干细胞治疗的应用

目的:干细胞研究是当今生物医学主要热点之一.对干细胞的概念、生物学特性、分类等进行了阐述,同时也对干细胞在移植治疗、克隆技术及转基因技术等方面的应用作了综述.资料来源:因特网上检索PubMed数据库中2000-01/2005-06期间有关干细胞治疗进展的英文文章,检索词"stem cell,totipotent stem cell,muhipotent stem cell,application,therapy",同时检索万方医学文献数据库2000-01/2005-06期间的相关文章,检索词为"于细胞,全能干细胞,多能干细胞,应用,治疗".资料选择:对资料进行筛选,选取相关文章查找全文.纳入标准:①干细胞相关生物学特性及分类研究.②干细胞治疗应用的研究.③能获取文章的全文.排除标准:①较陈旧的文献,②重复研究.资料提炼:共收集到224篇与干细胞治疗应用进展相关的文献,其中16篇符合纳入标准.资料综合:①干细胞具有自我更新和高度增殖能力,根据其分化潜能不同可以分为全能干细胞和多能干细胞.②干细胞移植正日益广泛地应用于各种肿瘤及某些遗传性疾病的治疗,已经成为治疗癌症、造血系统疾病、自身免疫系统疾病的重要手段之一.神经干细胞的研究也为神经系统疾病的治疗提供了广阔的应用前景.干细胞生物工程应用于基因治疗可以使外源基因得以有效扩增;并且干细胞可以在体外操作,避免由于基因插入而导致的细胞失常;干细胞作为人体细胞,作为载体其毒性小,是导入组织的佳形式.③干细胞的应用及研究前景不但取决于干细胞技术本身,还受伦理和法律问题的制约.结论:干细胞作为一类既有自我更新能力,又有多分化潜能的细胞,具有非常重要的基础研究和临床应用价值.目前人类干细胞如胚胎干细胞、造血干细胞、神经干细胞和骨髓间质干细胞已成为生物医学领域中有希望和有吸引力的研究热点.

细胞移植治疗帕金森病的理论研究与应用技术

目的:根据近年来国内外有关细胞移植治疗帕金森病的情况,探讨细胞替代性治疗的研究进展.资料来源:应用计算机检索Medline 1994-01/2005-06相关细胞移植的文献,检索词"stem cell,brain transplantation",并限定文献语言种类为English.同时计算机检索CBM 2000-01/2005-06相关细胞移植方面的文献,检索词为"移植,帕金森病",并限定语言种类为中文.资料选择:对资料进行初审,开始查找全文.纳入标准:选取包括细胞移植与帕金森病的文献.排除标准:综述文献、Meta分析、重复研究文章.资料提炼:将收集到的文章分为移植细胞的来源及脑内移植两部分进行评价分析.资料综合:目前临床上对帕金森病尚无有效的治疗办法,具有多分化能力的干细胞为帕金森病的替代性治疗带来了希望.细胞的来源较多,可以从胚胎干细胞诱导分化,可以直接提取神经干细胞,也可以利用骨髓基质干细胞等进行移植.移植的效果与移植技术关系密切,研究表明可以通过控制移植神经干细胞的数量、选择移植部位及利用支架材料等提高移植细胞的存活,提高治疗效果.结论:干细胞移植治疗帕金森病是可行的,经过深入的实验研究后可望从根本上治疗帕金森病.

自体角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉30例

目的观察自体角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉的效果.方法选择2000-01/2005-01在天津市武清区人民医院治疗的翼状胬肉患者40例(45跟),分为角膜缘干细胞移植组30例(35眼)和单纯切除组10例(10眼).角膜缘干细胞移植组在显微镜下进行翼状胬肉的自体角膜缘干细胞移植术治疗,单纯切除组行单纯翼状胬肉切除.术后随访1年观察复发率.结果角膜缘干细胞移植组30例(35眼)术后角结膜光滑透明,愈合良好,无一例复发;单纯切除组10例(10眼)3眼复发.结论患眼自体角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉简便、安全、有效.

电场干预对血管平滑肌细胞血小板衍化生长因子受体分布的影响

目的:观察电场作用下血管平滑肌细胞膜血小板衍化生长因子受体表达的变化及其与细胞迁移生长的关系.方法:①实验于2003-08/2004-08在解放军第三军医大学附属西南医院心内科及烧伤实验室完成.选用健康Wistar大鼠120只.②按常规组织块贴壁法原代培养血管平滑肌细胞.③通过外加电场干预装置(基本结构包括:观测小室和细胞培养室、电极系统、直流电源.细胞培养室的中央部分是对细胞行为进行显微镜下直接观测的地方,即观测小室.是该装置的关键部分.与细胞培养室相连的电极采用琼脂-盐桥电极.电源系统为输出电压0.1～200V,输出电流0.01～10mA,连续可调的电压电流双稳直流电源),对体外培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞直流电场干预,间断显微细胞图像记录和分析,观察不同强度电场、不同作用时间下血管平滑肌细胞迁移和细胞形态的变化;采用免疫荧光染色方法检测电场干预后,与血管平滑肌细胞迁移密切相关的血小板衍化生长因子受体膜表达,观察血小板衍化生长因子受体表达变化与细胞生物行为变化的关系.④两组间差异比较采用t检验.结果:①在施加150 mV/mm电场干预后,血小板衍化生长因子受体表达增加(P＜0.05～0.01),部分细胞血小板衍化生长因子受体表达呈不对称分布,在细胞向阴极伸展的板状突起中有明显荧光着色.血小板衍化生长因子受体在血管平滑肌细胞的重新分布在电场干预30 min后出现,在6 h电场干预中仍持续存在.②在150 mV/mm电场干预下,培养的血管平滑肌细胞有明显的电场趋化性,细胞向阴极迁移的距离明显长于无电场作用对照组,血管平滑肌细胞在电场作用下迁移速度亦明显加快[(13.84±0.79),(4.32±0.42)p±m/h,P＜0.01),其电场趋化性与血小板衍化生长因子受体的不对称分布相一致.结论:外加直流电场干预下,大鼠血管平滑肌细胞的血小板衍化生长因子受体表达上调并呈极性不对称分布,这一改变可能与血管平滑肌细胞形状发生改变和向电场阴极面定向迁移有关.

氧自由基对培养人脐静脉内皮细胞代谢产物的影响

目的:观察氧自由基对培养的人脐静脉内皮细胞产生的裂解不对称二甲精氨酸的酶一二甲精氨酸-二甲赖氨酸水解酶活性及表达的影响,以探要讨不对称二甲精氨酸代谢机制及卡托普利的作用.方法:实验于2003-05/2004-06在南昌大学医学分子中心进行.采用改良的Jaffe法培养人脐静脉内皮细胞,取生长良好的3～6代人脐静脉内皮细胞分为4组:①空白对照组:加DMEM培养液.②氧自由基0.01,0.1 mmol/L组:分别加入氧自由基0.01,0.1 mmol/L.③卡托普利组:同时加入氧自由基0.1 mmol/L及卡托普利(100mg/L)共孵.孵育24h后,检测上清液中一氧化氮、一氧化氮合酶活性、内皮细胞的代谢产物不对称二甲精氨酸浓度以及反应二甲精氨酸-二甲赖氨酸水解酶酶活性的L-瓜氨酸浓度,采用Western blotting测定细胞裂解液中二甲精氨酸-二甲赖氨酸水解酶的蛋白表达.结果:①二甲精氨酸浓度:氧自由基0.01,0.1 mmol/L组均高于空白对照组[(2.71±0.35),(4.78±0.67),(0.81±0.12)μmol/L,P＜0.05,0.01],卡托普利组低于氧自由基0.1 mmol/L组[(2:03±0.35)μmol/L,P＜0.01].②L-瓜氨酸浓度:氧自由基0.01,0.1 mml//L组均低于空白对照组(P＜0.05,0.01),卡托普利组高于氧自由基0.1 mmol/L组(P＜0.01).③一氧化氮浓度及一氧化氮合酶活性:氧自由基0.01,0.1 mmol/L组均低于空白对照组(P＜0.05,0.01),卡托普利组高于氧自由基0.1 mmol/L组(P＜0.01).④二甲精氨酸-二甲赖氨酸水解酶的蛋白表达:各组间无差异(P＞0.05).结论:氧自由基培养下,内皮损伤,不对称二甲精氨酸的增加与二甲精氨酸-二甲赖氨酸水解酶的活性减弱有关,与其蛋白的表达无关.而卡托普利则通过增加二甲精氨酸-二甲赖氨酸水解酶活性促进不对称二甲精氨酸代谢,使一氧化氮合酶活性增加,抑制氧自由基对内皮功能的损伤.

人重组表皮生长因子与碱性成纤维细胞生长因子联合应用对糖尿病创面愈合过程的修复效应

目的:联合应用重组人表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子,探讨其对糖尿病创面愈合过程的影响.方法:选择2001-05/2005-03广西医科大学烧伤整形康复中心收治的29例糖尿病足部溃疡患者,均自愿签署知情同意书.采用随机表法将29例患者随机分为4组:联合用药组7例、重组人表皮生长因子组8例、碱性成纤维细胞生长因子组6例、生理盐水对照组8例.各组患者均在处理创面前将空腹血糖控制在11.1 mmol/L以下,伴感染者经有效抗生素静脉滴注至感染完全控制,创面刮除病理性肉芽.联合用药组给予外用重组人表皮生长因子1 500IU/次,外喷碱性成纤维细胞生长因子720 AU/次;重组人表皮生长因子组单纯给予外用重组人表皮生长因子1 500IU/次;碱性成纤维细胞生长因子组给予外喷碱性成纤维细胞生长因子720 AU/次;生理盐水对照组仅用生理盐水擦拭创面.各组敷料包扎,隔天换药,于处理创面后第3,7,14天观察创面上皮葡行情况和肉芽组织成熟程度.结果:实验选用糖尿病足患者29例,全部进入结果分析.①创面处理后不同时间各组创面愈合率的比较:创面处理后第3天各组基本相似(P＞0.05);创面处理后第7天,与生理盐水对照组比较,联合用药组和重组人表皮生长因子组均明显提高(P＜0.05);创面处理后14天,与生理盐水对照组比较,联合用药组、重组人表皮生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子组均显著提高(21.67±1.53)%,(33.50±1.56)%,(28.77±1.50)%,(23.73±1.20)%(P＜0.01或0.05),以联合用药组升高为明显.②创面处理后不同时间各组肉芽组织生长大体观察情况:各组于创面处理后第3,7天创面肉芽组织生长情况均基本相似(P＞0.05).创面处理后第14天,联合用药组创面肉芽组织生长情况明显优于重组人表皮生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子组、生理盐水对照组(P＜0.05).结论:重组生长因子和碱性成纤维细胞生长因子联合应用对于糖尿病创面的治疗具有协同效应.

血管化组织工程骨修复山羊胫骨骨缺损的实验

背景:组织工程骨修复大型哺乳动物大范围的骨缺损,如何促进组织工程骨的体内再血管化进程是核心问题.在临床工作中,常采用带蒂筋膜技术促进植入物的再血管化.目的:观察带蒂深筋膜瓣促组织工程骨修复羊胫骨骨缺损及其再血管化的能力.设计:随机对照动物实验.单位:南方医科大学南方医院创伤骨科.材料:36只中国青山羊,体质量14.5～15.5kg,雌雄不限.方法:实验于1999-12/2003-12在原解放军第一军医大学南方医院创伤骨科完成.36只中国青山羊制作单侧胫骨中段20 mm骨与骨膜缺损,钢板内固定,随机分4组:空白组、单纯材料组(珊瑚羟基磷灰石)、组织工程骨组(单纯珊瑚羟基磷灰石复合经诱导分化的骨髓基质细胞)、筋膜瓣组(带蒂深筋膜包裹组织工程骨).术后2,4,8周行放射性核素骨显像检查;4,8,12周放射学及组织学检查、12周生物力学检查评价各组成骨及再血管化情况.主要观察指标:各组动物骨缺损区大体观察、X射线、放射性核素骨扫描、生物力学及组织学观察结果.结果:36只羊均进入结果分析.①各组动物骨缺损修复标本大体形态观察:术后空白组在各个时间点均无骨组织形成.单纯材料组8～12周时,材料表面未见明显骨质形成和骨痂形成.组织工程骨组骨8～12周骨缺损渐被充填,材料表面可见有较多骨痂突出并向中央集中,并基本包裹材料.筋膜瓣组骨其成骨过程明显优于组织工程骨组.②各组动物发射型断层扫描仪检查结果:筋膜瓣组2～8周间肉眼可明显分辨出术侧感兴趣区的放射性浓度呈明显上升趋势,组织工程骨组呈现与筋膜瓣组类似的变化趋势,但其感兴趣区计数及T/NT比值均较相应的筋膜瓣组低.单纯材料组的递增趋势亦较组织工程骨组低.③各组动物放射学检查结果:通过吸光度比值的测量按成骨量大小形成的顺序依次为筋膜瓣组、组织工程骨组、单纯材料组[12周分别为(4.180±0.192),(3.480±0.453),(2.959±0.682)].④各组动物生物力学检测结果:筋膜瓣组、组织工程骨组、单纯材料组组间载荷、弯曲应力差异显著[载荷依次为(758.333±88.754),(530.214±65.297),(359.667±60.715)N;弯曲应力依次为(13.937±2.199),(10.123±1.243),(6.223±0.945)N/mm2].⑤各组动物组织学结果:空白组术后各时间点切片显示无骨组织.其余3组随时间增长,成骨范围和质量依次为筋膜瓣组、组织工程骨组、单纯材料组.结论:筋膜瓣通过促进组织工程骨体内再血管化的速度,促进其体内成骨速度及修复骨缺损的能力.

几丁聚糖纳米微粒分散体系应用于烧伤创面的实验

目的:制备以几丁聚糖为主要原料纳米微粒分散体系,并通过动物烧伤实验进行医学应用效果观察.方法:实验于2003-05/2004-05在浙江省医学科学院医学生物工程研究所及浙江省动物实验中心完成.首先运用物理和化学综合手段,制备几丁聚糖纳米微粒分散体系,用透射电镜观察法进行纳米微粒尺寸测定评估;其次采用制备的几丁聚糖纳米微粒分散体系进行动物烧伤实验,①烧伤动物模型建立:选择体质量2.5～3.0kg健康兔子8只,雌雄对半,脱毛并麻醉后,在实验兔子背部,以脊椎为对称轴,用盛装100℃开水的人工烧伤器(质量500g),紧贴兔子皮肤3 s,制成浅Ⅱ度烧伤创面24个,5 s制成深Ⅱ度创面24个,每个创面平均面积16 cm2,左侧创面为实验组,右侧为对照组.②治疗方法:左侧实验组创面涂敷几丁聚糖纳米体系,右侧创面涂敷凡士林,2次/d,上下午各1次,连续3 d后停止涂敷,每日观测记录创面的渗出液、创面大小、结痂时间、脱痂愈合时间等临床指标.结果:①几丁聚糖纳米微粒分散体系颗粒粒径平均为(36.40±5.14)am.②治疗动物烧伤实验第7天的烧伤创面平均面积试验组小于对照组[浅Ⅱ度:(2.29±0.51)和(4.28±0.45)cm2;深Ⅱ度:(2.15±0.34)和(4.39±0.52)cm2,P＜0.01].③烧伤创面结痂平均时间试验组短于对照组[浅Ⅱ度:(6.45±0.58)和(10.5±0.75)d;深Ⅱ度:(7.5±0.66)和(10.6±0.78)d,P＜0.01].④几丁聚糖纳米体系对烧伤创面脱痂愈合的平均时间试验组短于对照组[浅Ⅱ度:(14.36±0.58)和(16.27±0.75)d;深Ⅱ度:(22.0±1.33)和(29.88±1.86)d,P＜0.01].结论:几丁聚糖纳米微粒分散体系对动物Ⅱ度烧伤具有明显的缩小创面、提早结痂、促进愈合之疗效,提示具有临床功能敷料的开发应用前景.

髌腱移植重建前交叉韧带后膝关节功能恢复1年随访

目的:通过随访观察前交叉韧带断裂自体异体髌腱移植重建后患者膝关节功能的恢复.方法:选取2002-08/2004-08广州市第一人民医院关节外科24例成功随访的前交叉韧带重建患者为观察对象.采用髌腱重建前交叉韧带自体髌腱移植髌骨供区植骨9例,采用异体髌腱移植14例,腘绳肌移植1例,术后1年随访进行评估,以临床检查(前抽屉试验、Lachman试验、轴移试验),IKDC评分(采用4级评分法:即正常、接近正常、异常、严重异常,包括8个方面的21项内容,具体为:①按0～3级患者主观评估膝关节的功能及膝关节影响活动水平;②症状;③活动范围;④Lachman法;⑤关节间隙征;⑥受检部位病征压痛、敏感、麻木;⑦X射线退行性关节病改变;⑧功能方式检验),Lysholm评分评估患者膝关节功能,包括8个方面的34项内容①跛行;②支撑;③交锁;④不稳;⑤疼痛;⑥肿胀;⑦上下梯;⑧下蹲.总分100分,分数愈高,膝关节功能恢复愈好.结果:23例患者平均随访时间1年,随访率100%.①9例采用自体髌腱移植重建前交叉韧带,术中髌骨供区植骨的患者,前抽屉试验(+)1例;Lachman试验(+)1例;轴移试验(+)1例;IKDC评分正常8例(88.9%),接近正常1例(11.1%);患者主观感觉良好;Lysholm评分,患膝术前平均45.3分,术后89.8分,其中优6膝、良1膝、中1膝,优良率88.9%,患膝力量达对侧膝的75%以上,可免支具和拐杖行走.无伸膝受限,屈膝活动达130°以上.3例膝部皮肤麻木,1例跪地疼痛,2例膝行疼痛.②14例异体髌腱移植重建前交叉韧带、髌骨供区植骨患者:前抽屉试验I度1例,Lachman试验(+)1例,轴移试验(+)1例;IKDC评分正常11例(78.6%),接近正常2例(13.9%),异常1例(7.5%);Lysholm评分,患膝术前平均46.1分,术后88.7分,其中优11膝、良2膝、中1膝,优良率92.8%,患膝力量达对侧膝的75%以上,可免支具和拐杖行走.无伸膝受限,屈膝活动达130°以上.结论:植骨修补髌骨表面缺损,有助于供区的修复,特别是髌骨的修复,植骨可减少以往自体髌腱移植的不适症状,尤其是髌股关节疼痛.

转化生长因子β对异种骨移植局部免疫因子表达的调节

背景:异种骨移植免疫排斥反应是影响预后的主要问题.然而,对异种骨移植中免疫因子表达和调节的认识尚少.白细胞介素1,白细胞介素6和肿瘤坏死因子α是重要的免疫因子,与移植后排斥反应密切相关.目的;观察异种骨移植局部白细胞介素1、白纽胞介素6和肿瘤坏死因子αmRNA和蛋白质的表达,并探索转化生长因子β对这些免疫因子的调节作用.设计:随机对照实验.单位:解放军第四军医大学西京医院骨科研究所.对象:雄性Balb/c小鼠72只,体质量20～25 g,随机分为3组,复合松质骨载体组,单纯松质骨载体组和空白对照组,每组24只.方法:实验于2003-06/2004-06在解放军第四军医大学西京医院骨科研究所完成.复合松质骨载体组小鼠左侧股部肌间隙植入复合转化生长因子β的松质骨载体;单纯松质骨载体组植入单纯松质骨载体;空白对照组仅行手术,不植入材料.术后4,7,14和21 d观察各组小鼠植骨或手术区周围组织中增殖细胞记数;应用原位杂交和免疫组化技术检测植骨局部多种免疫因子的表达.主要观察指标:各组小鼠移植骨局部组织学观察及细胞密度测定;移植骨局部白细胞介素1α,白细胞介素6和肿瘤坏死因子α mRNA和蛋白质的表达.结果:①各组小鼠移植骨局部组织学观察及细胞密度测定:7 d时,复合松质骨骨粒组较单纯牛松质骨骨粒组增殖组织中细胞密度明显高[(470.63±132.89),(311.46±93.69)个/视野,P＜0.01];但14,21 d时两组间则无明显差异.②各组小鼠移植骨局部白细胞介素1 α,白细胞介素6和肿瘤坏死因子αmRNA和蛋白质哟表达:异种骨移植后的7,14 d,复合了转化生长因子β的异种骨移植局部白细胞介索1α和白细胞介素6蛋白质表达分别较单纯异种骨低(7d白细胞介索1α:42.55±9.65比67.95±17.82,白细胞介素6:48.26±11.17比77.21±15,16;14 d白细胞介素1 α mRNA:84.77±7.42比112.94±7.02,白细胞介素6:78.10±17.22比121.18±15.44,P＜0.01),但对肿瘤坏死因子α而言,则无明显差异(P＞0.05).结论:在异种骨移植局部,多种细胞可以表达白细胞介素1α,白细胞介素6-和肿瘤坏死因子αmRNA和蛋白质.且这种表达受到转化生长因子β的调节.提示了转化生长因子β调节异种骨移植免疫的一种方式.

兔晶体上皮细胞在不同材料人工晶状体表面黏附与增殖状况

目的:观察不同材料人工晶状体表面对体外培养的兔晶体上皮细胞黏附、增殖与移行的影响.方法:实验于1999-08/2002-03在辽宁省人民医院中心实验室完成.选取健康家兔10只,双眼正常.按人工晶状体材料的不同分为5组:聚甲基丙烯酸甲酯人工晶状体组14枚,肝素表面处理后聚甲基丙烯酸甲酯人工晶状体组、聚丙烯酸甲酯人工晶状体组、硅凝胶人工晶状体组、水凝胶人工晶状体组各12枚.将体外培养至第3代的兔晶体上皮细胞用质量浓度为1.25g/L的胰蛋白酶消化为单个细胞,用培养液配置细胞密度为1x109L-1的细胞悬液体外接种到各组人工晶状体表面,流式细胞仪检测培养12 h时细胞附壁的细胞数,相差显微镜下观察细胞生长情况,并定量分析细胞增殖移行速度.结果:实验纳入聚甲基丙烯酸甲酯人工晶状体14枚,肝素表面处理后聚甲基丙烯酸甲酯人工晶状体、聚丙烯酸甲酯人工晶状体、硅凝胶人工晶状体、水凝胶人工晶状体各12枚,全部进入结果分析.①培养12 h各组人工晶状体表面黏附的兔晶体上皮细胞密度比较:聚甲基丙烯酸甲酯人工晶状体组、聚丙烯酸甲酯人工晶状体组均明显高于水凝胶人工晶状体组、肝素表面处理后聚甲基丙烯酸甲酯人工晶状体组、硅凝胶人工晶状体组[(284.75±30.40),(205.00t21.47),(149,17t6.40),(144.33±8.96),(136.17±8.89)个/mm2,P均＜0.01].②兔晶体上皮细胞在不同人工晶状体表面的生长形态观察:各组人工晶状体表面生长的细胞都具有典型的上皮细胞特征,且可见分裂增殖的细胞.③兔晶体上皮细胞在不同人工晶状体表面的增殖移行情况:制造无细胞区后第1天即可看到细胞向心性移行生长,不同材料人工晶状体表面的兔晶体上皮细胞移行速度不同,以硅凝胶人工晶状体组快,聚甲基丙烯酸甲酯人工晶状体组次之,剩余3组较慢.各组无细胞区内的无细胞面积分别为(3.78±0.21),(3.95±0.19),(5.13±0.22),(5.40±0.16),(5.59±0.17)mm2.结论:聚甲基丙烯酸甲酯人工晶状体、聚丙烯酸甲酯人工晶状体的表面易于兔晶体上皮细胞黏附,硅凝胶人工晶状体和聚甲基丙烯酸甲酯人工晶状体则易于诱发其表面的兔晶体上皮细胞增殖、纤维化及移行,而经肝素表面处理后的聚甲基丙烯酸甲酯人工晶状体对兔晶体上皮细胞的黏附、增殖及移行均无明显影响.

自体周围神经植入治疗脊髓陈旧性不完全性断裂伤

背景:临床上常可发现,脊髓损伤患者在排除了脊髓压迫与不稳定等因素外,许多影像学改变极为相似的患者其感觉运动功能的恢复程度差别却很大.研究表明为硬脊膜内的粘连、纤维索条的牵拉、脊髓本身的创伤后瘢痕化、软化、囊肿所致. 目的:观察脊髓减压松解、神经组织植入治疗对陈旧性脊髓不完全性断裂伤的临床效果. ,设计:患者自身前后对照观察.对象:选择1994-06/2002-08解放军第二军医大学长海医院骨科外伤性陈旧性不完全瘫痪患者16例.损伤平面T7～9 5例,T10～12 7例,L1,2 4例.16例患者均曾于伤时行脊柱减压内固定,4例后路手术患者于本次手术前已取出内固定.6例患者曾针对外伤性不完全瘫痪进行过高压氧等治疗.有尿便功能障碍11例;神经根性疼痛4例.按Frankel分级:B级12例,C级4例.单位:解放军第二军医大学长海医院骨科.方法:采用显微外科技术切开患者硬脊膜,将蛛网膜、软脊膜、齿状韧带、神经根起始段与脊髓的粘连及周围的纤维条索彻底解除.将被瘢痕缩紧段的脊髓行3～6个切口纵行切开、深0.1～0.2 mm、长度超过损伤节段;若发现脊髓内囊肿,则切开后吸出其中液体.然后,将自身腓肠神经用显微外科方法去除外膜、束膜,并剪开、使神经组织的质地、外观类似马尾组织,将其排列呈多条状、纵行植入已切开的脊髓处或原囊肿腔内,用9-0的无损伤线与软脊膜适当固定.后用外科防粘连膜和骶棘肌瓣覆盖.主要观察指标:患者术后感觉和运动及尿便功能恢复情况.结果:16例患者平均随访2.5年,均进入结果分析.所有患者感觉和运动均增加1级以上,11例术前有尿便功能障碍者症状明显改善,其中6例按Frankel肌力分级,双下肢主要肌群肌力术后较术前增加2级以上,达4级,恢复行走能力,10例增加1级.结论:解除硬脊膜内粘连,瘢痕段脊髓切开,自体周围神经组织植入桥接,可以明显改善外伤性陈旧性不完全瘫痪患者的尿便功能并恢复其部分感觉运动功能.

低温冻存同种异体半月板与半月板脱细胞基质移植实验效果比较

背景:目前常用半月板供体有3种,即深低温保存的半月板、新鲜半月板和低温冻存的半月板.但移植后均出现不同程度的退行性变.目的:通过对低温冻存的同种异体半月板和半月板脱细胞基质移植效果的比较,寻找更好的同种异体半月板的保存方法.设计:随机对照动物实验.单位:哈尔滨医科大学附属第二医院骨科.材料:雄性日本大耳白兔64只,体质量3.0～3.5 kg.方法:实验于2002-09/2003-09在哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心完成.取成年兔64只,按照体质量配成32对,分别作为供体动物和受体动物.取出供体动物的双膝内侧半月板,将右侧的冻存(-80℃),左侧半月板制成脱细胞基质冻存.将供体半月板分别移植到受体动物后肢对应的膝关节中,左侧为实验侧,右侧为对照侧.术后4,8,12和16周分批取材作大体、影像学、组织学观察.主要观察指标:①兔后肢实验侧和对照侧影像学观察结果.②兔后肢实验侧和对照侧大体观察.③半月板测量结果.④兔腹主动脉灌注结果.⑤兔半月板组织学观察结果.结果:64只兔均进入结果分析.①影像学观察:术后4,8周实验侧和对照侧影像学改变均不明显,术后12周时对照侧较实验侧有轻微的改变,而术后16周时对照侧较实验侧有明显改变,出现不同程度的关节间隙狭窄、骨质增生和软骨下骨硬化(13,0.6分,P＜0.05).②大体观察及半月板萎缩率:实验侧半月板较对照侧萎缩的程度轻,速度慢;萎缩率低[4周萎缩率依次为(15.14±4.62)%,(20.97±4.72)%,P＜0.001;16周萎缩率依次为(19.23±11.27)%,(32.74±10.43)%,＜0.05].③腹主动脉灌注:肉眼未发现半月板周边部有血管再生.④组织学结果:术后4,8,12,16周组织学检查证实实验侧的组织结构明显优于对照侧.结论:兔半月板脱细胞基质移植的效果优于低温冻存的半月板移植,半月板脱细胞基质可以作为同种异体半月板供体保存方法.

人造血管移植修复四肢血管损伤的保肢功效

背景:四肢血管损伤常伴血管缺损,常用自体血管移植修复,但存在来源有限和创伤等缺点.目的:回顾性分析29例人造血管移植修复四肢大血管损伤的保肢功效.设计:回顾性分析.单位:解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军战创伤中心骨创伤科.对象:选择解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军战创伤中心骨创伤科1989-01/2000-12采用人造血管移植修复四肢主要血管损伤患者29例.男23例,女6例.损伤部位:锁骨下动脉9例,腋动脉6例,肱动脉2例,股动脉10例,股静脉1例,腘动脉1例.合并休克11例,占37.9%.合并骨折、脱位8例,周围神经损伤5例,感染3例.方法:采用人造血管与修整后的血管行端端间断吻合.感染性动脉损伤3例在手术中采用旁路迂回感染区,人造血管经过非炎性区再桥接,肌瓣和肌皮瓣覆盖感染区的方法.术后2周及1年随访时采用肢体运动功能评定标准(MAS)评分方法评价肢体功能.主要观察指标:移植血管通畅率和保肢情况.结果:29例均进入结果分析.保肢功效:肢体全部保存住,其中1例由于肢体缺血时间长达12 h已出现神经损害,后期出现足底溃疡.术后2周Doppler血流探测移植血管通畅率100%,1年复查时通畅率96.5%,肢体功能评定优良率为89%.结论:采用人造血管移植修复四肢主要血管损伤是保住肢体及其功能的方法之一,其优势为术后短期评估血管通畅率及肢体功能优良率均较好.

兔股骨缺损模型的建立

目的:传统的兔桡骨骨缺损模型和胫骨骨缺损模型在骨的愈合过程中,不能排除与其紧密相临的尺骨或腓骨骨膜向骨缺损区成骨.为避免这种缺点,拟设计兔股骨1.5gm骨缺损模型,从而提供一种较为科学的骨缺损模型.方法:实验于2004-03/2005-12在解放军第一军医大学南方医院动物所完成.选取健康月龄6个月的新西兰大白兔6只,均制备左侧股骨中段长1.5 cm的段缺性骨与骨膜缺损.从兔左后肢股骨前外侧纵切口,切开皮肤、皮下组织和深筋膜,沿股直肌与股外侧肌间隙锐性分开进入,不切开骨膜,于股骨前外侧放置已塑形好的4孔普通钢板,钢板预弯弧度5°～8°,以使钢板和股骨向前外凸的弧度相吻合.电钻钻孔后依次旋人4枚螺钉固定,可在两边两个螺钉之间各加用一根细钢丝环扎以增加牢固性.于钢板第2、3孔之间,以线锯锯断股骨一侧,用直尺测量股骨1.5 cm长,并标记好另一端截骨线,线锯截断,并切除该段对应的骨膜,造成标准的1.5 cm段缺性骨与骨膜缺损,生理盐水冲洗伤口,缝合后敷料包扎,术后肌注青霉素钠40万u预防感染.术后严密观察6只兔的精神状况、饮食、活动、伤口愈合情况.分别于术后6,12,18周各处死2只,大体观察骨缺损处的表面变化、内痂形成、两截骨端变化、骨缺损修复情况;摄左侧股骨正位X光片观察骨缺损愈合情况.结果:实验选取新西兰大白兔6只,全部进入结果分析.①术后动物一般情况:术后第1天所有兔的精神状况稍差,进食略减少,活动减少,术肢跛行明显,全身无皮疹及畏寒发热.2 d后逐渐恢复正常活动,饮食增加,精神好转.②术后骨缺损区大体观察结果:术后6周骨缺损区有质较软的肉芽组织,无明显骨痂形成.术后12周有少量比较薄的骨痂,骨缺损区为软组织包裹.术后18周骨痂形成较前稍有增多,但骨缺损区仍无骨性连接,骨缺损未愈合.③术后骨缺损区X射线片观察结果:术后6周骨缺损区呈散在点状阻射影,骨缺损区清淅可见;术后12周骨缺损区周围近截骨端有小片状阻射影,骨缺损区呈透亮影;术后18周骨缺损区仍呈透亮影,两骨端硬化、髓腔封闭,骨缺损仍不能愈合.结论:采用股骨制备骨缺损模型,可避免膜性成骨的骨形成作用,神经、血管的解剖部位相对恒定,变异小,制作模型操作简单,且模型的统一性和可重复性好,能更好地观察骨缺损的修复效果.

甲基丙烯酸β羟乙酯水凝胶义眼台植入时巩膜包裹状态对血管化进程的影响

目的:观察甲基丙烯酸改性甲基丙烯酸β羟乙酯水凝胶义眼台植入时有无巩膜包裹对血管化进程和预后的影响.方法:实验于2003-03-01/09-01在解放军总医院眼科实验室完成.清洁级新西兰白兔64只,体质量2.0～2.5 kg,雌雄不拘,随机分为巩膜包裹组和无巩膜包裹组,每组32只兔子(32只眼).麻醉状态下分别进行眼内容剜除水凝胶义眼台植入术和眼球摘除水凝胶义眼台植入术(即水凝胶义眼台植入有无巩膜包裹).术后0.5,1,2,3,6个月取出水凝胶义眼台,切成鼻侧和颞侧半,鼻侧半在显微镜下测量标本3,6,9,12点方位纤维血管组织生长的长度,取4个数值的平均值进行比较,制成5 μm的切片,做单光子发射型计算机断层及病理检查,比较有无巩膜包裹对血管化进程和预后的影响.比较有无巩膜包裹的两种手术方法对义眼台血管化进程及预后的影响.结果:所有动物均完成了实验,64只大白兔均进入结果分析.①术后不同时间植入物纤维血管化程度显示0.5,1,2,3个月时无巩膜包裹组高于巩膜包裹组,无巩膜包裹组在3个月时已完成血管化.②单光子发射型计算机断层检查显示无巩膜包裹组示踪剂99Tcm-MDP 2个月前结果与巩膜包裹组类似,3个月时在植人物内部即呈均匀分布,6个月时的表现与3个月相同;巩膜包裹组3个月时在植入物内部可见同位素浓集但分布不均匀,6个月时同位素在植人物内均匀分布.③两组植入物纤维血管增长是从周边到中心,0.5个月时已有纤维血管组织长入孔隙,孔隙中可见纤维母细胞、中性粒细胞和淋巴细胞,偶尔可见大的巨噬细胞.两组区别表现为相同时间点巩膜包裹组纤维血管填充的孔隙较无巩膜包裹组少,仅在巩膜开窗处纤维血管生长与无巩膜包裹组类似.④64只眼中仅无巩膜包裹组2只眼出现结膜裂开、义眼台暴露,两组的并发症差异无显著性(X2=2.064 5,F=0.492,P=0.151).结论:甲基丙烯酸改性甲基丙烯酸β羟乙酯水凝胶义眼台植入兔眶腔时不用巩膜包裹血管化速度快于用巩膜包裹者,术后出现并发症的概率在统计学方面差异无显著性.

骨痂中转化生长因子-β1基因表达及利用骨痂植骨对术后功能的影响

背景:在骨折愈合过程中,若将骨折端周围的骨痂组织去除,骨折端比较难完全吻合,可以推测这些骨痂组织是人体在修复过程中的必然产物,应该是有益的,拟将这些骨痂做组织学分析和冰冻切片的原位杂交,观察其组织学内容和转化生长因子β1的含量,并做为供骨植于骨折端,了解骨痂植骨在骨折愈合中的作用.目的:通过测定骨痂中的组织学内容和转化生长因子β1的含量来了解延迟手术中骨折端周围骨痂组织的再利用价值.设计:采用骨痂组织原位杂交及随机分组对照的实验.单位:西安交通大学第二医院骨科、台州市中心医院骨科.材料:病例分别选择西安交通大学第二医院骨科和台州市中心医院骨科1994-07/2003-10骨折延迟手术的住院患者51例,在手术中取骨折延迟愈合的骨痂做标本(均已征得患者同意),Dig标记试剂盒购自Boehringer Mannheim公司,转化生长因子β1寡核苷酸探针的序列:CTTGCTGTA CTGTGTGTC CAA,由DNA合成仪合成,X线计算机系统(CR)购自日本富士公司.方法:在骨折后的2,4,6和8周,在手术中取出少量骨痂做标本,采用不脱钙的骨痂组织做冰冻切片,采用非同位素Dig标记原位杂交,观察转化生长因子β1在骨痂中的基因表达.术中将骨断端清理后,在骨折牢固固定的同时,再将原骨痂植于骨缺损处及骨折周围.对延迟手术的患者分别采用单纯骨痂植骨、髂骨植骨,骨痂加髂骨植骨,经1～4年患者复诊随访,平均1年9个月.主要观察指标:①骨折不同时期骨痂中的组织学内容和转化生长因子β1的含量.②不同植骨方式对骨折愈合时间的影响.结果:参加治疗51例,有7例因死亡和到外地生活而未能进行随访,评定44例,纳入结果分析.①骨痂中转化生长因子β1的基因表达:骨折后第2周,骨折端有少量纤维骨痂,软骨骨痂较多,转化生长因子β1在软骨小岛内的软骨细胞中高表达.骨折后4周左右转化生长因子β1在成骨细胞内表达显著.8周左右大量骨痂生长,并以软骨化骨为主,成纤维细胞、骨痂、成骨细胞、骨小梁越来越多,术后6周转化生长因子β1在各种细胞内的表达消失,但随着骨重建过程增强,8周时骨基质中转化生长因子β1表达又有增高趋势.②不同植骨方式的愈合时间:不同的植骨方式在愈合时间上没有显著性差异.结论:转化生长因子β1在骨愈合的平衡中发挥重要作用,不同阶段骨痂的组织变化和转化生长因子β1量的变化有着必然的联系,骨痂是机体修复和重建的产物,骨痂植骨再利用是一种可行的方法,它对需要植骨的患者可减少其痛苦和损伤.

低强度脉冲超声波对人骨膜细胞的生物学效应

目的:从细胞水平探讨低强度脉冲超声波对体外分离培养的人骨膜细胞的生物学效应,分析低强度脉冲超声波可能的作用途径,为合理化的临床应用提供实验依据.方法:实验于2002-05/11在香港中文大学矫形外科学系完成.选取香港中文大学威尔士亲王医院矫形外科收治的1例27岁尺骨骨不连患者,以其尺骨骨膜培养的传2代细胞用于实验.按低强度脉冲超声波(30 mW/cm2)作用于体外培养的人骨膜细胞的时间剂量分为4组:5 min/d组,10min/d组,20min/d组,空白对照组.在超声波作用1,2,4 d后检测各组DNA合成量、四甲基偶氮唑蓝摄取情况、碱性磷酸酶活性及骨钙素分泌量.结果:与空白对照组比较,5 min/d组,10 min/d组,20 min/d组给予低强度脉冲超声波后,骨膜细胞DNA合成及四甲基偶氮唑蓝摄取量无明显变化(P＞0.05);10 min/d组与20 min/d组骨膜细胞单位质量蛋白中碱性磷酸酶活性显著升高(P＜0.05);20 min/d组骨膜细胞受1,25-二羟基维生素D3刺激后分泌骨钙素显著增加,形成钙结节能力显著增强(P＜0.01).结论:20min/fd以内剂量的低强度脉冲超声波对人骨膜细胞的生长增殖无明显影响,但能够增强人骨膜细胞碱性磷酸酶活性的表达,促进细胞分泌骨钙素及钙盐沉积,具有显著促进人骨膜细胞向成骨细胞分化的生物学作用.

胶质细胞源性神经营养因子对培养脊髓运动神经元的影响

背景:胶质细胞源性神经营养因子对运动神经元具有营养作用,但不同浓度的营养因子对培养运动神经元体外生长影响的作用缺乏量化数据.目的:采用体外培养胚胎大鼠的脊髓运动神经元,观察不同浓度胶质细胞源性神经营养因子对其生长活性的作用.设计:以体外培养细胞为对象的验证性观察.单位:河北医科大学第二医院神经内科.材料:实验于2001-01/2002-09在河北医科大学第二医院神经内科实验室完成.选择成年清洁级雌雄SD大鼠合笼,取孕15 d的大鼠胚胎进行脊髓分离.方法:取孕鼠15d胚胎的脊髓腹侧半组织进行原代体外分离培养.胶质细胞源性神经营养因子组按浓度1,10,50,100 μg/L分为4组.对照组为不含胶质细胞源性神经营养因子的培养液.各组设立8个复孔L,共做2个批次.从细胞形态学及应用MTT法观察不同浓度胶质细胞源性神经营养因子对大鼠脊髓运动神经元的影响.主要观察指标:培养运动神经元的细胞存活数目和细胞突起的长度.结果:①脊髓运动神经元细胞突起的长度比较:胶质细胞源性神经营养因子1μg/L组、10μg/L组、50μg/L组和100μg/L组明显高于对照组[(107.4±35 .406 8,160.5±38.564 9,450.5±60.640 3,293.5±67.3814,82.8±7.9725)μm,t=2.610-2.647,P＜0.01].②细胞存活数:胶质细胞源性神经营养因子1μg/L组、10μg/L组、50μg/L组和100μg/L组明显高于对照组[(13.9±0.899 9,16.1±0.668 0,20.1±0.667 9,26.0±0.603 0,10.5±0.782 O)μm,t=2.211-2.312,P＜0.05].③MTT比色微量分析:胶质细胞源性神经营养因子1 μg/L组、10μg/L组、50μg/L组和100μg/L组明显高于对照组[(0.350±0.059 8,0.366 7±0.071 9,0.381 9±0.063 8.0.395 3±0.060 5,0.285 8±0.032 5)μm,t=2.259-2.577,P＜0.05].结论:不同浓度胶质细胞源性神经营养因子对体外培养大鼠胚胎脊髓运动神经元有不同程度的促生长作用.

模拟失重条件下骨形态发生蛋白2诱导成骨细胞蛋白激酶MEK 1的活性变化

背景:模拟失重条件下,骨形态发生蛋白2诱导的大鼠骨肉瘤成骨样细胞(ROS17/2.8)的I型胶原α1链的基因表达下降,而丝裂原激活的蛋白激酶信号传导通路中的蛋白激酶MEK1参与了骨形态发生蛋白2对成骨细胞I型胶原α1链mRNA表达的调节过程,但是在模拟失重条件下MEK1的活性如何变化尚不清楚.目的:观察模拟失重条件下由骨形态发生蛋白2诱导的ROS17/2.8细胞中MEK1激酶活性的变化.设计:不完全随机对照的实验.单位:解放军第四军医大学航空航天生物动力学教研室.材料:大鼠骨肉瘤成骨样细胞.方法:实验于2002-08/2003-01在北京航天医学工程研究所航天细胞与分子生物学实验室完成.在地面1 G和回转器模拟失重条件下培养ROS17/2.8细胞,培养时间分别为24,48和72 h.分为7组:第1组,空白对照组,即1G条件下不加骨形态发生蛋白2培养24 h;第2组,1 G培养24h;第3组,失重培养24h;第4组,1G培养48 h;第5组,失重培养48 h;第6组,1G培养72 h;第7组,失重培养72 h;第2组至第7组均加入骨形态发生蛋白2.培养结束前1 h加入骨形态发生蛋白2(500 mg/L),1 h后提取细胞蛋白,应用Western Blotting法检测MEK1的活性.主要观察指标:观察细胞中的总ERK1/2和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)的含量.结果:①模拟失重条件下骨形态发生蛋白2诱导后ROS17/2.8细胞的总ERK1/2的表达:各实验组细胞的总ERK1/2蛋白表达量无明显差异.②模拟失重条件下骨形态发生蛋白2诱导后ROS17/2.8细胞的磷酸化ERK1/2的表达:第1组,细胞培养液中不含骨形态发生蛋白2在1 G重力条件下培养24 h,p-ERK1/2呈低水平表达,第2组,即培养液中加入骨形态发生蛋白2在1 G条件下培养24 h,p-ERK1/2的表达量明显高于第1组(P＜0.01).各模拟失重组p-ERK1/2表达量均低于相同时间点1 G重力对照组,即第3,5,7组的表达分别低于第2,4,6组(P＜0.01),且随着失重时间延长,第3,5,7组的p-ERK1/2表达量呈逐渐降低的趋势(P＜0.01).结论:模拟失重条件下骨形态发生蛋白2诱导的成骨细胞丝裂原激活的蛋白激酶信号通路中蛋白激酶MEK1的活性下降.

局部血管生成因子的表达与骨折愈合过程中不同压应力的变化

目的:探讨在骨折愈合过程中向骨折端施加不同压应力与其促进局部血管再生的关系.方法:实验于1999-06/2000-03在全军交通医学研究所完成.采用新西兰大耳白兔30只,复制右后肢胫骨骨折模型,用自制的外固定器加压固定,按施加应力的不同分为不施加应力组、(11.05±1.68)N/cm2应力组、(28.32±3.83)N/cm2应力组、(39.90±2.34)N/cm2应力组、(46.16±1.71)N/cm2应力组、(59.03±2.77)N/cm2应力组,每组5只.各组动物于骨折后3周取骨折端骨组织标本,提取组织蛋白,用Western blot方法检测各组动物骨折端骨组织的血管内皮生长因子、血小板Ⅷ因子相关抗原的表达. 结果:实验纳入的30只动物均进入结果分析.①在一定范围内骨折断端的血管内皮生长因子相关抗原的表达量随所加应力的增加而增加,(28.32±3.83) N/cm2应力组血管内皮生长因子表达明显高于其他各组(P＜0.01),其吸光度值为4 758.93,当超过这一高限后它们的表达又随所加应力的增加而减少.②在一定范围内骨折断端的血小板Ⅷ因子相关抗原的表达量随所加应力的增加而增加,(39.90±2.34)N/cm2应力组血小板Ⅷ因子相关抗原表达高于其他各组(P＜0.01),其吸光度值为2 849.94,超过这一高限后它们的表达也随所加应力的增加而减少.结论:在一定范围内向骨折端施加的轴向应力能促进骨折端新生血管的生成,但当所加应力超过一定的限度后这种促进作用就逐渐减弱,甚至可能起反作用.

PCI-hTGF-β1转染体外培养成人退变椎间盘细胞及其表达产物的测定

背景:人转化生长因子β1基因可用于椎间盘退变的基因治疗,但有效载体的构建是实验的关键.目的:测定真核表达载体PCI-hTGF-β1转染体外培养成人退变椎间盘细胞可否表达产物人转化生长因子β1,为椎间盘退变的基因治疗提供实验基础.设计:单一样本实验.单位:山东省创伤骨科研究所,一所市立医院骨科.材料:实验于1999-10/2001-01在山东省创伤骨科研究所实验室进行.椎间盘标本均为椎间盘突出症患者手术中取材(获患者知情同意).标本1为30岁女性的L4/5椎间盘,标本2为38岁女性的L5/S,椎间盘.方法:①培养成人退变椎间盘细胞:标本离体30 min内取回实验室,收集原代培养的纤维环细胞和髓核细胞.②转染:将细胞置于24孔培养板中,每孔细胞数目在5.5×105 个,应用构建的PCI-hTGF-β1真核表达载体对其进行转染,并设立转染PCI组和未转染组.③用免疫组织化学方法对转染48 h后的细胞进行表达产物测定.主要观察指标:两个标本中,各组原代纤维环细胞和髓核细胞中真核表达载体PCI-hTGF-β1的阳性细胞产物的吸光度值比较.结果:①标本1:原代纤维环细胞和原代髓核细胞中真核表达载体PCI-hTGF-β1的阳性细胞产物的吸光度值为PCI组的3.49,3.69倍,为未转染组的3.55倍.②标本2:原代纤维环细胞和原代髓核细胞中真核表达载体PCI-hTGF-β1的阳性细胞产物的吸光度值为PCI组的3.56,3.46倍,为未转染组的3.43,3.33倍.结论:PCI-hTGF-β1是人转化生长因子β1基因在体外培养退变椎间盘细胞转染中有效的真核表达载体,可以成功转染体外培养的成人退变椎间盘细胞,并可获得人转化生长因子β1基因产物的高表达.

一次缺血预处理对严重缺血再灌注损伤肾移植模型肾功能恢复的保护效应

目的:利用大鼠肾移植模型观察缺血预处理对长时间冷缺血造成严重缺血再灌注损伤的移植肾脏的保护作用.方法:实验于2004-11/2005-06在解放军第四军医大学西京医院泌尿外科实验室完成.将40只Wistar大鼠分为两组,实验组(n=20)接受缺血预处理(15 min的热缺血/10 min的再灌注),对照组(7=20)不接受上述处理.然后将移植肾脏用UW液低温保存42 h后行肾移植术.对早期移植肾功能、移植肾组织中Na+及K+-ATPase及超氧化物歧化酶水平进行检测.结果:①实验组移植肾功能恢复比对照组快,血肌酐水平实验组明显低于对照组[术后第3天:(238.5±24.15),(344.37±27.66)μmol/L;术后第6天:(79.37±8.83),(241.5±11.81)μmol/L,P＜0.05或0.01].②移植肾组织中Na+,K+-ATPase水平术后第3,6天实验组明显高于对照组[术后第3天:(0.186±0.013),(0.078±0.024)nkat/g;术后第6天:(0.196±0.029),(0.082±0.111)nkat/g,P＜0.01].③移植肾组织中超氧化物歧化酶水平术后第3,6天实验组明显高于高于对照组[术后第3天:(1 951.3±312.5),(1 408.5±182.3)Nu/g;术后第6天:(1 457.0±171.8),(1 044.4±280.2)NU/g,P＜0.05].结论:一次缺血预处理(15 min/10 min)提高了移植肾组织中Na+及K+-ATPase及超氧化物歧化酶的水平,可以加快严重缺血再灌注损伤移植肾脏的恢复.可以改善长时间冷缺血移植肾的预后.

外源性碱性成纤维细胞生长因子在周围神经损伤运动终板再生中的效应

目的:观察神经损伤晚期修复时,碱性成纤维细胞生长因子对运动终板再生的影响.方法:实验于2001-09/2003-12在广东省第二人民医院骨科实验室进行.①选用健康同龄雌性SD大白鼠50只,行右侧坐骨神经切断,12周后再吻合.③将大鼠随机分为两组,每组25只.实验组于神经缝合处放入浸有生理盐水溶解的碱性成纤维细胞生长因子1 200 u明胶海绵(1 cmxO.5 cmX0.5 cm),术后患肢腓肠肌注射0.2 mL生理盐水稀释的碱性成纤维细胞生长因子1 200 u,隔日1次至28 d;对照组缝合处放入同样大小浸有生理盐水的明胶海绵,术后患肢腓肠肌注射等量生理盐水,隔日1次至28 d.③术后2,4,6,8,12周实验组和对照组各取5只大鼠行神经电生理和组织学检查及超微结果观察.结果:50只大鼠均进入结果分析.①两组大鼠神经电生理检查结果:术后4,6,8周实验组运动神经传导速度比对照组显著加快(31.7±3.12)比(19.30±3.41)m/s(44.50±3.83)比(30.20±4.63)m/s,(48.08±3.45)比(37.10±3.58)m/s,F=7.15～13.65,P＜0.05);术后6,8,12周实验组腓肠肌诱发动作电位显著高于对照组(10.12±3.10)比(6.87±3.82)mV,(15.80±3.21)比(10.12±3.23)mV,(28.70±5.61)比(19.98±4.10)mV,F=5.20～6.12,P＜0.05).②两组大鼠腓肠肌光镜及电镜观察结果:实验组和对照组镜下均可见再生运动终板,可见初级突触间隙形成,术后第8周,运动终板进一步形成,且实验组较对照组运动终板染色深,可见次级突触间隙形成.术后12周,实验组运动终板形态与着色接近正常.结论:神经损伤晚期修复时碱性成纤维细胞生长因子可促进运动终板再生.

用于组织工程骨构建研究的兔单一负重骨缺损模型

目的:为组织工程骨构建及修复负重长骨缺损的研究提供标准化的实验性骨缺损动物模型.方法:本实验于2004-10/2005-04在南方医科大学南方医院组织工程实验室和实验动物研究中心完成.①测量成年新西兰大白兔5只10具股骨干标本相关解剖数据并据此改进兔股骨固定方法.②18只新西兰大白兔随机分为3组,每组6只,分别制备10 Hmm,15 mm,20 mm的股骨干中段骨和骨膜缺损,普通钢板螺丝钉及钢丝固定.(③术后4,8,12周分别摄X射线侧位片进行定性分析、双能量X射线骨密度测量仪(DEXA)测量骨密度进行定量分析,各时间点每组各取2只标本做组织学检查.结果:23只兔均进入结果分析.①兔股骨测量结果:股骨长度(9.41±3.0)mm;股骨干中点横径(7.4±0.4)mm,矢状径(5.8±0.4)mm;骨皮质平均厚度(1.2±0.1)mm;髓腔平均直径(4.1±0.2)mm.②大体观察:4周时各组骨缺损均为纤维组织填充;8周时10 mm骨缺损组已经见到骨痂连接;12周时10 mm骨缺损组骨痂坚实,无异常活动,而15 mm,20 mm骨缺损组均为纤维瘢痕组织填充,去除内固定后有异常活动度.③X射线观察缺损区骨生长情况:10mm骨缺损组第12周时骨缺损区图像与4周时相比有明显的新骨形成;而15 mm,20mm骨缺损组各时间段均无骨性填充影像;DEXA测量结果显示10 mm骨缺损组在12周时新生骨已达临近骨组织密度的一半,而15 mm,20 mm骨缺损组各时间段的骨密度均为零.④组织学检查:12周时10 mm缺损组由新生骨和软骨组织填充,部分髓腔再通;15 mm,20 mm骨缺损组在12周的观察期内只有骨断端和钢板螺丝钉周围有少量骨痂生长.以上各项检查显示:10mm骨缺损组均于8～12周出现骨性愈合;15 mm和20 mm骨缺损组直到12周仍未见骨愈合现象.结论:钢板螺丝钉固定的兔股骨干15 mm以上的实验性骨缺损不能自行愈合,可用于组织工程骨的血管神经同步构建研究.

旋转恒定强磁场对大鼠骨密度及生物力学参数以及破骨细胞影响的体内外实验

目的:探讨磁场直接提高骨密度的作用途径,从而为骨质疏松的磁疗提供科学依据.方法:实验分别于2003-12/2004-06在深圳大学生命科学学院微生物基因工程重点实验室及香港城市大学深圳研究中心细胞学实验室完成.①体内研究:选择雌性SD大鼠90只,随机分为6组,每组15只,除假手术组外另5组大鼠均切除卵巢.曝磁处理于卵巢切除2周后进行.假手术组仅手术切除卵巢附近一小块脂肪;去卵巢组仅进行卵巢切除术;去卵巢+钙组另外给予200mg/kg苏糖酸钙灌胃,1次/d;去卵巢+钙+磁30 min/d组在去卵巢+钙组的基础上给予30 min/d曝磁30 d处理;去卵巢+磁30 min/d组仅给予去卵巢大鼠30 mir/d曝磁30 d处理;去卵巢+磁60 min/d组在去卵巢+磁30 min/d组基础上曝磁时间延长为60 min/d,共30 d.分别磁场对各组大鼠骨密度、骨强度、骨钙含量、雌二醇和骨钙素的影响.检测成骨细胞、破骨细胞的生长和功能的指标-骨碱性磷酸酶及尿脱氧吡啶交联水平.②体外研究:为进一步在细胞水平阐明磁场影响骨密度的原理,培养RAW264.7细胞株(前破骨细胞),使用破骨细胞分化因子诱导其向破骨细胞分化,同时外加磁场处理,观察磁场对RAW264.7细胞株生长、成熟情况的影响.另外在不同强度磁场下培养兔破骨细胞,观察对骨片的吸收情况.结果:纳入大鼠90只,全部进入结果分析,无脱失.①体内研究:各组大鼠骨密度及生物力学参数的变化:所有曝磁组大鼠的骨密度均高于去卵巢组,其中去卵巢+磁60 min/d组大鼠显著高于去卵巢组(F=6.98,P＜0.05).各曝磁组大鼠骨碱性磷酸酶含量显著高于去卵巢组及假手术组(F=6.98,9.14,P＜0.05).各曝磁组大鼠尿脱氧吡啶交联水平显著低于去卵巢组(F=21.41,P＜0.01).②体外研究:强恒定磁场对RAW264.7细胞生长、分化和功能的影响:在磁场作用下培养的经破骨细胞分化因子诱导的RAW264.7细胞株加速凋亡,而兔破骨细胞裙边消失,吸收骨片的能力丧失.结论:旋转恒定磁场能够促进大鼠成骨细胞的生长和分泌功能、抑制破骨细胞生长和破骨功能,从而提高骨密度及骨强度,对于骨质疏松有较好的干预效果.

不同配方可注射性羟基磷灰石/硫酸钙骨替代材料的性能分析

目的:评价自行研制的含不同质量羟基磷灰石的可注射性硫酸钙骨替代物的理化特性,选择一种含合适比例羟基磷灰石的可注射性硫酸钙骨替代物.方法:实验于2004-10/2005-04在瑞典隆德大学医学院骨科实验室完成.室温条件下,将单纯α-半水硫酸钙和10%,20%,30%,40%,50%不同质量比例的羟基磷灰石混合均匀后,用Gillmore双针法,材料万能测试机,注射器推注法测定含不同质量羟基磷灰石的α--半水硫酸钙与固化液欧乃派克混合后的凝固时间(初凝时间和终凝时间),抗压强度和可注射能力.结果:含10%,20%,30%,40%,50%质量羟基磷灰石的α--半水硫酸钙初凝时间分别为(18.1±2.3),(17.9±2.3),(16.7±2.1),(14.8±1.6),(12.3±2.0)min;终凝时间分别为(25.2±2.2),(24.2±2.1),(22.4±2.1),(20.1±2.2),(18.9±2.1)min;抗压强度分别为(15.1±1.1),(13.4±0.9),(12.1±0.9),(10.7±0.6),(9.3±0.5)MPa;可注射的平均时间分别为(7.8±0.6),(6.9±0.7),(6.1±0.5),(5.8±0.4),(4.8±0.3)min.结论:含40%质量羟基磷灰石的α--半水硫酸钙较适合作为可注射性骨替代材料的要求,并可以扩大可注射性硫酸钙骨替代物的应用范围.

化学合成siRNA对原代皮层神经元NgR表达的抑制效应

目的:了解化学合成siRNA对原代培养神经元NgR表达的抑制效果和对细胞的毒性作用.方法:实验于2005-03/07在上海市消化疾病研究所进行.①取怀孕16 d的SD大鼠3只进行大鼠原代皮层神经元培养.②化学合成一段针对大鼠NgR基因编码区的siRNA,用阳离子脂质体转染大鼠皮层神经元.③分别于转染前、转染后24,48,72,96 h行反转录-聚合酶链反应检测NgR mRNA水平;转染后48 h行免疫细胞化学检测NgR表达的变化;碘化丙啶染色检测转染后各时间点神经细胞的存活情况.结果:①转染siRNA后24h和48 h NgR mRNA水平明显下降,到72 h明显回升,转染后96 h NgR mRNA水平与转染前已无显著差异.②与转染无关序列oligo的细胞相比,转染siRNA的细胞其NgR表达明显下降.③碘化丙啶染色显示转染后24和48 h,用脂质体转染的细胞(包括转染siRNA、无关序列Oligo和单纯脂质体组)其碘化丙啶阳性率与非转染对照组无明显差异,而转染后72和96 h碘化丙啶阳性率显著高于未转染组[siRNA组为(12.57±0.69)%和(13.60±0.61)%;无关序列组为(12.64±0.47)%和(13.61±0.37)%;脂质体组为(12.59±0.29)%和(14.08±0.31)%;未转染组为(8.41±0.16)%和(8.40±0.71)%;P＜0.05]但在各时间点,脂质体转染的各组间碘化丙啶阳性率不存在明显差异.结论:化学合成siRNA能有效抑制原代皮层神经元的NgR表达,并于短期内维持于低水平.该段siRNA转染的毒性作用主要来自于转染试剂,与序列本身无明确关系.

血管内皮细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞后心肌移植对促进心肌缺血大鼠心功能恢复的效果评价

目的:观察血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞后心肌移植对缺血性心脏病心功能的影响,并比较联合治疗与基因治疗、细胞治疗单独使用的疗效差别.方法:实验于2003-07/2004-08在中南大学湘雅二医院心胸外科实验室及中心实验室完成.以Wistar近交系大鼠建立心肌缺血模型.选取模型制备成功48只大鼠随机分为4组:联合组、细胞组、基因组、对照组,每组12只.联合组在心肌梗死模型建立2周后于心肌梗死区移植血管内皮细胞生长因子-骨髓间充质干细胞,细胞组移植等量的骨髓间充质干细胞,基因组注射脂质体-pcDNA3.1-hVEGF165DNA复合物,对照组注射等容积培养液.假手术组12只仅开胸而不缝扎,不作任何注射.4周后以Buxco系统有创在体检测心功能,测量心肌梗死面积,免疫组化检测Brdu、肌钙蛋白T双染评估移植细胞的存活与分化.结果:对照组有2只于移植后第2,3周死亡,终进入结果分析为联合组12只、细胞组12只、基因组12只和对照组10只,假手术组12只.①移植治疗4周后,联合组心肌梗死面积为(27.8±3.0)%,低于细胞组(37.0±10.1)%(P=0.035)与基因组(37.1±5.2)%(P=0.033).②Buxco检测心功能显示联合组左心室收缩压、左心室等容收缩期室内压大上升速率高于细胞组与基因组[左心室收缩压:(104.5±9.1),(93.9±11.9),(93.6±13.9) mm Hg,(P=.026,0.022);左心室等容收缩期室内压大上升速率:(4 971.1±371.3),(4420.6±424.9),(4 361.8±617.6)mm Hg/s,(P=0.030,0.017)],左心室等容收缩期室内压大下降速率低于细胞组与基因组[( 210.3±449.5),(3 751.3±431.2),(3 587.5±763.5)mm Hg/s,(P=0.036,0.005)],左心室舒张末压有低于细胞组与基因组[(3.1±3.5),(6.5±4.9),(6.1±5.8)am Hg,(P=0.155,0.202)]的趋势.③Brdu、肌钙蛋白T双染示各治疗组心肌梗死区心肌细胞数量不同程度多于对照组,部分为双染阳性细胞. 结论:血管内皮细胞生长因子转染骨髓间充质干细胞移植可用于治疗缺血性心脏病,其综合疗效优于基因细胞治疗与治疗的单独应用.

利用菲立磁细胞内标记恒河猴骨髓基质细胞的初步实验

目的:探索利用菲立磁和转染试剂体外磁性标记恒河猴骨髓基质细胞的可行性,为临床上应用磁共振成像追踪标记细胞奠定基础.方法:实验于2004-04/2005-05在南方医科大学珠江医院全军神经医学研究所完成.纳入健康恒河猴3只,无菌条件下取骨髓,梯度密度离心法分离获取恒河猴骨髓基质细胞,使用"菲立磁-多聚赖氨酸复合物"标记骨髓基质细胞,采用普鲁士兰染色、电镜和锥虫蓝排除实验等方法鉴定菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记恒河猴骨髓基质细胞的效率和细胞的活力,并对菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记骨髓基质细胞的增殖和分化能力进行评估. 结果:①菲立磁可以高效率地标记骨髓基质细胞,标记效率在99%左右.②普鲁士蓝染色显示菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记骨髓基质细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒.③电镜结果显示菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记的骨髓基质细胞胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡.④与正常未标记的细胞相比较,菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记对骨髓基质细胞的活力、增殖和分化等能力没有明显的影响.结论:菲立磁可以用来体外标记恒河猴骨髓基质细胞.

小鼠胚胎神经干细胞的体外生长特性和相关基因的表达

目的:观察小鼠胚胎神经干细胞的体外生长特性并检测其相关基因的表达.方法:实验于2005-02/06在暨南大学医学院中心实验室进行.①取妊娠13.5 d昆明小鼠分离胚胎大脑中的神经干细胞,用添加碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基进行体外培养,取培养3 d的神经球接种于多聚赖氨酸包被的培养瓶,用含血清的培养基诱导分化.②免疫细胞化学检测细胞表面抗原.③四甲基偶氮唑盐法绘制生长曲线.④流式细胞术检测细胞周期.⑤反转录-聚合酶链反应和免疫细胞化学技术对神经干细胞进行鉴定.结果:①胚胎神经干细胞及其分化细胞的抗原表达:血清诱导8 h,分化细胞中(8.9±5.6)%细胞呈Tubulin阳性,(87.5±7.4)%细胞胞浆呈胶质纤维酸性蛋白阳性表达.未诱导细胞近100%呈巢蛋白阳性,仅有极少数细胞Tubulin阳性或胶质纤维酸性蛋白阳性.②胚胎神经干细胞的细胞周期:从小鼠胚胎大脑获取的神经干细胞3 d左右进入指数生长期;原代培养细胞83.8%处于静止期/DNA合成前期.③原代与传代细胞均表达巢蛋白mRNA,聚集形成的神经球巢蛋白阳性.血清诱导4 h胚胎神经干细胞开始转录神经元相关基因Tau和胶质细胞相关基因胶质纤维酸性蛋白.结论:从小鼠胚胎大脑可成功分离获得大量胚胎神经干细胞,并在含碱性成纤维细胞生长因子的条件培养基中迅速增殖,血清诱导下分化生成神经元和星型胶质细胞.

骨髓间充质干细胞与肌源性细胞移植改善缺血性心脏病兔心功能的对照观察

目的:探讨骨髓间充质干细胞和肌源性细胞移植治疗缺血性心脏病的可行性.方法:①实验于2001-08/2002-04在北京协和医院血液科细胞培养室和动物实验室完成.选用健康雄性新西兰大白兔70只.由其胸骨获得骨髓间充质干细胞,进行培养并经5-氮杂胞苷诱导分化为肌源性细胞.采取结扎前降支的办法建立兔心肌梗死模型.②实验过程中死亡20只,将剩余50只分为5组:正常组(正常新西兰大白兔,未造模),模型组(建立心肌梗死模型,不给予其他处理),移植干细胞组(建立心肌梗死模型后1个月移植骨髓间充质干细胞),移植肌源性细胞组(建立心肌梗死模型后1个月,移植肌源性细胞),对照组(注射IMDM无血清培养基),每组10只.③采用BL-410生物机能实验系统软件记录其血流动力学变化(左心室内压大上升速率),以了解心功能变化.④两组计量资料间差异比较采用t检验.结果:建立心梗模型时死亡6只,移植过程中及移植后共死亡14只,50只进入结果分析.左心室内压大上升速率:正常组和移植干细胞组及移植肌源性细胞组明显高于模型组和对照组[(6 910±360),(4 830±470),(4 820±510),(2 460±370),(2 500±360)mm Hg/s,t=11.75～27.39,P＜0.05];移植于细胞组及移植肌源性细胞组明显低于正常组(t=11.11,10.59,P＜0.05).结论:移植骨髓间充质干细胞及肌源性细胞均能改善实验动物的心功能,但不能使实验动物的心功能完全恢复正常.

5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的特点及可行性

背景:骨髓干细胞移植成功的定性指标是标记移植的细胞至组织器官后存活并发挥了正常的功能.目前细胞学研究方面采用的标记方法有酶联标记、氚胸腺嘧啶核苷标记、荧光标记和5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记等.目的:观察5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的特点.设计:单一样本观察.单位:华北煤炭医学院附属医院心胸外科.材料:实验于2003-07/2004-12在华北煤炭医学院中心实验室完成.取月龄3个月的日本大耳白兔6只,雌雄不限,体质量(3.00±0.25)kg.方法:①利用密度为1 073 g/L的Percoll分离骨髓的单核细胞,以含体积分数为0.1的胎牛血清的低糖Dulbecco's改良的Eagle's培养基培养与扩增间充质干细胞,纯度可达95%左右.②用5-溴脱氧尿嘧啶核·苷标记骨髓间充质干细胞24,48,72,96 h后的检测标记率(标记组);阴性对照为未经5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞;空白对照为以磷酸盐缓冲液或正常鼠血清替代一抗.主要观察指标:①3组各检测200个细胞,并在不同时间点观察.②5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记的骨髓间充质干细胞免疫组织化学染色结果及细胞计数结果.结果:①标记组均见5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞,5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性反应物位于细胞核,呈棕色、颗粒状或弥漫性分布;对照组未见阳性细胞.②标记组24,48,72,96 h 5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞的数目分别为48±2,100±4,173±2,178±3,随着标记时间的延长,标记率逐渐增高,标记72 h后标记率在85%以上.③阴性对照和空白对照组各时间点均为0.结论:①用5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的佳时间是72 h.②标记后检测的敏感性好,在低倍镜中亦可见,适合于大块组织的定量研究.③结果表明5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞是可行的.

脐血单个核细胞颈内动脉输注对血管性痴呆大鼠学习记忆能力和海马神经元突触可塑性的干预

目的:以主动回避反应和脑海马齿状回长时程增强为指标,观察颈内动脉输注脐血单个核细胞后血管性痴呆大鼠学习记忆能力和脑海马神经元突触可塑性的变化.方法:实验于2005-03/07在解放军第三军医大学生理教研室和大坪医院野战外科研究所完成.选取清洁级24月龄Wistar大鼠36只,随机分为正常对照组、模型对照组、脐血单个核细胞组,12只/组.选取解放军第三军医大学大坪医院产科的健康足月妊娠产妇(产妇均签署知情同意书),无菌条件下穿刺脐静脉,收集胎盘脐血后体外分离脐血单个核细胞.模型对照组、脐血单个核细胞组应用改良Pulsinellis四血管阻断法建立血管性痴呆大鼠模型,正常对照组不进行椎动脉烧灼和颈总动脉夹闭.造模后24 h脐血单个核细胞组颈内动脉输注5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记的脐血单个核细胞6×109 L-1,正常对照组和模型对照组输注等量生理盐水.采用电脑控制的穿梭箱系统和海马齿状回长时程增强系统检测各组大鼠学习记忆能力及其电生理的改变.结果:实验选用36只大鼠,全部进入结果分析.①造模后4,8周各组大鼠主动回避反应率的比较:与正常对照组比较,模型对照组明显降低[(90.0±4.3)%,(42.5±5.0)%;(92.5±5.0)%,(45.8±3.6)%;P均＜0.01];与模型对照组比较,脐血单个核细胞组显著提高(P均＜0.01).②造模后4,8周各组大鼠脑海马齿状回长时程增强诱导率的变化:模型对照组诱导率较正常对照组均明显降低(91%,17%,χ2=13.59,P＜0.01;91%,25%,χ2=10.97,P＜0.01);脐血单个核细胞组诱导率较模型对照组显著提高(χ2=4.44,P＜0.05;χ2=4.20,P＜0.05).③各组造模后不同时间给予高频刺激后群体电位振幅的变化:造模后4,8周模型对照组较正常对照组均明显降低(P均＜0.01);脐血单个核细胞组较模型对照组均显著提高(P均＜0.01).④各组高频刺激前后脑海马齿状回长时程增强潜伏期的变化:造模后4,8周模型对照组较正常对照组均明显延长(P均＜0.01);脐血单个核细胞组较模型对照组均显著缩短(P均＜0.05).结论:慢性脑缺血可使大鼠脑海马齿状回长时程增强的诱导率、群体电位的振幅和潜伏期呈显著下降趋势,引起大鼠认知功能的损害,而颈内动脉输注脐血单个核细胞可显著易化脑海马齿状回神经元突触的可塑性,改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力.

转化生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞体外构建纤维蛋白胶软骨模块

目的:观察体外构建骨髓间充质干细胞、改良纤维蛋白胶及生长因子的组织工程软骨模块的可行性.方法:实验于2004-07/12在南方医科大学附属珠江医院中心实验室进行.选取新西兰兔10只,密度梯度法分离培养兔骨髓间充质干细胞,在培养系统中加入生长因子(含10μg/L转化生长因子β1,100 mol/L地塞米松,50 mg/L维生素C,以及1%ITS-A.培养第2,4,6,8天采用四甲基偶氮噻唑法在酶标仪上检测吸光度值表示细胞增殖.于培养7,14 d行细胞爬片甲苯胺蓝染色及Ⅱ胶原免疫组化.诱导后骨髓间充质干细胞种植于改良纤维蛋白胶支架上,加入生长因子诱导培养,于培养7,14,21 d行形态组织学及透射电镜检查.结果:实验兔10只均进入实验结果分析.①四甲基偶氮噻唑法测定培养第6和8天后,实验组骨髓间充质干细胞增殖的吸收度值高于对照组(实验组:0.455 4±0.020 6,0.534 8±0.016 9;对照组:0.427 0±0.025 5,0.505 7±0.036 8,P＜0.05).②细胞爬片甲苯胺蓝染色细胞周围有蓝色基质.Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性.③诱导后骨髓间充质干细胞在改良纤维蛋白胶支架中培养,Masson染色可见胞浆及细胞周围有胶原的形成;Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性.透射电镜可见细胞代谢旺盛.结论:骨髓间充质干细胞、改良纤维蛋白胶及生长因子的组织工程模块体外培养系统中,改良纤维蛋白胶支架相容性好,转化生长因子β等生长因子促进骨髓间充质干细胞在改良纤维蛋白胶支架增殖,诱导分化成软骨细胞表型.

单细胞反转录酶聚合链式反应技术对胰岛干细胞标记物胰岛素促进因子的鉴别

目的:利用干细胞分化获得胰岛细胞后目前还没有较理想的鉴别方法,实验通过单细胞反转录酶聚合链式反应技术鉴别胰岛干细胞标记物胰岛素促进因子,以建立一种检测胰岛干细胞的有效方法.方法:实验于2001-10/2005-08在加拿大多伦多大学和南京大学附属鼓楼医院完成.①将收集培养2～4周的单个胰岛干细胞用于实验.②胰岛活性测定实验中,选择1×106分化的胰腺干细胞,用低浓度和高浓度葡萄糖分别刺激1～4 h,检测12,14,24 d培养液中胰岛素的浓度.③单细胞反转录酶聚合链式反应检测胰岛素促进因子基因实验中,选择12个单个胰腺干细胞进行检测,另取12个单个未分化的干细胞作为对照.聚合链式反应体系为20μL.聚合链式反应扩增反应条件为94℃预变性4 min,94℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸2 min条件下循环35次.聚合链式反应产物以质量浓度为20g/L的琼脂糖凝胶电泳.结果:①分化的胰腺干细胞培养液中胰岛素浓度的检测:培养12,14,24 d时培养液中胰岛素的浓度分别为42.6,68.2,73.5 IU/L,随着时间的延长,呈逐渐升高的趋势.②单个胰岛干细胞胰岛素促进因子反转录酶聚合链式反应检测结果:12个单个胰岛干细胞中有7个胰岛素促进因子表达呈阳性,而作为对照的12个未分化干细胞均未检出,两者差异显著(P＜0.001).结论:采用单细胞反转录酶聚合链式反应检测方法为胰腺干细胞的鉴定和纯化提供了技术保障,证明单细胞反转录酶聚合链式反应是一种检测胰腺干细胞标记物的有效方法.

胚胎和新生大鼠神经干细胞培养与分化的特性比较

目的:比较胚胎和新生大鼠神经干细胞的体外培养与诱导分化特性,为脊髓损伤、神经再生等疾病的治疗提供参考依据.方法:实验于2004-11/2005-05在安徽医科大学微生物学实验室完成.选取清洁级孕12 d的SD大鼠和新生1 d的SD大鼠各1只.①分别将胚胎鼠和新生鼠的大脑皮质体外分离培养,每3天换液1/2,每7 d传代1次.②选取第3代神经干细胞克隆球吹打成单细胞悬液接种于预先涂有多聚赖氨酸的盖玻片的12孔培养板中,补足神经干细胞分化培养基,继续培养7 d,进行神经干细胞的诱导分化.③通过形态学观察和Nestin免疫细胞化学鉴定,以及5-溴脱氧尿核苷法检测神经干细胞的增殖能力,并检测分化成熟的神经细胞标志抗原MAP2、胶质纤维酸性蛋白抗原的阳性细胞数及细胞总数.结果:①胚胎鼠与新生鼠原代、传代、分化培养的细胞形态学观察结果:胚胎鼠形成的神经球数量和每个神经球所含细胞数均多于新生鼠.胚胎鼠与新生鼠培养的球形克隆均可连续传代获得大量亚克隆细胞,并诱导分化成3种主要形态的神经细胞.②神经干细胞的鉴定结果:原代和传代的细胞均呈神经干细胞标志性蛋白-Nestin阳性反应,结合悬浮培养有神经球形成的现象,证明所观察细胞为神经干细胞.③胚胎鼠与新生鼠不同时间段单位面积Nestin与5-溴脱氧尿核苷阳性细胞数、细胞总数、阳性率的比较:两组培养1,3,7,11,14,28 d后单位面积Nestin与5-溴脱氧尿核苷阳性细胞数、细胞总数及阳性率均有显著差异(t=2.41～92.71,P＜0.01或0.05).④胚胎鼠与新生鼠神经干细胞分化指标的测定:胚胎鼠及新生鼠的MAP2阳性细胞分别为(32.6±5.6)%,(30.7±6.7)%,抗原胶质纤维酸性蛋白阳性细胞分别为(47.5±9.4)%,(50.3±8.9)%,P均＞0.05.结论:从胚胎鼠和新生鼠的大脑皮质均能够成功分离培养出神经干细胞,表达神经干细胞特异性标志蛋白Nestin,并具有自我更新及体外扩增传代能力.胚胎鼠神经干细胞数量多且增殖能力强,更适合用于神经再生与修复的临床治疗.

兔骨髓源成骨细胞与人部分脱钙骨基质构建组织工程骨修复骨缺损的实验研究

目的:观察兔骨髓源成骨细胞与人部分脱钙骨基质构建组织工程骨的可行性及其骨缺损修复作用.方法:实验于2004-03/2005-01在哈尔滨医科大学第一临床医学院动物实验中心完成.①选取日本大耳白兔36只,雌雄不限,随机分成两组,即实验组和对照组各18只,每组再随机分成3小组即4,8和12周组各6只,另选3只日本大耳白兔作为空白组.②将实验组所有动物于胫骨结节处用骨穿针刺入骨髓腔抽取骨髓2.0 mL,进行分离、培养和诱导,适时将功能状态良好的兔骨髓源成骨细胞以一定细胞浓度与人部分脱钙骨基质支架材料复合构建组织工程骨,并于复合后24,48和72 h用扫描电镜观察细胞在支架材料孔隙内贴附、生长、增殖和功能情况.③所有动物于右侧桡骨中段制作1.5 cm骨膜骨缺损模型,实验组骨缺损处植入组织工程骨,对照组骨缺损处植入人部分脱钙骨基质支架.于术后4,8,12周行X射线检查、大体观察、组织学检查,对比研究其成骨和血管化过程及其骨缺损修复能力.结果:①兔骨髓源成骨细胞与人部分脱钙骨基质复合后24 h在材料孔隙内部分贴附良好,部分堆积成团;48 h基本全部贴壁并有胶原分泌;72 h全部贴壁,细胞完全伸展,相邻细胞间有突起相互连接,细胞分布均匀,数量增多,并有大量胶原分泌.②术后12周,实验组X线有明显阻射,骨缺损部位塑型基本完成,骨髓腔已开始再通;对照组支架材料X线阻射进一步增强,两端已愈合,已开始塑型.空白组术后无X射线阻射,无成骨.③实验组和对照组随着时间的推移其成骨量和新生血管数量逐渐增多,实验组4,8,12周组织学血管面积测定值均高于对照组[(2.068±0.216)%比(0.532±0.102)%,(2.976±0.304)%(1.302±0.354)%,(3.708±0.382)%比(2.246±0.402)%,P＜0.05].结论:兔骨髓源成骨细胞与人部分脱钙骨基质生物相容性良好,支架材料为细胞生长提供了良好的三维空间,用兔骨髓源成骨细胞与人部分脱钙骨基质构建组织工程骨是可行的,构建的组织工程骨具有良好的骨修复作用.

胰酶分次消化及无血清角化细胞培养基培养甲床上皮细胞的体外实验

目的:探讨甲床上皮细胞体外培养及传代的方法.方法:实验于2004-10/2005-04在吉林大学第一医院中心实验室完成.①标本消毒后,切取甲床并剪碎.②2.5g/L胰蛋白酶+3g/L乙二胺四乙酸1:1混合液,37℃下消化重复3次,获得细胞悬液.③离心两次,清洗细胞,加入无血清角化细胞培养液制成细胞悬液,计数后接种于25 mm培养瓶中.④37℃,体积分数为0.05的CO2、饱和湿度的培养箱内培养,每2天换液1次.⑤至单层细胞铺满近培养瓶底的80%以上时进行传代.⑥第3代细胞检测项目:倒置显微镜下观察细胞生长情况并摄片;细胞计数,绘制生长曲线;鼠抗人角蛋白17抗体做免疫细胞化学.结果:①细胞生长情况:倒置显微镜观察接种后的细胞12 h后,大部分贴壁,11d左右时细胞生长密度可达瓶底的70%～80%,呈铺路石样排列.②免疫细胞化学鉴定结果:培养的细胞70%以上特异性角蛋白17抗体染色阳性.③生长曲线和群体倍增时间:接种后一两天细胞数减少,自第3天起细胞数迅速增多,至9～12 d达高峰.对数期细胞群体倍增时间为4.46 d.结论:利用酶消化法成功培养出人甲床上皮细胞,所得细胞纯度高并能传代培养,为深入研究甲床细胞的病理生理及分子生物学奠定了基础.

内皮前体细胞移植对新血管形成的促进作用

目的:观察体外培养的内皮前体细胞自体移植后在缺血肢体新血管形成和改善血液灌注过程中的形态学变化及其作用.方法:①实验于2002-08/2003-04在解放军总医院心内科实验室完成.选用成年雄性新西兰白兔20只.随机将动物分为2组,分别为细胞移植组和对照组(肌肉注射磷酸盐缓冲液1 mL),各10只.实验2个时间点3,5周各5只.②细胞移植组兔抽取骨髓,分离单个核细胞,采用内皮细胞专用培养基(添加体积分数0.2胎牛血清,肝素1×104 U/L和青霉素1×105 U/L)体外培养扩增内皮前体细胞并给予鉴定.细胞移植组动物肌肉注射内皮前体细胞悬液,移植细胞数量为(7.4±1.7)×106,共注射5个点.③分别饲养3和5周后行激光多普勒灌注显像显示缺血肢体血液灌注情况;行腹主动脉造影计数右侧大腿自腹股沟韧带至膝关节的血流时间,以股骨中点的垂直线为标准,计数侧支血管数目;行组织学和免疫组织化学检测观察缺血肌肉组织标记细胞是否整合至血管壁内.④采用t检验比较计量资料间差异.结果:①内皮前体细胞贴壁后呈纺锤体形,原代细胞呈集落生长,生长速度较慢,传代以后分布较均匀,生长迅速.原代细胞培养时可见较多杂细胞存在,但传代2次以后细胞形态非常单一.I型荆豆凝集素、乙酰化低密度脂蛋白和抗Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体鉴定均为阳性,细胞纯度达100%.②内皮前体细胞移植后3周,激光多普勒灌注显像检测显示细胞移植组缺血肢体血液灌注显著改善(t=5.96,P＜0.01),血管造影显示细胞移植组侧支血管生成增多(t=5.28,＜0.01),血流速度增快(t=-6.85,P＜0.01).细胞移植后5周,切开动物缺血肢体皮肤发现,细胞移植组皮肤、皮下组织和肌肉基本不形成粘连,而对照组粘连严重,此时激光多普勒灌注显像检测显示细胞移植组和对照组血液灌注检测无显著差别(P＞0.05),但造影检测显示细胞移植组侧支血管数目明显多于对照组,血流时间明显短于对照组(t=3.32,-4.62,P＜0.01).③组织学检测显示对照组缺血肢体存在肌肉坏死现象,同时有大量炎细胞浸润,而细胞移植组未见未见肌肉坏死和炎细胞浸润,细胞追踪显示大量标记的细胞整合至血管壁内形成内皮细胞.结论:①骨髓中的内皮前体细胞可以在体外大量扩增,从而达到满足自体移植的需要.②内皮前体细胞自体移植后可以参与新血管形成,进而形成侧支血管,有效改善缺血组织的血液灌注.

表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对人胎脑室下区神经干细胞增殖分化的影响

背景:由于神经干细胞分化的多向性和不确定性给临床应用造成巨大困难,因此,探讨神经干细胞增殖分化条件已成为解决这一问题的关键.目的:观察表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对人胎脑神经干细胞增殖分化的影响. 设计:以培养的人胚神经干细胞为观察对象,随机对照实验.单位:解放军第一军医大学珠江医院儿科.材料:实验于2004-01/05在全军儿科中心实验室进行.随机在广州市某三级甲等医院产科选取自愿水囊引产的16周胎儿2例(胎儿父母签署同意书),取其脑室下区组织分别在无血清培养基和血清培养基进行细胞培养.方法:采用含有表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子以及表皮生长因子+碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基对人胎脑室下区组织进行原代细胞培养;两种生长因子的浓度均为20 μg/L,采用血清培养基对原代培养的细胞克隆球进行分化实验;并采用免疫组化技术对分化细胞进行检测.主要观察指标:各组克隆球数量及其分化为神经元和星形胶质细胞的变化.结果:①碱性成纤维细胞生长因子组、表皮生长因子+碱性成纤维细胞生长因子组形成的原代克隆球数量无显著差异[(150.3±14.9),(173.6±26.4)个/孔,P＞0.05],但均明显多于表皮生长因子组[(99.5±14.9)个/孔,P＜0.01].②碱性成纤维细胞生长因子组以及表皮生长因子+碱性成纤维细胞生长因子组克隆球分化为神经元的数量明显多于表皮生长因子组,而表皮生长因子组产生较多的星形胶质细胞.结论:①碱性成纤维细胞生长因子能促进人胎脑室下区神经干细胞增殖,所形成的细胞克隆球能分化出较多的神经元.②两种因子合用并没有获得明显的优于单用碱性成纤维细胞生长因子的结果,提示不存在协同作用.

嗅鞘细胞移植治疗晚期脊髓损伤的长期安全性评价:磁共振成像3年随访

目的:在证明嗅鞘细胞移植治疗晚期脊髓损伤的近期安全性和有效性的基础上,进一步评价其长期的安全性.方法:选择2001-11/2002-12北京西山医院神经疾病研究治疗中心收治的晚期脊髓损伤患者171例,随机选择其中1O例纳入本组观察,男9例,女1例;年龄22～55岁,平均36.7岁;病程1.5～8年,平均4.4年;受伤原因包括车祸、摔伤、医源性损伤、机器挤压伤等.所有患者均接受胚胎嗅鞘细胞移植治疗,即取胚胎嗅球,消化成单个嗅鞘细胞后,培养两三周,然后移植到患者脊髓损伤部位的上下处.术后采用1.5T MRI脊髓扫描定期随访,观察嗅鞘细胞移植物的生物安全性.结果:10例患者平均获随访3.2年,均进入结果分析.术前MRI表现均有脊髓软化,变形,囊肿,瘢痕形成并萎缩.随访期间,患者无细胞移植相关性副反应.术前术后MRI扫描对比,脊髓移植部位及其周围未发现新生肿瘤、出血、水肿、囊肿形成、神经结构破坏以及感染(脓肿)等病理性改变.结论:采用嗅鞘细胞移植手术治疗脊髓损伤患者,3年随访MRI成像无异常所见,是安全的.

肝硬化患者骨髓间充质干细胞诱导分化为肝样细胞的实验

目的:探讨肝硬化患者骨髓间充质干细胞向肝样细胞的诱导分化,为患者自体骨髓间充质干细胞移植修复肝损伤提供实验依据.方法:实验于2005-05/06在解放军北京军区总医院肝病中心完成.骨髓来自北京军区总医院肝病中心一例肝硬化患者,应用Ficol1分离液分离培养其骨髓间充质干细胞,应用人肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞进行定向诱导分化,采用倒置显微镜形态观察、反转录聚合酶链反应及免疫组织化学染色检测诱导前后不同阶段骨髓间充质干细胞中白蛋白和角蛋白18核糖核酸和蛋白的表达,通过细胞形态及其白蛋白和角蛋白18的表达等指标确定骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化.结果:①经Ficoll分离液分离得到的人骨髓间充质干细胞体外培养20 d左右细胞生长达80%～90%汇合,其形态呈较均一的长梭形.②人骨髓间充质干细胞经肝细胞生长因子诱导培养3周后,诱导组中出现圆形细胞,呈克隆样生长.③人骨髓间充质干细胞经肝细胞生长因子诱导2周时,表达少量白蛋白核糖核酸,于诱导3周时可见白蛋白核糖核酸的表达明显增多.④应用肝细胞生长因子诱导3周后人骨髓间充质干细胞胞浆中自蛋白及角蛋白18染色均呈阳性.结论:肝硬化患者骨髓间充质干细胞在肝细胞生长因子诱导下能定向分化为肝样细胞.

骨髓基质细胞复合人脱细胞骨的成骨活性

背景:寻找一种既保持支持功能良好又具有一定成骨活性的同种异体骨是治疗骨缺损的重要研究课题.以往曾对比测定脱细胞骨的生物力学性质,发现其与正常大小的新鲜骨质在大抗压力,压强方面无显著性差异.人脱细胞骨复合骨髓基质细胞后的成骨活性如何,是否能够保持成骨的活性是临床医生非常关心的问题.目的:研究人脱细胞骨复合经诱导的骨髓基质细胞的实验效果,观察细胞的黏附和生长情况,并对其成骨活性进行检测.设计:单一样本实验.单位:哈尔滨医科大学附属第二医院.材料:实验于2003-01/2004-08在哈尔滨医科大学附属第二医院实验中心完成.脱细胞骨(取新鲜尸体髂骨块,自愿捐献).方法:用过氧化氢和乙醚去除人髂骨块内的结缔组织和细胞成分,消毒后制备人脱细胞骨.取材活体或新鲜尸体的骨髓行骨髓基质细胞培养,细胞纯化后加入β-甘油酸钠,地塞米松和抗坏血酸等向成骨方向诱导,并进行对照培养.通过碱性磷酸酶和骨钙素检测来确定骨髓基质细胞的增殖和分化情况,将诱导的骨髓基质细胞浓缩后复合到制备好的脱细胞骨块内进行培养.8 d后通过光镜和电镜等形态学观察以及生化指标检测来确定细胞的成骨活性.主要观察指标:①人骨髓基质细胞/脱细胞骨复合物碱性磷酸酶和骨钙素检测结果.②人骨髓基质细胞/脱细胞骨复合物组织学观察结果.结果:①人髂骨块细胞清除干净,骨基质保存良好.②诱导8 d后的骨髓基质细胞碱性磷酸酶和骨钙素含量明显高于对照组[诱导后骨髓基质细胞:(181.54±40.01)nkat/L,(7.2±1.3)μg/L,对照组:无法测到,P＜0.05].③骨髓基质细胞在人脱细胞骨支架内附着紧密,生长良好.结论:人脱细胞骨复合经诱导的骨髓基质细胞在体外具有有效的成骨功能,是一种较为理想的骨组织工程材料.

大鼠脑缺血再灌注损伤后神经干细胞的增殖分化以及通心络的干预效果

目的:观察大鼠脑缺血再灌注损伤后反应性星形胶质细胞及神经细胞的活化增殖情况,以及通心络对脑缺血损伤后内源性神经干细胞的增殖分化作用.方法:实验于2005-03/09在南方医科大学附属南方医院神经内科实验室完成.选取健康雄性SD大鼠160只,随机分为4组:通心络(主要成分为人参、水蛭、全蝎、土鳖虫、蜈蚣、蝉蜕、赤芍、冰片等)1g/(kg·d)组、通心络0.5g/(kg·d)组、模型对照组、假手术组,40只/组.①除假手术组外,各组均建立右侧大脑中动脉阻塞及再灌流模型.假手术组也插入丝线,但不阻塞大脑中动脉.②按Zealonga神经功能评分法对造模后大鼠进行评分,将造模后6 h神经功能缺损评分在2分以上的大鼠纳入实验.③通心络1g/(kg·d)组、通心络0.5g/(kg·d)组按剂量给药,模型对照组、假手术组分别以等量蒸馏水灌胃.各组大鼠于再灌注清醒后即给药,2次/d,分别于缺血再灌注3,5,14,30 d 4个时间点进行取材.④应用免疫组织化学方法观察各组缺血再灌注后不同时间点缺血侧室管膜及室管膜下区、海马齿状回BrdU、BrdU+β-微管蛋白、BrdU+胶质纤维酸性蛋白阳性细胞荧光强度值的变化.结果:实验纳入大鼠160只,终128只进入结果分析.与模型对照组比较,通心络各剂量组于缺血再灌注第3天缺血侧海马、室管膜及室下区BrdU、BrdU+β-微管蛋白、BrdU+胶质纤维酸性蛋白阳性细胞荧光强度值基本相似(P＞0.05);第5,14,30天时均明显升高(P＜0.05);且通心络1g/(kg·d)组均显著高于通心络0.5g/(kg·d)组(P＜0.001).结论:大鼠缺血再灌注损伤后可引起其缺血侧海马、室管膜及室下区星形胶质细胞及神经细胞反应和增殖;而通心络可显著增加大脑中动脉阻塞大鼠的神经干细胞增殖分化能力.

不同发育阶段小鼠纹状体神经干细胞的体外增殖和分化情况比较

目的:分析胚胎、新生以及成年小鼠纹状体神经干细胞的体外培养和分化条件,并比较其体外增殖和分化情况. 方法:实验于2005-02/05在解放军第四军医大学西京医院神经内科实验室完成.选取孕14 d小鼠、出生24 h内的新生小鼠和4月龄的成年小鼠各1只用于实验.①神经干细胞的原代培养:分别将孕14 d小鼠、新生小鼠和成年小鼠处死后取出纹状体组织,轻轻吹打制成单个细胞悬液,接种于无血清的D/F12培养基中,每六七天机械分离克隆传代1次.②神经干细胞的鉴定:采用有限稀释法获得神经干细胞单克隆,继续培养得到大量来自单个细胞的亚克隆.对神经球行免疫荧光染色鉴定.③通过四甲基偶氮唑盐比色法及免疫荧光染色比较胚胎鼠、新生鼠及成年小鼠的神经干细胞的增殖和分化情况.结果:①成功地从胚胎鼠、新生鼠以及成年小鼠的纹状体中分离培养出神经干细胞.②胚胎鼠、新生鼠及成年小鼠的神经干细胞分化为神经元的比例均为7%～11%,分化为星形胶质细胞的比例均为76%～88%,差异无显著性意义(P＞0.01).③与成年小鼠比较,胚胎鼠和新生鼠的神经干细胞增殖旺盛(P＜0.01),而胚胎鼠和新生鼠之间差异无显著性意义.结论:随着小鼠年龄的增加纹状体神经干细胞的增殖能力逐渐减弱,但仍保持着分化为神经元和胶质子细胞的能力.胚胎和新生鼠源性的神经干细胞均具有较强的增殖能力,为寻找理想的移植细胞提供了思路.

诱导型一氧化氮合酶在关节软骨缺血再灌注损伤及骨细胞凋亡中的作用

目的:观察兔膝关节软骨缺血再灌注损伤过程中诱导型一氧化氮合酶的表达规律及软骨细胞的凋亡情况,探讨诱导型一氧化氮合酶在关节软骨缺血再灌注损伤中的作用.方法:实验于2004-03/09在泰山医学院形态学研究室完成.①选择健康新西兰白兔45只,随机分为假手术组5只,暴露股动静脉但不阻断血运,术后4 h取材;缺血组5只,缺血4 h不恢复血运即取材;缺血再灌注组35只,阻断股动静脉4 h后恢复血运,于缺血再灌注2,4,8,24 h,3,7,14 d取材,每时点各5只.②采用免疫荧光法测定软骨内诱导型一氧化氮合酶的表达阳性细胞,染色成功后用激光共聚焦显微镜观察并扫描记录.阳性细胞标记为红色荧光.③采用原位末端标记法测定凋亡软骨细胞数目,染色成功后在显微镜下观察并记数.细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞,即凋亡细胞.结果:纳入动物45只,均进入结果分析.①缺血再灌注组诱导型一氧化氮合酶阳性细胞数高于缺血组和假手术组[假手术组、缺血组、缺血再灌注2,4,8,24 h,3,7,14 d分别为0,(1.20±0.40),(22.20±1.30),(33.00±1.58),(40.00±1.58),(33.80±1.30),(18.20±1.48),(11.20±1.67),(3.00±1.00)个/mm2,P＜0.01].②缺血再灌注组软骨细胞凋亡数高于缺血组和假手术组[假手术组、缺血组、缺血再灌注2,4,8,24 h,3,7,14 d分别为[(0.50±0.40),(1.20±0.45),(7.80±1.30),(12.60±1.14),(16.60±1.12),(17.80±1.30),(15.20±0.87),(13.60±0.89),(4.40±1.67)个/mm2,P＜0.01].③诱导型一氧化氮合酶的表达与软骨细胞凋亡数高度相关(r=0.716,P=0.046).结论:诱导型一氧化氮合酶参与了软骨缺血再灌注损伤,并可能是触发软骨细胞凋亡的重要因素.

25 G经结膜免缝合玻璃体切割系统用于黄斑部手术的实用性和安全性

背景:传统的20 G经睫状体平坦部玻璃体切割手术虽可以改善玻璃体视网膜疾病的治疗预后,但手术损伤较大,并发症多.目的:探讨25 G经结膜免缝合玻璃体切割系统用于黄斑部手术的实用性和安全性,总结微创玻璃体切割术初步的临床经验.设计:病例分析.单位:武装警察部队总医院眼科,北京中日友好医院眼科,香港中文大学眼科及视觉科学系,香港威尔斯亲王医院眼科. 对象:选取2003-07/2004-07武装警察部队总医院眼科收治的16例黄斑疾病患者(16眼)为观察对象,16例患者均为单眼发病,黄斑前膜9例,特发性黄斑裂孔3例,外伤性黄斑裂孔2例,玻璃体黄斑牵引综合征2例;患病时间3～36个月,术前视力0.06～0.4之间.方法:16例患者术前进行眼科专科检查,包括视力检查、Amsler表检查、裂隙灯检查、散瞳眼底检查、眼压测量.对黄斑裂孔患者行光相干断层扫描检查.手术应用25 G经结膜免缝合玻璃体切割系统,均在局部麻醉下行微创玻璃体切割术.切割速率1 500次/min,灌注瓶高度40～50 cm,吸引负压为550 mm Hg,手术中眼压维持在29～35 mm Hg.术中用特制套管针颞上、颞下和鼻上象限做经结膜的三个长为0.5 mm的巩膜穿刺口,并留置经结膜的套管.将灌注管的管头插入颞下方的套管,建立灌注.25G玻璃体切割头等内眼操作用的器械均从鼻上或颞上方留置的两个套管出入,进行玻璃体切割、剥膜等眼内操作.术毕拔除套管,除非泄露不止,不缝合球结膜和巩膜穿刺口.术后对全部患者进行3～18个月随访.主要观察指标:①手术所需时间,术中建立"三通道"的时间.②手术前后患者眼压的变化.③内眼操作结束后患者穿刺口漏水情况.④术后患者视力、并发症、裂孔封闭情况.结果:纳入实验的16例患者全部进入结果分析.①16例患者均顺利完成手术,手术时间28～56 min,平均手术时间37 min.建立手术"三通道"所需要的时间平均为84 s,关闭手术切口需要的时间平均为32 s.②术前眼压平均为16.4 mm Hg,术后第1天、第1周、第1个月的平均眼压分别为13.5,15.5,17.9mmHg.③内眼操作结束后,16例患者中共3例患者4个穿刺口漏水.经2mL型一次性注射器从原穿刺口注射1.0～2.0 mL消毒空气入眼球后,3个穿刺口闭合,泄漏停止,但仍有1个穿刺口漏水,用6-0可吸收线缝合.④术后平均住院时间为5 d.16例患者中共14例术后视力提高,平均提高3行视标,其中5例患者视力恢复到0.8以上,8例患者视物变形消失,3例视物变形减轻;剩余2例患者术后视力无提高.无低眼压及其他手术并发症.5例患者黄斑裂孔均达到了临床封闭.结论:25 G经结膜免缝合玻璃体切割系统能够简化玻璃体切割手术操作,可减少手术损伤及术后并发症,使手术时间缩短,患者恢复快.

人工骨负型三维网架制作工艺研究

目的:从快速成型、材料学和生物学的角度分析人工骨制备中微观仿生结构制作的可行性.方法:利用溶解骨负型支架的工艺来制作人工骨内部微管结构.结果:①建立了仿生计算机辅助设计模型,较真实地体现了自然骨内部微管结构的特征.②由得到的模型数据,利用快速成型技术制备出了相应的骨组织微管结构三维网架.③所制备的三维网架具有孔径大小和孔隙率可人为控制的优点.结论:所开发的人工骨工程化制造系统的设计方案有效可行,可以弥补传统生物填充材料由于缺乏适当的微孔结构而无法实现快速活化的缺陷.

两种构型空心加压螺钉固定头颈型股骨颈骨折的生物力学效果评估

目的:比较两种构型空心加压螺钉固定头颈型股骨颈骨折的股骨标本的生物力学特征,为临床治疗股骨颈骨折提供理论依据.方法:实验于2002-11/2004-03在河北骨科研究所完成.将10根股骨随机分成倒等腰三角形组和正等腰三角形组,每组5根.倒、正等腰三角形构型的3枚空心加压螺钉固定头颈型股骨颈骨折的股骨标本,用生物力学机(长春市实验机研究所产CSS-44020生物力学仪,河北骨科研究所提供)测试、比较两种空间构型抗压、抗扭性能及大垂直载荷,所得实验数据均用SPSS 10.0统计软件进行分析.结果:倒等腰三角形组的抗压、大垂直载荷性能明显优于正等腰三角形组,具有统计学意义(P＜0.05);但两者抗扭转性能无显著性差别(P＞0.05)[600和750 N垂直载负下,倒等腰三角形组股骨头下沉位移(0.933±0.135)和(1.310±0.217)mm,正等腰三角形组股骨头下沉位移(1.556±0.235)和(1.975±0.250)mm;扭转2°和4°所需力矩,倒等腰三角形组(3.148±0.765)和(6.658±2.021)N·m,正等腰三角形组(2.847±1.130)和(5.392±1.601)N·m;大垂直载荷倒等腰三角形组(2 069.97±200.864)N,正等腰三角形组(1614.57±80.567)N].结论:对头颈型股骨颈骨折,应用倒等腰三角形构型的空心加压螺钉比正等腰三角形构型的空心加压螺钉固定股骨标本,可获得更好的抗压和体现其大垂直载荷性能的生物力学效果.

计算机辅助对冲技术测定运动神经纤维传导速度分布的研究

目的:研究计算机辅助对冲技术的主要影响因素及运动纤维传导速度分布的正常值.方法:选择2004-05/2005-03知情同意的健康志愿者29人进行计算机辅助对冲技术检测,测定了正中、尺及腓总神经传导速度分布正常值范围,并对慢纤维传导速度(慢纤维速度)的影响因素进行回归分析.观察了2名健康人不同肢体皮温(变化范围2～4℃)的传导速度分布结果和10名健康人的不同计算机辅助对冲技术刺激强度(大、大+15%～50%)传导速度分布的变化.对5名健康人的相同神经采用相同的计算机辅助对冲技术参数和方法分别进行3次重复检测,观察其结果的一致性和可重复性.结果:①室温20～22℃,肢体皮温(31.9±0.89)℃情况下,测得传导速度分布正常值,正中神经慢速度(慢纤维速度CV10%)(47.31±4.58)m/s、中等速度(中速纤维速度CV50%)(52.17±3.78)m/s、快速度(快纤维速度CV90%)(56.14±5.13)m/s;尺神经慢纤维速度(48.46±6.0)n/s、中速纤维速度(53.11±5.16)m/s、快纤维速度(57.33±5.04)m/s;腓总神经慢纤维速度(35.58±5.98)m/s、中速纤维速度(41.61±4.76)m/s、快纤维速度(46.04±3.50)m/s.②回归分析显示:身高、皮温和年龄与慢纤维速度呈负相关,身高是慢纤维速度显著的影响因素(P=0.013).③肢体皮温下降2℃时的传导速度分布结果与标准皮温比较无明显变化,下降4℃的传导速度分布数值明显降低,快纤维速度降低7～10 m/s,慢纤维速度降低3～9 m/s.④大刺激强度和超强刺激(大刺激量+15%～50%)的传导速度分布结果比较显示＜50 m/s的纤维分布明显减少,而快纤维速度无明显差别;超强刺激强度变化对传导速度分布结果无明显影响(P=0.999).⑤计算机辅助对冲技术重复实验传导速度分布结果显示各组之间无显著差异(P正中=0.649,P腓总=0.984).结论:计算机辅助对冲技术对研究不同传导速度的运动神经纤维具有重复性好、无创和敏感性高的特点,能更全面评价运动神经传导特性.因此计算机辅助对冲技术可能在周围神经病变的早期诊断,尤其是发现亚临床病变具有重要临床意义.

采用反求工程和快速原型技术精确定制骨组织工程支架

背景:组织工程基本原理是从患者获取组织,经体外培养扩增种子细胞,接种在支架内,通过支架引导形成三维外形的组织,后植入该患者体内以替代病损组织的功能,以后随着新生血管长入,支架逐步溶解,新生组织终与周围组织完全融合.目的:探讨应用反求工程和快速原型技术定制个体特异的解剖外形骨组织工程支架的可行性,克服常规制作方法的缺陷.设计:定制个体特异的解剖外形骨组织工程支架方法.单位:解放军广州军区广州总医院全军创伤骨科中心.材料:支架CAD设计在广东省机械研究所CAD培训中心完成,支架快速成型制作在广东省龙创域公司完成,快速成型工艺为立体光固化工艺,采用材料为光敏树脂.方法:实验于2004-10/2005-01在广州军区广州总医院全军创伤骨科中心完成.按反求工程的基本原理,采用医学CT/MRI扫描获取患者骨骼的分层图像信息,采用计算机辅助技术进行三维重建和曲面重构建立骨骼感兴趣区域的解剖模型,并在建立的解剖模型的外形轮廓内进行支架内部结构的计算机辅助设计,建立其计算机辅助设计模型,后采用快速成型工艺精确制作骨组织工程支架的原型.主要观察指标:①CT/MRI扫描三维重建与解剖建模结果.②个体化组织工程支架的内部结构设计结果.③个体化组织工程支架快速成型制作.结果:①经CT/MRI图像三维重建,建立了骨关节解剖模型.②计算机辅助设计软件设计支架内部结构成功地建立了骨组织工程支架的实体模型.③骨组织工程支架CAD模型指导快速成型工艺成功地制作了个体化解剖外形的支架,制作的骨组织工程支架内部结构非常精细,具有高孔隙率和较好的孔隙相互连通性能.结论:采用反求工程和先进制造技术,可以任意制作个体化解剖外形的组织工程支架;在所有快速成型工艺中,以立体光固化成型精度高,表面光滑、成型质量好.

股骨上段髓腔的计算机测量方法

背景:临床研究表明假体与股骨髓腔的匹配度决定假体的长期稳定性,以往股骨近端测量主要以正侧位X射线片为主,但存在较多误差.目的:研究股骨上段髓腔截面几何形态的统计规律.设计:重复测量观察.单位:上海交通大学医学院附属第九人民医院骨科.对象:选取无破损尸体股骨标本10个(上海第二医科大学解剖教研室提供).方法:2000-01/03在上海第二医科大学附属第九人民医院骨科完成,以计算机图像处理的方法对股骨上段髓腔截面形态进行自动提取,并提出圆锥曲线拟合的参数化数学方法;同时采用人工方法对10例股骨上段髓腔截面的进行测量.主要观察指标:计算机和人工方法测量突出末端坐标和连接点坐标比较.结果:10个股骨标本均进入结果分析.计算机测量股骨上段髓腔截面突出末端坐标(X,Y)和连接点坐标(X,Y)与人工方法测量结果差异无显著性(P分别为0.993 8,0.996 9,0.958 2,0.960 6).结论:计算机图像处理的方法对股骨上段髓腔截面形态进行自动提取测量法不仅减少了人为误差,且能以计算机自动完成,适合于大批量的形态计量.

天鹅型记忆加压接骨器记忆生物力学特性检测

背景:通过记忆生物力学计算和实验测定,分析肱骨骨折和近关节部位天鹅型记忆接骨器的记忆生物力学特性.目的:通过对天鹅型记忆加压接骨器进行力学测定,分析相关记忆生物力学意义.设计:理论计算和实验测定,互为补充,互为验证.单位:解放军第二军医大学附属长海医院骨科和同济大学生命科学与生物工程学院.材料:实验于2001-01/2003-05在解放军第二军医大学长海医院骨科实验室和同济大学生命科学与生物工程学院实验室完成.选择死于颅脑损伤的成年男性肱骨20根.方法:分别选取成人尸体湿肱骨,制作骨折模型,包绕压敏胶片后以天鹅型记忆接骨器固定,测定加压支和环抱支固定骨折时的应力值.主要观察指标:①环抱支的压力测量结果.②加压支的测量结果.结果:天鹅型记忆接骨器环抱支与肱骨接触部位的应力范围是2.42～22.68 N,而加压支在骨折断面产生的应力较大,应力为13.6 MPa左右.结论:天鹅型记忆接骨器的环抱支应力有利于固定骨折两断端,加压支在骨折断面形成的应力场有利于骨折的愈合.

点式接触动力加压接骨板的生物力学性能和对骨血循环的影响

目的:比较新型点式接触动力加压接骨板和动力加压钢板的力学性能和固定后皮质骨微循环形态学的变化.方法:实验于2002-01/05在第三军医大学西南医院骨科实验室完成.①力学测试:采用山羊新鲜配对胫骨20对,做成横断骨折模型,分别用动力加压钢板及点式接触动力加压接骨板加压固定和骨折断端存在3一间隙情况下固定,进行四点弯曲实验及扭转实验比较两者的力学性能.②骨血液循环改变:采用13只山羊,在左右侧完整胫骨中段分别用点式接触动力加压接骨板和动力加压钢板固定.分别于固定术后1 d,2,6,12周进行活体双硫蓝染色,固定骨段钢板床和横切面观察.结果:13只山羊均进入结果分析.①两种接骨板四点弯曲试验结果:两种接骨板抗弯、抗扭性能差异均无显著性.②两种接骨板动物实验结果:动力加压钢板固定侧术后1 d,2周,6周板下皮质骨外层持续存在缺血现象,直到术后12周微循环恢复;点式接触动力加压接骨板实验侧于术后1 d螺钉孔周围和钢板点接触部位皮质骨缺血,两螺钉孔中间骨段未观察到明显缺血区域,于术后2周已完全恢复.结论:点式接触动力加压接骨板和动力加压钢板的力学性能相似,但点式接触动力加压接骨板可明显保护局部骨微循环.

动脉修复过程中组织结构成分与生物力学指标的变化规律

目的:探讨动脉吻合后的修复过程中,动脉壁弹性纤维和胶原纤维结构成分及吻合口段动脉顺应性的变化规律.方法:实验于2005-03/2005-06在解放军第三军医大学完成.选用健康成年Wistar大鼠50只,雌雄不拘,体质量195～230 g.随机分为动脉吻合术后3,7,14,30 d组和正常对照组,每组10只.动脉吻合手术组麻醉后,显露游离股动脉中部,切断后以12/0尼龙线行端端吻合.正常对照组只显露股动脉不行动脉切断及吻合术.在体测定大鼠股动脉吻合后3,7,14,30 d吻合口段的压力与直径相关数据,分析动脉的顺应性与平均血压的关系.取术后各时间点的动脉段,常规石蜡切片后,分别行弹性纤维和胶原纤维特殊染色,显微图像分析测定两种纤维结构成分的相对含量;同时采用寡核苷酸探针组织切片原位杂交,检测各时间点动脉壁弹性蛋白原mRNA表达变化. 结果:实验大鼠50只均进入结果分析.①与正常对照组相比较,术后3～14 d吻合口段动脉的顺应性逐渐降低,术后14 d降低显著.术后30d有所回升.②术后3～7 d弹性纤维和胶原纤维相对含量与对照组比较无显著变化,术后14和30 d弹性纤维和胶原纤维相对含量高于对照组[弹性纤维:(0.269±0.039),(0.350±0.062);胶原纤维:(0.684±0.031),(0.691±0.023);对照组:(0.189±0.035),(0.294±0.047),P＜0.05].③术后14 d胶原纤维与弹性纤维含量的比值较对照组明显增高(4.20±0.56,1.66±0.39,P＜0.05).④术后3 d动脉壁即有弹性蛋白原mRNA的表达,术后7 d为表达高峰期,随后表达逐渐减少. 结论:动脉吻合后的修复过程中其可扩张能力呈先减弱后有所回升的变化趋势,这种生物力学特性变化与动脉组织结构成分改变密切相关.

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