表达维持在低水平略有升高趋势,两组间无显著性差异.诱导凋亡组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白的表达水平逐渐升高,12 h达高峰;与其他两组比较,具有显著性差异(P＜0.01).③诱导凋亡组的细胞凋亡率随着诱导持续时间的延长而明显增加,与其他两组比较,具有显著性差异(P＜0.001);抑制凋亡组和正常贴壁组,细胞凋亡率维持在较低的水平且无明显差异.结论:半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂通过有效抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的活性和表达,可以明显降低细胞失巢凋亡率,起到保护骨髓间充质干细胞的作用.
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应用免疫磁珠负选法分离与纯化小鼠骨髓间充质干细胞
目的:拟建立体外分离纯化小鼠骨髓间充质干细胞的新方法,从而得到高纯度的骨髓间充质干细胞.方法:实验于2002-09/2005-03在解放军第二军医大学附属长海医院烧伤科实验室完成.①选取清洁级7 d龄FVB/N小鼠15只,利用免疫磁珠法(CD11b负选)从小鼠的骨髓细胞中分离纯化骨髓间充质干细胞:颈椎脱臼处死后无菌条件下取出小鼠双侧股骨,消毒离断后去除上清及脂肪层,吹打成单细胞悬液后接种于培养基中.贴壁细胞达到90%左右融合后,用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸进行消化,将悬浮的细胞与CD11b抗体避光反应2 min,移入已预置入磁场的LD管,不加压通过,收集管中的细胞成分,用培养基重悬并吹打成单细胞悬液后以1×109 L-1～2×109 L-1的密度接种于培养基中培养.②培养传代后流式细胞仪检测细胞周期、表面标记物,并利用诱导剂观察其定向诱导为脂肪细胞和成骨细胞的能力.结果:①细胞形态学观察:免疫磁珠法获得的细胞几乎无圆形细胞夹杂,贴壁率高,形态单一呈典型成纤维样、漩涡状生长,体外增殖迅速.②细胞生长曲线绘制情况:细胞贴壁后一两天为细胞生长缓滞期,之后进入对数增长期,六七天后进入平台期.③细胞周期分析结果:G0/G1期细胞约86%,S+G2+M期约14%.④细胞表面标记物检测结果:第3代骨髓间充质干细胞3%表达CD45,68.7%表达CD29,3%表达CD34,89.6%表达CD105.⑤骨髓间充质干细胞向脂肪细胞与成骨细胞定向分化情况:在地塞米松、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤、吲哚美辛等诱导剂作用下,脂肪细胞+成骨细胞诱导组细胞第5天开始油红O染色显示细胞核呈蓝色,细胞内脂滴呈橙色;在β-甘油磷酸钠、2-磷酸-抗坏血酸等诱导剂的作用下,第10天开始AKP染色显示细胞内有致密颗粒形成,Von Kossa染色显示钙盐沉积.结论:本实验通过免疫磁珠法(CD11b负选)成功地从FVB/N小鼠骨髓细胞中分离纯化出骨髓间充质干细胞.根据表面标记物的检测结果提示该法获得的细胞纯度高、周期性慢、多分化潜能,符合干细胞特性.
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眼底图像对比度的调整
背景:眼底图像处理是眼底血管图像定量分析的必要前提,在实际操作过程中受仪器、噪声电流等因素的限制,图像的效果常常不甚理想,提高图像对比度是很必要的.目的:寻找一种较理想的调整图像对比度的方法.设计:对比分析.单位:解放军第三军医大学附属大坪医院设备科、阜阳肿瘤医院.方法:介绍调整图像对比度的两种方法,并选用幂函数曲线法,同时配合红色增强的分色处理,对其中的可控参数也进行分析.结果:用幂函数曲线法处理后的图像中间灰度值附近对比度变化的力度要大一些,灰度值在0处附近也没有全强行置0,也即没有失真现象.而对于分色处理,在红色增强的同时,也使颜色较浅的部分出现了淡淡的青蓝色,这是因为红色分量减少而是蓝绿分量突出的结果(对以上的结果分析都把平移参数假定为零).结论:用幂函数曲线法来提高眼底图像对比度的效果是比较好的.
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多层螺旋CT在建立上颌骨三维有限元模型中的应用
目的:为了能够提高牙颌组织有限元分析研究的水平,拟探讨利用多层螺旋CT获取上颌骨扫描数据,进而快速地建立高精度的上颌骨三维有限元模型的方法.方法:2004-07采用西安市中心医院多层螺旋CT对1名上下颌牙列缺失经全口义齿修复已1年,上颌牙槽嵴宽大丰满的男性进行头面部扫描,利用专业造型软件完成三维实体模型的重建,并在此基础上建立完整无牙颌上颌骨及颅骨的三维有限元模型.结果:获取了精确的头面部多排螺旋CT扫描断层影像数据,利用所得数据建立了63 360个节点、38 879个单元的无牙颌上颌骨计算机模拟全口义齿修复三维有限元模型,完整重现了上颌骨复杂的形态,得到了上颌骨、颧骨、颅骨以及上颌窦、眶腔等结构鲜明、直观的印象.结论:利用多层螺旋CT扫描数据建立上颌骨三维有限元模型,无需描记轮廓线、插层等人工操作,能够尽可能地排除人为的干扰,既缩短了建模时间,又提高了所建立模型的精度.
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利用交互式数据语言处理医学数字图像的初步研究
目的:交互式数据语言IDL不仅提供了与C/C++和FORTRAN等语言同样的编程能力,而且具备交互性、图形显示和面向矩阵的运算等性能.故探讨基于IDL的医学数字图像处理技术,以期推动其在国内医学影像学科的应用.方法:在PC机上应用IDL6.1编程,程序在Windows XP平台上运行.①读取和显示DICOM格式的医学图像.②对MRI,CT和数字乳腺钼靶图像进行图像平滑、边缘增强、直方图均衡和局部放大镜功能等处理.③与非交互式程序设计语言在编程效率方面进行比较,以表现IDL面向矩阵、集成多种图像和图形命令以及编程简易的优点.结果:利用IDL的交互特性,使用若干条命令以及调用IDI内建的图像处理程序包或函数,便可轻松地完成一般的医学图像处理工作,而这是C/C++或FORTRAN语言所难以做到的.结论:IDL是每个会使用计算机的人都能容易理解的一种计算机语言,具有对海量数据进行获取、分析、可视化以及对多种图像进行处理和交互式操作的功能,非常适合用来进行二维或三维医学数字图像处理.IDL在医学影像学领域的推广应用,必将促进医学图像处理与分析水平的进一步提高.
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正常人与骨质疏松患者胸腰椎三维有限元模型的建立及分析
目的:基于CT医学图像,建立骨质疏松患者的T11～L3的三维有限元模型,对其生物力学特性进行分析.方法:实验于2003-09/2004-02在上海大学生物力学研究所完成.选取骨质疏松症患者1例,女,65岁,骨密度值与正常人相比,T值=-2.68＜-2.5.CT扫描证实无脊柱畸形或破坏.应用CT扫描技术、图形数字化方法获取胸腰段的三维坐标,利用ANSYS 5.0有限元分析软件等工具建立骨质疏松患者胸腰段的三维有限元模型.结果:①L1椎体在轴向载存800 N作用下的应力场分布表明,正常椎体皮质骨、松质骨、终板、纤维环、后部结构的平均应力值高于骨质疏松椎体(分别为1.786,1.542 MPa;0.742,0.601 MPa;0.839,0.608 MPa;0.862,0.554 MPa;0.424,0.308 MPa).②从椎体的剖面上观察,外面皮质骨应力较大,里面松质骨应力较小.椎体骨密质的应力集中在近椎弓根附近,松质骨的应力集中在与终板临近的中央部分,后部结构的应力分布不均匀,应力集中在椎弓根、峡部和小关节部分,而横突和棘的应力水平很低.胸腰椎的应力分布规律和人体正常椎体相似.骨质疏松椎体的应力分布规律与正常椎体应力分布相似,相同承载,不过应力比较低,负载规律相一致.两者的应力分布相似,就是数值不同而已.结论:应用三维有限元法分析骨质疏松椎体的力学特性是切实可行的并能获得独特的信息,结果可信.
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静态三维钉板系统与滑动鹅头钉固定不稳定股骨颈骨折的生物力学比较
目的:对静态三维钉板系统进行生物力学比较,评价静态三维钉板系统的力学性能.方法:于2004-01/02在国防科技大学航空与航天材料学院进行力学实验.将11付成人股骨标本(苏州医学院解剖教研室提供)随机数字法分为两大组.骨折模型组(8付)和完整骨组(3付).骨折模型组制备伴后部粉碎、Pauwels角70°的股骨颈大角度剪切骨折模型,再随机分为抗扭实验组(4付)和抗压实验组(4付),双侧分别以静态三维钉板系统或滑动鹅头钉固定,进行抗扭和抗压实验;完整骨组以同前固定后再取出,行破坏性抗压实验.抗扭实验的扭转轴与股骨干成25°,抗压实验的压力轴与股骨干成15°.观察①扭转实验中扭转相同角度时所需的扭矩,股骨颈前部骨折线张开相同程度时所需的扭距.②抗压实验中相同股骨头下沉位移时所需的载荷,相同载荷时股骨颈上部骨折线的张开位移,抗压极限载荷.③愈合模型抗压实验中抗压极限载荷.结果:①抗扭实验结果:在扭转30°以内时,扭矩随扭转角度的增大而增大,并且股骨颈前部骨折线出现分离.扭转相同角度所需的扭矩和股骨颈前部骨折线张开相同程度时所需的扭矩,静态三维钉板系统组均大于滑动鹅头钉组(均P＜0.05).②抗压实验结果:比较股骨头下沉相同位移时所需的载荷、极限载荷以及相同载荷时的股骨预上部骨折线的张开位移,静态三维钉板系统组与滑动鹅头钉组之间无统计学差异(P＞0.05).③愈合模型抗压实验结果:静态三维钉板系统组的抗压极限载荷大于滑动鹅头钉组[静态三维钉板系统组为(6 001±2 660)N,滑动鹅头钉组为(2 926±1 443)N,P＜0.05].结论:①对股骨颈骨折模型的固定,静态三维钉板系统的抗扭力优于滑动鹅头钉,轴向抗压力接近滑动鹅头钉.内固定拆除后骨强度的保留能力,静态三维钉板系统优于滑动鹅头钉.②静态三维钉板系统是一种具有较好生物力学性能的股骨颈骨折内固定器械.
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基于Visual C++和Matlab的磁共振影像增强后处理系统
目的:随着医学影像学的飞速发展,手术导航技术的应用及脑功能等图像分析研究的不断深入,基于医学数字成像和通信标准的医学影像分析与处理也随之成为医学图像处理领域中的热点.为便于科研人员研究相应的磁共振图像局部增强等后处理算法及进行图像分析,提出一种基于Visual C++和Matlab的磁共振影像增强后处理研发平台.方法:对北京协和医院放射科2005-01/10获取的部分磁共振医学数字成像和通信图像利用灰度扩展进行全局增强,利用基于数学形态学方法进行局部增强算法的研究.在程序实现上使用Matlab引擎实现VC++和Matlab混合编程处理医学数字成像和通信图像.结果:为磁共振图像进行增强局部对比度算法研究提供了一个研发平台,实现了位图图像与医学数字成像和通信图像的数据转换接口功能.结论:处理后的图像具有更好的应用价值,为图像局部对比度增强算法的研究提供一个有效的平台.在算法研制阶段采用VC和Matlab混合编程的方法可以提高算法研究效率.
