中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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氨氯地平L-型钙通道阻滞作用以外的血管生物学特性
目的:钙通道阻滞剂是临床上常用的血管扩张剂之一.但近年来,随着新型钙通道阻滞剂的应用,钙通道阻滞剂的多效性得到研究,一些钙通道阻滞剂治疗的益处除扩张血管作用外尚有其他作用,故了解钙通道阻滞剂的多效性将有助于进一步阐明钙通道阻滞剂治疗机制及合理使用钙通道阻滞剂.资料来源:应用计算机检索Pubmed数据库1982-01/2006-01有关钙通道阻滞剂氨氯地平的文章,检索词"calcium antagonist,amlodipine,enantiomer,isomer,racemic mixture",限定文章语言种类为English.资料选择:对资料进行初审,选取符合研究要求的有关文章找全文.纳入标准:①有关氨氯地平的理化特性及其与胆固醇和氧自由基相互作用的研究.②有关氨氯地平调节一氧化氮的生成和意义的研究.③氨氯地平在控制平滑肌细胞增生和基质形成中作用的研究.排除标准:重复研究.资料提炼:共收集到231篇有关氨氯地平L-型钙通道阻滞作用以外的血管生物学特性的文章,排除重复或类似的同一研究,21篇符合研究要求.资料综合:①氨氯地平的理化特性及其与胆固醇和氧自由基的相互作用的研究:氨氯地平在胞膜的浓度比膜外浓度高出1000倍以上,为长效的钙通道阻滞剂,且即使在细胞膜富含高胆固醇动脉粥样硬化时,和细胞膜仍具有较高的亲和力,从而逆转胆固醇对膜结构和功能的不良影响.②氨氯地平调节一氧化氮的生成和意义的研究:氨氯地平可刺激内皮一氧化氮合成酶异构体的形成,但氨氯地平对一氧化氮释放具有对应体特异性,即左旋氨氯地平则对血管内一氧化氮的生成没有影响,右旋氨氯地平能激活内皮一氧化氮合成酶.③氨氯地平在控制平滑肌细胞增生和基质形成中作用的研究:氨氯地平减轻血管平滑肌细胞增生的机制可能为:氨氯地平对钙信号的影响;一氧化氮的生成及抗氧化作用;其他作用.结论:氨氯地平除具有L-型钙通道阻滞剂的特性外,还具有非L-型钙通道阻滞剂相关的多效性.了解氨氯地平L-型钙通道阻滞作用以外的血管生物学特性具有重要临床意义.
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Excel软件在t检验和u检验中的应用
目的:通过Excel模板编制,介绍几种较为常用的且具有实用价值的t检验和u检验方法.方法:实验于2005-10/11在湖南环境生物职业技术学院医学部完成.①为Excel安装"分析工具库":在使用"分析工具"之前,应检查"工具"菜单,确定Excel当前是否安装了"分析工具".如果在"工具"菜单中没有"数据分析"命令项,则需通过调用加载宏来安装"分析工具库".②利用分析工具进行描述统计:选中模板表为当前工作表;单击"工具"菜单→"数据分析"命令,出现"数据分析"对话框;选中"描述统计"项并单击[确定];显示"描述统计"工具对话框;在"输入区域"框输入待分析数据区域B3:C15;"分组方式"区域,选择"逐列"选项;选中"标志位于第一行";选中"输出区域",F1作为存放分析结果的起始单元格;选中"汇总统计"复选框和"平均数置信度"复选框;单击[确定]按钮.结果:统计分析模板具有形式直观、动态性、可修改以及广泛的适应性:可以根据资料特点编制适应读者特殊需要的模板,应用于多个项目组的t检验、成组设计的两样本几何均数比较、u检验中.模板建立后注意保存,多个项目组的t检验中在下次计算时只要将相应数据输入即可;成组设计的两样本几何均数比较中遇到类似的问题直接修改原始数据即可得到计算结果;u检验中在下次计算时只要将相应数据输入即可迅速得到结果.结论:在科学研究中经常需要对原始数据作t检验和u检验等统计分析,使用电子表格软件Excel编制统计分析模板来进行t检验和u检验,对于非统计专业人员来说是一种易学、方便、快捷的好方法.
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近视眼患者波阵面像差的研究
目的:筛选适宜进行波阵面像差引导的个体化切削准分子激光原位角膜磨镶术的患者.方法:选择2004-05/2005-05承德医学院附属医院眼科准分子激光治疗中心收治的拟接受准分子激光原位角膜磨镶术屈光性手术的近视眼患者172例343只眼,分为3组:屈光度数＞-6.00D组124只眼,-3.00D＜屈光度数≤-6.00D组153只眼,屈光度数≤-3.00D组66只眼.分别对3组患者波阵面像差的分布状况进行检查,比较各组间存在的差异.结果:①波前像差由低阶到高阶的均方根值呈递减趋势:低阶像差的均方根值为7.06±2.82,总体高阶像差的均方根值为0.47±0.34,3阶像差的均方根值为0.41±0.35,4阶像差的均方根值为0.18±0.18,5阶像差的均方根值为0.14±0.18.②低阶像差、总体高阶像差、第3阶像差各组间差异均有显著性意义(F=4.61～282.33,P均＜0.05);但第4,5阶像差基本相似(F=1.06～2.81,P＞0.05).③裸眼视力与低阶像差呈明显的负相关;球镜度数与低阶像差、总体高阶像差、第3,5阶像差均存在明显的正相关.结论:波前像差可以精确反映近视患者的屈光状态,并准确引导角膜屈光手术的个体化切削.
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黄金分割——人体环境因子的优化选择
目的:人体始终包围在环境物理因子中,环境物理因子处在何种比例值时,人体的感觉、心情愉决,舒适?利用黄金数比例规律寻找出环境物理因子对人体的佳条件.方法:通过收集和浏览各个学科的大量资料总结和概括出环境温度、湿度、环境光波和声波以及环境气压和氧分压的黄金数比例内容,以及在此条件下的人体感觉.结果:①环境温度的黄金分割值与人体的和谐作用:室温保持22～24℃时,正好处在人体体温(37℃)的黄金分割处.此时人体感觉环境温度不冷不热舒适.②环境湿度的黄金分割值与人体的和谐作用:天气潮湿度处在60%～69%的适度潮湿天气时包含着环境潮湿度的黄金分割数61.8%,此时人体没有干燥和霪湿的感觉.③环境光线的黄金分割值与人体的和谐作用:可见光波长5.3×10-5 cm处在可视光谱波长的黄金数分割点,该波长处于黄光和绿光的界限中,即黄绿光.人的眼睛对可视光线每个部分有着不同的感受性,波长越远离黄绿光敏感性越差,而对黄绿光敏感性为显著,并对机体舒适.④环境声波的黄金分割值与人体的和谐作用:听阈声强级0 dB到痛阈声强级120 dB的黄金分割值分别为45.84 dB和74.16 dB;处在正常范围40～60 dB和响度范围60～80 dB之间,同时也处在乐音区域,乐音对心血管系统、消化系统、腺体分泌、甚至思维活动等都有良好的影响.⑤环境氧分压的黄金分割值与人体的和谐作用:环境氧分压比值在黄金数附近时,给人提供心情愉快机体能完全适应、感觉正常的"中性带".当氧分压比值远离黄金数时,会出现不适应的反常现象;会出现缺氧、烦闷、恶心、呕吐等不良现象.结论:环境物理因子的佳条件是可以选择的.环境温度、湿度、环境光波和声波以及环境气压和氧分压处在黄金数比例附近时,会与人体产生和谐合拍的作用.
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硬膜替代材料胶原海绵应用于神经外科手术患者207例回顾性分析
为了解硬膜替代材料胶原海绵应用于神经外科手术的并发症及其预后情况,采用回顾性分析,计算机随机抽取本院2004-01/2005-04进行神经外科手术的207例患者,根据术中是否使用胶原海绵分为2组:空白对照组83例,胶原海绵组124例.对两组患者的一般情况、术后感染、脑脊液漏、癫痫的发生率进行统计分析.结果两组患者的性别、年龄、病种等一般情况差异无显著性意义(χ2=0.180～1.200或t=1.899,P均＞0.05);术后脑脊液漏发生率胶原海绵组明显低于空白对照组(3.2%,10.8%,χ2=4.902,P＜0.05),术后颅内感染率、癫痫发生率两组基本相似(χ2=0.009～0.048,P均＞0.05).表明胶原海绵作为硬膜替代材料应用于神经外科手术可以降低术后脑脊液漏的发生,而颅内感染及癫痫发生率并不会增高.
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羊膜移植治疗早期重度眼表碱烧伤
纳入重度眼表碱烧伤患者16例,符合国内1982年眼外伤与职业性眼病协作小组通过的重度眼表碱烧伤的分度标准,均知情同意,共16只眼.对患者行羊膜移植术覆盖伤眼角结膜表面,观察术后羊膜转归、角膜透明度及纤维增殖情况.术后3～6个月复查发现,14例患者羊膜贴附佳,均未进行2次手术,眼表稳定,视力在指数/眼前～4.5之间,其中10例角膜遗留不同程度的斑翳.剩余2例患者进行3次羊膜移植未控制住无菌性炎症,角膜表面全周纤维血管增殖,分别行两次对侧健眼角膜缘干细胞移植才控制住炎症,视力恢复差.结果提示羊膜移植可有效应用于早期重度眼表碱烧伤的重建治疗,但对于全周干细胞缺损的患者,则需联合角膜缘干细胞移植治疗.
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可吸收胶原生物材料封阻穿刺口两侧血管壁与人工止血的效果比较
目的 评价在冠状动脉介入诊疗术后,应用Angio-Seal血管闭合器止血的安全性及有效性.方法 ①选择2003-08/2005-12绵阳市中心医院心内科经股动脉穿刺行冠状动脉介入诊疗的患者212例,随机数字表法分为两组:血管闭合器止血组98例,人工压迫止血组114例.两组在年龄、性别以及动脉鞘尺寸等方面差异均无显著性意义.②血管闭合器止血组冠状动脉造影或介入治疗术后即刻拔除动脉鞘管,根据动脉鞘的尺寸选用适当规格的Angio-Seal血管闭合器止血.人工压迫止血组冠状动脉造影或介入治疗术后6 h拔除动脉鞘管,人工压迫止血.③记录两组止血时间、肢体制动时间、止血时的血管迷走反应、术后1周内血管并发症的发生率.结果 ①血管闭合器止血组98例患者,96例成功,成功率97.9%.3例穿刺处出血,1例假性动脉瘤形成.冠状动脉造影止血时间(0.58±0.23)min,下肢制动时间(2.5±0.6)h;冠状动脉介入治疗止血时间(0.67±0.40)min,下肢制动时间(4.4±0.7)h;术后1周内血管并发症的发生率为4.1%.②人工压迫止血组114例患者,止血成功率100%.3例发生穿刺处血肿,2例假性动脉瘤形成,9例发生血管迷走反射.冠状动脉造影止血时间(12.4±6.5)min,下肢制动时间(17.2±5.3)h;冠状动脉介入治疗止血时间(28.3±9.4)min,下肢制动时间(20.4±4.6)h;术后1周内血管并发症的发生率为4.4%.结论 采用Angio-Seal闭合器止血安全有效,较手压止血明显缩短了止血时间及制动时间,未增加穿刺部位血管并发症,并有减少血管迷走反射发生的可能性.
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肾移植术后的肺部感染特点
为提高肾移植后肺部感染的诊断治愈率,选取本院1999-01/2004-12收治的82例肾移植患者术后并发肺部感染的临床资料进行回顾性分析.82例肾移植术后肺部感染患者中,单纯细菌感染32例,真菌感染3例,巨细胞病毒感染13例,卡氏肺孢子虫感染12例,混合感染14例,病原不清8例.其中26例(31.7%)发展成重症肺部感染.治愈63例(76.8%),19例死亡(23.2%).肺部感染是肾移植术后的一种严重的并发症,早期诊断并及时予以抗细菌、抗病毒、抗真菌、抗原虫治疗,同时调整免疫抑制方案,加强对症及支持治疗,有利于提高其治愈率.
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Renfert电子仪器和GEO系列蜡制作固定义齿蜡型的优点
目的:介绍Renfert电子仪器和GEO系列蜡制作固定义齿冠桥熔模蜡型所具备的优点.方法:①Renfert电子仪器(德国仁福公司,Hotty E型).WaxlectricⅡ电子上蜡刀:电子上蜡刀的雕刻刀头已经被预先内部加热,使用时不必放在火焰上加热,可直接取蜡,同时熔模蜡不会被过分加热,避免蜡严重收缩,保证熔模蜡型的高度精确.Hotty LED浸蜡器:通过精确的温度调节来制作统一的内冠蜡型,能够在几秒内制作出厚度均匀一致、高度贴合的内冠.Vario E电子熔蜡器:能将蜡块通过预先加热到理想的制作温度,与WaxlectricⅡ电子上蜡刀结合使用,可以节省较多的操作时间.此仪器装有3个不同熔模蜡的蜡罐,可以被分别打开和控制,使用极其方便.②GEO系列蜡(德国仁福公司,批号2000.5).GEO-Dip:是具有多种型号的浸蜡技术专用小蜡球,放入浸蜡器供电子加热,用来制作铸造冠的内层以及精确度高且厚度一致的烤瓷内冠.GEO-先锋高级通用蜡:是特别为电子上蜡技术调配的,不能供火焰蜡刀使用,以保证熔模蜡型的高度精确,分为两种:一种是通用蜡,表面张力低,硬度较低,用于铸造冠熔模轴面成型;另一种是牙合面蜡,表面张力高,硬度高,可满足牙合面尖窝细微形态的雕塑而不变形,保证(牙合)面的高度准确.GEO-Pontics:这是烤瓷桥的桥体成品熔模蜡,有多种型号,可以帮助烤瓷桥快速成型.GEO-牙(牙合)面成品蜡:它是根据天然牙精确仿制的,有多种型号,提供较多的替换选择.GEO-三角形桥体专业铸道蜡:既可减少竖铸道的时间,又能保证固定桥熔模不变形.GEO Cervical-Wax:是特殊颈部蜡,质软、具有一定的弹性、很容易与代型冠边缘紧密贴合.结果:①节省时间:电子上蜡刀、浸蜡器、电子熔蜡器都是预先加热到理想的温度,在熔模蜡型制作时可以直接取用而无需等待,同时烤瓷桥的桥体成品蜡、金属冠桥的(牙合)面成品蜡的应用,缩短了冠桥熔模蜡型的制作时间,提高了工作效率.②牙冠更密合:浸蜡器及专用蜡的应用,使得浸蜡后的内冠厚度均匀一致且高度密合;特殊颈部蜡的使用,保证了冠边缘与代型的紧密贴合,可有效的防止修复体戴入口腔后造成患者牙颈部黏固料发生溶解在局部形成明显缝隙,造成唾液渗入和菌斑集聚形成继发龋和牙龈炎及牙周炎,甚至影响修复体的固位.③(牙合)面形态更完美:牙(牙合)面成品蜡及牙(牙合)面蜡的应用,可弥补技师操作水平的差异,使之都能够得到(牙合)面形态相似修复体.④固定桥熔模蜡型不变形:通过电子仪器和GEO系列蜡的合理使用,特别是桥体通用蜡的连接、三角形桥体专业铸道的使用,保证了固定桥在制作熔模蜡型后不变形.⑤注意事项:由于每种型号的蜡都有各自的熔点和佳的操作温度,应调整好各熔蜡罐的温度,防止蜡球没有预先加热到理想的温度而影响取蜡和温度过高引起熔模蜡型雕塑困难及增加熔模蜡的凝固收缩;电子上蜡刀的刀头温度也应控制好,否则会延长操作时间,影响熔模蜡型雕塑质量.结论:制作一副质量优良的固定义齿修复体,除医生、技师、护士的相互配合、精心制作外,还与所用器械和材料密切相关.
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应用液态及凝胶态生物载体材料负载同种异体软骨细胞修复全厚关节软骨缺损
背景:应用固态载体作为细胞支架,修复关节软骨缺损,已有成功经验.尝试将液态载体或凝胶态载体材料复合细胞后注入动物体内,观察该方法的可行性.目的:探讨液态载体或凝胶态载体材料氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2负载同种异体软骨细胞修复全厚关节软骨的可行性.设计:对照实验.单位:威海市立医院骨科,山东省创伤骨科研究所.材料:实验于2001-11/2003-09在山东省创伤骨科研究所实验室进行.健康成年新西兰大白兔36只,体质量2.5～4.5 kg,雌雄不限.编号后根据缺损处注入物质的成分随机数字法分成4组,即氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2软骨细胞组、氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2组、氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物软骨细胞组、空白对照组,每组9只.方法:36只大白兔分组后造关节软骨缺损模型,取同种新西兰大白兔关节软骨细胞,体外培养扩增后与20％氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2混合,移植到缺损处进行修复.各移植组缺损处分别注入氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2负载软骨细胞、氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2、氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物软骨细胞组.空白对照组:缺损处不做任何处理.移植后4,8,12周对缺损的修复情况进行大体、光镜组织学评估和电镜观察.据Wakitani评分标准,采用盲法对修复质量作出评价.主要观察指标:①软骨缺损修复程度.②软骨细胞的性质形态,基质中胶原性质、数量及排列方式.结果:①移植的氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2负载软骨细胞中的软骨细胞能很好地生长,4周时,缺损区完全填充.8,12周再生组织与周围正常软骨组织外观相似,界限模糊.组织学检查:形成透明软骨,缺损处被修复.②电镜下:8,12周,修复组织中可见多数成熟的透明软骨细胞及其周围排列不规则的、纤细的、均匀的和无周期性的Ⅱ型胶原.空白对照组仅见纤维修复,再生组织缺乏弹性,表面粗糙,不规则.③修复质量评分:氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2负载软骨细胞组和各组相比在各个时期差异均存在显著性,氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2组和氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物软骨细胞组与对照组相比在各个时期差异均存在显著性[4周:(3.93±1.91),(4.56±1.07),(4.78±1.09),(8.44±1.13)分；8周:(2.80±1.45),(3.24±1.00),(3.33±1.00),(8.44±1.13)分；12周:(2.22±1.10),(3.01±0.69),(3.00±0.71),(9.00±0.87)分,P＜0.001],但两组之间在各个时期无显著的差异(P＞0.05).结论:氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2负载同种异体软骨细胞移植能以透明软骨的方式成功修复兔膝股骨髁软骨缺损,并优于单纯的氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物负载重组人骨形态蛋白2或单纯的氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物软骨细胞的移植.
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孔隙率对锶磷灰石多孔陶瓷骨融合能力的影响
目的:观察孔隙率不同的锶磷灰石多孔陶瓷的骨融合能力差异.方法:实验于2004-06/2005-02在上海第九人民医院动物房和动物手术室完成.24只健康新西兰大白兔随机分为4组,在双侧前肢制造10 mm桡骨缺损,分别植入孔隙率为50%、60%、70%的锶磷灰石多孔陶瓷(掺锶5%克分子数的羟磷灰石)作为实验组,以植入70%孔隙率的羟磷灰石多孔陶瓷作对照组.在术后3,6,12,24周处死动物,大体及X射线摄片观察新骨生成情况,取缺损两端各3 mm长骨组织作组织学图像观察,24周标本作四环素荧光标记及不脱钙硬组织图像观察.结果:24只白兔中有4只死亡,后补充,进入结果分析24只.①术后3周,70%孔隙率锶磷灰石和70%孔隙率羟磷灰石多孔陶瓷的孔隙内有少量骨基质及成骨细胞,6周,70%孔隙率的锶磷灰石多孔陶瓷的成骨现象明显,其余,70%孔隙率羟磷灰石＞60%孔隙率锶磷灰石＞50%孔隙率锶磷灰石.②24周荧光显示70%孔隙率锶磷灰石的荧光强度和面积丰富.③24周硬组织图像显示锶磷灰石陶瓷随孔隙率的增高,陶瓷的降解现象明显.结论:同一孔径、孔隙率高的锶磷灰石成骨现象早,骨量丰富,24周材料降解较明显;同一孔径、同一孔隙率条件下,锶磷灰石比羟磷灰石成骨量大,生物降解明显.
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脱矿脱细胞骨基质环孔隙度作为组织工程椎间盘纤维环细胞支架材料的可行性
目的:观察脱矿脱细胞骨基质环孔隙度是否适合作为组织工程椎间盘纤维环细胞支架.方法:实验于2005-08/2006-01在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室完成.①选用成年健康新西兰兔10只,按随机抽签法分为2组:实验组和对照组,每组5只.实验组取兔股骨近端骨制成环状,改进一般制备脱矿骨基质的方法,删除明胶化步骤,并进行脱细胞处理,使骨组织保留多孔结构,制成支架材料;对照组取兔股骨近端骨制成环状,不进行脱矿脱细胞处理.②两组均使用Zhang氏液体置换法测定材料的孔隙度.结果:新西兰兔10只均进入结果分析.实验组支架材料孔隙率为82.5%～91.1%,平均(87.8±2.8)%;对照组孔隙率为81.3%～88.4%,平均(85.5±2.2)%.两组标本孔隙度比较,差异不明显(P＞0.05).结论:经改进的方法制备的脱矿脱细胞骨基质环保持了骨的多孔结构,孔隙度指标达到作为支架材料的基本要求.
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牛骨形成蛋白与异体脱钙骨基质颗粒及骨水泥复合修复椎体骨缺损:3个月效果随访
目的:将骨形成蛋白-脱钙骨基质颗粒-骨水泥复合材料用于临床修复椎体骨缺损,观察其临床效果,分析椎体骨缺损的修复与重建方法.方法:以2004-04/2006-02在解放军济南军区总医院脊髓修复科就诊的脊髓损伤患者23例为观察对象,男15例,女8例.提取牛骨形成蛋白,制备异体脱钙骨基质颗粒,将二者按1:25的质量比复合后,与骨水泥以1:1的质量比制成复合材料,经充分的动物实验评价后应用到临床.手术方法:所有患者均行气管插管全麻.T10,S1采用后方入路,其余均取前路,前路以CT和(或)MRI示脊髓受压较重的一侧进入.彻底清除对脊髓形成压迫的部分,对局部遗留的空洞清理干净,待骨水泥到拔丝期时将骨形成蛋白-脱钙骨基质颗粒复合物加入混匀复合在一起,复合物固化前植入椎体骨缺损部位,剩余的复合物在台下观察,完全固化后冲洗切口,缝合.为了加强重建椎体的稳定性,同时应用内固定.其中1例因椎体外壳坚硬且完整,复合材料重建后稳定性很好,故未用内固定.术后定时随访,以患者主观感觉和复查时的影象学资料为判定标准.结果:23例患者获得平均9个月的随访.①X射线片示复合材料填充的骨缺损处在术后1个月时可见复合材料与宿主骨边缘模糊,于3,6,9,12,18个月模糊程度缓慢增加,外围骨痂逐渐重新塑建.23例患者无椎体移位,与复合材料相邻的椎体无塌陷,复合材料所在的脊柱节段无侧弯,内固定物无断裂和松动.1例没用内固定的患者,也没有发生椎体移位和脊柱侧弯.②17例获得了3～12个月(平均(9±2)个月)的MRI随访.MRI示术后脊髓减压充分,复合材料处在T1像上呈低信号,复合材料与宿主骨之间没有间隙.在T2像上,复合材料所在部位呈高信号.③患者脊柱无畸形,应用后无不良反应.结论:骨形成蛋白-脱钙骨基质颗粒-骨水泥复合材料是修复椎体骨缺损的理想材料,在体内可与宿主骨终形成"生物铆定".
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加速器照射大鼠伤口愈合过程中血小板源性生长因子及其受体表达与胶原形成的关系
目的:探讨加速器照射后大鼠皮肤伤口愈合过程中血小板源性生长因子及其受体表达与胶原形成的规律.方法:实验于2002-05/2003-06在解放军军事医学科学院附属医院放疗科及解放军军事医学科学院放射医学研究所病理室完成.清洁级雄性Wistar大鼠36只,体质量(200±20)g,随机数字法分为4组,每组9只,1组作为空白对照组,3组作为照射组.在每只大鼠背部脊柱两侧切2个圆形创面,创面直径1.5 cm,深达皮下组织全层,2个创面间隔15 cm.处理完毕后以无菌纱布包扎伤口,动物置于单笼饲养.术后48 h,照射组大鼠背部创口以直线加速器6MeV电子线照射,分组300 cGy组(300 cGy/(次·d),连续照射5次)、400 cGy组(400 cGy/(次·d),连续照射5次)和500 cGy组(500 cGy/(次·d),隔日1次,连续照射3次),照射剂量率为240 cGy/min.观察创面愈合及渗出情况.对照组分别于致伤后2,5,7,10,14,21 d麻醉后取材,照射组均在伤后7,10,14,17,21,28 d取材.常规苏木精-伊红染色病理组织学观察、天狼猩红染色后偏光镜观察胶原纤维含量变化、免疫组化方法和图象分析定性和定量检测各组伤口愈合过程中胶原纤维和血小板源性生长因子及其受体表达的动态变化.结果:实验大鼠36只均进入结果分析.①照射组创面愈合延迟,对照组创面平均11d全部愈合,照射组平均14 d愈合.②照射组肉芽组织产生和胶原纤维的合成受抑制,300 cGy照射组较其他各组胶原纤维细小,排列稀疏.28 d图像分析胶原积分吸光度300 cGy组、400 cGy组、500 cGy组分别为(0.323±0.015,0.349±0.012,0.457±0.019),组间比较差异有显著性(P＜0.05).③照射组血小板源性生长因子-A及受体表达伤后10～14 d达到高峰,对照组7～10 d达到高峰.各时间点300 cGy组与400 cGy组差异不明显(P＞0.05),500 cGy组高峰出现晚,后期较其他组显著升高(P＜0.05).结论:直线加速器照射抑制血小板源性生长因子及其受体表达,并与胶原形成的效果与照射剂量有关,应用低剂量分次照射防治瘢痕增生是很好的选择.
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胫骨骨折大鼠失神经支配条件下骨折愈合过程中大载荷及静态骨计量学参数变化
背景:临床观察表明,截瘫患者骨折常常愈合加快或在下肢有异位骨化形成,表明周围神经系统对骨折愈合有重要的调节作用.目的:观察一侧下肢失神经胫骨骨折愈合过程中骨计量学参数及骨痂形成和生物力学的变化.设计:自身对照动物实验.单位:天津医院.材料:健康雄性Wistar大鼠36只,6个月龄,平均体质量210 g.方法:实验于2001-03/2004-03在天津医院动物实验中心完成.将大鼠一侧下肢制成失神经胫骨骨折模型,对侧制成正常神经支配骨折模型.骨折后2周、4周麻醉状态下处死大鼠,取双侧胫骨,拍X射线片、测定生物力学强度,制备不脱钙切片,进行骨计量学观察.主要观察指标:①两组大鼠骨折后双侧胫骨和骨痂湿质量比较.②X射线平片计分.③胫骨标本生物力学测试结果.④骨折愈合组织形态学观察.结果:①两组大鼠骨折后双侧胫骨和骨痂湿质量比较:骨折后2,4周失神经组重量远大于正常神经支配组[(0.94±0.15)比(0.76±0.14)g,(1.06±0.26)比(0.81±0.10)g,P＜0.05].②X射线平片计分结果:失神经组骨痂形成量明显增多(P＜0.01).③胫骨标本三点弯曲生物力学测试结果:骨折后2,4周失神经组骨痂的强度明显低于正常神经支配组[(9.88±8.49)比(16.62±13.38)N,(12.77±7.55)比(20.19±10.60)N,P＜0.05].④骨计量学检测结果:静态参数与正常神经支配组比较,失神经组矿化骨小梁宽度明显减小(P＜0.05),类骨质宽度增加,破骨细胞指数及骨吸收表面明显增大(P＜0.05),成骨细胞指数及骨形成表面两组无差别；动态参数与正常神经支配组比较,失神经组矿化沉积率明显变小(P＜0.05),类骨质成熟时间延长(P＜0.05).结论:周围神经在骨折愈合早、中期起重要的调节作用,完整的神经支配是骨折愈合所必需的.
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外源性胰岛素样生长因子Ⅰ促创面愈合的特征
目的:观察局部应用胰岛素样生长因子Ⅰ对大鼠皮肤创面愈合的作用,为临床应用胰岛素样生长因子Ⅰ加速创面愈合建立理论和实验依据.方法:实验于2002-05/06在北京世纪坛医院动物实验室完成.①清洁级SD大鼠32只,雌雄不拘,体质量180～200 g.随机分为胰岛素样生长因子Ⅰ组、胰岛素样生长因子Ⅰ+重组人生长激素组、重组人生长激素组、生理盐水组,每组8只.②在大鼠背部脊柱切除直径1.6～1.8 cm的圆形皮肤全层缺损,创面压迫止血后各组分别给药.③胰岛素样生长因子Ⅰ组:每次每个创面给液量0.1 mL,胰岛素样生长因子Ⅰ浓度1 mg/L;胰岛素样生长因子Ⅰ+重组人生长激素组:每次每个创面给液量0.1 mL,胰岛素样生长因子Ⅰ浓度1 mg/L,重组人生长激素浓度0.2 U/mL;重组人生长激素组:每次每个创面给液量0.1 mL,重组人生长激素浓度0.2 U/mL;生理盐水组:每次每个创面给生理盐水,给液量0.1 mL.④分别于伤后1、4、7、11、14、17 d创面取材,作组织切片观察.在取材同时剩余创面给药,药量同前,在伤后11～13 d创面愈合后,14、17 d取材为愈合部位组织.取材后即时以10%多聚甲醛固定10 h,逐级脱水,作组织切片.⑤利用免疫组织化学和图像分析,研究局部应用胰岛素样生长因子Ⅰ、重组人生长激素后,创伤模型大鼠皮肤创面愈合过程中与创面愈合相关因素增殖细胞核抗原、Ⅰ型胶原之间的关系.结果:实验大鼠32只全部进入结果分析.①在局部应用外源性胰岛素样生长因子Ⅰ、重组人生长激素后,创面愈合过程中组织内Ⅰ型胶原的变化:伤后1 d,胰岛素样生长因子Ⅰ组和胰岛素样生长因子Ⅰ+重组人生长激素组在胞浆里出现了Ⅰ型胶原表达,到伤后11 d创面接近愈合及14 d和17 d创面愈合后在细胞间质中仍有增加的趋势.②增殖细胞核抗原的变化:在核内,胰岛素样生长因子Ⅰ组和胰岛素样生长因子Ⅰ+重组人生长激素组的增殖细胞核抗原表达量于4 d达到高峰值,重组人生长激素组和生理盐水组伤后增殖细胞核抗原的表达量随时间的推移逐渐增加,在7 d时达到高后就开始降低,14、17 d创面愈合后,其表达量也就下降到正常范围.③胰岛素样生长因子Ⅰ的变化:胰岛素样生长因子Ⅰ组和胰岛素样生长因子Ⅰ+重组人生长激素组伤后在胞浆和细胞间质胰岛素样生长因子Ⅰ的表达量就一直在高值,在重组人生长激素组和生理盐水组,伤后1 d出现胰岛素样生长因子Ⅰ的表达,在7 d时达到峰值,在伤后11 d,表达量下降,14、17 d创面愈合后,其表达量也就下降到正常范围.④组间采用t检验.结论:在创面应用胰岛素样生长因子Ⅰ能够促进成纤维细胞分裂增殖,合成分泌增加,是成纤维细胞增生的直接促进因子,能促进创面的愈合.创面应用的重组人生长激素促增殖作用不强.
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医用硫酸钙在腰椎后外侧融合中的成骨能力
目的:在腰椎后外侧融合中,通过与自体减压骨进行比较,评价医用硫酸钙在腰椎后外侧融合中的成骨能力.方法:于2004-03/2005-01选择北京大学人民医院脊柱外科行腰椎后外侧融合术使用医用硫酸钙进行植骨患者27例为观察对象,所有患者均为左侧横突间植入硫酸钙与自体减压骨1:1混合物,右侧植入自体减压骨,术后定期复查,评价临床效果(JOA评分)、有无排斥反应及植骨融合情况(Lenke评分).结果:纳入患者27例,26例进入结果分析,1例外地患者脱落.①随访12～21个月,平均15.3个月.术后效果良好,患者伤口Ⅰ甲愈合,随访过程中无异物反应.术后JOA评分随着术后时间的延长有不同程度的增加(术后3,6,12个月分别为28.9,28.6,30.1分).②术后3个月时硫酸钙侧Lenke评分高于自体减压骨侧,差异有显著性意义[分别为(2.3±0.5),(1.9±0.4)分,P＜0.05],术后6个月及12个月时两侧差异无显著性意义(P＞0.05).结论:在腰椎后外侧融合中使用硫酸钙可以起到与自体骨相当的作用,医用硫酸钙是一种良好的骨替代材料.
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同种异体手移植术后患者的早期免疫学状态
背景:同种异体肢体移植在动物实验中已有大量免疫学方面的研究,但由于临床只是早期的探索,对其临床免疫学研究需要进一步积累.目的:动态分析异体手移植患者术后早期免疫学状态的变化.设计:对照实验.单位:解放军广州军区广州总医院骨科,解放军第一军医大学南方医院创伤骨科和检验科.对象:实验组纳入解放军广州军区广州总医院骨科两例单侧异体手移植的患者,观察时间1999-09/2000-03.健康对照组为同期本院体检者20人,男12人,女8人,年龄20～45岁,均为自愿者,无活动性免疫性和感染性疾病.方法:2例手移植患者手术前1和3 d各采外周血1次,术后第1周采血1次/d,2～4周采血3次/周,5～8周采血2次/周,9～16周采血1次/周,5～6个月采血2次/月.①运用流式细胞仪检测外周血T细胞亚群(CD3+,CD4+,CD8+T细胞),用ELISA法检测血清群体反应性抗体,免疫透射比浊法测定血清C反应蛋白,酶动力法检测血清肌酸肌酶.②混合淋巴细胞反应:以丝裂霉素C处理的供体外周血淋巴细胞作刺激细胞,3H-TDR掺人法检测患者外周血淋巴细胞对供体移植抗原的增生反应(阴性:刺激指数的均值与1无显著性差异,反之为阳性).以自体相同处理过的外周血淋巴细胞代替供体刺激细胞作为对照,计算每一标本的刺激指数(刺激指数=实验cpm/对照cpm)作为比较指标.健康对照组20人均采外周血检测外周血T细胞亚群(CD3+,CD4+,CD8+T细胞)、血清群体反应性抗体、C反应蛋白和肌酸肌酶;20人随机分为10组,互为供受体,行外周血混合淋巴细胞反应.主要观察指标:①外周血T细胞亚群(CD3+,CD4+,CD8+T细胞).②血清群体反应性抗体.③C反应蛋白.④肌酸肌酶.⑤混合淋巴细胞反应.结果:①术后1周内CD3+,CD4+,CD8+T细胞明显下降,1周后除CD8+细胞比术前升高外均逐渐恢复至术前水平[CD3+:(66.43±4.56);CD4+:(30.55±3.94);CD8+:(33.45±2.69)].实验组与健康对照组差异无显著性.②血清群体反应性抗体为0～10％,与对照组差异无显著性.③血清C-反应蛋白为0～0.359 mg/L,与对照组差异无显著性.④血清肌酸肌酶肌酸肌酶为25～170 mmol/L,与对照组差异无显著性.⑤移植后混合淋巴细胞反应为阴性,5个月后转为阳性.对照组均为阳性.结论:T细胞亚群的短期的变化与长期的再分布与免疫抑制剂密切相关,说明免疫抑制剂对异体手移植术后T细胞亚群有明显的影响.免疫诱导方案使患者处于免疫抑制状态,有效地避免了早期排斥反应的发生,但患者还未达到特异性耐受,还需要免疫抑制剂的抑制.
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蛋白石/聚左旋乳酸复合材料与人成骨细胞的相容性
目的:在体外细胞培养条件下,从细胞形态和细胞增殖方面观察和评价蛋白石/聚左旋乳酸复合材料与人成骨细胞的生物相容性.方法:实验于2004-09/2005-11在香港理工大学应用生物和化学系细胞实验室及西安交通大学生命科学与技术学院生物科学与工程系完成.参照美国药典对医用高分子材料制作浸提液的方法,以无菌生理盐水作为浸提介质,对蛋白石/聚左旋乳酸复合材料和聚左旋乳酸材料分别制取浸提液.测定提取液及其稀释液(1:1,1:4,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256)的pH值,并在加有此浸提液的培养基中培养成骨细胞,空白对照组加等量无菌生理盐水,在倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况;选用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞的增殖情况.结果:①蛋白石/聚左旋乳酸复合材料提取液及其稀释液的pH值高于相应浓度聚左旋乳酸材料,说明复合材料释酸量减少,有利于避免因聚左旋乳酸释酸而引起的各种不良反应.②倒置显微镜观察显示,加入蛋白石/聚左旋乳酸复合材料浸提液的培养皿中成骨细胞的增殖与空白对照组差异无显著性意义,均未发现细胞衰老及异常分裂现象.③MTT法测定表明不同浓度的蛋白石/聚左旋乳酸复合材料和聚左旋乳酸材料浸提液加入后,细胞的增殖不论是与空白对照比较,还是它们二者之间相互比较,差异均无显著性意义(P＞0.05).以美国药典中细胞相对增殖率与细胞毒性分级的关系,蛋白石/聚左旋乳酸复合材料为USP毒性0级,即无毒级.结论:蛋白石/聚左旋乳酸复合材料与聚左旋乳酸材料表现出相似的细胞相容性.考虑到蛋白石的加入使聚左旋乳酸的释酸量减少,再加上蛋白石的负离子释放功能,蛋白石/聚左旋乳酸复合材料必将在组织工程领域存在着广阔的应用前景.
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α-磷酸三钙/羟基磷灰石骨水泥材料的制备及力学性能测定
目的:利用α-磷酸三钙和羟基磷灰石复合,制备出具有一定强度的生物活性骨水泥.方法:实验于2003-09/2005-01在兰州交通大学材料系实验室完成.首先利用化学沉淀法合成羟基磷灰石粉末,然后利用固相反应制备α-磷酸三钙粉末,将其二者按一定比例混合均匀制得骨水泥粉料,后用固化液(25%柠檬酸+70%去离子水+5%柠檬酸钾)调和制得骨水泥.结果:①沉淀法制备羟基磷灰石粉末中主要是羟基磷灰石相,含量高达99.5%,所有杂质相含量低于0.5%.②α-磷酸三钙粉末与羟基磷灰石粉末按不同配比混合后粉剂中仅存在两个晶相:羟基磷灰石/高温型磷酸三钙.③两相骨水泥的压缩强度已基本达到规定要求(≥30 MPa),但弯曲强度仍较低.其中T50H50强度较高.④固化体在37℃生理盐水中浸渍2个月后,α-磷酸三钙含量明显减少,羟基磷灰石晶相大量增加,无新的结晶相生成.结论:制备的骨水泥克服了陶瓷型羟基磷灰石烧结形成、修整困难等缺点,具有制备容易、使用方便、固化时放热小等优点,可应用于体内骨修复材料.
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人角质化细胞生长因子2基因克隆、表达及其产物的纯化和鉴定
背景:人角质化细胞生长因子2具有广泛的生理功能,在胚胎发育、组织的修复、神经的再生、血管的生成和肿瘤发展中具有重要作用.目的:克隆人角质化细胞生长因子2基因,于大肠杆菌中表达,并检测其生物学活性,为进一步开发提供实验依据.设计:开放性实验.单位:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所.材料:实验于2000-09/2002-05在中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室完成.pBV220温控表达载体为病毒基因工程国家重点实验室构建,EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、T4 DNA连接酶(Promega公司);人角质化细胞生长因子2特异性聚合酶链反应引物(上海博亚生物技术有限公司合成);肝素-Sepharose CL-6B (Pharmacia公司);快速聚合酶链反应产物纯化试剂盒、总RNA提取Trizol试剂盒、反转录-聚合酶链反应试剂盒(GIBCO公司);质粒DNA快速提取试剂盒(博大公司);BL-21-codon plus compent cells (Stratagene公司).方法:用高表达菌株BL-21-codon plus compentent cells表达重组人角质化细胞生长因子2蛋白并初步纯化和检测其活性.通过反转录-聚合酶链反应从自然流产胎儿肺组织中钓取人角质化细胞生长因子2 cDNA,将其克隆入pBV220载体质粒.在大肠杆菌BL-21-eodon plus compent cells中表达人角质化细胞生长因子2蛋白.采用亲和层析和离子交换层析分离纯化,以细胞增殖实验测定表达蛋白的生物活性.主要观察指标:人角质化细胞生长因子2 cDNA的片段长度和序列,人角质化细胞生长因子2基因在大肠杆菌中的表达,纯化人角质化细胞生长因子2的活性.结果:人角质化细胞生长因子2 cDNA片段大小约500 bp,人角质化细胞生长因子2蛋白在BL-21中得到高效表达,于上清中可溶性表达,SDS-PAGE显示相对分子质量约20 000;人角质化细胞生长因子2蛋白对NIH3T3细胞具有显著的促有丝分裂活性,1,5,10/L人角质化细胞生长因子2 A值(490 nm)高于空白对照组,差异有非常显著性意义(分别为0.174±0.022,0.220±0.029,0.306±0.050,0.066±0.004,P＜0.001).结论:成功克隆人角质化细胞生长因子2基因,并于大肠杆菌BL-21中得到高效表达;纯化的人角质化细胞生长因子2蛋白能刺激NIH3T3细胞的增殖,具有显著的促有丝分裂活性.
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轴卷猪小肠黏膜下层修复异种肌腱缺损后免疫排斥反应及生物力学适应性
背景:自体肌腱移植治疗外伤后肌腱缺损存在机体再次损伤和取材局限的不足.碳纤维人工肌腱、人发肌腱等人工肌腱被证实也可进行移植,但其植入体内后存在着免疫排斥反应和生物力学强度的不适应.因此,开发新的人工肌腱替代物是目前需要解决的主要问题.目的:观察轴卷的猪小肠黏膜下层作为人工肌腱移植修补鸡左、右足第3趾2 cm肌腱缺损,以及修补后的免疫排斥反应和生物力学适应性.设计:随机对照动物实验.单位:上海交通大学附属第六人民医院骨科.材料:12周Leghorn鸡45只,雌雄不限,体质量4.0～4.5 kg.方法:实验于2002-09/2003-06在上海交通大学附属第六人民医院骨科完成.①将45只12周的Leghorn鸡随机分为3组.取自体移植组20只和猪小肠黏膜下层移植组20只鸡的左、右足第3趾,于中节趾骨处切断趾深屈肌腱并造成2 cm的肌腱缺损模型.自体移植组缺损的肌腱进行原位缝合;猪小肠黏膜下层移植组缺损的肌腱用猪小肠黏膜下层进行修补;空白组5只,不作任何处理.②在肌腱移植术后3,6,9周进行组织形态学、移植免疫学、生物力学及功能恢复的测定.主要观察指标:①各组鸡手术趾大体观察及植入物光镜观察.②术前3 d、移植后3 d、1周、2周白细胞分类计数.③各组鸡生物力学测试及功能恢复试验结果.结果:45只鸡均进入结果分析.①术后9周时,肉眼下,猪小肠黏膜下层形态同正常肌腱已基本相同,光镜下,猪小肠黏膜下层上成纤维细胞沿长轴方向有序排列且出现胶原细胞外间质.②术后2周内,猪小肠黏膜下层移植组与自体移植组白细胞测量结果差异无显著性意义(P＞0.05),表明猪小肠黏膜下层作为异种材料没有明显免疫排斥.③在生物力学测试中,猪小肠黏膜下层移植组在术后12周时生物力学强度要优于自体移植组[(22.22±0.90),(20.78±0.94),P＜0.05].④在功能恢复试验中,3组掌趾关节的活动度无明显差异(P＞0.05),空白组的近节趾间关节活动度要优于猪小肠黏膜下层移植组及自体移植组[(21.0±1.6)°,(15.1±1.7)°,(16.0±2.1)°,P＜0.05).结论:猪小肠黏膜下层植入鸡体内后,没有发现有免疫排斥反应的迹象,可作为修复肌腱缺损的异种材料.
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同型半胱氨酸通过核因子κB途径诱导人内皮细胞表达RANTES mRNA和蛋白的表达
目的:观察同型半胱氨酸诱导培养人脐静脉内皮细胞表达RANTESmRNA及蛋白,并分析其机制.方法:实验于2004-11/2005-11在新乡医学院分子生物研究室完成.①采用酶消化法分离脐静脉内皮细胞.②当脐静脉内皮细胞生长至汇合状态时,随机分为对照组、同型半胱氨酸组和二硫代氨基甲酸吡咯烷预处理组.对照组用无血清培养基、同型半胱氨酸组用含0.1 mmol/L同型半胱氨酸的无血清培养基培养,分别孵育8 h;二硫代氨基甲酸吡咯烷预处理组用含100 μmol/L二硫代氨基甲酸吡咯烷的无血清培养基培养20 min后,再加入0.1 mmol/L的同型半胱氨酸孵育8 h.③采用斑点杂交检测脐静脉内皮细胞中RANTES mRNA的表达.④采用Western blot检测脐静脉内皮细胞中RANTES蛋白的表达.⑤用免疫细胞化学方法检测正常对照组和同型半胱氨酸组核因子κB P65蛋白的表达.结果:①脐静脉内皮细胞中RANTES mRNA的表达:图像分析显示,同型半胱氨酸组、二硫代氨基甲酸吡咯烷预处理组的积分吸光度值分别为18 790和16 420,分别为对照组(积分吸光度值为12 680)的1.48倍和1.29倍.②脐静脉内皮细胞中RANTES蛋白的表达:图像分析显示,同型半胱氨酸组RANTES蛋白印迹条带的积分吸光度值为0.794 2,而二硫代氨基甲酸吡咯烷预处理组的积分吸光度值为0.501 3,分别是对照组(0.293 0)的2.72倍和1.72倍.③脐静脉内皮细胞中核因子κBP65蛋白的表达:在对照组脐静脉内皮细胞中,核因子κB P65蛋白的表达以细胞质为主;同型半胱氨酸刺激后,细胞核染色的阳性率明显增加,由对照组的8.3%上升到43.5%(P＜0.01).结论:同型半胱氨酸能诱导人脐静脉内皮细胞表达RANTES mRNA和蛋白,核因子κB可能参与了该过程.同型半胱氨酸可能通过诱导内皮细胞表达RANTES在动脉粥样硬化形成中起作用.
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人血浆神经生长因子对射频消融的反应
背景:射频消融能触发犬的心肌神经再生和交感神经再支配,其对人体也可能有同样的作用.神经生长因子是一种神经营养因子,能够促进交感神经的生长和分化,改善靶器官的神经支配.目的:证实射频消融能提高人神经生长因子的浓度的假设.设计:自身对照实验.单位:解放军第四军医大学唐都医院心内科.材料:选择2005-01/06在解放军第四军医大学唐都医院心内科行房室结折返性心动过速(n=18)、右侧旁道(n=13)和左侧旁道(n=12)射频消融治疗的患者43例,男20例,女23例;年龄28～65岁.所有患者对实验均知情同意.方法:于射频消融前和消融后6 h,1,3,5,7 d抽取患者静脉血,用酶联吸附免疫分析法测量射频消融前和射频消融后不同时间点的血浆神经生长因子浓度.主要观察指标:酶联吸附免疫吸附法测量的射频消融前和消融后6 h,1,3,5,7 d神经生长因子浓度.结果:纳入患者43例,均进入结果分析.射频消融后6 h神经生长因子开始增高并且持续增高到第7天.房室结折返性心动过速、右侧旁道和左侧旁道射频消融治疗的患者射频消融后6 h,1,3,5,7 d的神经生长因子浓度分别为(29.72±7.04),(30.94±5.68),(31.39±4.92),(31.06±4.56),(29.11±4.59),(31.77±6.25),(30.69±5.10),(31.46±4.96),(30.15±4.01),(30.43±3.14),(31.42±6.75),(31.00±5.20),(32.08±4.62),(30.67±3.71),(29.27±2.75)μg/L,均明显大于射频消融前[(14.89±2.84),(15.00±2.71),(15.51±2.75)μg/L,P＜0.01].但射频消融后各时间点的神经生长因子浓度差异不明显,房室结折返性心动过速、右侧旁道和左侧旁道射频消融治疗的患者在同一时间点的神经生长因子浓度差异不明显(P＞0.05).神经生长因子浓度的改变与房室结折返性心动过速、右侧旁道和左侧旁道射频消融的手术时间、次数和总的消融能量均无显著性相关(P＞0.05).结论:射频消融能提高人神经生长因子的浓度,神经生长因子浓度与平均手术时间、射频消融的次数和总的消融能量均无显著性相关.
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1,6-二磷酸果糖与环孢素A对心脏移植大鼠心室肌细胞凋亡的协同作用
目的:观察1,6-二磷酸果糖与环孢素A单独与联合应用对同种异体大鼠心脏移植后急性排斥期心肌细胞凋亡的影响.方法:实验于2004-04/12在南京军区南京总医院动物实验中心完成.选择Wistar大鼠(供体)和SD大鼠(受体)各40只,根据Ono改进模型将Wistar大鼠心脏移植到SD大鼠腹腔,随机数字表法分为4组,各组10例.对照组,手术前后不作处理;1,6-二磷酸果糖组,供体术前5 d开始每天静脉注射1,6-二磷酸果糖350 mg/kg,术后受体同剂量注射至处死或停跳;环孢菌素A组,受体手术当天开始肌肉注射环孢菌素A5.0 mg/kg,直至处死或停跳;1,6-二磷酸果糖+环孢菌素A组,按1,6-二磷酸果糖组与环孢菌素A组联合进行给药.术后5 d采用TUNEL法测定各组5例移植后心室肌细胞凋亡指数,其余5例观察移植心脏存活时间.结果:纳入Wistar大鼠(供体)和SD大鼠(受体)各40只,40只受体均进入结果分析.①1,6-二磷酸果糖组、环孢菌素A组、1,6-二磷酸果糖+环孢菌素A组大鼠移植心脏心室肌细胞凋亡指数较对照组明显降低(分别为8.06±0.70,6.63±0.52,3.12±0.45,12.07±1.32,P＜0.05),1,6-二磷酸果糖+环孢菌素A组降低尤其明显(P＜0.01).②1,6-二磷酸果糖组、环孢菌素A组、1,6-二磷酸果糖+环孢菌素A组大鼠移植心脏生存时间高于对照组,差异有显著性意义[分别为(12.4±1.1),(11.6±1.1),(18.0±1.0),(6.0±1.0)d,P＜0.05],1,6-二磷酸果糖+环孢菌素A组更加显著(P＜0.01).结论:1,6-二磷酸果糖是细胞能量代谢的重要中间产物,可以减少移植心肌细胞凋亡,对促进移植心脏复跳、保护心功能、延长移植心脏生存时间均有显著效果,可以作为心脏移植围手术期与环孢素A协同用药.
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血管生成抑制因子METH-1腺病毒载体的构建
目的:利用大肠杆菌同源重组构建重组腺病毒载体并在293细胞制备高滴度的病毒.方法:实验于2004-08/2005-08在中山大学眼科中心国家重点实验室完成.自真核表达载体pMD18-T-METH1中酶切出METH1基因,亚克隆至带有增强型绿色荧光蛋白表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdTrack-CMV-METH1,在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组,得到重组腺病毒载体pAd-METH1.以pAd-METH1为模板,经DNA测序正确后,用PacI酶切线性化pAd-METH1,转染293细胞,包装成重组病毒颗粒,荧光显微镜观察转染细胞增强型绿色荧光蛋白的表达,采用聚合酶链反应方法对重组腺病毒进行鉴定.结果:①构建了携带外源基因人血管生成抑制因子的穿梭载体pAdTrack-CMV-METH1.②制备了METH1重组腺病毒载体pAdEasyMETH1.③METH1重组腺病毒可感染293细胞并在293细胞中进行有效的复制.结论:应用细菌内同源重组能够快速构建腺病毒载体,制备高滴度重组病毒,为METH1基因功能研究奠定了基础.
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转化生长因子β调节体外培养人成骨细胞结缔组织生长因子mRNA的表达
目的:观察转化生长因子β对体外培养人成骨细胞结缔组织生长因子mRNA表达的影响.方法:实验在青岛海慈医疗集团检验科完成.选择2005-02/03在青岛海慈医疗集团骨科住院的无其他疾患的骨折患者3例,年龄30～50岁,经患者知情同意后,取其髂骨松质骨,剪碎,Ⅳ型胶原酶消化后,将骨片贴于25 cm2培养瓶,加入MEM培养液约15 d后,可见细胞游出,约25 d达汇片,胰酶消化,按1×106个细胞接种培养后第2天,换含1 g/L BSA MEM培养液继续培养24 h后,加入10 ng/L转化生长因子β干预培养0,3,6,12,24 h,或在转化生长因子β作用峰值时,分别给予不同浓度(0,5,10,25 ng/L)干预,抽提总RNA,采用半定量反转录-聚合酶链反应和Northern blot法检测干预后成骨细胞结缔组织生长因子mRNA表达水平.结果:①半定量反转录-聚合酶链反应检测转化生长因子β对体外培养成骨细胞结缔组织生长因子mRNA表达的影响:与0 ng/L对照组相比,5,10和25 ng/L转化生长因子β干预后结缔组织生长因子mRNA表达水平显著升高(P＜0.01),呈明显剂量依赖关系;10 ng/L转化生长因子β干预6 h时转化生长因子β上调作用达高峰(P＜0.01),然后下降,至24 h时转化生长因子β对结缔组织生长因子的上调作用基本消失(P＞0.05).②Northern blot法检测转化生长因子β对体外培养成骨细胞结缔组织生长因子mRNA表达的影响:与0 ng/L对照组相比,10和25 ng/L转化生长因子β干预后结缔组织生长因子mRNA表达水平显著升高(P＜0.01),但无明显剂量依赖关系(P＞0.05);10 ng/L转化生长因子β干预6 h时转化生长因子β上调作用达高峰(P＜0.01),然后下降,至24 h时转化生长因子β对结缔组织生长因子的上调作用基本消失(P＞0.05).结论:转化生长因子β可呈剂量依赖性上调人成骨细胞结缔组织生长因子mRNA的表达.
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异体手移植急性排斥反应的成功预防
目的:探讨异体手移植急性排斥反应的防治措施.方法:1999-09-21南方医科大学南方医院为2例男性患者同时进行了右手异体移植,其一患者2年前炸鱼时将右手炸毁,初期手术作残端修整;其二患者2年前右腕部被钢丝勒断,在当地医院行再植术失败后作残端修整.2000-09-26又为一双前臂缺失患者进行了异体手移植,患者的双前臂炸伤缺失1年,缺失平面为右前臂中下1/3,左前臂中上1/3.3例患者心理及免疫状态均正常,无全身性疾病,残肢局部情况好,强烈要求手移植.以与受者ABO、Rh血型相同,HLA配型良好的脑死亡患者为供体;所有供肢尺桡骨骨髓刮除,其中2例供肢于移植前行8 Gy的X射线照射;全部患者显微镜下吻合动脉、静脉及神经,联合应用免疫抑制剂;动态检测外周血T细胞亚群和细胞因子.结果:①患者手移植一般情况及移植手皮肤、组织病理检查结果:3例患者手移植后,生命体征平稳,移植术后手血运均良好,无合并细菌、病毒和真菌感染,皮肤愈合同断肢再植,移植手全部成活,临床症状、体征及皮肤病理检查均提示没有发生急性排斥反应.②外周血细胞因子动态检测提示:移植术后诱导期血清中自细胞介素2、肿瘤坏死因子α、干扰素-γ水平迅速下降,1周后恢复至手术前水平,随后逐渐降低并维持在低水平.结论:异体手移植急性排斥反应的预防与供受者间的组织配型、供肢的适当处理、免疫抑制剂应用的个体化、微创外科技术、周密的预防感染措施等因素密切相关.术后监测血清中白细胞介素2、肿瘤坏死因子α、干扰素-γ的水平可以早期判断排斥反应的发生.
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指屈肌腱三维重建后的可视化
实验主要于2003-06/2005-08在解放军第三军医大学中心实验室、解剖教研室及解放军第二五一医院骨科完成.将2只新鲜成人手标本(由解放军第三军医大学解剖教研室提供)用50 g/L浅蓝色明胶溶液包埋,采用冰冻薄层断面切片技术通过数控铣床将标本手铣切为0.2 mm的薄层断面,用Canon(ESO 1OD)数码相机(630万像素)自然光下采集数据并传输到电脑中保存,采集到的图像数据经对位、裁切及格式转换等一系列处理,后按3:1的比例抽取共计353个层面的二维图像数据,组成一个新的数据集.利用第三军医大学解剖教研室提供的三维重建软件(未商品化)在PC机上对手指屈肌腱进行三维重建.从重建的图像可以看出手指屈肌腱包括4条指浅屈肌腱、4条指深屈肌腱和1条拇长屈肌腱,各指屈肌腱共同穿出狭窄的腕管进入掌部,沿各手指的方向呈扇形散开.重建的手部骨骼包括指骨、掌骨和腕骨以及各骨之间形成的关节,可以单独显示或与重建的指浅屈肌腱及指深屈肌腱任意搭配显示,重建的图像比较清晰的显示了手部诸骨及指屈肌腱的空间形态和毗邻关系.
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振动法对骨折后骨质结构和功能的影响
目的:探讨振动法对骨折愈合的促进作用,以提高临床骨折康复质量.方法:实验于2005-10/11在南阳医学高等专科学校实验中心完成.①选用清洁级6～8月龄的家兔40只,随机数字表法分为4组:空白对照组、骨折后24 h振动治疗组、骨折后48 h振动治疗组、骨折后72 h振动治疗组,10只/组.②各组均建立胫骨横断骨折模型,术后立即对骨折的胫骨进行对合,自制夹板外固定.为减少损伤后局部瘀血、红肿,在骨折局部包敷中成药七厘散干粉[商品名:辽源七厘散,四川乐山大千药业有限公司生产,药品批号:国药准字Z51021507,主要成分为血竭、红花、乳香(制)、没药(制)、大黄、骨碎补(烫去毛)、方海、降香、土鳖虫、三七等十三味],中药外敷后包扎固定.③骨折后24,48,72 h振动治疗组采用小型振动仪,分别在骨折后24,48,72 h开始施以振动疗法,频率为25 Hz,20 min/次,1次/d.空白对照组任其自然愈合.④各组分别于骨折前及骨折后1,2,3周拍摄X线片,观察骨痂形成情况.第3周末处死,行弯曲试验测试骨折愈合的强度,取愈合处骨及周围软组织标本进行病理切片检查.结果:按实际处理分析,实验选用6～8月龄家兔40只,骨折后24,48 h振动治疗组各有1只因重度腹泻死亡,共38只进入结果分析.①振动治疗后X线观察各组骨痂形成情况:与空白对照组比较,第3周末骨折后48,72 h振动治疗组骨痂形成率均明显升高(50%,88.9%,90%,P＜0.05).②弯曲实验中各组骨折愈合强度指标检测结果:与空白对照组比较,骨折后48,72 h振动治疗组大载荷、大破坏弯矩均明显增加(P＜0.05).③振动治疗对骨质结构组织学愈合情况的影响:各振动治疗组血管吻合支丰富,结缔组织完整;而空白对照组大多有黏液样基质,夹杂少许含铁血黄素,提示供血不良.与空白对照组比较,各振动治疗组骨质结构组织学愈合等级均优于空白对照组(χ2=16.38,P＜0.01).结论:采用小型振动仪间歇振动可有效促进骨折的愈合速度和质量,且振动介入以骨折后2～3 d为佳.
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微波干预急性胰腺炎大鼠胰腺亚细胞器的功能变化
观察微波对急性胰腺炎大鼠亚细胞器功能的影响.实验于2003-05/06在大连医科大学病生实验室完成.采用健康SD大鼠30只,随机数字法分为3组:假手术组、急性重症胰腺炎模型组、微波治疗组,每组10只.急性重症胰腺炎模型组、微波治疗组大鼠剖腹后经十二指肠乳头向胰管内缓慢逆行注入1.5%去氧胆酸钠溶液0.5 μL/kg体质量,诱发急性重症胰腺炎;假手术组剖腹后适当翻动腹腔脏器后关腹.微波治疗组于造模后每天2次上腹部行微波照射.各组大鼠于术后48 h经内眦采血测血清超氧化物歧化酶及血清丙二醛的变化;并处死动物取胰腺组织,采用组织化学方法检测胰腺细胞线粒体琥珀酸脱氢酶和溶酶体酸性磷酸酶的活性.实验大鼠30只均进入结果分析.①血清超氧化物歧化酶活性:急性重症胰腺炎模型组低于假手术组[(108.341±7.324),(115.802±1.918)NU/mL,P＜0.05].②血清丙二醛含量:急性重症胰腺炎模型组高于假手术组[6.778±1.610),(5.116±0.573)μmol/L,P＜0.05].③胰腺细胞溶酶体酸性磷酸酶释放率:急性重症胰腺炎模型组明显高于假手术组和微波治疗组[(33.257±9.462)%,(13.618±6.978)%,(21.246±9.511)%,P＜0.01].④胰腺细胞线粒体琥珀酸脱氢酶活性:急性重症胰腺炎模型组低于假手术组和微波治疗组[(0.180±0.082),(0.362±0.126),(0.284±0.074)mkat/g,P＜0.01,0.05].急性胰腺炎大鼠存在脂质过氧化损伤及胰腺亚细胞器功能的损害.微波对急性胰腺炎大鼠氧自由基的产生有抑制作用,减轻了对胰腺亚细胞器功能的损害,维持了亚细胞器功能.
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体外血清预培养促进神经干细胞增殖
背景:神经干细胞的临床应用前景广阔,寻找多种方法体外促进神经干细胞的增殖和分化为今后的发展方向. 目的:介绍一种省时且经济的神经干细胞的培养方法.设计:观察对比实验.单位:北京市神经外科研究所.材料:选择4只孕14天Wistar大鼠,常温常湿环境饲养,体质量(180±20)g,均购自中国医学科学院动物所(实验动物许可证号码:SCXK1100-0006).DMEM/F12(1:1)以及B27购自Gibco公司;碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子购自PeproTech公司;巢蛋白单克隆抗体、胶质纤维酸性蛋白多克隆抗体、半乳酸脑苷多克隆抗体和微管相关蛋白2单克隆抗体购自Chemicon公司.胎牛血清购自Hyclone公司.方法:实验于2004-05/2004-10在北京市神经外科研究所损伤修复室完成.将Wistar大鼠脱臼处死,每次取4只胎鼠,将其脑组织置于Hank's液中,解剖显微镜下剥离软脑膜及血管,眼科剪剪碎脑组织并收集细胞于2个离心管中离心,弃上清液.①根据给予血清预培养与否将细胞分成血清预培养组及对照组.血清预培养组细胞加入含100 g/L胎牛血清DMEM培养液,培养48 h后换含表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、B27的DMEM/F12培养液;对照组细胞中直接加含表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、B27的DMEM/F12培养液,37℃,体积分数为0.05的CO2培养箱培养1周.通过相差显微镜观察血清预培养组对照组培养48 h后神经干细胞的生长情况.②用100 g/L胎牛血清诱导分化后的第5天和第10天行nestin、胶质纤维酸性蛋白多克隆抗体、半乳酸脑苷多克隆抗体和微管相关蛋白2单克隆抗体免疫荧光染色,采用荧光显微镜观察检测两组神经干细胞的表达;对照组采用PBS缓冲液替代一抗,其它步骤同血清预培养组.主要观察指标:①相差显微镜下观察血清预培养组及对照组神经干细胞培养48 h后的生长状况.②免疫荧光染色检测两组神经干细胞的表达.结果:①血清预培养组细胞经培养48 h后,出现大量较规则的神经干细胞球,多数细胞球由8-10个细胞聚集而成.改用表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、B27的DMEM/F12培养液后,细胞球增殖很快;对照组细胞培养48 h后只有不规则片状块,4-5 d后才出现规则的小细胞球.②荧光显微镜观察可见两组细胞的分化速度和分化方向相同,在诱导分化后的第5天,nestin、胶质纤维酸性蛋白、半乳酸脑苷为阳性,微管相关蛋白2为阴性;在诱导分化后的第10天,nestin和胶质纤维酸性蛋白为阳性,半乳酸脑苷和微管相关蛋白为阴性.结论:血清预培养可使神经干细胞聚球速度加快,促进神经干细胞增殖.
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骨髓间充质干细胞来源的内皮细胞构建组织工程瓣膜及其抗血栓作用
目的:分析骨髓间充质干细胞来源的内皮细胞构建组织工程瓣膜的可行性,评价其抗血栓功能.方法:实验于2005-08/2006-04在复旦大学上海医学院分子生物学实验室完成.①人骨髓来源为中山医院胸外科手术摘除的一段肋骨(患者知情同意);取健康志愿者静脉血进行血小板黏附观察;新鲜猪心瓣膜取自上海复新屠宰场.②利用胰酶-乙二胺四乙酸、核酸酶处理猪心瓣膜制备脱细胞支架.将摘除的一段肋骨无菌条件下用含肝素的磷酸盐缓冲液充分冲洗骨髓腔,进行骨髓间充质干细胞的分离培养及体外诱导分化.③经体外诱导成的内皮细胞后,种植于瓣膜支架,构建组织工程瓣膜.体外培养1周后,取组织工程瓣膜及未种细胞的空支架做血小板黏附试验.以CD31、vWF对细胞进行鉴定,采用苏木精-伊红染色、免疫荧光及扫描电镜对组织工程瓣膜进行评价.结果:①骨髓间充质干细胞定向诱导为内皮细胞及其性质鉴定:骨髓间充质干细胞定向诱导为内皮细胞后,CD31及vWF染色由阴性转为阳性,呈现出"铺路石"样形态.②瓣膜组织形态观察结果:猪心瓣膜的细胞成分完全去除,胞外基质保存良好,组织工程瓣膜表面形成一连续的内皮细胞单层.③血小板黏附情况:扫描电镜显示空支架表面有大量血小板聚集和黏附,而组织工程瓣膜表面无此现象,显示了良好的抗血栓性能.结论:骨髓间充质干细胞来源的内皮细胞可以用来构建具有良好的抗血栓性能组织工程瓣膜.
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中国实验用小型猪成骨细胞的培养与鉴定
目的:分离、诱导培养中国实验用小型猪成骨细胞作为骨组织工程种子细胞,并进行形态学与生物学性能鉴定,为骨组织工程研究提供新型种子细胞.方法:实验于2002-08/2004-08在天津市口腔医院暨天津市整形外科医院中心实验室组织工程实验室完成.采用胶原酶消化法和诱导条件培养法自新生中国实验用小型猪四肢骨松质分离成骨细胞,经细胞生活形态观察、细胞倍增时间测定、透射电镜超微结构分析、裂解上清碱性磷酸酶检测、矿化结节形成测定等方法进行成骨细胞的生物学性能鉴定,以获取中国实验用小型猪成骨细胞作为骨组织工程种子细胞的必备的增殖活性与成骨活性数据.结果:①原代培养中国实验用小型猪成骨样细胞具有很强的贴壁率,细胞分裂旺盛,2～3 d即可达到完全融合.细胞形态呈多角形和星形、胞体大、胞核圆,核仁丰富,通常为两三个核仁;胞浆中核周见散在黑色颗粒.②条件培养液诱导后的猪成骨样细胞培养6 d左右可见细胞呈旋涡状复层生长,胞突伸展互相连接并集结成细胞簇团,中心区形成褐色结节;细胞核周围胞浆中出现大量黑色颗粒.③细胞增殖曲线显示猪成骨样细胞在播种3 d后进入对数生长期,15 d左右达到生长峰值;经细胞倍增时间公式计算猪成骨样细胞倍增时间为67.2 h.④透射电镜观察显示:中国实验用小型猪成骨样细胞表面突起极丰富;核大,有较多和较深的内陷;核仁大而多窗孔,胞质内细胞器常常分布于核的一侧,扩张的粗面内质网池内有中等电子密度的蛋白质沉淀,其膜表面的核糖体密集分布.Golgi氏复合体发达,并见胞质内微丝及多量的游离核糖体.核仁特征为高转录活动的核仁.细胞外形、核谱型、核位置以及胞质内细胞器的特征性分布符合成骨细胞的超微结构特征.⑤猪成骨样细胞的碱性磷酸酶活性在β-磷酸甘油和地塞米松刺激后3 d开始上升,18 d达到高峰,21 d时开始下降.⑥Von Kossa染色显示从培养6 d开始,小型猪成骨样细胞培养细胞层出现散在的小矿化结节,以后数量渐多,体积渐大,21 d达高峰,体外成骨活性显著.结论:中国实验用小型猪骨松质成骨细胞具备骨组织工程种子细胞必备的增殖活性与成骨活性,适合作为骨组织工程的种子细胞.
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人胚胎神经干细胞分离、培养、纯化及增殖潜能的特点
目的:探讨获取和培养人胚胎神经干细胞的方法.方法:实验于2003-09/2004-12在重庆医科大学基础研究所完成.人胚胎来源为7～12周人工药物流产胎儿,由重庆医科大学附属第二医院及重庆市妇幼保健院提供,征得产妇本人同意.①从人胚胎大脑皮质中分离、培养、纯化原代神经干细胞,经体外反复传代培养以获得能在体外长期生存的神经干细胞.②免疫细胞化学鉴定神经干细胞特异性表达抗原.③观察不同种植细胞密度对神经干细胞增殖的影响,分析其生长特点并绘制生长曲线.④采用悬浮细胞培养法扩增细胞,冷冻复苏后观察细胞的生物学特性.结果:①人胚胎神经干细胞体外生长特点:从7～12周流产胎儿大脑皮质中获得了能在体外长期生存的神经干细胞.经体外传至15代,神经干细胞细胞数量扩增至200倍.②神经干细胞接种密度对增生的影响:当种植细胞的密度为1×105 L-1,1×107 L-1时,体外培养30 d后仍呈单细胞贴壁状态.以1×109 L-1细胞密度接种时,12 h后即见多个单细胞聚成的小球,悬浮生长.③神经干细胞自我更新能力的检测结果:多数单个细胞在培养后24～48 h分裂为2～4个细胞的小克隆,7～10 d均发展为上百个细胞的较大的克隆.④nestin抗原的表达:培养的神经干细胞神经球nestin免疫细胞染色均呈阳性.⑤神经干细胞多向分化能力检测:NSE和GFAP免疫细胞化学染色显示,被测细胞胞浆有棕黄色颗粒沉着,呈阳性表达.⑥神经干细胞复苏后的存活率:冻存1,4,8,12周的神经干细胞存活率基本相似[(80.2±1.8)%,(80.1±1.2)%,(79.9±0.8)%,(80.1±2.1)%,P＞0.05].结论:成功地从人胚胎大脑皮质中分离得到了神经干细胞.经体外培养证明:人胚胎神经干细胞具有自我更新增殖能力和向神经元样细胞、星形胶质样细胞分化的潜能.
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5-氮胞苷体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的实验
目的:观察5-氮胞苷在体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的情况及GATA-4和Nkx2.5基因的表达,从而确定人骨髓间充质干细胞体外诱导为心肌样细胞的条件、规律及转化细胞的特点.方法:实验于2005-08/2006-05在解放军沈阳军区总医院心血管外科和中国医科大学实验技术中心一部完成.取非血液疾病的5例胸科手术患者术中已切除掉的肋骨,抽取骨髓.利用淋巴细胞分离液行密度梯度离心法和差异贴壁法进行分离、提纯骨髓间充质干细胞,并进行培养扩增.用流式细胞仪对第2代的骨髓间充质干细胞表面抗原进行测定.应用10 μmol/L 5-氮胞苷对第2代的骨髓间充质干细胞诱导24 h,于诱导后1,2,3,4周,用反转录-聚合酶链反应检测GATA-4和Nkx2.5基因表达.结果:①3份第2代骨髓间充质干细胞样本重复测定,表达CD29,CD44,不表达CD34,CD45.②以5-氮胞苷诱导培养24 h后,骨髓间充质干细胞形态和排列方式发生明显变化,诱导1周后,细胞体积增大,多呈长梭行,平行排列;诱导2周后,细胞变为短柱状,突起位于两端,相邻细胞的突起紧密接触;诱导3周后,短柱状细胞的突起相互连接,部分细胞可见类肌管样结构;诱导4周后,细胞体积变小,可见由几个细胞连接形成的多核肌管样结构.③诱导组细胞GATA-4和Nkx2.5的聚合酶链反应产物凝胶电泳呈阳性,对照组为阴性,诱导组基因表达量均随着时间延长逐渐增加.结论:5-氮胞苷可诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞转化,其处于祖心肌细胞和分化的心肌细胞之间.
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不同培养条件下人脐血间充质干细胞的差异
目的:观察不同条件对人脐血间充质干细胞培养的影响.方法:实验于2004-10/2005-10在首都医科大学组织学胚胎学教研室实验室完成.①用复方枸橼酸血液保存液和肝素钠两种不同的抗凝血剂保存的人脐带血,经密度梯度离心法分离新鲜脐带血,获取的单个核细胞,经椎虫蓝染色进行活细胞计数,比较所获得的单个核细胞数.②用不同密度1×109 L-1,2×109 L-1,5×109 L-1接种单个核细胞,倒置显微镜下观察细胞形态.用流式细胞仪检测所培养的细胞免疫表型.③分别用高糖和低糖DMEM培养液(含体积分数0.1的胎牛血清)培养单个核细胞,其他条件相同,从72 h后对所形成的细胞克隆进行计数,对两种培养基形成的细胞克隆和生长状况进行比较.结果:①不同抗凝血剂抗凝的人脐带血所获得的单个核细胞数及细胞生长状态:用肝素钠抗凝血剂保存的人脐带血所获得的单个核细胞数和细胞生长状态明显优于用复方枸橼酸血液保存液保存的人脐带血(P＜0.05).②不同接种密度人脐血间充质干细胞的贴壁生长状态及人脐血间充质干细胞的免疫表型:较低密度接种细胞并不能形成大量贴壁细胞,而以5×109 L-1密度接种,72 h后单个核细胞开始贴壁并开始形成细胞克隆,在10 d后出现梭形细胞,培养过程中细胞形态逐渐形成均一梭形.用流式细胞仪检测所培养的细胞为非造血间充质干细胞.③两种培养基形成的细胞克隆数和生长状况:在10 d以后,用低糖DMEM组培养的单个核细胞形成的细胞克隆数与高糖DMEM组相比较差异有显著性意义(P＜0.05).结论:①肝素钠作为人脐带血保存液能获得大量的单个核细胞,有利于人脐血间充质干细胞的培养.②5×109 L-i细胞接种密度有利于人脐血间充质干细胞贴壁生长.③用低糖DMEM作为培养人脐血间充质干细胞的培养基有利于细胞克隆的形成和维持,对保持人脐血间充质干细胞特性有良好作用.
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局灶性脑缺血大鼠永生化神经前体细胞移植的可行性
目的:观察局灶性脑缺血大鼠移植永生化神经前体细胞在脑内的存活情况,为进一步研究细胞移植及转基因治疗脑缺血提供有意义的数据及图像资料.方法:实验于2005-10/2006-03在华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学实验室进行.①选取健康雄性SD大鼠18只,随机数字表法分为假手术组、脑缺血对照组、细胞移植组,6只/组.②脑缺血对照组、细胞移植组采用线栓法建立大鼠右侧大脑中动脉缺血模型.假手术组仅分离血管,不进行脑缺血处理.③应用无血清Neurobasal培养基进行INPC培养,移植前加入BrdU,使终浓度为10μmol/L,标记3 d,然后取出细胞爬片,无水甲醇固定10 min,SP法检测BrdU标记细胞阳性率.④将BrdU标记3 d的永生化神经前体细胞用胰蛋白酶消化,离心重悬后使细胞密度达到2×1010 L-1,细胞移植组于大鼠脑缺血后3 d取5μL永生化神经前体细胞移植到右侧纹状体缺血半暗带区,以前囟为零点,即A:-0.5 mm,R:2.5 mm,V:-4.5 mm.脑缺血对照组仅注射等量磷酸盐缓冲液.⑤各组分别于缺血后6 h,1 d,3 d及细胞移植后1周对大鼠进行Longa神经功能评价(0～4分,分数越高表示神经功能损伤越严重),缺血后6 h神经功能评分≥1分视为模型成功.⑥细胞移植后1周处死各组大鼠,取脑组织制作冰冻切片,通过免疫组织化学SP法检测BrdU的表达,观察移植的永生化神经前体细胞在脑内缺血半暗带区的存活情况.结果:18只大鼠均进入结果分析.①体外检测移植细胞BrdU标记阳性率:永生化神经前体细胞加入BrdU标记3 d后,免疫组化检测阳性细胞胞核呈棕黄色,细胞阳性率达95%以上.②造模后不同时间点各组大鼠神经功能评价:缺血后6 h,脑缺血对照组与细胞移植组每只大鼠神经功能Longa评分均≥1分,表明造模成功,且Longa评分均明显高于假手术组[(1.70±0.48)分,(1.60±0.52)分,0分,P＜0.05].缺血后6 h,1 d,3 d及细胞移植后l周脑缺血对照组与细胞移植组Longa评分均基本相似(P＞0.05).③移植细胞的存活情况:细胞移植后1周,细胞移植组在永生化神经前体细胞移植侧针道附近可检测到BrdU免疫染色阳性细胞,而假手术组、脑缺血对照组、细胞移植组的移植对侧BrdU免疫染色均呈阴性.结论:永生化神经前体细胞植入局灶性脑缺血大鼠缺血半暗带区后,主要存活于移植侧针道附近.
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体外分离培养兔脂肪干细胞的生物学特性
目的:建立兔脂肪于细胞的体外分离培养方法,鉴定并分析其生物学特性.方法:实验于2005-06/2006-03在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室和同济医院中心实验室完成.选用雌性新西兰大白兔,兔龄4个月,无菌取出雌兔双侧腹股沟脂肪垫,贴壁法及Ⅰ型胶原酶法分离出兔脂肪干细胞,并进行体外培养,取5代以后的兔脂肪干细胞观察其形态特征,并绘制细胞生长曲线及倍增时间,同时进行细胞过氧化物酶、苏丹黑B、碱性磷酸酶、α-醋酸萘酚酯酶与糖原化学染色;用流式细胞仪检测其细胞表面标志并进行细胞周期分析.结果:①兔脂肪干细胞原代及传代细胞形态:原代及传代的兔脂肪干细胞均呈长梭形或多边形贴壁生长,生长分化活跃.②兔脂肪干细胞的生长曲线及倍增时间:传代的兔脂肪干细胞生长曲线呈"S"形,群体倍增时间为22 h.③兔脂肪干细胞的化学染色特点:兔脂肪干细胞的过氧化物酶、苏丹黑B染色呈阴性,而碱性磷酸酶、α-醋酸萘酚酯酶与糖原染色呈阳性.④兔脂肪干细胞表面标志及细胞周期:流式细胞仪检测结果显示兔脂肪干细胞的表面标志物CD29,CD44,CD90,CD105,CD166表达阳性,而CD31,CD34,CD45和CD106表达阴性.细胞周期分析显示,G0/G1期占80.25%,G2/M期占6.03%,S期占13.72%.结论:本次实验所分离出来的兔脂肪干细胞在体外具有生长稳定,增殖较快的特点.
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脂肪间充质干细胞移植对犬心肌梗死后心功能的影响
目的:观察将脂肪间充质干细胞移植入犬心肌梗死模型后,犬心功能的变化情况.方法:实验于2005-08/2006-03在解放军总医院心内科实验室及解放军总医院实验动物中心完成,选用杂种犬13只,按随机数字表法分为2组,对照组7只,脂肪间充质干细胞移植组6只.①两组犬均进行心肌梗死模型制备,取犬脂肪间充质干细胞进行体外分离培养和DAPI标记,脂肪间充质干细胞移植组犬心外膜下共注射2×106个DAPI标记后的脂肪间充质干细胞,对照组注射相同体积IMDM完全培养基.常规关闭胸腔,继续饲养4周.②于细胞移植术前、术后4周行超声心动检查,测定左心室射血分数、左心室舒张末容积及左心室收缩末容积;术后4周行血流动力学检查,测定左心室舒张末压力、左心室收缩末压力、左心室室内压大上升速率及左心室室内压大下降速率.术后4周后处死动物取心脏标本观察移植细胞存活及分化情况.结果:对照组1只犬于移植术后第2天死亡,进入结果分析共12只犬,对照组和脂肪间充质干细胞移植组各6只.①移植术后4周移植细胞存活及分化的观察结果:在脂肪间充质干细胞移植组心肌组织冰冻切片中可见发出DAPI蓝色荧光染色的细胞核,同一视野下还可看到发绿色荧光的细胞浆.②移植术后4周两组犬心功能的比较:脂肪间充质干细胞移植组与对照组比较,左心室室内压大下降速率、左心室舒张末压力、左心室舒张末容积及左心室收缩末容积减少(P＜0.05～0.01),左心室射血分数、左心室收缩末压力、左心室室内压大上升速率增加(P＜0.05～0.01).结论:脂肪间充质干细胞移植可在心肌细胞内存活,并可分化为心肌细胞,改善急性心肌梗死后心力衰竭犬的心脏功能.
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鼠骨髓间充质干细胞对缺氧-复氧神经元修复的体外实验
目的:观察在体外培养条件下骨髓间充质干细胞对缺氧-复氧新生大鼠大脑皮质神经元活性的影响.方法:实验于2005-01/2006-12在兰州大学第一医院中心实验室完成.健康Wistar大鼠成鼠5只,健康新生Wistar大鼠20只,无菌条件下分离、培养、传代Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,细胞融合达90%时更换培养基培养24 h,收集细胞培养液即为骨髓间充质干细胞条件培养基;无菌条件下培养新生Wistar大鼠大脑皮质神经元,第8天随机分为正常对照组、缺氧组、间充质干细胞条件培养基处理组,即用骨髓间充质干细胞条件培养基进行缺氧神经元的修复.分别于缺氧0 h、缺氧6 h、复氧24 h用噻唑蓝盐比色法测定吸光度值和BeckMan全自动生化仪测定培养液乳酸脱氢酶漏出量,分别检测各组神经元的活性和细胞损伤后修复的程度.结果:各实验组均全部进入结果分析.①各组神经元的活性:鼠大脑皮质神经元缺氧6 h及复氧24 h后缺氧组噻唑蓝明显低于正常对照组,骨髓间充质干细胞条件培养基处理组复氧24 h后噻唑蓝高于缺氧组(缺氧6 h:缺氧组0.42±0.14,正常对照组0.81±0.12;复氧24 h:缺氧组0.35±0.15,正常对照组0.82±0.21,骨髓间充质干细胞条件培养基处理组0.74±0.25,P＜0.01或0.001).②各组细胞损伤后修复的程度:缺氧6 h和复氧24 h后,缺氧组乳酸脱氢酶漏出量比正常对照组明显增多,骨髓间充质干细胞条件培养基处理组比缺氧组明显减少[缺氧6 h:缺氧组(790.16±34.51)nkat/L,对照组(340.07±25.17)nkat/L,骨髓间充质干细胞条件培养基处理组(570.11±53,18)nkat/L;复氧24 h:缺氧组(1790.36±252.38)nkat/L,对照组(340.07±19.00)nkat/L,骨髓间充质干细胞条件培养基处理组(860.17±40.17)nkat/L,P＜0.001].结论:在体外培养条件下骨髓间充质干细胞能增加缺氧神经元的细胞活性,促进缺氧神经元的修复.
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大鼠嗅鞘细胞原代培养克隆样生长的人为干预效应
目的:通过对大鼠嗅鞘细胞早期原代培养的克隆样生长进行人为干预,观察其对细胞的增殖、贴壁及再分布的作用.方法:实验于2005-08/2006-01在云南省肿瘤研究所完成.①将取自成年SD大鼠嗅球的嗅鞘细胞用差速贴壁法进行纯化.②将纯化后的细胞随机分为干预组和对照组,干预组于干预前1 d换液,次日倒掉上清液,加入1.25 g/L胰酶,加入量以刚浸没瓶底为宜.置于37℃培养箱消化3 min,待镜下示胞体回缩变圆时加入DMEM培养基终止消化,并予以尖吸管反复吹打至镜下见大量细胞悬浮无明显克隆样细胞团为止.随后再加入适量培养基置于培养箱中继续培养.对照组不行任何措施.③采用倒置显微镜下观察两组生长的形态学特点,比较干预组干预前后嗅鞘细胞的生长情况及贴壁分布变化.结果:①干预前两组细胞的形态学观察:用差速贴壁法纯化细胞后,发现细胞早期呈克隆样生长,分布不均匀.②干预后两组细胞的形态学观察:干预组细胞经消化吹打干预后均匀贴壁生长,无明显克隆样生长中心,细胞多呈双极或多极样形态,细胞立体感及折光性好,视野清晰,细胞增殖迅速,数天后即可长满瓶底;对照组细胞分布不均,培养至3周仍无法长满瓶底,仍呈克隆样生长状态,周边区域的细胞数量少,增殖缓慢.结论:嗅鞘细胞原代培养的早期需采取人为干预使细胞均匀分布贴壁生长,从而加快细胞的生长速度,缩短实验耗时.
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同种异体骨髓间质干细胞移植联合血管内皮细胞生长因子基因转染治疗心肌梗死
背景:骨髓间质干细胞和血管内皮细胞生长因子移植具有促进血管再生、改善心功能的作用,但是二者联合应用是否优于单独应用尚不清楚.目的:观察同种异体骨髓间质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染对大鼠急性心肌梗死血管再生和心功能的影响.设计:大鼠骨髓间质干细胞培养采用单一样本观察;细胞移植和基因转染采用随机对照动物实验.单位:华中科技大学协和医院心内科,同济医学院心血管病研究所.材料:健康雄性Wistar大鼠94只.表达载体PAdTrack/VEGF165.方法:实验于2004-06/2005-06在同济医学院心血管病研究所实验室完成.①体外分离、纯化、培养大鼠骨髓间质干细胞,以5-溴-2'-脱氧尿苷标记细胞.②制备、抽提、纯化、鉴定质粒PAdTrack/VEGF165.③结扎冠状动脉建立急性心肌梗死模型2周后,随机将其分为4组,每组均为12只,干细胞+质粒组、干细胞组、质粒组、对照组,分别进行心肌内大鼠骨髓间质干细胞移植和/或VEGF165转染、DMEM注射.④4周后行免疫组织化学和超声心动图检查.主要观察指标:①各组大鼠梗死及缺血区免疫组织化学和苏木精-伊红染色检查.②血管计数.③超声心动图检查.结果:48只大鼠进入结果分析.①干细胞+质粒组和干细胞组梗死及缺血心肌处可见大量5-溴-2'-脱氧尿苷标记的移植细胞,其中缺血心肌处部分移植细胞分化为血管内皮细胞并形成新生毛细血管.②Ⅷ因子染色阳性的新生血管密度分布为干细胞+质粒组＞质粒组＞干细胞组＞对照组(P均＜0.01).③细胞移植和基因转染治疗后室壁厚度和室壁运动幅度改善,射血分数值增加幅度为干细胞+质粒组＞干细胞组＞质粒组＞对照组(P均＜0.01).结论:同种异体骨髓间质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染能进一步增强大鼠梗死缺血区血管再生、改善室壁厚度和心功能.
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克隆化兔骨髓基质干细胞系的建立及其生物学特性
目的:建立克隆化兔骨髓基质干细胞系,为组织缺损修复研究寻找理想的种子细胞提供新的途径.方法:实验于2004-09/2005-12在浙江省医学科学院生物工程研究所完成.①取3个月龄新西兰白兔,无菌抽取骨髓液,经密度梯度离心和贴壁培养,获得原代培养骨髓基质干细胞.用有限稀释法进行克隆化培养,选择单细胞克隆增殖细胞,进行扩大培养和液氮冻存保种.②取对数生长期第2,15和32代克隆化骨髓基质干细胞,用四甲基偶氮唑盐法测定其吸光值(A值),绘制生长曲线.③取第4和32代对数生长期骨髓基质干细胞,按常规方法制作染色体标本,进行染色体分析.④取第5代对数生长期骨髓基质干细胞,用成骨诱导试验进行体外分化潜能鉴定.⑤取第5代对数生长期的骨髓基质干细胞,按常规方法测定适细胞接种密度.结果:①克隆化兔骨髓基质干细胞系的建立结果:获得一株克隆化兔骨髓基质干细胞系,其细胞形态为均一的长梭形,体外连续传代培养至32代,细胞仍保持旺盛的增殖能力.经-196℃冻存复苏后仍保持良好的生长状态.②生长曲线:克隆化骨髓基质干细胞的第2,15和32代细胞生长曲线基本相同,细胞增殖速度没有明显的下降趋势.③染色体分析:第4和32代克隆化兔骨髓基质干细胞的染色体众数均为44条,结构未见异常.显示该细胞在体外经过32代培养,仍保持稳定的二倍体核型.④适接种密度:第5代对数生长期骨髓基质干细胞,经常规方法测定,以1×103/cm2的接种密度为适接种密度.⑤体外分化潜能:第6代克隆化骨髓基质干细胞,在向成骨细胞诱导条件下,4,8,12碱性磷酸酶的表达均显著高于对照组[(375.41±13.17)比(239.38±7.33)nkat/L,(503.77±13.34)比(249.22±5.17)nkat/L,(605.95±10.84)比(298.73±8.17)nkat/L,P＜0.01];茜素红染色显示有钙化结节形成,对照组为阴性.表明克隆化兔骨髓基质干细胞具有体外诱导分化潜能.结论:采用克隆化分离技术,成功获得了单细胞克隆的具有旺盛增殖能力和分化潜能,遗传性能稳定的兔骨髓基质干细胞系.
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构建永生化人肝细胞系人端粒酶反转录酶真核表达质粒
目的:构建人端粒酶反转录酶真核表达质粒,为人端粒酶反转录酶稳定转染细胞提供简单、快速的检测方法.方法:实验于2005-06/2006-03在解放军第三○二医院病毒研究室完成.①聚合酶链反应扩增人端粒酶反转录酶基因和绿色荧光蛋白基因.②利用基因重组技术构建真核表达质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP-C1-hTERT,筛选阳性克隆进行双酶切、聚合酶链反应和序列测定.③转染HepG2细胞,荧光显微镜下观察人端粒酶反转录酶基因和绿色荧光蛋白的表达情况.结果:①聚合酶链反应扩增目的基因:电泳显示人端粒酶反转录酶基因的聚合酶链反应产物在3.5kb处有特异性目的条带,绿色荧光蛋白基因的聚合酶链反应产物在750 bp处显示特异性目的条带.②质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP-C1-hTERT的构建和鉴定结果:双酶切、聚合酶链反应鉴定和测序结果与预期完全相符.③转染HepG2细胞结果:荧光显微镜下观察人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白主要分布在细胞核内.结论:①初步验证所构建的真核表达质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP-C1-hTERT的正确性.两种质粒可使转染细胞同时表达人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白,通过观察绿色荧光蛋白的表达对转染效率和结果进行及时、快捷的观察.②重组真核表达质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP-C1-hTERT的构建成功,为人端粒酶反转录酶转染细胞提供简洁、快速、实时的检测方法,并为建立永生化人肝细胞系奠定基础.
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含NURR1基因腺病毒修饰神经干细胞移植治疗帕金森病的试验
目的:观察含NURR1基因腺病毒修饰的C17.2神经干细胞移植治疗对帕金森病模型症状和组织学的改善.方法:实验于2004-03/2005-01在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成.6-羟基多巴脑内立体定向及单侧纹状体两点定位注射制作SD大鼠帕金森病模型,1周后,行阿朴吗啡行为学检测,即阿朴吗啡(0.5 mg/kg)腹腔内注射后30 min内,计数大鼠平均每分钟身体旋转360°的次数,达到6圈/min及以上者为合格帕金森病模型,每周测1次,连续4周,获取稳定动物模型共31只,分为帕金森病模型对照组10只、帕金森病+C17.2组11只、帕金森病+C17.2+腺病毒组10只,无菌收集所需的C17.2神经干细胞、含NURR1基因腺病毒载体修饰C17.2神经干细胞,浓度为(1.0～4.0)×109L-1细胞,对入组的帕金森病模型进行无菌细胞注射移植,注射点与造模时注射点相同,每点约3μL,帕金森病模型对照组注射生理盐水.细胞移植后10 d和4周进行阿朴吗啡诱发的帕金森病模型旋转试验,免疫组化检测帕金森病模型纹状体内酪氨酸羟化酶阳性神经元数量.结果:在实验过程中又有4只死亡,共有27只帕金森病模型鼠进入试验.①帕金森病模型旋转圈数:移植后10 d和4周帕金森病+C17.2组和帕金森病+C17.2+腺病毒组均少于帕金森病模型对照组,帕金森病+C17.2+腺病毒组少于帕金森病+C17.2组(移植后10 d:帕金森病模型对照组21.57±5.26,帕金森病+C17.2组3.90±0.90,帕金森病+C17.2+腺病毒组1.56±0.58;移植后4周:帕金森病模型对照组18.40±5.84,帕金森病+C17.2组3.60±0.67,帕金森病+C17.2+腺病毒组1.00±0.55,P＜0.05).②纹状体内酪氨酸羟化酶阳性细胞数:移植后10 d帕金森病+C17.2组和帕金森病+C17.2+腺病毒组多于帕金森病模型对照组,帕金森病+C17.2+腺病毒组多于帕金森病+C17.2组(帕金森病模型对照组3.50±0.67,帕金森病+C17.2组13.17±1.89,帕金森病+C17.2+腺病毒组20.50±1.67,P＜0.05).结论:NURR1基因结合神经干细胞有效改善了帕金森病模型症状,提高移植后酪氨酸羟化酶阳性神经元细胞的数量.
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脑源性神经营养因子基因修饰人骨髓间充质干细胞有限细胞系的建立
目的:建立脑源性神经营养因子基因修饰的人骨髓间充质干细胞系.方法:实验于2004-02/2005-06在解放军军事医学科学院干细胞研究中心完成.人类骨髓细胞来源于解放军三○七医院骨髓移植治疗的6名健康成年骨髓供者,男3名,女3名,年龄25～45岁.常规分离培养人骨髓间充质干细胞,流式细胞术检测骨髓间充质干细胞表面分子CD34、CD44、CD45,采用重组逆转录病毒载体将脑源性神经营养因子基因转入人骨髓间充质干细胞.检测脑源性神经营养因子基因修饰的骨髓间充质干细胞的增殖特性,细胞内脑源性神经营养因子的蛋白表达,细胞培养液中脑源性神经营养因子含量,以及PCR检测脑源性神经营养因子-骨髓间充质干细胞中外源性脑源性神经营养因子基因DNA.结果:①人工分离培养出的骨髓间充质干细胞,形态、大小一致,呈长梭型或长多边形,从P0至P20基本保持一致,P2代骨髓间充质干细胞表达基质细胞表面标志CD44,不表达造血系细胞表面标志CD34、CD45.②反转录病毒感染骨髓间充质干细胞的感染效率约为10%,修饰后形成的脑源性神经营养因子-骨髓间充质干细胞在形态上始终保持一致,与骨髓间充质干细胞几乎完全一样,生长速率与未经基因修饰的骨髓间充质干细胞基本相同,培养10代后细胞停止分裂,免疫细胞化学染色显示脑源性神经营养因子-骨髓间充质干细胞的脑源性神经营养因子阳性率超过98%,培养72 h后培养基中脑源性神经营养因子的含量较之骨髓间充质干细胞提高约20 000倍.③PCR对脑源性神经营养因子-骨髓间充质干细胞基因组DNA进行扩增,得到外源性脑源性神经营养因子条带.结论:利用反转录病毒载体进行基因修饰得到了稳定的脑源性神经营养因子基因修饰的人骨髓间充质干细胞有限细胞系,为基因治疗提供了一种以多潜能成体干细胞为载体的种子细胞.
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自体骨髓基质源干细胞在损伤脑区及其他脑区的分布
背景:近来骨髓基质细胞多向分化潜能的发现,特别是骨髓基质细胞向神经干细胞方向分化的成功,为干细胞移植治疗神经系统损伤提供了可能.目的:观察自体骨髓基质源干细胞对脑损伤的治疗作用.设计:以BrdU标记的自体骨髓基质源干细胞在模型动物损伤脑区和其他脑区的分布为观察对象的前瞻性研究.单位:北京军区总医院.材料:实验于1999-10/2002-02在北京军区总医院完成.取1.5～3.0岁成年家犬22只,雌雄不限,体质量(13±2)kg.随机分为假手术组6只,常规治疗组8只,骨髓基质源神经干细胞组8只.方法:对犬骨髓基质细胞进行采集、分离、体外扩增、标记和移植用细胞培养.假手术组仅做皮肤切口及颅骨锥孔,不致中脑损伤,于麻醉清醒后行正常进食.常规治疗组行中脑被盖区毁损后行三磷酸腺苷20 mg,辅酶A 50 u,加入生理盐水中静脉滴注,2次/g,共3 d.骨髓基质源神经干细胞组行中脑被盖区毁损,然后给予骨髓基质细胞源神经干细胞1 mL和脑脊液1 mL的混合液,注入脑室,1次/d,共3 d.术后第1,7,14,28天4个时间点观察骨髓基质源干细胞在损伤脑区及其他脑区的分布情况.主要观察指标:观察骨髓基质源干细胞在损伤脑区及其它脑区的分布情况.结果:22只动物均进入结果分析.①在术后第28天:骨髓基质源神经干细胞组BrdU阳性细胞明显高于假手术组和常规治疗组[(15.4±2.4,0.5±0.5,0.5±0.5)个].②骨髓基质源神经干细胞组术后第14天脑片BrdU阳性细胞数:中脑的伤侧明显高于对侧[(15.5±3.3,5.0±1.5)个];额叶的伤侧高于对侧[(1.6±0.6,1.5±0.7)个].结论:由于骨髓基质源神经干细胞移植组BrdU阳性细胞数在脑损伤区的分布明显多于对侧非伤区和两个对照组的同部位.提示骨髓基质源干细胞可向损伤脑区迁移,能对脑干损伤的恢复有一定促进作用.
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应用原瓶黏附分选表皮干细胞的方法学特点
目的:探索一种简单易行的方法分离表皮干细胞,为组织工程学的进一步研究奠定基础.方法:实验于2005-07/12在中山大学眼科中心国家眼科学重点实验室完成.健康3个月龄恒河猴2只,分离与培养猴表皮细胞,获取第2～4代的细胞,消化后,将细胞重新放回原瓶中,培养箱中静置20 min,获得的贴壁细胞即为快吸附的表皮细胞.①于光学显微镜下观察分选前细胞和快吸附细胞.②对20 min快吸附的表皮细胞进行整合素α6和CD71流式细胞仪检测,以未经吸附分选的细胞作为对照.③20 min快吸附的表皮细胞和分选后未黏附细胞分别制作3组细胞爬片,进行整合素β1、K15、和K10的免疫组织化学染色.④20 min快吸附的表皮细胞和分选后未黏附细胞进行K15、整合素β1和K1(K10对应角蛋白)的mRNA反转录聚合酶链反应的检测.结果:①分选后的细胞体积较小,核浆比例较大.②流式细胞仪的结果显示快吸附细胞以干细胞为主(α6bri CD71dim 为82.5±1.641),也含有少量的短暂扩增细胞(α6bri CD71bri 为4.9±2.125),有丝分裂后细胞及终末细胞则检测不到(α6dim).③免疫组化可见快吸附细胞呈K15和整合素β1阳性,K10阴性;分选后未黏附细胞K10为阳性,而K15和整合素β1均为阴性.④反转录聚合酶链反应示吸附分选后的快吸附细胞高表达K15和β1整合素,K10没有表达;而分选后剩余的细胞只表达K10.结论:原瓶黏附分选方法是一种简单可行的分选表皮干细胞的方法.
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联合应用地塞米松和维甲酸诱导兔骨髓基质细胞向成骨方向的转化
目的:观察维甲酸和地塞米松对兔骨髓基质细胞的成骨诱导影响,探讨二者联合诱导兔骨髓基质细胞向成骨细胞分化的可能性和适当条件,使兔骨髓基质细胞向成骨诱导得以优化,从而为临床治疗骨缺损提供实验基础.方法:实验于2005-12/2006-3在锦州医学院附属第一医院骨科实验室完成.①体外培养兔骨髓基质干细胞.②用不同的诱导剂将其向类成骨细胞诱导.实验分非诱导组(用DMEM培养基培养),地塞米松诱导组(培养基中加入地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C),维甲酸诱导组(培养基中加入维甲酸),地塞米松与维甲酸联合诱导组(培养基中加入地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C和维甲酸).③通过倒置相差显微镜对细胞的形态进行观察;于第4,6,8,10,12天定量检测其分泌的碱性磷酸酶;应用原位杂交技术检测Ⅰ型胶原的表达情况.结果:①原代和传代培养时不同组别兔骨髓基质细胞的生长情况:地塞米松诱导组细胞形态向类成骨细胞转化,维甲酸诱导组细胞与神经干细胞类似,地塞米松与维甲酸联合诱导组细胞与地塞米松诱导组细胞形态变化大体一致,但细胞更饱满,多角形细胞比例更高,部分区域细胞呈现漩涡状分布.②各组碱性磷酸酶活性检测结果:非诱导组碱性磷酸酶表达量低,随时间略有增加;地塞米松诱导组碱性磷酸酶表达呈曲线升高[6,8,10,12 d依次为(265.9±47.3),(445.4±69.4),(650.3±52.0),(703.6±62.5)nkat/L];维甲酸诱导组基本无碱性磷酸酶表达;地塞米松与维甲酸联合诱导组碱性磷酸酶表达趋势与地塞米松诱导组相似,但绝对值有所增高[6,8,10,12 d依次为(355.4±62.2),(631.3±84.4),(925.0±69.0),(1039.5±85.2)nkat/L].③各组原位杂交技术检测Ⅰ型胶原结果:地塞米松诱导组和地塞米松、维甲酸联合诱导组检测Ⅰ型胶原结果发现胞浆内可见大量棕黄色颗粒,非诱导组与维甲酸诱导组为阴性.结论:适当浓度地塞米松可成功的将兔骨髓基质细胞向成骨细胞诱导,维甲酸与地塞米松联合诱导可使成骨能力进一步加强,表现为碱性磷酸酶表达明显增高,并表达Ⅰ型胶原,具体浓度条件有待进一步研究.
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碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后目的基因的表达
目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后bFGF目的基因的表达情况,并进行影响骨髓间充质干细胞的生物学特性分析.方法:实验于2005-03/2006-02在中山大学第二附属医院医学研究中心完成.①选择近交系4周龄雄性SD大鼠10只,贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,构建含bFGF基因的腺病毒表达载体,利用腺病毒介导转染SD大鼠骨髓间充质干细胞.②传2代后,将细胞接种12孔培养板,培养至90%融合时弃上清,调整转染病毒滴度范围为50～400.荧光显微镜下通过观察绿色荧光强度检测转染效果,以流式细胞仪检测细胞转染效率.③传2代后,胰酶消化,置于6孔板内,每孔细胞数量5×105,2 d后细胞贴壁生长于盖玻片上,分别转染Ad.bFGF、Ad.GFP,同时设立空白对照.转染病毒滴度选择200.应用免疫组化和Western-Blot法鉴定碱性成纤维细胞生长因子的表达,ELISA法检测培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子的浓度.观察转染后骨髓间充质干细胞形态和生长情况的变化.结果:①pcDNA3/bFGF的鉴定结果:成功构建碱性成纤维细胞生长因子腺病毒表达载体.②Ad.GFP转染骨髓间充质干细胞的效率测定:转染48 h后,绿色荧光蛋白的表达明显增强.当转染病毒滴度≤200时,腺病毒的转染效率与病毒剂量呈明显的正相关(P＜0.05),当＞200时转染效率趋于稳定,均在96%以上.③Ad.bFGF转染骨髓间充质干细胞的表达情况:bFGF蛋白表达免疫组化检测可见转染Ad.bFGF骨髓间充质干细胞的胞浆内充满棕褐色颗粒,阳性表达率为86%,而转染Ad.GFP及空白对照的骨髓间充质干细胞均为阴性.Western-Blot示转染Ad.bFGF的细胞裂解产物中碱性成纤维细胞生长因子含量明显高于转染Ad.GFP及空白对照.ELISA检测结果表明转染Ad.bFGF的细胞培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子浓度第15天达高峰1 467 ng/L,此后逐渐下降,但至转染第28天时仍显著高于空白对照(441 ng/L,128 ng/L,t=4.31,P＜0.01).④转染Ad.bFGF对骨髓间充质干细胞增殖的影响:骨髓间充质干细胞的增殖分化没有明显变化.结论:采用腺病毒介导的基因转染技术可以将碱性成纤维细胞生长因子转染至骨髓间充质干细胞中,并有外源性基因和蛋白的表达.提示骨髓间充质干细胞是碱性成纤维细胞生长因子基因治疗的理想载体.
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经冠状动脉自体骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死:3个月疗效随访
背景:急性心肌梗死预后的决定因素是心肌梗死的面积.减少梗死面积的方法有改善血运和替代治疗.骨髓间充质干细胞可以分化为心血管组织,而且获取容易体外培养扩增,成为心血管替代治疗的理想细胞.目的:评价经冠状动脉人骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的疗效.设计:患者自身前后对照观察.单位:南京医科大学附属南京第一医院心内科、核医学科、超声心动图室.对象:选择2003-03/2004-03南京医科大学附属南京第一医院心内科收治的急性心肌梗死进行骨髓间充质干细胞移植治疗患者20例.患者知情同意,术后完整随访＞3个月.男15例,女5例,平均年龄(64±10)岁.方法:①20例患者,均行经皮冠状动脉介入治疗治疗梗死相关血管.术后3 d内采集患者自体骨髓,提取干细胞体外诱导、分化、增殖.2周内经冠状动脉植入梗死相关血管,平均植入干细胞数量为(21.7±30.14)×107.②干细胞植入前及术后3个月行门控双核素心肌灌注/代谢显像(18F-脱氧葡萄糖,18F-FDG)检查,预测存活及坏死心肌,并获取梗死面积.同时行超声心动图检查评价室壁运动、心功能指标,术后3个月复查超声心动图检查评价室壁运动、心功能指标改善情况.③门控双核素心肌灌注/代谢显像(18F-FDG-SPECT)评价采用5分法:正常0分,稀疏1分,明显稀疏2分,缺损3分.超声心动图评价标准:正常1分,减低2分,明显减低3分,室壁无运动或矛盾运动4分；室壁运动二个分值或二个分值以上为室壁运动改善.主要观察指标:①门控双核素心肌灌注/代谢显像(18F-FDG-SPECT)结果.②超声心动图随访观察患者干细胞移植前后梗死相关心肌节段评分及心功能指标.结果:20例患者全部进入结果分析.①门控双核素心肌灌注/代谢显像(18F-FDG-SPECT)结果:20例患者心肌灌注缺损面积治疗后较治疗前明显减少((33±15)％,(44±18)％,P＜0.05)；代谢缺损面积治疗后较治疗前明显减少((33±17)％,(43±21)％,P＜0.05)；治疗前共有199个节段血流灌注及糖代谢缺损匹配,判定为坏死心肌,治疗后79个节段血流灌注代谢明显改善,仍有120个节段血流灌注、糖代谢无明显改善(P＜0.05).⑥超声心动图结果:患者术后射血分数值术后显著大于术前[(53±8)％,(42±7)％,P＜0.05].结论:经冠状动脉途径植入人骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死,方法简单易行,治疗后梗死面积明显减少,坏死区域心肌血流灌注、代谢改善,术前判定为无存活心肌节段术后明显减少,患者心功能得到改善.
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人体股骨冲击特性数值模拟
目的:考察人体步态运动过程中冲击载荷作用时的应力和变形分布.方法:①2005-08-31在徐州医学院附属医院通过美国GE公司HispeedNx/i型双层螺旋CT对一志愿者(年龄28岁,身高173 cm,体质量60 kg)的股骨进行扫描,获得DICOM格式图像数据,采用逆向工程方法生成实体模型.②将三维模型导入有限元分析软件(Ansys 8.0),单元选择Solid45,骨密质的弹性模量选择为16.7 GPa,泊松比0.3.③对股骨进行远端固定,模拟股骨在膝关节完全固定情况(人体站立相)下的静力影响,同时采用冲击载荷对股骨进行试验,比较冲击载荷对股骨的不同作用效果,以及股骨在冲击载荷作用下的力学特性.结果:①在200 N载荷作用下静载的峰值应力大于冲击载荷作用(847.451 MPa比308.511 MPa),从分布区域看,静载的峰值应力主要集中在股骨干部分,位置接近于远端1/3处,而冲击载荷峰值分布于股骨颈周围区域.②股骨在受到2 546.04 N冲击载荷作用后,股骨颈下部是应力响应的敏感区域,随着与冲击区域距离的增加,应力响应逐渐变小,除股骨近端1/3处外其他各处响应均迅速下降.③应力值随着冲击载荷的增大而增大,载荷为2 063.88 N,2 546.04 N时大应力区均集中在股骨颈的下侧面,但当冲击载荷达到2 728.32 N时大应力区超出颈部区域,出现在小转子外侧的股骨干上,且应力分布峰值区域变大.结论:①在低冲击载荷作用下,高应力区出现在股骨颈附近区域,随着载荷的增加,破坏区域从单纯的骨股颈区域扩展到了小转子外下侧的股骨干区域.②对比临床,股骨颈和小转子外下侧股骨干部分也是可能导致骨折的区域.
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基于多尺度形态学的医学图像局部对比度增强
目的:寻找一种更精确有效的医学图像局部对比度增强方法,解决磁共振图像中常出现的局部对比度不足问题.方法:在对已有算法研究的基础上,提出了新算法.新算法的特点是:形态学运算采用了非对偶运算,对比度扩展运算采用加法运算代替乘法运算.为避免灰度偏差,提出了条件归一方法.结果:用实用磁共振图像和模拟实验对新算法进行了测试.新算法在精度、运算速度及对噪声的敏感性方面都优于已有同类算法.结论:利用形态学非对偶运算能够以更精确的方式实现局部对比度增强,灰度级偏差可以通过归一化方法消除.
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言语测听在助听器选配中的应用
背景:言语测听在助听器的选配中有决定性的作用,但中国临床应用较少. 目的:通过言语测听了解耳内式助听器和耳背式助听器的使用者在言语分辨率上的差别.设计:配对对照实验.单位:解放军第四一四医院听力中心,江苏省听力康复中心.对象:选择就诊于解放军第四一四医院听力中心,江苏省听力康复中心耳聋患者62例.32例(耳)使用耳内式助听器耳聋患者中,平均听力损失(500,1 000,2 000,4 000 Hz)＜85 dB,年龄16～60岁.30例(耳)使用耳背式助听器耳聋患者中,平均听力损失(500,1 000,2 000,4 000 Hz)＜85 dB,年龄16-60岁.对实验均知情同意.方法:采用开放法和闭合法,分别对耳内式、耳背式助听器使用者,进行单耳聆听条件下的言语测试.言语信号类型选用单音节词和双音节词,每耳测听单音节词和双音节词各为20个.主要观察指标:耳内式、耳背式助听器对单、双音节词测听比较.结果:耳内式、耳背式助听器使用者的使用效果相比,在言语分辨率上无论开放式、闭合式对双音节词、单音节词的分辨率差异均无显著性意义(P＞0.05);双音节词和单音节词的分辨率比较,开放式的状态下,差异有显著性意义(P＜0.05);闭合式的状态下,差异无显著性意义(P＞0.05).结论:在助听器选配中言语测听的实际实施受诸多因素影响.
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低功率半导体激光照射后耐药金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌的耐药性变化
目的:观察耐甲氧西林金黄色葡萄球菌与耐药铜绿假单胞菌经低功率半导体激光照射后,其耐药强度的变化,初步探讨激光照射治疗耐药细菌的可行性.方法:实验于2005-11/2006-01在西京医院检验科细菌实验室进行.①取临床分离菌株:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌与耐药铜绿假单胞菌,抗生素:青霉素,头孢唑啉,头孢派酮,替卡西林.②两种细菌均分为1个对照组与4个实验组.实验组分别为20 mW照射30,60 min,40 mW照射30,60 min.实验组菌液每天照射1次,连续4 d.对照组不照射.③青霉素与头孢唑啉测试耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性,头孢派酮与替卡西林测试耐药铜绿假单胞菌耐药性.倍比稀释法检测各组照射1,4 d后的低抑菌浓度.结果:①青霉素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的低抑菌浓度值:经1次照射后各实验组没有改变;经4次照射后,各实验组均低于对照组, 其中40 mW照射60 min组较对照组低了3个梯度.②头孢唑啉对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的低抑菌浓度值:经过1次照射后,各实验组均低于对照组,其中20mW照射60min组较对照组低了3个梯度;经过4次照射后,20 mW照射30 min组较对照组低了4个梯度.照射1次和4次比较差异不显著.③头孢派酮对铜绿假单胞菌的低抑菌浓度值:经1次照射后,20mW照射30,60min组均较对照组低了3个梯度;经4次照射后,20 mW照射30 min组较对照组低了2个梯度.经4次照射后各实验组低抑菌浓度值均高于照射1次后.④替卡西林对铜绿假单胞菌的低抑菌浓度值:经1次照射后,各实验组均低于对照组,其中照射30min组较对照组低4个梯度;经4次照射后,各实验组的低抑菌浓度值均比1次照射后上升,仍是20 mW照射30 min组的值低,比对照组低2个梯度.结论:①耐药菌经低功率半导体激光照射后,耐药性下降.因此,激光体外照射炎症部位可能有助于提高药物疗效.②耐药金黄色葡萄球菌较铜绿假单胞菌所需激光生物剂量大,提示应根据疾病主要致病菌种类确定佳激光照射的生物剂量.
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数据挖掘在医学影像储存与传输系统结构化报告中的应用
目的:应用数据挖掘技术的理论和方法,挖掘基于医学影像存储与传输系统的结构化报告归档数据库诊断信息资料,扩充结构化报告的影像诊断教学知识库和报告模板库.方法:结构化报告系统基于医学影像存储与传输系统的体系结构,报告的存储与传输符合医学数字影像与通讯标准.应用数据挖掘技术,实现对结构化报告文本数据资料的提取、分类和编码.结果:挖掘结构化报告归档数据库中诊断报告的数据资料,形成带有12个节点的疾病知识库决策树,在知识库中存储.按诊断报告格式,将疾病对应的条件属性值转换为报告模板,形成结构化报告的诊断报告模板库,使影像诊断医生能够依据可能的诊断结果,利用操作菜单,从中选择那些符合观察结果的影像特征值.结论:数据挖掘技术在结构化报告系统中的应用有利于提高影像诊断报告质量和效率.
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基于平滑伪魏格纳分布的人体结肠压力信号分析
目的:对人体结肠压力信号进行时频分析,探求人体结肠的运动学和动力学特性.方法:采用瑞典CTD-SYNETICS公司生产的胃肠道功能监测仪测试结肠功能正常和异常受试者的结肠压力数据,并采用平滑伪魏格纳分布分析人体结肠压力信号.结果:从人体结肠压力信号的平滑伪魏格纳分布,可以看出三类结肠动力特性:正常动力、动力过缓和动力紊乱,与临床观察相符.结论:平滑伪魏格纳分布具有良好的时频分辨率,可以在降低噪声干扰的同时有效地分析出信号的规律性.采用平滑伪魏格纳分布能够有效分析结肠压力信号的特性,为揭示结肠动力特性提供有用的手段.
