中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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成体干细胞在治疗心力衰竭上的临床研究问题与前景
背景:近年来心力衰竭的发病率正在逐年增加,尽管传统治疗手段已取得了巨大的进步,但只能起到延缓心力衰竭进程的作用,并不能彻底解决心脏组织损伤的根本问题.而细胞治疗具有改变心力衰竭治疗现状的潜力,可以通过心肌再生彻底根治心力衰竭.目的:对目前几种不同成体干细胞治疗心力衰竭的研究进展做一综述.方法:以"heart failure,adult stem cells,keletal myoblasts,cardiac stem cells,mesenchymal stem cells"等为关键词检索PubMed等外文数据库,以"心力衰竭、成体干细胞、骨骼肌成肌细胞、心脏干细胞、间充质干细胞"等关键词检索CNKI等中文数据库从2001年至今的相关文献,排除与文章研究目的无关及重复性文章,纳入符合标准的61篇文献进行综述.结果与结论:目前临床研究用于治疗心力衰竭的成体干细胞种类主要包括骨骼肌成肌细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、人脐血间充质干细胞、心脏干细胞.多数临床结果显示成体干细胞在治疗心力衰竭上具有良好的效果且不良反应小,成体干细胞治疗心力衰竭的作用机制可能与移植形成新的血管、旁分泌机制、细胞融合有关,但具体细胞株、剂量、给药途径、治疗频率的选择以及精确的作用机制等仍需进一步研究.
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外周血单倍体造血干细胞移植治疗成人急性淋巴细胞白血病:监测微小残留病及干预复发
背景:异基因造血干细胞移植后复发是影响急性淋巴细胞白血病患者长期生存的主要问题.早期干预、预防移植后复发可以提高无病生存率、总体生存率,降低移植后死亡率.通过分子生物学技术监测微小残留病是目前广泛可靠、切实可行的方法.目的:动态监测成人急性淋巴细胞白血病患者外周血单倍体造血干细胞移植后微小残留病指标,探讨其预测早期复发的意义.方法:选择2011年6月至2017年6月在郑州大学第一附属医院行外周血单倍体造血干细胞移植治疗的急性淋巴细胞白血病患者53例,检测移植后1,3,6,12个月微小残留病指标变化,观察微小残留病水平与移植后复发的关系.结果与结论:①微小残留病阳性组与阴性组的无病生存率分别为20.0%和65.8%,总生存率分别为50.8%和68.9%,差异均有显著性意义;②移植后骨髓微小残留病阳性患者16例,进行干预治疗后,4例患者微小残留病转阴,至今未复发;③血液学复发患者11例,分别给予酪氨酸激酶抑制剂靶向治疗、化疗、供者淋巴细胞输注和二次移植,终血液学复发死亡,从发现微小残留病阳性到血液学复发的中位时间为100(7-190) d,期间给予干预,可延长复发时间;④1例患者拒绝治疗,终复发死亡;⑤结果表明,急性淋巴细胞白血病患者外周血单倍体造血干细胞移植后动态监测微小残留病水平,预防早期复发,及时给予干预治疗,可以提高移植后无病生存率、总体生存率,延长复发时间.
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骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死大鼠心肌钾离子通道蛋白和细胞因子的影响
背景:研究表明,骨髓间充质干细胞移植可以有效改善心肌梗死后的心功能,移植后的骨髓间充质干细胞可能对心肌电生理有一定影响,但目前相关的研究甚少.目的:观察骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死大鼠心肌钾离子电压门控通道蛋白和心肌梗死相关细胞因子的影响,为进一步探索骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死引起心律失常的相关机制提供研究基础.方法:将40只SPF级Wistar雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、细胞培养液组和骨髓间充质干细胞组.通过冠状动脉左前降支结扎建立心肌梗死模型,并于建模成功15-20 min后在梗死区周围采用四点法注射100 μL骨髓间充质干细胞悬液(含1×106个骨髓间充质干细胞)和100 μL细胞培养液.细胞移植4周后获取心脏标本,采用苏木精-伊红染色观察梗死心肌组织病理形态并计算梗死面积,采用Westernn blot检测钾离子电压门控通道蛋白Kv1.2和Kv1.5和心肌细胞特异性蛋白cTnT的表达,利用免疫组化方法检测梗死区心肌细胞凋亡因子Caspase-3、自噬因子Bcl-2 和一氧化氮及超氧化物歧化酶的表达.结果与结论:①与模型组相比,骨髓间充质干细胞组心肌梗死面积减小(P < 0.05),cTnT、Kv1.5和超氧化物歧化酶表达水平均提高(P < 0.05),Caspase-3、Bcl-2和Kv1.2表达水平均降低(P < 0.05);②与细胞培养液组比较,骨髓间充质干细胞组心肌梗死面积减小(P < 0.05),cTnT、Kv1.5和超氧化物歧化酶表达水平均提高(P < 0.05),Caspase-3、Bcl-2和Kv1.2表达水平均降低(P < 0.05);③结果提示,骨髓间充质干细胞移植提高了心肌抗氧化能力,减少了细胞凋亡和自噬,促进钾离子通道蛋白Kv1.5的表达.
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脑源性神经营养因子修饰人羊膜间充质干细胞移植改善老年痴呆大鼠的学习记忆能力
背景:研究发现多种干细胞治疗老年痴呆大鼠效果显著,但关于脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)修饰人羊膜间充质干细胞移植治疗老年痴呆的研究报道较少.目的:探讨BDNF修饰人羊膜间充质干细胞移植对老年痴呆大鼠学习记忆能力的影响.方法:将48只SD大鼠根据随机数字法分为对照组、模型组、干细胞移植组和BDNF修饰干细胞移植组,每组12只.后3组建立老年痴呆大鼠模型,干细胞移植组和BDNF修饰干细胞移植组大鼠基底前脑注射人羊膜间充质干细胞和BDNF修饰人羊膜间充质干细胞.移植后2周,大鼠在三等份辐射式迷宫箱中检测学习记忆能力,免疫组化染色结合图像分析测定p75 NGFR阳性神经元数目.结果与结论:①模型组、干细胞移植组、BDNF修饰干细胞移植组斜角带和内侧隔核p75 NGFR阳性神经元数均低于对照组(P < 0.05),干细胞移植组、BDNF修饰干细胞移植组斜角带和内侧隔核p75 NGFR阳性神经元数均高于模型组(P < 0.05),BDNF修饰干细胞移植组斜角带和内侧隔核p75 NGFR阳性神经元数高于干细胞移植组(P < 0.05);②模型组、干细胞移植组、BDNF修饰干细胞移植组大鼠的学习记忆能力均低于对照组(P < 0.05),干细胞移植组、BDNF修饰干细胞移植组大鼠的学习记忆能力均高于模型组(P < 0.05),BDNF修饰干细胞移植组大鼠的学习记忆能力高于干细胞移植组(P < 0.05);③BDNF修饰干细胞移植组大鼠的学习次数与p75 NGFR阳性神经元数呈负相关(P < 0.05),记忆能力与p75 NGFR阳性神经元数呈正相关(P <0.05);④结果表明,人羊膜间充质干细胞移植可提高老年痴呆大鼠的学习记忆能力,BDNF修饰人羊膜间充质干细胞可进一步提高人羊膜间充质干细胞的治疗效果.
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自体外周血单个核细胞治疗高位桡神经离断伤
背景:近年来神经干细胞、脂肪间充质干细胞、肌源性干细胞、诱导多能干细胞已应用于治疗周围神经损伤,但自体外周血单个核细胞应用于外周神经损伤的治疗鲜有报道.目的:观察自体外周血单个核细胞治疗高位桡神经离断伤的疗效.方法:自2011年4月至2015年9月,共收治上臂中段桡神经离断伤12例,术前动员外周血单个核细胞,手术当日提取外周血单个核细胞悬液15 mL,手术探查吻合桡神经,显微镜下行端端外膜缝合法吻合神经,用浸泡5 mL自体外周血单个核细胞悬液的凝胶海绵包裹神经吻合口,剩余10 mL外周血单个核细胞悬液行局部肌肉多点注射,每点注射0.5 mL,缝合深筋膜,常规缝合伤口.术后给予抗生素预防感染48 h,上肢制动4周,指导患者康复锻炼.随访观察腕关节背伸度数、伸腕伸指肌肌力,进行疗效评价.结果与结论:①术后患者均获随访,随访时间15-36个月,平均17个月;②综合评价:优9例,良2例,可1例,差0例,优良率为92%;③腕关节背伸均能够达到功能需要,拇指背伸、伸指基本满足功能要求;④结果提示,自体外周血单个核细胞移植治疗高位桡神经损伤效果满意.
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两种状态脐血间充质干细胞移植对脑梗死大鼠神经功能恢复的对比研究
背景:脐血间充质干细胞对缺血缺氧引起的神经细胞损伤具有修复作用,而原代分离的和经过诱导分化的细胞,何种状态的治疗效果好未有定论.目的:比较原代分离的和经过培养诱导分化的2种状态脐血间充质干细胞对大鼠脑梗死模型治疗效果.方法:①取足月分娩的胎儿脐血,经四联袋梯度密度离心法分离脐血间充质干细胞;②通过含有碱性成纤维生长因子的培养基诱导分化脐血间充质干细胞;③将60只大鼠随机等分为4组:假手术组、模型组、原代细胞治疗组及诱导分化细胞治疗组,后3组建立脑梗死模型.原代细胞治疗组及诱导分化细胞治疗组分别在造模后7 d通过尾静脉注射原代分离的和经过培养诱导分化的2种状态脐血间充质干细胞.结果与结论:移植原代分离的和经过培养诱导分化的2种状态脐血间充质干细胞的脑梗死模型大鼠平衡、行走、空间定位和学习记忆能力得到明显改善,且其中与原代分离的脐血间充质干细胞治疗的大鼠相比,经诱导分化的脐血间充质干细胞治疗的大鼠脑梗死体积接近,脑组织病理损伤改善更为明显,脑组织中 CD34、Ki-67阳性细胞数量较高,神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数量较低,脑组织中炎症因子白细胞介素1β和肿瘤坏死因子β表达减少,而白细胞介素6表达水平接近.说明经过培养诱导分化的脐血间充质干细胞对脑梗死模型大鼠神经功能的治疗效果更佳.
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人骨髓间充质干细胞脑内移植治疗锰中毒模型的可行性
背景:研究证明骨髓间充质干细胞可以治疗中枢神经系统疾病,具有进行自我更新和分化成多种神经细胞类型的功能,而且被证明可以在移植入动物模型脑后成功分化为多巴胺神经元.目的:观察移植的骨髓间充质干细胞对锰中毒大鼠行为学以及脑内多巴胺神经元的影响.方法:通过向 SD 大鼠腹腔内注射四水氯化锰构建锰中毒大鼠模型,将锰中毒大鼠随机分为骨髓间充质干细胞组和对照组,分别向锰中毒大鼠右侧纹状体内移植5 μL第3代人骨髓间充质干细胞悬液或等量PBS.移植1个月后对大鼠进行行为学评分.通过免疫荧光观察骨髓间充质干细胞的分化情况,用ELISA检测大鼠右侧纹状体内多巴胺、脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子的含量.结果与结论:移植后观察到骨髓间充质干细胞组较对照组行为学评分显著下降.移植后的骨髓间充质干细胞组脑内可见人类特异性细胞核/酪氨酸羟化酶和人类特异性细胞核/胶质细胞源性酸性蛋白双标阳性细胞,而对照组脑内未见此两类双标阳性细胞;骨髓间充质干细胞组多巴胺、脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子含量与对照组接近.这表明骨髓间充质干细胞可以改善锰中毒大鼠的行为学,可以分化为多巴胺神经元和星形胶质细胞.
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慢病毒载体转染内皮祖细胞移植治疗肺动脉高压并黄芪总苷干预
背景:CD40通路的激活对内皮祖细胞的疗效起负向调节作用,而抑制该通路能增强内皮祖细胞的生物学功能.目的:比较CD40基因沉默的内皮祖细胞(shRNA-CD40转染内皮祖细胞)与常规内皮祖细胞移植治疗肺动脉高压模型的疗效,并探讨黄芪总苷在内皮祖细胞移植治疗肺动脉高压中的干预作用.方法:将90只SD大鼠以随机数字表法分为5组,分别为正常对照组(n=24)、模型组(n=24)、慢病毒转染组(n=18)、常规移植组(n=18)及黄芪总苷组(n=6).除正常对照组外,其余4组均以野百合碱诱发肺动脉高压模型,慢病毒转染组大鼠分别于野百合碱注射后第7,14,21天尾静脉注射Lv-shRNA-CD40转染的内皮祖细胞,每个时间点6只;常规移植组大鼠分别于野百合碱注射后第7,14,21天尾静脉注射内皮祖细胞,每个时间点6只;黄芪总苷组在野百合碱注射后第21天时间点注射Lv-shRNA-CD40转染的内皮祖细胞,同时在第1-21天每日一次给予80 mg/(kg?d)黄芪总苷腹腔注射.野百合碱注射后第28天,进行血流动力学、血浆内皮素1水平与右心室肥大指数检测.结果与结论:①与正常对照组比较,模型组右心室压力、平均肺动脉压、右心室肥大指数均升高(P < 0.05).与模型组比较,慢病毒转染组、常规移植组右心室压力、平均肺动脉压、右心室肥大指数均明显下降(P < 0.05).随着移植内皮祖细胞时间的延长,2个细胞移植组右心室压力、平均肺动脉压、右心室肥大指数均有逐渐升高趋势,但慢病毒转染组变化差异不明显;②与正常对照组比较,模型组大鼠血浆内皮素1水平升高(P < 0.05);与模型组比较,慢病毒转染组、常规移植组血浆内皮素1水平降低(P < 0.05);慢病毒转染组相同移植时间点的血浆内皮素1水平低于常规移植组(P < 0.05);③黄芪总苷组的血流动力学、血浆内皮素1水平及右心室肥大指数均优于慢病毒转染组(P < 0.05);④结果表明,CD40基因沉默的内皮祖细胞治疗肺动脉高压的效果更明显且更持久,黄芪总苷可增强其治疗效果.
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人脐带间充质干细胞治疗膝关节骨性关节炎的临床试验方案
背景:骨关节炎是一种严重危害人类健康的慢性骨关节疾病.细胞治疗骨关节炎近年来发展较快,并得到了广泛关注.脐带来源的间充质干细胞治疗骨关节炎既具有其他来源间充质干细胞扩增分化容易,具有抗炎和招募作用等优势,又具有细胞年轻化、获得量大、无伦理问题、取材过程无痛苦、高增殖特性、多能分化特性、低免疫源性、无致瘤性等特点,是目前临床细胞治疗常用的种子细胞.目的:拟利用同种异体脐带来源间充质干细胞治疗人膝关节骨关节炎,获得脐带来源间充质干细胞治疗骨关节炎的有效性和安全性数据,以期为干细胞治疗骨关节炎提供必要的理论基础和临床依据.方法:试验在中国北京市,北京大学人民医院关节病诊疗研究中心完成.在获得受试者的知情同意以及伦理委员会审批后(该试验前两部分均已注册(https://register.clinicaltrials.gov/),编号分别为 NCT03357770及NCT03358654,第三部分需要根据前两部分安全性评价后再行进行),按照既定的纳入/排除标准招募受试者.临床试验共分为3个部分:第一部分纳入3组受试者,每组3人,分别接受高、中、低3种等级的细胞剂量治疗,3组受试者在注射后进行随访,评价剂量限制性毒性,确立大耐受剂量.第二部分即单臂临床试验,继续招募9名受试者进行干预试验,注射剂量为第一步试验确定的高剂量,受试者在注射后进行随访,评价治疗的安全性及有效性.第三部分采用随机对照研究的试验设计,按照随机化的原则将受试者随机分为2组,每组7人,分别给予干细胞治疗和传统的透明质酸治疗,在试验期间,保证评价者盲、受试者盲以及干预者盲.在术后既定时间点进行随访,评价干预措施的安全性和疗效数据.主要终点是参考 NCI-CTCAE 标准,出现不明原因的局部及全身症状或死亡终止试验.预期结果:参考既往文献报道,经过该干预措施治疗后随访1至2年,受试者膝关节疼痛程度降低,关节功能评分提高,MRI检查见软骨缺损面积减小.预计试验时间共3年6个月.
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持续低氧对小鼠胚胎成纤维细胞增殖及饲养层制备的影响
背景:在传统的胚胎干细胞培养体系中,饲养层细胞制备和胚胎干细胞的培养扩增大都是在常氧条件下进行的,氧培养条件的改变有可能影响饲养层细胞,从而改变胚胎干细胞的生长特性或分化能力,但尚未见到这方面的系统研究报道.目的:观察低氧培养对饲养层细胞及小鼠胚胎干细胞干性维持的影响.方法:原代小鼠胚胎成纤维细胞分为常氧组(体积分数20%O2)和低氧组(体积分数5%O2)持续传代培养,绘制生长曲线,检测活性氧水平和线粒体膜电位.将小鼠胚胎干细胞分为常氧组(饲养层为常氧组小鼠胚胎成纤维细胞,体积分数20%O2条件下培养)和低氧组(饲养层为低氧组小鼠胚胎成纤维细胞,体积分数5%O2条件下培养),观察胚胎干细胞的生长形态,检测干细胞多能性指标Oct4、Sox2以及低氧诱导因子HIF-1α mRNA表达.结果与结论:①与常氧组相比,低氧组小鼠胚胎成纤维细胞增殖较快,线粒体膜电位上升,产生活性氧减少(P < 0.05);②胚胎干细胞碱性磷酸酶染色阳性,Oct4、Sox2高表达,低氧组形成的中小集落及HIF-1α mRNA表达比常氧组显著增多(P < 0.05);③结果表明,体积分数5%O2持续低氧培养利于维持饲养层细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)的活力和胚胎干细胞的干性维持.
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1,25-二羟维生素D3和地塞米松促进人颞下颌关节滑液间充质干细胞的体外成骨分化
背景:人颞下颌关节滑液间充质干细胞获取微创简便且体外扩增能力强,成为组织工程修复一重要的种子细胞来源,优化其成骨分化能力有利于在关节骨组织再生中的应用.目的:分析1,25-二羟维生素D3和地塞米松对关节滑液间充质干细胞成骨能力的影响,获得人颞下颌关节滑液间充质干细胞成骨分化的理想条件.方法:将获得的人颞下颌关节滑液标本进行体外培养扩增,分别加入不同组分的成骨诱导液进行成骨诱导,通过茜素红和Von kossa 染色比较各组矿化形成情况,通过RT-PCR定量比较成骨相关标志ALP、RUNX2和OCN的表达.结果与结论:①体外培养的人颞下颌关节滑液间充质干细胞可以向成骨细胞分化,其中含有100 nmol/L地塞米松和10 nmol/L 1,25-维生素D3的成骨诱导液其矿化形成明显增强;②含有1,25-二羟维生素D3的成骨诱导液诱导后ALP、RUNX2和OCN的基因表达明显增加;③适当浓度的地塞米松和1,25-二羟维生素D3可以促进人颞下颌关节滑液间充质干细胞的成骨分化,从而可为其自体应用修复颞下颌关节组织提供依据.
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骨形态发生蛋白2联合基因转染骨髓间充质干细胞复合同种异体骨修复极限骨缺损
背景:组织工程技术为骨缺损带来新的治疗路径,生物基因转染优化了组织工程骨修复骨缺损的效果.目的:观察骨形态发生蛋白2与碱性成纤维细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞/同种异体骨修复绵羊极限骨缺损的效果.方法:取9只阿勒泰大尾绵羊,制作双侧髂骨极限性骨缺损模型,左侧植入骨形态发生蛋白2与碱性成纤维细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞/同种异体骨复合材料(实验组),其中3只右侧植入骨髓间充质干细胞/同种异体支架骨复合材料(细胞支架组),3只右侧植入同种异体支架骨材料(同种异体骨组),3只右侧植入β-磷酸三钙材料(磷酸三钙组).植入后4,8,12周进行组织学、免疫组织化学染色观察.结果与结论:①组织学观察:植入12周时,实验组同种异体骨材料大范围吸收,破骨样细胞逐渐减少,成骨样细胞增多,骨小梁周围骨纤维基质逐渐致密,可见大面积成片状新骨,骨小梁结构清晰,骨改建明显,术区始终未见炎性细胞浸润;其余3组支架骨材料降解,但无明显骨改建;②免疫组织化学观察:植入12周时,实验组骨涎蛋白与Ⅰ型胶原呈强阳性表达,其余3组骨涎蛋白与Ⅰ型胶原呈弱表达;③结果表明:骨形态发生蛋白2联合碱性成纤维细胞生长因子基因转染的骨髓间充质干细胞复合同种异体骨,可完全修复羊极限骨缺损.
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二氮嗪对低氧环境下骨髓间充质干细胞增殖活力及凋亡的影响
背景:如何有效干预骨髓间充质干细胞进行缺氧预适应使得其移植后发挥应有的疗效是目前急需解决的问题.目的:探讨抗氧自由基药物Mito-KATP通道激活剂二氮嗪对低氧环境中小鼠骨髓间充质干细胞增殖活力及凋亡的影响.方法:将购买的小鼠骨髓间充质干细胞分为4组:空白对照组、0.16 μmol/L二氮嗪组、0.8 μmol/L二氮嗪组、4 μmol/L二氮嗪组,各组在二氮嗪干预下放置于体积分数为10%O2培养箱培养.分别干预1,2,4,6,8 d进行MTT检测细胞增殖活性.干预后第14天进行Hoechst 33258染色,观察细胞凋亡情况.结果与结论:①建系的小鼠骨髓间充质干细胞纯度较高,形态均一,但增殖分化能力较弱;②不同浓度二氮嗪作用下骨髓间充质干细胞活力差异无显著性意义(P > 0.05);③空白对照组细胞核浓缩,颜色深蓝,核聚集,发现数个类圆形凋亡小体,二氮嗪组偶发现凋亡小体,3个浓度二氮嗪组间无明显差异,3组均低于空白对照组;④一定浓度的抗氧自由基Mito KATP通道激活剂二氮嗪在低氧环境下(体积分数为10%O2)不影响小鼠骨髓间充质干细胞增殖活力但可减少细胞凋亡.
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慢病毒介导人骨形态发生蛋白2/骨髓间充质干细胞/脱钙骨基质修复股骨大段缺损
背景:课题组前期研究已证实,慢病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2 基因转染兔骨髓间充质干细胞在表达持续时间上具有一定的优势.但慢病毒介导人骨形态发生蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞复合脱钙骨基质能否在体内促进骨缺损修复的问题有待探究.目的:观察兔股骨大段缺损中植入慢病毒介导人骨形态发生蛋白2转染骨髓间充质干细胞复合脱钙骨基质后的修复效果,探寻治疗股骨大段缺损的新途径.方法:选取48只新西兰大白兔,股骨中段截骨钢板内固定法制备兔左侧股骨大段缺损模型.造模成功后,随机分成A,B,C,D组,每组12只.A 组无修复材料植入,B,C,D组分别植入脱钙骨基质、脱钙骨基质/骨髓间充质干细胞、慢病毒载体介导人骨形态发生蛋白2/骨髓间充质干细胞/脱钙骨基质.造模后2,4,8 及12 周分别处死每组3只兔子,通过苏木精-伊红染色、生物力学分析,X射线检查评价股骨大段缺损修复的情况.结果与结论: ①X 射线示A,B,C,D组均有不同的骨痂修复形成,且Lane-Sandhu X射线评分A
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抗坏血酸作用下兔骨髓间充质干细胞外基质分泌与结构改变
背景:细胞外基质对干细胞的影响是目前组织工程学的研究热点,而关于自身细胞外基质的合成、分泌及对细胞的影响却少有研究报道.目的:体外培养兔骨髓间充质干细胞,观察抗坏血酸对其细胞外基质与整体结构改变的影响.方法:通过差速贴壁法分离获取兔骨髓间充质干细胞,流式细胞技术检测CD44、CD45、CD31的表达.将兔骨髓间充质干细胞用含抗坏血酸(20 mg/L)的培养基进行干预,观察细胞形态、大体结构、超微结构及组织学改变,RT-PCR检测细胞外基质相关基因的表达.结果与结论:①经流式细胞学分析,第2代骨髓间充质干细胞中95%以上的细胞表达CD44,而CD45与CD31的表达极低;②抗坏血酸干预后,骨髓间充质干细胞增殖良好,细胞间界限难以分辨,干预10-14 d后,形成了"膜片状"结构;③苏木精-伊红染色后可见细胞分层排列,Masson 染色后可见大量细胞外基质成分,透射电镜下可见胞内含大量内质网与"囊泡样"结构;④与未经抗坏血酸干预的对照组相比较,经抗坏血酸干预的实验组纤维连接蛋白的mRNA表达显著升高(P < 0.05),而Ⅰ型胶原的mRNA表达虽稍提高,但两组间差异无显著性意义;⑤结果表明,抗坏血酸促进了兔骨髓间充质干细胞的增殖转化、细胞外基质的合成分泌、膜片状结构的形成,在组织工程应用中具有巨大潜能.
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过表达白血病抑制因子受体对甲状腺癌干细胞干性维持及体内肺转移能力的影响
背景:甲状腺癌干细胞是甲状腺癌发生复发转移的关键,白血病抑制因子受体(leukemia inhibitory factor receptor,LIFR)在多种恶性肿瘤中表达下调,且过表达LIFR可抑制恶性肿瘤的复发与转移.目的:探讨LIFR对甲状腺癌干细胞干性维持和体内肺转移能力的影响.方法:收集转移性甲状腺癌患者的肺转移灶,分离培养原代甲状腺癌细胞 TCLM,经无血清悬浮培养形成肿瘤细胞球,流式分选筛选出CD133+表型的转移性甲状腺癌干细胞细胞亚群TCLM-S.将包含LIFR的重组慢病毒过表达质粒及其阴性对照空载体质粒分别以病毒/细胞数量=20的比例感染甲状腺癌干细胞TCLM-S,经2.0 mg/L嘌呤霉素筛选,成功构建稳定表达LIFR或阴性对照的TCLM-SLIFR和TCLM-Scontrol细胞株.qRT-PCR检测LIFR在TCLM-SLIFR和TCLM-Scontrol细胞中的表达,流式细胞术检测TCLM-SLIFR和TCLM-Scontrol细胞中CD133+细胞亚群的比例,Western Blot检测TCLM-SLIFR和TCLM-Scontrol细胞中干性相关因子SOX2、Oct4、Nanog及肿瘤侵袭和转移相关蛋白E-cad、MMP-2、MMP-7的表达.将TCLM-SLIFR和TCLM-Scontrol细胞分别经尾静脉注射到BALB/c裸鼠体内,构建甲状腺癌干细胞裸鼠肺转移模型,观察过表达LIFR对裸鼠体内肺转移能力的影响.结果与结论:与TCLM-Scontrol细胞相比,TCLM-SLIFR细胞中LIFR的表达显著增加,流式分选技术检测CD133+干细胞亚群的比例显著降低,干细胞干性相关因子SOX2、Oct4和Nanog的蛋白表达显著降低,肿瘤侵袭和转移相关蛋白E-cad的表达显著增加,MMP-2和MMP-7的表达显著降低,裸鼠体内肺转移的数量显著降低.结果表明,过表达LIFR可显著抑制甲状腺癌干细胞的干性和体内肺转移能力.
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脂肪间充质干细胞向睾丸间质细胞的诱导分化
背景:近年来干细胞的发展,为治疗雄激素缺乏疾病提供了新的思路.目的:探讨脂肪间充质干细胞是否可分化为睾丸间质细胞.方法:取生长状态良好的第3代大鼠脂肪间充质干细胞,分2组培养:实验组加入0.1 mg/L人绒毛膜促性腺激素、10.0 μg/L血小板源性生长因子及10.0 μg/L碱性成纤维细胞生长因子,进行向睾丸间质细胞的诱导培养;对照组不加入上述细胞生长因子,常规培养.诱导培养1,7,14,21 d,进行相关指标检测.结果与结论:①免疫荧光染色:对照组无3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)阳性细胞;实验组可见3β-HSD 阳性细胞,并且随着诱导时间的延长,3β-HSD 阳性细胞逐渐增多,荧光染色增强;②睾酮分泌水平:对照组无睾酮分泌;诱导培养7 d后,实验组检测到睾酮分泌,并且随着诱导时间的延长,睾酮分泌增加;③RT-PCR检测:对照组无黄体生成素受体、类固醇合成急性调节蛋白、3β-HSD阳性条带;实验组诱导培养7 d后,可见黄体生成素受体、类固醇合成急性调节蛋白、3β-HSD阳性条带,并且随着诱导培养时间的延长,阳性条带增强;④结果表明,脂肪间充质干细胞可分化为睾丸间质细胞.
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1,25(OH)2D3对脂肪干细胞分泌Ⅰ型胶原的影响及作用机制
背景:脂肪间充质干细胞具有促进创伤修复的作用,但其分泌的Ⅰ型胶原会促进瘢痕形成,因此,寻找抑制脂肪间充质干细胞分泌胶原的方法将进一步增强其应用价值.目的:观察1,25(OH)2D3对脂肪间充质干细胞分泌Ⅰ型胶原的影响及其作用机制.方法:①利用胶原酶消化法分离培养人脂肪间充质干细胞,将第4代脂肪间充质干细胞分别培养在含不同浓度(10-7,10-8,10-9,10-10,0 mol/L)1,25(OH)2D3的DMEM/F12培养基中干预4 d,收集细胞培养上清,采用ELISA方法检测Ⅰ型胶原水平;②选取1,25(OH)2D3抑制Ⅰ型胶原分泌作用明显的浓度对脂肪间充质干细胞进行干预,通过Real-time PCR检测1,25 (OH)2D3干预前后细胞内Smad3的mRNA表达,Western blot检测1,25(OH)2D3干预前后细胞内Smad3总蛋白和磷酸化蛋白表达;③在1,25(OH)2D3干预基础上加入SMAD3抑制剂SIS3对脂肪间充质干细胞进行干预,4 d后收集细胞培养上清,采用ELISA方法检测Ⅰ型胶原水平,以分析Smad3信号通路在其中的作用.结果与结论:①1,25(OH)2D3对人脂肪间充质干细胞分泌Ⅰ型胶原的影响表现为剂量依赖性抑制作用;②Real-time PCR和Western blot结果显示1,25(OH)2D3干预后Smad3表达水平有一定升高;Western blot结果显示磷酸化Smad3蛋白含量显著升高;③Smad3抑制剂可阻断1,25(OH)2D3对Ⅰ型胶原分泌的抑制作用;④这些结果表明,1,25(OH)2D3可能通过上调Smad3的表达及活性来抑制人脂肪间充质干细胞分泌Ⅰ型胶原.
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低氧诱导大鼠脂肪干细胞旁分泌对心肌的保护作用
背景:研究表明,脂肪组织来源干细胞能够有效改善心肌梗死后心功能,是一个非常有前景的心肌细胞再生来源.目前大部分研究是在正常氧体积分数下探讨脂肪干细胞介导的心肌保护作用.目的:观察低氧环境培养条件下脂肪干细胞的旁分泌及抗凋亡等保护作用.方法:分离、培养大鼠脂肪细胞以及乳鼠心肌细胞,在正常氧体积分数下和低氧体积分数下(10%)共培养大鼠脂肪干细胞及过氧化氢损伤的乳鼠心肌细胞,通过酶联免疫吸附法检测细胞沉淀中还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽比值(GSH/GSSG)以及培养基上清中血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、碱性成纤维细胞生长因子水平,Western blot 检测细胞沉淀中凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表达.结果与结论:①过氧化氢损伤乳鼠心肌细胞后,还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽比值、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、碱性成纤维细胞生长因子水平下降;②在低氧状态下,损伤的心肌细胞与脂肪干细胞共培养能够使还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽比值升高,促进脂肪干细胞旁分泌细胞因子,而且使凋亡蛋白 Bax 表达下降,Bcl-2表达上升;③结果表明,低氧状态促进脂肪干细胞旁分泌作用增强,从而起到抗凋亡、保护心肌的作用.
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不同代数人脂肪干细胞分泌多种细胞因子水平的比较
背景:脂肪干细胞可分泌丰富的细胞因子,建立良好的损伤修复微环境,可成为细胞因子治疗各种缺血性疾病的良好的种子细胞来源.目的:观察第2-10代(P2-P10)人脂肪干细胞分泌细胞因子水平的变化情况.方法:从人脂肪组织中分离培养脂肪干细胞,显微镜下观察细胞形态特征,通过细胞免疫表型和细胞体外分化功能对细胞进行鉴定.结果与结论:①细胞形态:脂肪干细胞形态呈长梭形或多角形,胞体丰满、胞浆均匀、核仁清晰,其生长增殖能力较强,体外诱导可进行成脂、成骨和成软骨分化;②流式细胞检测分析结果显示:P3代脂肪干细胞表达间充质表面标志物CD29(99.21%)、CD73(99.65%)和CD90(99.92%),而几乎不表达造血干细胞表面标志CD34(2.25%);③酶联免疫吸附试验结果显示:P5代脂肪干细胞分泌血管内皮细胞生长因子和肝细胞生长因子水平高,P3代脑源性神经营养因子的分泌水平高.结果证实,脂肪组织来源的干细胞生物学特性稳定,表现出良好的生长和增殖潜能;不同代数的脂肪干细胞分泌的血管内皮细胞生长因子、脑源性神经营养因子和肝细胞生长因子浓度不同,P5代脂肪干细胞显示出较强的分泌血管内皮细胞生长因子和肝细胞生长因子的能力,P3代脂肪干细胞显示出较强的分泌脑源性神经营养因子的能力.
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脂肪干细胞-脱钙骨的玻璃化冻存及复苏
背景:前期研究应用玻璃化冻存脂肪干细胞-脱钙骨支架复合物1周,得到玻璃化冻存液合适的配比成分.延长玻璃化冻存时间至12周,是否仍能保持细胞活力以及成骨能力值得进一步研究.目的:探讨短时(1周)、长时(12周)玻璃化冻存对组织工程骨中脂肪干细胞增殖活性和成骨能力的影响.方法:分离新西兰大白兔脂肪干细胞,扩增至第3代,接种于猪松质骨来源的脱钙骨,成骨诱导1周.将构建的组织工程骨,转移至含有玻璃化冻存液(30%二甲基亚砜,70%LG-DMEM,0.8 mol/L海藻糖)的2 mL冻存管中,将冻存管投入液氮冻存.分别于冻存后1周和12周,复苏1,3,7,11,13 d,用活死双染试剂染色,共聚焦显微镜观察脂肪干细胞在脱钙骨上的生长情况.复苏1,3,5,7,9,11,13 d,用Hochest33258法检测支架材料上的细胞数目.复苏1,4,7,10,14,21 d,用PNP微板法检测碱性磷酸酶活力,Real-time PCR检测成骨基因Runx2,OCN,COL-1,ALP的表达.结果与结论:①细胞活死双染结果显示,冻存1周或12周后,复苏1 d时红染的死细胞较冻存前红染的死细胞多,复苏3 d后绿染的活细胞逐渐增多;②Hochest33258结果表明,与冻存前的细胞数相比,冻存1周或者12周后,复苏第1,3天的细胞数目有所降低,复苏3 d后细胞数目开始持续增加,复苏第5天细胞数目恢复至冻存前水平;③复苏后1,4 d,碱性磷酸酶活力降低但是与冻存前比较差异无显著性意义,复苏4 d后碱性磷酸酶活力持续升高;④复苏后1,4 d,成骨基因Runx2,Col-1,ALP,OCN表达降低但是与冻存前相比差异无显著性意义,复苏4 d后成骨基因表达持续升高;⑤玻璃化冻存1周与12周比较,复苏后的细胞活力和成骨活性差异均无显著性意义;⑥实验初步证实,玻璃化冻存可以保持组织工程骨的细胞活力与成骨活性;冻存时间(1,12周)对复苏后组织工程骨的成骨能力没有显著影响.
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人脐带间充质干细胞来源外泌体提取方法的比较
背景:近年来"无细胞"的干细胞治疗方法备受关注,但对于提取高质量外泌体的方法尚无确切定论.目的:采用3种方法提取人脐带间充质干细胞中的外泌体,筛选佳提取外泌体的方法.方法:分别用Total Exosome Isolation试剂盒、Exo Quick试剂盒及差速超速离心法提取人脐带间充质干细胞来源的外泌体.使用透射电镜观察外泌体形态,BCA法进行蛋白质定量,western blot检测外泌体表面标志物CD9、CD81、CD63的表达.结果与结论:①3种方法均可以从培养基中提取到间充质干细胞来源的外泌体,并且在透射电镜下观察到圆形或椭圆形的膜性小囊泡;②差速超速离心法提取的外泌体中的蛋白浓度和纯度高,Exo Quick 试剂盒法其次,Total Exosome Isolation试剂盒法得到的蛋白浓度低,且3者比较差异有显著性意义(P < 0.05);③3种方法提取的外泌体均表达其表面特异性标志物 CD81、CD63和CD9,且在含有相同蛋白浓度的情况下,差速超速离心法提取的外泌体的表面标志物含量高,Exo Quick 试剂盒法其次,Total Exosome Isolation试剂盒法提取的外泌体表面标志物含量较低;④差速超速离心法和Total Exosome Isolation试剂盒法的操作时间明显多于Exo Quick试剂盒法,差异有显著性意义(P < 0.05);⑤结果表明,尽管差速超速离心法耗时稍长,但是纯度相对较高,满足实验的基本需求,可作为一种合理的分离方法.
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人脐带间充质干细胞治疗乙型肝炎肝硬化患者发生肝细胞癌的危险因素分析
背景:随着间充质干细胞治疗的不断发展,相关文献报道干细胞治疗可能会导致肿瘤的发生发展.目的:了解人脐带间充质干细胞移植治疗乙型肝炎肝硬化患者发生肝细胞癌的潜在风险.方法:收集2011年1月至2013年12月在解放军第一○五医院感染病科住院治疗的乙型肝炎肝硬化患者,随访36个月,终点为确诊肝细胞癌.对可能影响肝细胞癌发生的相关危险因素进行单因素Logistic和多因素非条件Logistic回归分析.结果与结论:①386例患者完成随访,其中171例接受人脐带间充质干细胞治疗的患者为观察组,215例仅接受常规内科综合治疗的患者为对照组;②随访12个月时,观察组肝细胞癌的发病率明显高于对照组(P <0.05),随访36个月时,观察组肝细胞癌的发生率为11.7%,对照组为9.8%(P > 0.05);③单因素Logistic回归分析显示观察组和对照组内肝细胞癌患者在年龄、甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白异质体(AFP-L3)、甲胎蛋白异质体比率(AFP-L3%)、高尔基体糖蛋白73(GP73)等方面均显著高于非肝细胞癌患者(P < 0.05),多因素非条件 Logistic 回归分析显示仅甲胎蛋白异质体比率是人脐带间充质干细胞治疗后乙型肝炎肝硬化患者发生肝细胞癌的独立危险因素;④结果表明,人脐带间充质干细胞治疗不会导致乙型肝炎肝硬化患者3年内肝细胞癌总发病率的上升,但可能会引起肝细胞癌发病时间的提前;甲胎蛋白异质体比率可作为人脐带间充质干细胞治疗后乙型肝炎肝硬化患者发生肝细胞癌的早期预测指标.
