补肾活血方对去卵巢胶原诱导性关节炎大鼠垂体雌激素受体amRNA表达的影响

背景:药理学研究显示,补肾活血方中的补肾中药如熟地、葛根等含有黄酮类物质,具有植物雌激素的作用特点,其中异黄酮具有雌激素受体调控剂的作用.目的:观察自拟补肾活血方对胶原诱导性关节炎大鼠血清雌二醇水平及垂体雌激素受体αmRNA表达的影响.设计、时间及地点:随机分组设计、对照动物实验,于2006-05/2008-05在白求恩国际和平医院中心实验室完成.材料:健康Wistar雌性大鼠60只,随机分为2组:假手术组(n=10)和手术组(n=50).手术组在卵巢切除术后2周复制胶原诱导性关节炎模型,选取关节炎指数≥5的大鼠再随机分为4组,每组10只:模型组、补肾活血方、甲氨蝶呤组和补肾活血方+甲氨蝶呤组.补肾活血方所用中药骨碎补、红花、熟地、仙灵脾、丹参、葛根等购自石家庄乐仁堂药店.常规煎煮,离心去杂,浓缩为1.3 kg/L的水煎液,密封分装,4℃冷藏备用.方法:假手术组和模型组灌胃给予生理盐水,2 mL/d;补肾活血组:补肾活血方煎液2 mL/d灌胃;甲氨蝶呤组按2.6 mg/kg剂量灌胃1次/周,体积为2 mL,其余时间生理盐水灌胃2 mL/d;补肾活血方+甲氨蝶呤组按甲氨蝶呤2.6 mg/kg剂量灌胃1次/周,体积为2 mL,另外补肾活血方煎液2 mL/d;各组均持续6周.主要观察指标:腹主动脉采血用磁分离酶联免疫法检测血清雌二醇水平,同时取大鼠垂体采用反转录一聚合酶链反应检测大鼠垂体雌激素受体αmRNA的表达.结果:与模型组比较,甲氨蝶呤组雌激素受体α mRNA表达增加,但差异无显著性意义;补肾活血方+甲氨蝶呤组表达明显增加(P<0.01);补肾活血方表达量高于甲氨蝶呤组,低于补肾活血方+甲氨蝶呤组(P<0.05);补肾活血方、补肾活血方+甲氨蝶呤组与假手术组差异无显著性意义.与假手术组比较,模型组雌二醇水平明显降低.与模型组比较,3个治疗组雌二醇水平均有不同程度的提高,其中甲氨蝶呤组偏低,与模型组差异无显著性意义(P>0.05),补肾活血方+甲氨蝶呤组提高明显,接近正常水平(P<0.01).雌二醇与垂体雌激素受体αmRNA呈显著正相关(r=0.483,P<0.05).结论:自拟补肾活血方具有拟雌激素样作用,可提高雌二醇水平,上调垂体雌激素受体α mRNA表达.

组织块法培养成体人牙髓细胞的增殖及分化状态水

背景:人牙髓组织较少,对酶解消化的耐受性较差,经胰蛋白酶和胶原酶分步消化处理后,细胞贴壁数量少,生长缓慢,难以成功传代,组织块酶解法获得的牙髓细胞种类少,活性差.目的:探索组织块培养法在人牙髓细胞体外培养中的应用.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2005/2007年在吉林大学和平校区及口腔医学院进行.材料:健康人正畸或阻生拔除的牙齿.方法:选取第三磨牙,取出牙髓,在少量DMEM培养液浸润下,将牙髓组织剪碎至1.0 mm×1.0 mm×0.5 mm组织块,将牙髓组织块移入含培养液的6孔板中.调整组织块密度至3～6块每孔,间距0.5cm均匀摆置.将6孔板倒置放入37℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度条件的培养箱中,3h后翻转培养板,保持组织块贴壁生长,加培养液至2 mL后继续培养.4～6 d换液1次.细胞6～15 d从组织块边缘游出,在组织块周围形成生长晕.细胞渐进汇合时,以用0.25%的胰蛋白酶、0.02%EDTA的混合液消化2.0～3.0 min,按1:(2～3)的比例传代培养至25 mL培养瓶.原代培养细胞通过反复消化传代的方式逐渐获得纯化的成纤维样细胞.主要观察指标:采用免疫组织化学方法鉴定细胞形态,碱性磷酸酶值测定牙髓细胞分泌.MTT法绘制牙髓组织细胞生长曲线.结果:相差显微镜下,获得的牙髓细胞主要是典型成纤维细胞,形态多呈星形、长梭形,胞体丰满,胞浆均匀,核圆形或卵圆,核仁清晰.免疫组织化学检测显示,细胞表面波丝蛋白阳性、角蛋白阴性,碱性磷酸酶阳性.在接种于96孔平底培养板1 d后,细胞数量有所下降,但在接种2 d后数量又有所增加.此时细胞增加不很明显.4 d开始进入对数生长期,细胞增加显著,8 d进入平台期,9 d开始减少,整个细胞曲线呈"S"形.结论:采用组织块培养法从成体人牙髓组织中可以分离培养出细胞,在体外能有效增殖并保持低分化状态.

家兔血清蛋白质组双向凝胶电泳技术的建立

背景:家兔血清是基础研究中常用的实验样品,双向凝胶电泳是蛋白质组学中经典的蛋白分离技术,因此建立稳定的家兔血清蛋白质组双向凝胶电泳技术体系非常重要.目的:建立家兔血清蛋白分离的双向凝胶电泳技术体系.设计、时间及地点:单一样本观察,实验于2008-06/07在武警医学院天津市职业与环境危害生物标志物重点实验室完成.材料:健康家兔6只,由唐山市职业技术学院动物中心提供.方法:去除高丰度蛋白前后的健康家兔血清样品,分别加入水化上样液使样品中的蛋白充分裂解,还原烷基化后上样,被动水化14 h.等电聚焦电泳后进行SDS-PAGE电泳.凝胶银染后用PDQuest7.4软件进行分析.主要观察指标:①高丰度蛋白去除效率.②2-DE图谱.结果:双向电泳图谱清晰,分辨率高,重复性好.未去除高丰度蛋白的血清2-DE图效果优于去除高丰度蛋白后的血清2-DE图.结论:成功建立家兔血清蛋白质双向凝胶电泳技术,将为进一步开展疾病的血清蛋白质组学研究奠定基础.

大强度离心运动大鼠不同时相骨骼肌结构及血白细胞介素6、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶的变化

背景:运动预处理可在一定程度上减轻运动性骨骼肌微损伤,从而避免延迟性肌肉酸痛的发生.目前应用白细胞介素6和CK-MM评定骨骼肌微细损伤还较缺少实验性研究.目的:观察运动预处理对大鼠大强度离心运动后不同时相骨骼肌结构损伤及血液白细胞介素6、肌酸激酶和CK-MM变化的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,2006/2007在成都体育学院动物实验室完成.材料:成年健康雌性SD大鼠80只,体质量(231.3±12.44)g.每组义随机分别分为运动前和运动后即刻、运动后24,48,72 h 5个亚组,每组8只.方法:无预处理组:除对运动前组外其他大鼠进行一次速度19～21 m/min,坡度为-16°的90 min的跑台运动.运动预处理组:进行2周离心跑台训练,2周后,除运动前组外,其他大鼠进行一次性跑台运动,运动方式同无预处理组.主要观察指标:一次性离心运动后即刻、24,48和72 h观察比目鱼肌结构及血液白细胞介素6、肌酸激酶、CK-MM的变化.结果:运动后两组大鼠比目鱼肌均出现损伤性改变,尤以无预处理组更为明显,且以运动后24～48 h较为严重.无预处理组运动后即刻血浆白细胞介素6显著增高,随后逐渐下降,72 h再次显著增高.运动预处理组运动后即刻略降低,随后逐渐升高,于48 h达峰值.运动后运动预处理组血浆白细胞介素6水平低于无预处理组.运动前运动预处理组肌酸激酶和CK-MM均低于无预处理组.运动后无预处理组、运动预处理组两组肌酸激酶和CK-MM先升后降,除运动后72 h外.运动预处理组CK和CK-MM水平及变化幅度低于无预处理组.结论:运动预处理有助于减轻离心运动导致的骨骼肌超微结构损伤及运动应激所引起的相关血液指标变化.肌酸激酶和CK-MM活性水平的个体差异较大,更适用于个体自身的纵向比较.

颈动脉内膜切除后基质金属蛋白酶9动态表达对早期血管再狭窄形成的意义

背景:颈动脉内膜切除后发生血管再狭窄是影响治疗效果的重要因素.目的:观察颈动脉内膜切除后基因基质金属蛋白酶9 mRNA动态表达在早期血管再狭窄发生中的意义.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,实验于2006-02/2007-12在解放军北京军区总医院完成.材料:健康雄性新西兰兔41只,体质量3.0 kg左右,其中36只用于制备颈动脉粥样硬化性狭窄模型.方法:将41只新西兰兔分为2组,对照组(n=5):不做任何干预.实验组(仃=36):于造模后4 h,1,3,7,30,90 d 6个时间点各取6只,以40 g/L多聚甲醛灌注固定取材,行常规病_理切片苏木精一伊红染色观察形态变化.主要观察指标:采用实时定量一聚合酶链反应技术观察术前即刻、术后1,3,7 d颈动脉内膜切除后基因基质金属蛋白酶9mRNA在早期血管再狭窄过程巾的表达变化.结果:颈动脉内膜切除后内膜修复过程大体上可以分为血栓形成阶段,炎症反应阶段,内皮修复阶段,血管平滑肌增殖阶段,基质形成、堆积阶段.基质金属蛋白酶9mRNA水平在术后1 d开始表达,术后3d达峰值,术后7d显著回落.结论:基质金属蛋白酶9对早期血管平滑肌细胞的增殖、迁移,介导的局部血管重建和再塑,对血管再狭窄的形成有重要作用.

成肌调节因子Myf-5在失神经骨骼肌萎缩不同时段的表达

背景:成肌调节因子Myf-5是参与肌肉发生过程分子调控、启动和维持骨骼肌细胞生长发育的重要基因,可能与失神经骨骼肌萎缩的发生有关.目的:观察不同部位、不同时段骨骼肌失神经支配后成肌调节因子Myf-5基因的表达情况.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-03104在山西医科大学完成.材料:选择健康8周龄雄性SD大鼠24只,随机分成4组,即假手术组(有神经支配)、去神经2 d组、去神经7 d组、去神经28 d组,每组6只.方法:假手术组不切断坐骨神经,仅做假手术.去神经组右下肢后部中段切断坐骨神经1 cm以上,分别于去神经第2,7,28天用脊椎脱臼法处死大鼠,分离出右小腿的胫骨前肌、比目鱼肌、腓肠肌、跖肌标本.主要观察指标:用反转录-聚合酶链反应技术检测各组肌肉Myf5 mRNA表达情况,抗Myf-5多克隆抗体免疫组织化学染色(ABC法),测量灰度值.结果:去神经骨骼肌早期,Myf-5的mRNA在去神经支配后第2,7,28天均表达上调(P<0.05).Myf-5抗体阳性染色细胞核数在SD大鼠骨骼肌失神经28 d时的肌卫星细胞中多.结论:Myf-5在大鼠失神经骨骼肌萎缩早期不同肌肉表达均为上调.大鼠骨骼肌失神经支配后早期肌卫星细胞中Myf-5表达上调.

模拟人后路髓核摘除构建椎间盘退行性变动物模型

背景:髓核摘除术是治疗椎间盘突出的经典方法,但存在较高的复发率.目的:验证模拟人后路髓核摘除进行后外侧穿刺抽吸髓核,建立椎间盘退行性变动物模型的可行性.设计、时间及地点:观察对照实验,于2006-10/2007-02在解放军南京军区福州总医院动物实验室完成.材料:选用日本大耳白兔20只,行椎间盘退行性变动物模型制备.方法:用持针器夹持21G穿刺针,行L<,1-2>及L<,3-4>椎间盘右后外侧穿刺髓核抽吸法摘除部分髓核组织,术后2,4,8,12周分别对造模后椎闻盘行组织学观察,并将L<,2-3>椎间盘作为对照.主要观察指标:通过苏木精-伊红染色观察椎间盘组织学结构.结果:苏木精-伊红染色可见对照椎间盘大多髓核完整,髓核与纤维环分界清晰,纤维环结构接近正常,髓核组织中有大量髓核细胞.造模后第4周髓核细胞数量不断减少,第12周时髓核中主要为纤维组织,伴有极少量髓核细胞.结论:模拟人后路髓核摘除术建立后外侧纤维环穿刺髓核抽吸的椎间盘退行性变动物模型成功建立.可为应用组织工程修复重建退行性变椎间盘提供有效的动物模型.

人脂联素基因的克隆构建及其序列分析

背景:脂联素已经成为缺血性疾病基因治疗的新靶点,而成功进行脂联素基因治疗的关键是脂联素基因的克隆.基因克隆主要有定向克隆法和T-A克隆法,定向克隆法操作较复杂;而T-A克隆法操作简便,成功率高.目的:应用T-A克隆法克隆人脂联素基因编码区,对其进行测序验证,并与GenBank比对.设计、时间及地点:基因水平的验证实验,于2006-061/2008-12在福建医科大学附属第一医院高血压研究所及福建中医学院中西医结合研究院完成.材料:脂肪组织取自福建医科大学第一附属医院外科患者术中切除的大网膜脂肪垫,液氮中冻存.Trizol为Invitrogen公司产品:M-MLV,Gel Extract Kit为PROMEGA公司产品;Taq酶为TIANGEN公司产品;限制性内切酶BamH Ⅰ,Sal Ⅰ,pMD18-T载体为TAKARA公司产品.方法:从人大网膜脂肪组织提取总RNA,经反转录-聚合酶链反应扩增出人脂联素编码区基因,再将人脂联素基因编码区克隆入载体pMD18-T中,通过限制性内切酶酶切鉴定后,对其进行测序验证,并与GenBank比对.主要观察指标:人脂联素克隆质粒酶切鉴定结果,人脂联素基因克隆序列与GenBank比对结果.结果:扩增得到人脂联素基因编码区,获得人脂联素的正向和反向克隆,与GenBank中人脂联素基因编码区序列比对均为完全一致.结论:成功地克隆出人脂联素基因编码区.

携带cdc2-siRNA重组腺相关病毒的包装

背景:细胞分裂周期2(cell division cycle 2,cdc2)在神经变性疾病如阿尔茨海默病的神经元变性过程中扮演了重要角色.以腺相关病毒为载体对cdc2基因进行沉默,可能对神经变性疾病的神经元起保护作用.目的:包装携带cdc2-siRNA的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV).设计、时间及地点:空白对照实验,于2007-10/2008-08在武汉同济医院神经科实验室完成.材料:Helper Free腺相关病毒系统(pAAV-MCS-EGFP、p-RC、p-Helper)及AAV-293细胞为Stratagene公司产品.方法:应用分子生物学方法构建生成pAAV-MCS-U6-cdc2-slRNA-EGFP表达质粒;用磷酸钙法将该质粒和p-RC、p-Helper质粒共转染AAV-293细胞,包装生成携带cdc2-siRNA的重组腺相关病毒(rAAV-U6-cdc2-siRNA-EGFP).病毒感染AAV-293细胞后行Western Blot检测cdc2-siRNA对细胞内cdc2基因的沉默效果,并用斑点杂交方法测定该病毒的滴度.主要观察指标:pAAV-MCS-U6-cdc2-siRNA-EGFP质粒中插入片段U6-cdc2-siRNA的测序;3质粒pAAV-MCS-U6-cdc2-siRNA-EGFP、p-RC、p-Helper共转染AAV-293细胞; rAAV-U6-cdc2-siRNA-EGFP感染AAV-293细胞后cdc2的表达.结果:①DNA测序证明U6-cdc2-siRNA已成功构建到表达质粒pAAV-MCS-EGFP中.②AAV-293细胞表达绿色荧光蛋白,共转染成功.③包装得到的重组腺相关病毒(rAAV-U6-cdC2-siRNA-EGFP)感染AAV-293细胞后能显著下调AAV-293细胞cdc2基因的表达量.④rAAV-U6-cdc2-siRNA-EGFP的滴度为1×1012v.g/mL.结论:携带cdc2-siRNA重组腺相关病毒的包装获得成功.它具有沉默cdc2基因表达的功能.

AMPKα2基因克隆及其野生型和突变型真核表达载体的构建

背景:实验表明,通过激活单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-Activated Protein Kinase, AMPK)α2可以增加胰岛素的敏感性和骨骼肌葡萄糖的摄取,其有望成为预防和治疗2型糖尿病的新的生理和药理作用靶点.目的:克隆人的AMPKα2基因,并构建其野生型和突变型真核表达载体.设计:单一样本观察.时间及地点:实验于2007-04/2008-01在中山大学附属第二医院临床分子生物实验室完成.材料:QuikChange Ⅱ Site-Directed Mutagenesis Kit为Stratagene公司产品.真核表达载体pcDNA3.1(+),大肠杆菌DH5α为实验室保存.人骨胳肌组织来源于中山大学附属第二医院手术截肢患者,获患者知情同意,新鲜取材后液氮冷冻.方法:采用反转录一聚合酶链反应技术从人骨骼肌扩增AMPKα2基因,并将其克隆到T载体,通过测序对其进行鉴定.采用Quickchange定点诱变试剂盒对AMPKα2基因进行体外定点诱变,并将其野生和突变的编码基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,通过酶切和测序进行鉴定.主要观察指标:①目的基因的克隆.②定点诱变.③真核表达质粒的构建.结果:成功克隆了AMPKα2基因,大小约1 700 bp,与已发表的AMPKα2同源性为99%,GenBank录入号EF056019.成功将AMPKα2第45位Lysine(AAA)突变为Arginine(AGA),成功构建了野生型和突变型pcDNA-AMPK α2重组质粒.结论:实验成功克隆了AMPKα2基因,构建了其野生型和突变型真核表达载体.

增生性瘢痕与瘢痕疙瘩DNA拷贝数变化的差异分析

背景:近年来临床遗传学和分子生物学研究均表明,瘢痕疙瘩的形成与遗传具有密切的关系.但增生性瘢痕与遗传是否有关,目前尚未明确.目的:了解增生性瘢痕与瘢痕疙瘩在遗传学改变上的异同.设计、时间及地点;对比观察,实验于2007-03/2008-12在广东医学院完成.材料:瘢痕标本均来自2003-01/2008-12广东医学院附属医院整形外科门诊及住院患者16例,其中增生性瘢痕10例,男3例,女7例,年龄20～50岁;瘢痕疙瘩6例,男1例,女5例,年龄19～46岁.方法:提取瘢痕疙瘩及增生性瘢痕组织DNA,应用比较基因组杂交技术观察增生性瘢痕及瘢痕疙瘩基因组的不平衡即遗传物质的丢失或扩增情况,比较两者间DNA拷贝数变化的差异.主要观察指标:①两组DNA拷贝数的缺失率的比较.②两组DNA拷贝数的扩增率的比较.结果:增生性瘢痕组未发现特异区域的DNA拷贝数的高频率缺失或扩增;瘢痕疙瘩组出现高频率的DNA拷贝数缺失的染色体是1,16,20号及22号染色体,未发现特异区域的DNA拷贝数的高频率扩增.两组1,16,20,22染色体DNA拷贝数的缺失率相比较,瘢痕疙瘩组明显高于增生性瘢痕组(P<0.05).结论:与瘢痕疙瘩相比,增生性瘢痕不存在明显的DNA拷贝数缺失或扩增,增生性瘢痕的形成与发展可能与遗传没有直接的关系.

维生素D受体基因多个位点多态性与绝经后妇女骨密度及骨转换生化标志物的关系

目的:观察维生素D受体基因BSM Ⅰ,TAQ Ⅰ,APA Ⅰ多态性与绝经后妇女骨密度及骨转换生化标志物的相关性.方法:①2007-01/2008-12从福州常住汉族人中随机检测绝经后妇女576例,年龄48～84(62.17±6.37)岁.受试者均知情同意.②记录年龄、绝经年限、体质量指数和绝经后骨折情况.③双能X射线骨密度仪检测正位第2～4腰椎、左侧股骨颈、大转子和Ward's三角区骨密度.④PCR-RFLP技术检测维生素D受体基因BSM Ⅰ,TAQ Ⅰ,APA Ⅰ多态性.⑤用酶联免疫吸附法检测骨转换生化标志物(血清骨钙素、血清骨碱性磷酸酶、尿吡啶啉和尿脱氧吡啶啉).结果:561例合格受试者进入结果分析.①维生素D受体基因BSM Ⅰ,TAQ Ⅰ,APA Ⅰ多态性各基因型间骨密度比较差异无显著性意义(P>0.05).②维生素D受体基因BSM Ⅰ,TAQ Ⅰ,APA Ⅰ多态性各基因型间骨转换生化标志物比较差异无显著性意义(P>0.05).⑧维生素D受体基因BSM Ⅰ,TAQ Ⅰ,APA Ⅰ多态性各基因型间骨质疏松症发生率比较差异无显著性意义(P>0.05).④维生素D受体基因BSM Ⅰ,TAQ Ⅰ,APA Ⅰ多态性各基因型间绝经后骨折发生率比较差异无显著性意义(P>0.05).结论:维生素D受体基因BSM Ⅰ,TAQ Ⅰ,APA Ⅰ多态性与绝经后骨质疏松症无明显关联,不能作为福州地区绝经后妇女骨质疏松的遗传标志.

自制32P敷贴器治疗瘢痕疙瘩

目的:观察自制32P敷贴器局部敷贴治疗不同类型瘢痕疙瘩的临床疗效.方法:105例瘢痕疙瘩患者中,39例病变厚度≤0.3 cm的行单纯敷贴治疗,病变厚度>0.3 cm的66例随机分为2组,单纯敷贴组36例,手术+敷贴组30例.单纯敷贴根据病变表面积大小及形状剪取敷贴片,根据剂量率和衰变校正计算每天敷贴时间,直接贴于病变表面,每天4.0～5.0 Gy/(部位·次),连续4 d为一疗程,每疗程间隔4周,总治疗4～6个疗程.幼儿单次剂量控制在每天4 Gy/(部位·次)以下.手术+敷贴组患者手术切除瘢痕疙瘩,待手术伤口无渗出后根据伤口形状剪取敷贴片对准伤口敷贴,剂量及疗程同单纯敷贴组.结果:单纯敷贴治疗对病变厚度≤0.3 cm的39例瘢痕疙瘩治愈32例(82%),总有效率98%;对病变厚度>0.3 cm的瘢痕疙瘩单纯敷贴和手术+敷贴两组治疗总有效率分别为56%和93%,两组差异有显著性意义(P<0.01),其中病程<9个月的患者治疗有效率分别为25%和75%,病程较长患者治疗有效率分别为13%和77%.治疗过程中有26例在敷帖过程中出现局部皮肤烧灼和刺痛感,均以炉甘石洗剂局部外用处理后缓解;5例出现Ⅰ度放射性皮炎,2例出现Ⅱ度放射性皮炎,以百多邦软膏局部外用后缓解,无出现Ⅲ度以上放射性皮炎病例.治愈患者局部皮肤均有不同程度的色素沉着或皮肤颜色改变.结论:32P敷贴治疗瘢痕疙瘩治疗安全有效,对病程较短或病变厚度小于0.3 cm的患者可单纯敷贴治疗,病程较长或病变厚度大于0.3 cm患者建议先手术后再敷贴治疗.

踝关节运动损伤的成因及快速康复方法探析

踝关节是人体重要的负重关节,踝关节的稳定性对保持其负重和运动功能具有重要的意义.踝关节损伤是体育运动中中为常见的运动损伤,占全身关节韧带损伤的第1位.损伤后如处理不当,易致创伤性关节炎等并发症.文章试图从现代运动医学的观点出发,对体育运动中所发生的踝关节损伤的机制进行全面科学的剖析,同时就如何有效地进行伤后功能的恢复做出了详细的论述.

强直性脊柱炎患者股骨密度与腰椎椎体骨折的相关性

目的:之前的观点认为强直性脊柱炎患者易发生椎体骨折是由于其继发性弥漫性的骨质疏松,而近年对强直性脊柱炎患者的骨矿物密度和椎体骨折的研究发现,两者之间并无相关性.文章旨在调查强直性脊柱炎患者腰椎椎体骨折与临床、实验室及影像学指标的相关性.方法:对65例强直性脊柱炎患者及62例健康体检者进行对比观察,每例受试者均拍摄腰椎平片判断有无椎体骨折,评估疾病活动性包括C-反应蛋白、血沉水平、指地距、Schober指数、Bath指数以及韧带骨赘评分,应用双能X射线吸收法测定腰椎及股骨骨密度.结果:65例强直性脊柱炎中有10例出现腰椎椎体骨折,占15.4%,其中楔形变4例,双凹畸形6例.强直性脊柱炎患者的腰椎和股骨骨密度均明显低于对照组(P<0.01).有椎体骨折和无椎体骨折的强直性脊柱炎患者相比,其Schober指数、指地距、Bath指数、韧带骨赘评分以及转子间骨密度差异均有显著性意义(P<0.01).多元Logistic回归分析发现,强直性脊柱炎患者转子间骨密度与腰椎椎体骨折的发生有独立相关性(P=0.041).结论:强直性脊柱炎的股骨尤其是转子问低骨密度值与腰椎椎体骨折发生的危险性具有相关性.

有氧运动对人全基因组表达的影响

目的:观察有氧运动对骨骼肌全基因组表达的影响.方法:选择6名某部队干休所中很少运动、年龄(66±9)岁的健康老年人集进行为期12周太极拳训练.运动前和运动12周后,所有受试都进行了体质评估.测试指标包括身高、体质量、肺活量、台阶指数、大摄氧量.在训练前后分别对实验对象进行肌活验,提取总RNA,经处理后与Affymetdx U133A基因芯片进行杂交,分析数据.结果:有氧运动可明显改善老年人心肺功能,同时有一定降低体脂(减肥)功效.有氧运动使老年人骨骼肌全基因组表达发生明显改变,筛选出725条表达有差异的基因.本文对表达差异显著的20条差异表达基因进行研究(3条基因表达上调,17条基因表达下调).根据基因功能分类对比,差异表达基因分别归属8种细胞组分和生物过程,经KEGG搜索找到4条基因的代谢途径.结论:有氧运动可使三羧酸循环相关酶基因表达上调,肌肉蛋白合成相关基因和神经鞘脂类相关基因表达下调,提示有氧运动有助于保护神经细胞的完整性,对抗衰老有积极作用,同时可加速体内脂类物质有氧代谢.

第2代亚健康调查表的项目分析与筛选

目的:结合多种项目分析方法对第2代亚健康调查表各个条目进行分析与筛选,为进一步研制亚健康量表奠定基础.方法:调查分析于2006-12/2008-05在南方医科大学完成.按整群抽样法抽取广州市某医科大学在读大学生共6 000名.采用现场问卷调查的方式,内容包括躯体症状、心理症状和社会症状和生存质量的总评.发出问卷6 000份,收同有效问卷5 599份.采用离散程度法、相关系数法、因子分析法、区分度分析法及克朗巴赫α系数法等5种方法对83个条目进行分析.结果:汇总5种方法的提名,将每一个条目选出被提名次数达4次以上者作为终结果,共有63个条目终被入选.结论:筛选出的63个条目均具备有较好的敏感性、代表性、独立性、重要性及内部一致性,为下一步研制亚健康量表提供基础.

解放军第二军医大学附属长海医院骨科李明教授

肝细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗免股骨头坏死

背景:课题利用实验室自主研制、已获国家SFDA批准临床试验的重组肝细胞生长因子腺病毒感染骨髓间充质干细胞,结合肝细胞生长因子的促血管新生和抗细胞凋亡以及间充质干细胞的成骨功能,通过细胞治疗的手段进行骨损伤修复.目的:探讨肝细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞移植对兔股骨头坏死骨缺损的治疗效果.设计、时间及地点:细胞-材料学体内实验,于2007-09/12在北京放射与辐射医学研究所和解放军66400部队骨病专科医院完成.材料:清洁级26～28周龄新西兰大白兔18只,由北京开源兔业养殖场提供.骨基质明胶为上海骁博科技发展有限公司产品.方法:采用贴壁法分离培养兔自体骨髓间充质干细胞,体外鉴定成骨和成脂肪能力.18只兔均建立双侧股骨头坏死骨缺损模型,随机分为3组,6只,组,单纯材料组缺损区仅填塞骨基质明胶,细胞-材料组填塞复合骨髓间充质干细胞的骨基质明胶,基因修饰细胞-材料组填寒复合Ad-HGF感染的骨髓间充质干细胞的骨基质明胶,各组细胞用量为107个/缺损,骨基质明胶用量为27 mm3/缺损,修复3个月后取材进行组织学检查.骨髓闻充质干细胞和Ad-HGF感染的骨髓间充质干细胞经荧光染料二醋酸琥珀酰酯羟基荧光素标记后,氯化钴处理72 h,流式细胞学分析细胞增殖情况.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的诱导分化,骨髓间充质干细胞对兔股骨头坏死的修复效果,Ad-HGF感染的骨髓间充质干细胞抗低氧损伤能力.结果:培养的细胞在适当诱导条件下可分化为成骨和成脂肪细胞.修复后3个月组织学分析显示,单纯材料组仅见疏松的纤维肉芽组织填充;细胞-材料组可见致密的纤维肉芽组织填充,其间有较多的新生血管,但未见新生骨组织;基因修饰细胞-材料组多为软骨样组织填充,周围可见新骨带形成.各组Lane-Sandhu骨组织学评分比较差异有非常显著性意义(P<0.01),其中基因修饰细胞-材料组评分高,即Ad-HGF感染的骨髓间充质干细胞具备佳的骨修复能力.培养体系中加入氯化钴后,已增殖的Ad-HGF感染的骨髓间充质干细胞比例显著高于未感染骨髓间充质干细胞(P<0.001).结论:在骨缺损模型中Ad-HGF感染的骨髓间充质干细胞具有更强的抗低氧损伤能力,其在体内成骨能力优于未感染的骨髓间充质干细胞,提示肝细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞移植是应用于缺血性骨坏死的有效治疗途径.

SOX-9和胰岛素样生长因子1共同转染大鼠骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景:单基因诱导虽能对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化产生积极影响,但作用有限,多种基因共同作用才符合机体真实内环境的需求,并有助于发挥多基因产物之间的协同作用,提高分化效果.目的:验证应用SOX-9和胰岛素样生长因子1基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后,目的基因分泌情况及向软骨细胞的分化效果.设计、时间及地点:两样本观察,实验于2008-04/2009-02在中国医科大学细胞生物实验室完成.对象:6周龄健康雄性Wistar大鼠2只用于骨髓间充质干细胞提取.方法:扩增、提取质粒pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9.分离、纯化Wistar大鼠骨髓间充质干细胞.按转染情况分为5组:①未转染组:仅加入双无(无血清无双抗)L-DMEM.②转染窄载体组:双无L-DMEM+pcDNA3.1空载体和脂质体.③转染SOX-9组:双无L-DMEM+pcDNA3.1-SOX-9质粒和脂质体.④转染胰岛素样生长因子1组:双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1质粒和脂质体.⑤共转染组:双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9质粒和脂质体,混合.主要观察指标:对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,反转录-聚合酶链反应和Western blot法检测筛选后细胞目的基因和蛋白的表达.结果:MTT法检测转染SOX-9组、转染胰岛素样生长因子1组和共转染组骨髓间充质干细胞增殖活性A值显著高于未转染组、转染空载体组(P<0.01).反转录-聚合酶链反应和Westem blot检测目结果显示,SOX-9表达以转染SOX-9组多;胰岛素样生长因子1表达以共转染组多:软骨细胞特异性基质Ⅱ型胶原表达以共转染组多.结论:双基因转染在诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化的能力和细胞外基质分泌的能力上更明显高于单基质转染;另外结果间接说明胰岛素样生长因子1具有诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的作用,但能力弱于SOX-9.

重组骨保护蛋白对糖皮质激素性骨质疏松的保护作用

背景:糖皮质激素性骨质疏松的发生机制与骨保护蛋白表达下调相关,在治疗雌激素缺乏性骨质疏松的动物实验和临床应用中,骨保护蛋白均表现出良好的抗骨吸收效能.目的:验证外源性重组骨保护蛋白对糖皮质激素所致骨质疏松的影响.设计、时间及地点:随机分组设计、对照动物实验,于2006-01/2008-06在解放军总医院骨科研究所完成.材料:选择清洁级健康成年雄性wistar大鼠60只;地塞米松磷酸钠注射液为天津金耀氨基酸有限公司产品,批准文号:国药准字H12020515.方法:大鼠随机分为3组,每组20只.对照组,生理盐水给药对照组;地塞米松组,单纯糖皮质激素给药组;骨保护蛋白组,糖皮质激素联合重组骨保护蛋白给药组.主要观察指标:12周各组大鼠分别取材,进行尿钙、磷、肌酐、骨密度、骨生物力学测定;大鼠骨骼局部免疫组织化学染色观察骨保护素表达.结果:纳入动物60只,均进入结果分析.①地塞米松组与对照组比较,尿钙上升(P<0.05);腰椎、股骨骨密度均明显下降(P<0.05),其中腰椎骨密度下降尤为显著(P<0.01);腰椎和股骨生物力学检测大载荷、人应力、弹性载荷、弹性应力、弹性模量显著下降(P<0.05);免疫组织化学显示骨髓内源性骨保护蛋白表达显著下降(P<0.01).②骨保护蛋白组与地塞米松组比较,尿钙下降(P<0.01);骨密度增加(P<0.05);腰椎和股骨生物力学检测指标均增强(P<0.05);骨髓内源性骨保护蛋白表达无明显变化.结论:糖皮质激素抑制骨骼局部骨保护蛋白表达,继发了渐进性骨质丢失,促进了骨质疏松的形成.重组骨保护蛋白可以部分抑制糖皮质激素引起的骨吸收,降低骨吸收指标、提高骨密度、增加骨强度,从而改善糖皮质激素性骨质疏松状况.

大鼠骨髓细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ和核结合因子α1表达增龄性变化与增龄性骨折愈合障碍

背景:有报道随着年龄的增加,骨折愈合的难度加大,可能是由于骨髓间充质干细胞分化为成脂细胞、成骨细胞等时的基因调控不同,但其具体机制尚不清楚.目的:观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ以及核结合因子α1在增龄性骨折愈合过程中的表达情况,以探讨过氧化物酶体增殖物激活受体与核结合因子α1基因的增龄性表达变化与增龄性骨折愈合障碍的联系.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-10/2008-02在中南大学湘雅三医院完成.材料:随机选取雄性3月龄及23月龄SD大鼠各6只.分为高龄组(23月龄)和低龄对照组(3月龄),每组各6只.方法:所有动物左下肢胫骨处安装自制微型外固定延长支架并行中上段横行截骨.术后第2天始每口延长牵综合外固定架2次,0.20 mm/次,牵引期为14 d.术后第15天处死大鼠,无菌条件下分离采集左胫骨标本.主要观察指标:骨折影像学、组织学检查;以反转录一聚合酶链反应检测过氧化物酶体增殖物激活受体与核结合因子α1 mRNA的表达.结果:所有动物均进入结果分析.骨折断端间影像学检查,低龄对照组骨折断端间大量骨痂产生,成骨显著强于实验组;组织学检查,低龄对照组各实验动物均有大量骨痂生长,膜内成骨显著:而老龄组骨痂生长存在明显减弱,断端间仅为纤维连接;反转录一聚合酶链反应检查,低龄组大鼠骨髓中核结合因子α1 mRNA表达明显强于高龄组,而高龄组过氧化物酶体增殖物激活受体mRNA表达则较为显著,且两组间该两种因子的表达差异有显著性意义.结论:不同年龄组大鼠骨折愈合情况存在差异,随着年龄的增加,骨折愈合能力下降:大鼠骨髓中过氧化物酶体增殖物激活受体mRNA与核结合因子α1 mRNA表达水平随年龄增加发生相应变化,提示该两种基因表达水平变化与增龄性骨折愈合障碍存在联系.

不同有氧运动时间对衰老大鼠骨质成分的影响

背景:实验表明,适宜运动可以延缓衰老,可以增加骨量的积累和减少骨量的丢失.目的:验证有氧运动对衰老大鼠骨质成分的影响.设计、时间及地点;随机对照动物实验,于2007-04/06在西安体育学院动物实验室完成.材料:清洁级离乳2月龄雄性SD大鼠64只,随机分为正常对照组、非模型运动组、衰老模型组和模型运动组,每组16只,分别在第6,9周各处死8只.方法:以D-galactose(D-半乳糖)建立衰老大鼠模型.①正常对照组和衰老模型组大鼠不进行任何训练.②非模型运动组和模型运动组大鼠进行6周和9周的游泳运动.主要观察指标:6,9周末检测各组大鼠血清碱性磷酸酶、骨钙素、Ⅰ型前胶后羧基端前肽、总钙、无机磷、镁含量,以及尿钙、尿无机磷、尿镁、尿羟赖氨酸糖甙含量.③光镜检查各组股骨组织骨小梁变化.结果:6,9周末,与正常对照组比较,衰老模型组血清碱性磷酸酶、Ⅰ型前胶后羧基端前肽、总钙、血清镁、尿钙、尿无机磷、尿羟脯氨酸水平降低,非模型运动组和模型运动组上述指标升高.6,9周末,与正常对照组比较,衰老模型组血清骨钙素、无机磷、尿镁、尿羟赖氨酸糖甙水平升高,非模型运动组和模型运动组上述指标下降.9周运动指标恢复效果好于6周.光镜检查衰老模型组大鼠骨小梁明显稀少,非模型运动组和模型运动组单位体积内的骨小梁增加.结论:有氧运动对衰老大鼠的股骨骨质成分的形态结构有着很大的影响,有延缓骨质疏松作用.

骨髓间充质细胞构建组织工程神经修复坐骨神经缺损

背景:许旺细胞是周围神经组织工程的种子细胞,但体外分离、培养、纯化许旺细胞较困难.脱细胞同种异体神经移植物具有较强的修复外周神经缺损的能力,且可诱导骨髓间充质细胞分化为类许旺细胞,理论上骨髓间充质细胞可替代许旺细胞作为种子细胞应用于周围神经组织工程.目的:观察骨髓间充质细胞构建组织工程神经修复坐骨神经缺损的效果,评估骨髓间充质细胞作为种子细胞修复周围神经缺损的可行性.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-07/12在大理学院基础医学院实验室完成.材料:将30只SD大鼠按随机数字表法分为3组,每组10只.骨髓间充质细胞+异体移植组将骨髓间充质细胞复合脱细胞同种异体神经移植物培养的组织工程神经与两断端用10/0无创线端端吻合;异体移植组将脱细胞同种异体神经移植物桥接;自体移植组将切断的坐骨神经旋转180°端端吻合.方法:运用骨髓间充质细胞构建的组织工程神经修复大鼠10 mm坐骨神经缺损,移植后12周通过坐骨神经功能指数、腓肠肌湿质量恢复率、S-100免疫组织化学染色、电镜等方法观察移植物修复效果.主要观察指标:复合物培养时观察细胞形态的变化;移植后观察坐骨神经功能指数及腓肠肌湿质量恢复率;通过甲苯胺蓝染色观察新生髓鞘形成和轴突生长及神经纤维的分布情况,结合透射电镜及S-100蛋白免疫组织化学染色,观察许旺细胞生长和神经纤维再生情况.结果:坐骨神经功能指数及腓肠肌湿质量恢复率的检测结果显示骨髓间充质细胞+异体移植组优于异体移植组(P<0.05).骨髓间充质细胞+异体移植组复合物中S-100的表达明显高于异体移植组,有髓神经纤维数量、有髓纤维直径和髓鞘厚度均大于异体移植组(P< 0.05),修复效果接近自体移植组.结论:骨髓间充质细胞构建的组织工程神经修复周围神经缺损的效果优于单纯的脱细胞同种异体神经移植物,骨髓间充质细胞作为种子细胞在周围神经组织工程中具有较强的应用价值.

碱性成纤维细胞生长因子基因转染对犬牙龈成纤维细胞的影响

背景:研究发现,局部应用外源性碱性成纤维细胞生长因子可明显促进体外培养牙龈成纤维细胞的增殖,口内局部应用可加速牙龈组织伤口的愈合.目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染对Beagle犬牙龈成纤维细胞生物学特性的影响.设计、时间、地点:观察对比体外细胞学实验,于2008-04/09在福建医科大学细胞与发育工程中心及解放军南京军区福州总医院比较医学科完成.材料:Beagle犬4只,12月龄,体质量10～13 kg,雄性;含有人全长碱性成纤维细胞生长因子cDNA的pIRES2-EGFP-bFGF质粒为白行构建.方法:切取Beagle犬左上颌第2,3,4前磨牙的游离龈.无菌磷酸盐缓冲液冲洗4遍,将组织块剪碎后用2.5 g/L的胰酶37℃消化2 h,离心后弃上清,加入含体积分数为10%胎生血清的DMEM,接种于6孔板并覆盖玻片,置于37℃、体积分数为5%CO<,2>的培养箱培养,取对数生长期细胞消化传代.利用脂质体介导法将pIRES2-EGFP-bFGF质粒转染Beagle犬牙龈成纤维细胞,以空质粒转染组及未转染组作为对照.主要观察指标:MTT法检测牙龈成纤维细胞增殖状况;AO/EB双染色检测牙龈成纤维细胞凋亡;化学比色法检测牙龈成纤维细胞碱性磷酸酶活性.结果:3组细胞均在转染后第3天开始进入对数生长期.MTT检测结果显示,转染后随着时间改变,与空质粒转染组及未转染组相比,实验组牙龈成纤维细胞的增殖能力明显增强(P<0.05),而空质粒转染组及未转染组差异无显著性意义(P>0.05).AO/EB双染色结果显示,实验组牙龈成纤维细胞凋亡率低于空质粒转染组及未转染组(P<0.05).转染碱性成纤维细胞生长因子基因后,牙龈成纤维细胞碱性磷酸酶活性未见明显改变,与未转染细胞差异无显著性意义.结论:碱性成纤维细胞生长因子基因转染可以加速牙龈成纤维细胞的增殖,抑制其凋亡,无促使牙龈成纤维细胞骨向分化的作用.

不同来源嗅鞘细胞修复脊髓损伤的效果比较

背景:研究表明嗅鞘细胞所分泌的细胞黏附分子和神经营养因子具有保护脊髓神经元和促进脊髓轴突再生的效应.目的:比较嗅球及嗅黏膜固有层来源的嗅鞘细胞异体移植修复脊髓损伤的能力.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-06/2008-06在西电集团医院中心实验室完成.材料:随机选取雄性3月龄及23月龄SD大鼠各6只,分为实验组(23月龄)和对照组(3月龄),用于嗅鞘细胞的体外培养和纯化;SD大鼠30只随机分为乳鼠嗅球嗅鞘细胞移植组、正常嗅黏膜嗅鞘细胞移植组、对照组,每组10只.方法:30只SD大鼠制造脊髓损伤模型,分别将体外培养的乳鼠和SD大鼠嗅鞘细胞进行脊髓损伤模型的异体移植,对照组不做移植.主要观察指标:术后4,8周,进行BBB神经功能评分,诱发电位,组织病理学观察.结果:实验过程中大鼠死亡7只,各组死亡率大致相同.移植后第4,8周时,乳鼠嗅鞘细胞移植组、正常嗅黏膜嗅鞘细胞组评分差异无显著性意义(P>0.05),均显著高于空白对照组(P<0.001);嗅鞘细胞移植2组评分8周高于4周(P<0.01).术后4周,各组动物均未引出运动诱发电位,移植后8周时,2组嗅鞘细胞移植组动物均可引出运动诱发电位,2组差异无显著性意义(P>0.05),空白对照组动物仍未引出运动诱发电位(P<0.001).移植后8周,2组嗅鞘细胞移植组脊髓损伤区有较多细胞浸润,对照组细胞数目较少.结论:来源于嗅球与嗅黏膜的嗅鞘细胞对脊髓损伤修复均有促进作用,且两者作用无明显差异.

脂联素对成骨细胞护骨素和核转录因子κB受体活化素配体表达的影响

背景:在骨组织中,护骨素的主要作用是抑制破骨细胞的形成和活性,核转录因子κB受体活化素配体的主要作用为刺激破骨细胞的分化和活性,抑制破骨细胞的凋亡.护骨素/核转录因子κB受体活化素配体在破骨功能调控中起重要作用.近来研究发现脂联素促进成骨细胞增殖和分化,脂联素与骨代谢相互偶联.但脂联素对破骨细胞的作用不明.目的:观察脂联素对成骨细胞核转录因子κB受体活化素配体和护骨素表达的影响,进一步分析其对破骨细胞生成的作用.设计、时间及地点:对比观察实验,于2007-0612008-12在中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所实验室完成.材料:外科手术取正常成人髂前上棘松质骨用于细胞培养,临床标本由湘雅医院提供.方法:分别用0,3,10和30 mg/L脂联素干预人成骨细胞48 h,检测护骨素和核转录因子κB受体活化素配体mRNA与蛋白表达.并用脂联素干预成骨细胞与外周血单核细胞共同培养系统,观察其对破骨细胞生成的影响.主要观察指标:分别采用荧光定量聚合酶链反应和酶联免疫吸附法检测人成骨细胞护骨素和核转录因子κB受体活化素配体mRNA与蛋白表达.抗酒石酸磷酸酶染色确定为破骨细胞.结果:脂联素呈剂量依赖性抑制人成骨细胞护骨素mRNA与蛋白质的表达(P<0.05).脂联素呈剂量依赖性促进人成骨细胞核转录因子κB受体活化素配体mRNA与蛋白的表达(P<0.05).脂联素干预成骨细胞与外周血单核细胞共同培养系统可诱导破骨细胞生成.结论:脂联素可通过诱导成骨细胞核转录因子κB受体活化素配体表达、抑制护骨素表达,诱导破骨细胞生成.

离心运动对大鼠骨骼肌细胞增殖和波形蛋白表达的时序性影响

背景:骨骼肌损伤后是通过肌卫星细胞的增殖形成新核来生长和修复的,但关于骨骼肌细胞增殖和波形蛋白表达的关系很少报道.目的:探讨骨骼肌细胞增殖与波形蛋白表达的关系以及运动性骨骼肌微损伤后修复的机制.设计、时间和地点:随机对照动物实验,于2007-12/2008-09在湖南师大运动人体科学实验中心完成.材料:健康成年8周龄雄性SD大鼠50只,随机分成对照组和运动后即刻、运动后3 h、运动后24 h和运动后48 h组,每组10只大鼠.方法:运动组大鼠进行重复3 d的力竭性离心运动,力竭模型采用跑台运动,速度为16 m/min,坡度为-16°,持续运动至力竭,对照组为正常大鼠,未做运动.主要观察指标:运动组分别于运动后即刻,3,24,48 h取材,对照组一次性取材,免疫组织化学法检测各组大鼠肱三头肌内侧头不同恢复时相增殖细胞核抗原PCNA的表达和波形蛋白的表达.结果:骨骼肌细胞增殖出现时序性变化,运动后即刻增殖指数显著大于对照组,运动后24 h达到峰值,运动后48 h增殖指数有所下降.骨骼肌细胞中波形蛋白表达出现时序性,而且其免疫反应分值的时序性与增殖指数出现一致性,但与增殖指数不具有相关性.结论:3 d重复性力竭离心运动后骨骼肌细胞增殖和波形蛋白的表达出现时序性变化.波形蛋白的表达与肌细胞增殖具有一定的关系,但不是惟一的影响的因素.

生长分化因子5真核表达质粒转染小鼠骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化

背景:生长分化因子5是软骨与骨组织形成、发育的重要调解因子,在诱导软骨形成,促进骨、软骨、肌健韧带损伤修复方面发挥重要作用.目的:小鼠骨髓基质干细胞体外转染真核表达质粒pcDNA 3.1(+),生长分化因子5,检测与软骨形成分化相关的细胞外基质及蛋白多糖的表达.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/12在武汉协和医院中心实验室完成.材料:雄性昆明种小鼠20只,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供.生长分化因子5真核表达质粒pCDNA 3.1(+)/生长分化因子5为自备.方法:全骨髓贴壁法体外分离培养小鼠骨髓基质干细胞,取传至第3代细胞接种到6孔板,在细胞生长到90%融合时开始转染.设立3组:转染组采用Lipofectamine<'TM>2000进行脂质体介导pcDNA3.1(+)/生长分化因子5重组质粒瞬时转染;空质粒组转染窄质粒pcDNA 3.1(+);空白对照组只加入等量脂质体,其余步骤相同.主要观察指标:转染后72 h通过RT-PCR及免疫细胞化学检测生长分化因子5基因与蛋白的表达鉴定转染是否成功,同法检测软骨基质Ⅱ型胶原的表达,转染后14 d阿尔辛蓝染色检测蛋白聚糖的表达.结果:转染组有一大小为219 bp的特异性扩增条带,骨髓基质干细胞胞浆内呈棕色阳性染色;而空质粒组、空白对照组均未发生生长分化因子5基因转录,无特异性扩增条带,且细胞胞浆未见明显染色.转染组町检测到Ⅱ型胶原基因的表达,基因大小225 bp,Ⅱ型胶原细胞胞浆中可见棕黄色染色;空质粒组、空白对照组均未检测到Ⅱ型胶原基因的表达,SP染色均无明显染色.阿尔辛蓝染色后转染组细胞呈蓝染,空质粒组、空白对照组均未见明显异染性着色.结论:pcDNA3.1(+)/生长分化因子5转染骨髓基质干细胞能显著增加Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达,促进骨髓基质干细胞向软骨细胞方向分化.

无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞修复大鼠坐骨神经缺损

背景:作者前期试验已成功制备了天然可生物降解的无细胞神经移植物并证明其可促进周围神经再生.目的:无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经并观察其修复大鼠坐骨神经缺损促进运动功能恢复的效果.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-06/2009-02在辽宁医学院附属第一医院医学组织工程实验室完成.材料:180～200 g成年健康雄性Wistar大鼠,用于制备无细胞神经移植物,100～120 g成年健康雄性Wistar大鼠,用于制备骨髓间充质干细胞,将骨髓间充质干细胞植入并与无细胞神经支架联合培养构建组织工程人工神经.方法:180～200 g成年健康雄性SD大鼠60只构建坐骨神经15 mm缺损模型,随机分成3组,每组20只.①实验组采用组织工程人工神经桥接大鼠坐骨神经缺损.②空白对照组采用组织工程神经支架桥接大鼠坐骨神经缺损.③自体神经对照组采用自体神经移植桥接大鼠坐骨神经缺损.主要观察指标:术后12周通过大体观察、电生理检测、组织学和小腿三头肌湿质量等方法分析评价运动功能恢复情况.结果:①术后12周,实验组大鼠手术侧足趾可以分开,并且可以支撑着地;实验组大鼠再生神经传导速度与自体神经对照组相比,差异无显著性意义.②术后12周,实验组组织化学染色可见腓肠肌内有呈AchE阳性的运动终板整齐地排列于腓肠肌的中上部形成终板带,经结合镀银染色后可见再生的神经束及发出的分支与运动终板相连.③实验组与自体神经对照组胫骨前肌湿质量比差异无显著性意义.结论:无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞桥接大鼠坐骨神经缺损具有促进其运动功能恢复的作用.

大鼠肝再生增强因子的基因克隆及序列分析

背景:肝再生增强因子是一种重要的次级肝再生因子,能够特异性地促进肝脏再生.目的:将乳鼠肝脏提取的RNA,利用特异引物克隆到肝再生增强因子基因,对其进行了生物信息学分析.设计、时间及地点:基因分子学体外实验,于2008-03/05在河南大学生命科学学院神经生物学实验室完成.材料:SPF级3日龄Wistar大鼠肝组织.方法:取3日龄Wistar大鼠肝组织.按异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法抽提肝组织总RNA,按分子生物学实验指南的步骤进行反转录-聚合酶链反应方法扩增目的片段,用凝胶同收试剂盒回收纯化目的基因,连接T载体,转入大肠杆菌,提取质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序.应用分子生物学软件对测序结果进行分析.主要观察指标:聚合酶链反应扩增条带观察;测序结果分析;丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点的预测;系统进化树分析.结果:聚合酶链反应扩增结果与目的片段位置一致,测序结果表明为肝再生增强因子mRNA,基因全长378 bp,在人、牛、小鼠、斑马鱼等物种中高度保守.结论:实验成功克隆了大鼠肝再生增强因子基因.

不同波长低能量激光对骨折愈合的影响

背景:低能鼍激光对骨折愈合有促进作用,能够加速骨折愈合,缩短骨折愈合时间,增强骨折愈合强度,对早期骨折愈合有较好的疗效.目的:评价不同波长低能量激光对早期骨折愈合的疗效.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-05/2006-05在韩国檀国大学医科大学激光中心完成.材料:60只9月龄的英国Hartley雌性豚鼠,体质量(300±30)g,随机分为632 nm,830 nm实验组各20只,对照组20只.方法:每只豚鼠左臀部肌肉内注射麻醉药,麻醉成功后,右侧股骨干中段用咬骨钳将其咬断并造成粉碎性骨折,再用1.4 mm克斯针经骨髓腔行内固定术.632 nm和830 nm波长半导体激光仪器分别用于两个实验组.低能量靠激光照射从术后48 h开始,在股骨干骨折区上方垂直照射,每两天1次,照射剂量同为100J/cm2,照射面积同为2.52cm2.后46只豚鼠成活,其中对照组14只,632 nm和830 nm实验组各16只.主要观察指标:在第3,6周心脏注射处死豚鼠.提取股骨干标本,采用Modified Zorlu Scoring System评价骨折愈合情况,包括肉眼观察,影像学CR检查和组织学检查.结果:46只豚鼠均存活,大体观察观察和影像学CR检查结果显示:第3周,632 nm和830 nm实验组的骨痂形成速率均显著性高于对照组(P<0.01):830 nm实验组的骨痂形成量多于632 nm实验组(P>0.05).组织学检查结果显示:第3周,两个实验组造骨细胞的增生聚集显著性大于对照组(P<0.01).在第3,6周,632 nm和830 nm两个实验组之间虽然没有显著性差异,但是830 nm实验组造骨细胞的增生量高于632 nm实验组(P>0.05).结论:632 nm和830 nm照射波长治疗对早期骨折愈合均取得较好的效果,830 nm波长促进骨折的愈合效果好于632 nm波长.

脑损伤合并骨折与单纯骨折患者血管内皮生长因子的表达及其临床意义

背景:临床发现,脑损伤合并骨折有些部位骨痂过度生长,出现异位骨化,骨折愈合明显加快.目的:对比观察脑损伤合并骨折与单纯骨折两组患者骨折愈合过程骨痂中血管内皮生长因子的表达及分布,探讨临床意义及其作用机制.设计、时间及地点:分组对照观察,于2006-02/2007-07在解放军第四军医大学西京医院完成.对象:合并脑损伤组与单纯骨折组骨痂病理标本各50例.合并脑损伤组:男41例,女9例,年龄19～55岁;单纯骨折组:男36例,女14例,年龄17～52岁.方法:取两组患者各50例受伤7～10,11～15,16～20,21～27,28～35 d的骨痂标本,用免疫组织化学方法,检测两组患者不同时期骨痂标本中血管内皮生长因子含量高低,观察骨折愈合速度.主要观察指标:①X射线观察结果.②免疫组织化学染色图像分析.结果:在骨折愈合的不同阶段,两组骨痂内表达血管内皮生长因子的细胞来源一致,合并脑损伤组骨祖细胞、成骨细胞、软骨细胞中早期表达程度明显高于单纯骨折组,骨祖细胞增殖,成骨细胞、软骨细胞分化明显增加,7～10 d达到高峰,高峰持续30 d后逐渐减少:单纯骨折组在11～15 d出现高峰,高峰在20 d开始下降,峰值明显低于合并脑损伤组,配对t检验两组比较差异有显著性意义(P<0.05).合并脑损伤组在伤后4周即可见X射线片长骨骨折处大量骨痂生长,单纯骨折组在伤后7～9周才见到大量骨痂生长.结论:脑损伤合并骨折患者骨折愈合早期血管内皮生长因子表达显著强于单纯骨折患者,持续时间明显延长;血管内皮生长因子促进骨祖细胞增殖,成骨细胞、软骨细胞分化明显高于单纯骨折组;骨祖细胞增殖、成骨细胞及软骨细胞快速大量分化,是骨折快速愈合机制之一.

血管内皮生长因子在阿托伐他汀干预股骨头缺血性坏死家兔骨组织中的表达

背景:研究证实,体外培养中他汀类药物可显著增加血管内皮祖细胞的数量,同时可以使血管内皮生长因子的含量明显增多.目的:验证阿托伐他汀对家兔股骨头缺血性坏死骨组织中血管内皮生长因子表达的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-09/2008-11在武汉大学人民医院骨关节外科完成.材料:健康成年新西兰大耳白兔45只,体质量2.5～3.5 kg,雌雄不限.随机分成空白对照组、模型组和阿托伐他汀组,每组15只.方法:模犁组和阿托伐他汀组应用液氮冷冻法建立家兔股骨头缺血性坏死模型,阿托伐他汀组于造模成功后2周开始用阿托伐他汀灌胃,空白对照组和模型组灌服等量的生理盐水.主要观察指标:于第4,8,12周每组随机各取5只动物处死,进行大体、X射线及组织学观察;以免疫组织化学法检测股骨头血管内皮生长因子蛋白表达和反转录-聚合酶链反应法检测血管内皮生长因子mRNA水平.结果:模型组和阿托伐他汀组血管内皮生长因子蛋白和mRNA表达明显低于空白对照组,但阿托伐他汀组喂药后的第8,12周血管内皮生长因子蛋白和mRNA表达水平明显高于模型组(P<0.05).结论:阿托伐他汀能够提高家兔股骨头缺血性坏死骨组织中血管内皮生长因子蛋白和mRNA的表达.

胎盘组织液-同种异体冻干骨与同种异体冻干骨修复颌骨缺损的对照

背景:研究证实,冻干和辐照灭菌的同种异体骨是理想的骨移植材料,不仅具有良好的生物相容性、生物力学特性,而且还保留骨基质中的骨形态发生蛋白和构成形态发生蛋白所必须的一些酶类,具有一定的骨诱导能力.目的:观察胎盘组织液-同种异体冻干骨修复犬的人工颌骨缺损效果,以同种异体冻干骨为对照.设计、时间及地点:对比观察性实验,于2007-12/2008-09在哈尔滨医科大学动物实验中心完成.材料:健康杂种成年犬8只;同种异体冻干骨由湖北联结生物材料有限公司提供;胎盘组织液为广东珠海丽珠制药厂产品,2 mL/支.同种异体冻干骨:胎盘组织液=(4.0-5.0):1.方法:在犬上、下中切牙、尖牙、第一磨牙根尖相对应的颌骨处分别建立直径1.0 cm类半球型上下颌骨缺损模型共96个实验区,实验组选择大小合适的同种异体冻干骨及骨颗粒按比例浸泡在胎盘组织液呈饱和状,阳性对照组亦将大小合适的同种异体冻干骨及骨颗粒浸泡在生理盐水液呈饱和状,分别放入颌骨缺损处并添满,阴性对照组不植入任何材料.每只犬的实验区均由4个实验组材料、4个阳性对照组材料、4个阴性对照组材料组成.主要观察指标:术后2,4,8,12周取材进行放射线学和组织学观察.结果:实验组早期以软骨内化骨为主,晚期以膜内化骨为主,有明显的新骨形成,并与周围骨组织连接良好;阳性对照组可见新生骨,与周围骨组织连接欠佳;阴性对照组骨缺损区中央尚未被骨小梁充满.经组织学测定,术后2,4,8,12周实验组成骨量均高于其他两个对照组,差异有显著性意义(P<0.05,P<0.01).结论:胎盘组织液-同种异体冻干骨复合材料能够积极地促进颌骨缺损的修复并有效缩短修复时间.

"承载丸"对股骨头坏死大鼠细胞黏附分子基因的影响

背景:研究表明承载丸治疗激素性股骨头坏死具有明确的疗效.可明显增加骨密度、骨重量、骨强度和刚性,能改变雌激素水平低下状态.目的:观察承载丸对激素性股骨头坏死大鼠骨细胞中细胞黏附分子基因的影响,以明确该药对坏死股骨头内血管恢复正常血运的作用.设计、时间及地点:分组对照观察,于2006-03/08在中国中医科学院望京医院药理实验室及生物芯片北京国家工程研究中心所属博奥芯片公司实验室完成.材料:6月龄雄性SD大鼠6只,体质量(280±20)g.承载丸主要成分:有当归,杜仲,黄芪,枸杞子,鹿角霜,肉苁蓉、地鳖虫,水蛭、丹参,续断等22味中药.由北京市勃然制药有限公司提供.方法:6只SD大鼠采用内毒素和甲基强地松龙制做激素性股骨头坏死动物模型,随机将大鼠分为模型组和承载组,每组各3只.承载组大鼠自第1次注射甲基强地松龙后,灌服承载丸药液1.5g/kg,1次/d,共灌服6周.6周后取股骨头提取总RNA,进行基因谱测试.主要观察指标:基因谱测试结果中的细胞黏附分子基因作用路径分析.结果:3只模型大鼠使用承载丸后,与模型大鼠相比较,出现1.5倍以上改变的基因,分别为633个(下调506个,上调127个)、883个(下调640个,上调243个)、593个(下调408个,上调185个).使用MAS软件归类分析后,共有相关作用路径79个,涉及297个基因.其中细胞黏附分子路径有8个下调基因.结论:大鼠服用承载丸后,使上述基因下调,恢复了大鼠巨噬细胞及靶细胞的识别功能,恢复了上皮细胞包括血管内皮细胞的正常生存条件,细胞黏附分子作用路径持正常水平,这是坏死股骨头内血管恢复正常血运的关键.

羟乙膦酸钠对去睾丸大鼠不同部位骨骼的影响

背景:男性骨质疏松的预防越来越受到人们的重视.目的:建立去睾丸大鼠骨质疏松模型,通过骨形态计量学方法观察羟乙膦酸钠对不同部位骨骼的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2002-10/2006-09在广东医学院动物实验中心及骨生物学研究室完成.材料:3.5月龄SD雄性大鼠40只,体质量(299+22)g.羟乙膦酸钠,成都化学制药厂生产,批号:970101.甲基睾丸酮片,广州侨光制药厂,批号:990701.方法:将大鼠随机分成基础对照组、假手术组、去睾丸组、去睾丸加甲基睾丸酮组和去睾丸加羟乙膦酸钠组,每组8只.基础对照组在实验开始时处死.假手术组切开皮肤,暴露睾丸但不切除.其余大鼠按文献报道方法切除睾丸.假手术组和去睾丸组给予生理盐水,睾丸酮组给予甲基睾丸酮片1.8 mg/(kg·d),羟乙膦酸钠组给予羟乙膦酸钠36 mg/(kg·d),大鼠每只按5mL/kg灌胃给药,连续给药90 d.主要观察指标:测量胫骨上段、第5腰椎松质骨和胫骨中段皮质骨骨组织形态计量学参数.结果:与假手术组比较,去睾丸组大鼠胫骨上段和腰椎松质骨骨小梁面积百分率、骨小梁数量或骨小梁厚度减少(P<0.05和0.01),而骨小梁分离度、标记周长百分数、骨形成率、每毫米破骨细胞数均增加(P<0.05和0.01).与去睾丸组比较,羟乙膦酸钠和睾丸酮组大鼠胫骨上段和腰椎松质骨骨量均增加,而骨形成和骨吸收的参数均降低,羟乙膦酸钠组与睾丸酮组比较差异无显著性意义.各组大鼠胫骨中段皮质骨形态计量学参数均无明显变化.结论:羟乙膦酸钠能预防鼠造成的胫骨上段和腰椎松质骨丢失,但对胫骨中段皮质骨无明显影响.