中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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炎症牙髓干细胞：起步研究与未来发展
背景：炎症牙髓干细胞是近年来新发现的一类牙髓干细胞，目前尚无对其研究进展的系统评价。目的：系统评价炎症牙髓干细胞的研究进展。方法：以“(Pulptis OR Inflam* Dental Pulp* OR Human Dental Pulp with Irreversible Pulpitis)AND Stem Cel*/(牙髓炎OR炎症牙髓OR不可逆性牙髓炎)AND干细胞”为检索词检索PubMed、Web of Science、CNKI、WanFang及VIP数据库(时间：建库至2014年2月)，同时手检纳入研究的参考文献。对研究结果进行定性分析，进行炎症牙髓干细胞研究进展的全面总结。结果与结论：共纳入11篇文献进行研究，全面阐述炎症牙髓干细胞的研究历史、材料来源、细胞培养、表面标志、扩增能力、多向分化能力、动物模型及临床应用前景的研究进展。炎症牙髓干细胞研究尚处于起步，培养条件和动物模型的建立正处于探究阶段，扩增能力和多向分化能力研究结果尚有争议，而在免疫特性、亚群研究和临床应用方面研究较少。
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甲状腺肿瘤干细胞与甲状腺肿瘤治疗：理论与应用
背景：研究发现甲状腺肿瘤干细胞促进肿瘤的发生发展，是肿瘤耐药的原因之一。对甲状腺肿瘤干细胞的认识与研究，可以为甲状腺肿瘤的诊断与治疗提供一些新的思路。目的：对甲状腺肿瘤干细胞的发现、鉴定识别、与肿瘤的关系及其临床应用进行综述。方法：由作者应用计算机检索PubMed、万方数据库中1995年1月至2014年1月相关文献。在标题、、关键词中以“thyroid cancer，cancer stem cel ，stem cel ，cancer suppressor gene”或“甲状腺肿瘤、肿瘤干细胞、干细胞，肿瘤抑癌基因”为检索词进行检索。选择文章内容与甲状腺肿瘤干细胞有关者，同一领域则选择近期发表在权威杂志上的文章。结果与结论：初检得到文献561篇，根据标准纳入57篇文献进行综述。肿瘤干细胞目前已成为肿瘤病因研究的热点。甲状腺及其肿瘤中也存在干细胞，目前可以通过一定的方法鉴别并分离甲状腺肿瘤干细胞。甲状腺肿瘤干细胞与肿瘤的发生、转移以及肿瘤的治疗息息相关，但是否可以通过抑制或根除肿瘤干细胞来治疗甲状腺肿瘤需要深入研究。
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单倍体相合造血干细胞移植治疗儿童重型再生障碍性贫血
背景：目前治疗儿童再生障碍性贫血的主要方法为强化免疫抑制治疗或干细胞移植，后者由于供者来源少而受到限制，HLA单倍体相合的异基因造血干细胞在白血病治疗中常见应用，在再生障碍性贫血治疗中较少应用。目的：探讨单倍体相合的造血干细胞移植联合胎盘来源的间充质干细胞移植治疗重型儿童再生障碍性贫血的疗效。方法：患儿，女，7岁，确诊重型再生障碍性贫血1年半，2012-07-09接受HLA单倍体相合的异基因骨髓及外周血单个核细胞联合胎盘来源间充质干细胞移植，供者为母亲。预处理采用氟达拉滨联合环磷酰胺和抗胸腺细胞球蛋白方案。结果与结论：移植后+9 d中性粒细胞>0.5×109 L-1，+12 d完成造血重建，+100 d查STR提示植入完成。移植后+8个月停用免疫抑制药物，未发生急、慢性移植物抗宿主病。患儿随访18个月，无病生存。结果表明， HLA单倍体相合的造血干细胞联合胎盘来源间充质细胞移植治疗儿童重型再生障碍性贫血是一种安全有效、值得探索的方法。
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脐带间充质干细胞移植治疗糖尿病下肢血管病变
背景：与骨髓和自体外周血干细胞相比，脐带间充质干细胞更原始，扩增能力更强，且免疫原性弱，无伦理问题，对于年老体弱的糖尿病患者更具有重要意义。目的：分析脐带间充质干细胞移植治疗糖尿病下肢血管病变的有效性和安全性。方法：56例中老年2型糖尿病下肢血管病变患者，随机分为对照组和观察组，对照组采用常规药物治疗，观察组采用脐带间充质干细胞移植治疗。结果与结论：观察组临床显效率高于对照组的临床显效率，差异有显著性意义(P<0.05)；两组治疗后皮温、经皮氧、踝肱指数值均有好转表现，观察组踝肱指数值好转更明显(P<0.05)；两组均未发现明显的不良反应。结果可见脐带间充质干细胞移植治疗糖尿病下肢血管病变是一种简便、安全、有效的治疗方法，近期疗效显著。
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骨髓间充质干细胞旁分泌对急性心肌梗死心肌的保护作用
背景：成人心肌细胞缺乏再生能力，使用细胞疗法再生和修复心肌，可能提高心肌缺血性损伤后功能。目的：探索骨髓间充质干细胞治疗急性心肌梗死中可能的作用机制。方法：密度梯度离心法从SD大鼠中分离培养骨髓间充质干细胞。20只大鼠以开胸冠状动脉结扎法制备急性心肌梗死模型后，随机等分为模型组和骨髓间充质干细胞组，骨髓间充质干细胞组大鼠于冠状动脉结扎后通过尾静脉注射骨髓间充质干细胞。结果与结论：造模6个月后，与模型组相比，骨髓间充质干细胞组大鼠心脏功能明显改善，心肌组织血管密度增加，细胞凋亡数量减少，心脏组织中炎症因子血管内皮生长因子、von Wil ebrand因子、肿瘤生长因子3β和白细胞介素1β mRNA表达明显增加。提示骨髓间充质干细胞通过调节心脏炎症因子与血管因子的分泌起到保护急性心肌梗死后心肌细胞的作用。
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促红细胞生成素基因修饰骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑梗死
背景：促红细胞生成素具有神经元的保护及促进神经再生的作用。目的：观察促红细胞生成素修饰的骨髓间充质干细胞尾静脉移植对大鼠脑梗死的治疗效果。方法：用Western blot鉴定外源人促红细胞生成素基因在骨髓间充质干细胞中的表达。采用线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞模型，模型组尾静脉注射PBS、骨髓间充质干细胞组注射骨髓间充质干细胞悬液，促红细胞生成素-骨髓间充质干细胞组注射转染了促红细胞生成素的骨髓间充质干细胞悬液。移植后3 d及移植后1，2，3，4周行改良神经功能评分，检测神经功能的损伤情况。移植后4周将大鼠麻醉后断头取脑，RT-PCR 检测脑组织中 bcl-2/bax 基因表达变化，用原位末端标记法测定细胞凋亡情况、苏木精-伊红染色及荧光显微镜观察PKH26标记的骨髓间充质干细胞的存活和分布情况。结果与结论：Western blot 结果显示，转染人促红细胞生成素基因的骨髓间充质干细胞体外能表达促红细胞生成素蛋白。移植后1-4周，骨髓间充质干细胞组和促红细胞生成素-骨髓间充质干细胞组神经缺损评分明显低于模型组(P<0.05，P<0.01)。与骨髓间充质干细胞组及模型组相比，大鼠脑梗死区组织促红细胞生成素-骨髓间充质干细胞组bcl-2基因的表达明显增高(P<0.05)，bax基因的表达明显降低(P<0.05)，凋亡细胞明显减少，PKH26阳性细胞数明显增多(P <0.05)。结果证实，促红细胞生成素修饰的骨髓间充质干细胞尾静脉移植对脑梗死大鼠脑梗死疗效较好。
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双基因重组腺病毒载体的构建及转染大鼠骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤
背景：脑源性神经生长因子对多巴胺能神经元、胆碱能神经元等多种神经元都有广泛作用，能促进干细胞更多的向神经元样细胞分化；低氧诱导因子1α可提高组织和细胞在缺血环境下的生存能力，维持局部成血管微环境方面比任何基因均有更广泛的生理作用。目的：通过构建脑源性神经生长因子联合三点突变型低氧诱导因子1α双基因重组腺病毒载体，探索其转染大鼠骨髓间充质干细胞后2种基因在体外常氧条件下对脊髓损伤促神经再生及血管新生的作用。方法：①利用PCR方法定点突变人低氧诱导因子1α编码区的第402、564和803位氨基酸，将突变后低氧诱导因子1α基因联合脑源性神经生长因子重组入腺病毒pAdEasy-1系统，包装病毒并测定滴度。②以4种病毒液连同空白组共分5组进行后续实验；将病毒液转染入骨髓间充质干细胞内观察转染效率，检测各组转染细胞中脑源性神经生长因子基因及低氧诱导因子1α mRNA和蛋白表达情况。③进一步通过Western blot方法检测各组细胞中低氧诱导因子1α的下游成血管基因血管内皮生长因子蛋白表达情况。结果与结论：①编码区第402、564和803位氨基酸均定点突变为丙氨酸；4种腺病毒重组体构建成功并包装鉴定完毕。②实验组、阳性对照组1脑源性神经生长因子 mRNA及蛋白表达量明显高于其他组(P<0.05)；实验组、阳性对照组2细胞内低氧诱导因子1α mRNA及蛋白表达量、血管内皮生长因子蛋白表达均明显高于其他3组(P<0.05)。结果说明单载体双基因腺病毒系统转染骨髓间充质干细胞后不仅能够在常氧条件下大量且高效表达脑源性神经生长因子及低氧诱导因子1α蛋白，还同时能够促进其下游血管内皮生长因子的高效表达，为基因联合细胞移植治疗脊髓损伤提供了一种新的方向。
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间充质干细胞输注对移植物抗宿主病中不同受损器官的治疗效果
背景：间充质干细胞的免疫学特性为其作为临床治疗移植物抗宿主病提供了可能。目的：分析骨髓间充质干细胞输注的安全性以及对移植物抗宿主病中不同受损器官的治疗效果。方法：8例恶性血液病患者在异基因造血干细胞移植后出现激素耐药重度急性移植物抗宿主病，在原有免疫抑制治疗的基础上给予输注间充质干细胞1×106/kg，分别输注1-4次。结果与结论：8例患者中6例经间充质干细胞治疗有效(2例完全缓解，4例部分缓解)，2例无效。5例皮肤病变中4例得到改善，1例无效；3例口腔病变中2例得到完全缓解，1例部分缓解。2例肝脏病变以及2例胃肠道病变均获得完全缓解。3例眼睛病变、1例闭塞性支气管炎以及1例泌尿系统移植物抗宿主病无效。在随访中位时间28(7-62)个月期间，8例患者中3例在输注间充质干细胞后3个月内出现移植后淋巴增殖性疾病。结果表明间充质干细胞输注对皮肤、肝脏、胃肠道、口腔移植物抗宿主病有一定的疗效，对眼睛、肺部以及泌尿系统的移植物抗宿主病无效果。间充质干细胞输注过程安全，间充质干细胞的使用是否与移植后淋巴增殖性疾病的发生有关需要更多病例资料的证实。
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骨髓间充质干细胞移植治疗炎症性肠病小鼠结肠炎的有效性及肿瘤学安全性
背景：骨髓间充质干细胞输注有望成为临床治疗炎症性肠病的新的有效生物治疗手段，但其肿瘤学安全性问题令人担忧，是决定间充质干细胞能否广泛用于炎症性肠病治疗的关键，亟待研究。目的：利用小鼠模型观察骨髓间充质干细胞输注对炎症性肠病结肠炎的疗效，并明确间充质干细胞对炎症性肠病炎症癌变的影响。方法：应用葡聚糖硫酸钠构建 Balb/c(H-2d)小鼠的实验性结肠炎模型，经尾静脉输注分离培养的同系基因型骨髓间充质干细胞，对比观察间充质干细胞的疗效并评价结肠炎的组织病理学改善情况；应用葡聚糖硫酸钠联合偶氮氧甲烷构建 Balb/c(H-2d)小鼠的结肠炎癌变模型，对比观察间充质干细胞输注后小鼠肠道肿瘤的形成情况。结果与结论：在葡聚糖硫酸钠结肠炎模型，骨髓间充质干细胞组在实验结束时体质量丧失、大便潜血较PBS组均有减轻；间充质干细胞组中结肠组织炎症损伤严重度评分更低，镜下小鼠远端结肠黏膜结构基本完整，有小范围上皮缺损或隐窝缺损，黏膜层和黏膜下层较多炎症细胞浸润，可见毛细血管和小血管增生；体内示踪可见输注的间充质干细胞向结肠炎症病灶处黏膜下层归巢定殖。在葡聚糖硫酸钠/偶氮氧甲烷结肠炎癌变模型，间充质干细胞组小鼠肠道肿瘤数量及肿瘤负荷均明显小于对照组。结果提示输注骨髓间充质干细胞能明显改善炎症性肠病小鼠的结肠炎症病变，并抑制结肠炎向肿瘤的恶性转化，为间充质干细胞治疗炎症性肠病的生物安全性提供了客观的理论依据。
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大鼠颌骨来源骨髓间充质干细胞中Cbfα1/p56亚型的表达
背景：与来源于中胚层间充质的躯干四肢骨不同，颌骨来源于颅神经嵴外胚间充质，具有独特的膜内成骨机制。核心结合因子Cbfα1是骨分化的关键性转录因子，但其p56亚型在颌骨组织中的作用尚不明确。目的：研究Cbfα1/p56亚型在大鼠颌骨来源骨髓间充质干细胞中的表达及意义。方法：原代培养大鼠颌骨和髂骨来源的骨髓间充质干细胞，采用ELISA法检测骨髓间充质干细胞中的碱性磷酸酶活性，荧光定量PCR法检测骨髓间充质干细胞中Cbfα1/p56和p57亚型的mRNA相对表达量。结果与结论：成功培养出大鼠颌骨和髂骨来源的骨髓间充质干细胞，颌骨来源骨髓间充质干细胞的增殖能力及碱性磷酸酶活性明显高于髂骨；在培养第6天，颌骨来源骨髓间充质干细胞的Cbfα1/p56亚型mRNA相对表达量高于髂骨来源骨髓间充质干细胞(P<0.05)，而Cbfα1/p57亚型在各培养时间点的mRNA 相对表达量两组间差异均无显著性意义(P>0.05)。结果提示Cbfα1/p56亚型对颌骨来源骨髓间充质干细胞的早期成骨分化具有重要意义。
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LMP-1基因转染骨髓间充质干细胞的LIM矿化蛋白表达
背景：体外实验提示LMP-1基因可提高骨质疏松性骨髓间充质干细胞LMP-1蛋白的表达。目的：用含有LIM矿化蛋白1基因的反转录病毒载体(RV-LMP-1-GFP)转染骨质疏松性SD大鼠骨髓间充质干细胞，检测其对骨质疏松性骨髓间充质干细胞LIM矿化蛋白表达的影响。方法：随机取雌性SD大鼠12只，采用双侧卵巢切除法建立骨质疏松性大鼠模型，另取6只大鼠仅切除卵巢周围等量脂肪组织，保留卵巢为假手术组。喂养2个月后取双侧股骨、胫骨、肱骨分离培养其骨髓间充质干细胞。均取3代培养细胞随机分为去势组、LMP-1转染组(转染LMP-1基因)和假手术组。分别行RT-PCR及Western-Blot检测各组细胞LIM矿化蛋白1 mRNA和蛋白的表达。结果与结论：培养出骨质疏松性SD大鼠骨髓间充质干细胞，转染后倒置荧光显微镜下可见绿色荧光表达；3组细胞均可在基因及蛋白水平表达 LIM 矿化蛋白1。与假手术组及去势组比较，LMP-1基因转染组的LIM-1mRNA和蛋白的表达均升高显著(P<0.05)，假手术组与去势组之间差异无显著性意义(P>0.05)。成功实现重组 RV-LMP-1-GFP 基因在骨质疏松性 SD 大鼠骨髓间充质干细胞中 mRNA 和蛋白水平的表达，且LMP-1的表达水平显著提高。结果表明重组LMP-1基因成功导入骨质疏松性大鼠骨髓间充质干细胞基因组中，并使得LMP-1 mRNA和蛋白的表达明显提高。
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幼兔髂骨穿刺抽取骨髓间充质干细胞分离培养鉴定：注意的细节与技术
背景：骨髓间充质干细胞被认为是构建组织工程骨修复骨与软骨缺损中较为常用的种子细胞，在其基本操作过程中注意常见问题并及时避免，对后期细胞学及组织工程学实验很有意义。目的：通过作者实验操作过程中所遇问题的总结和分析，为初学者和科研人员提供可靠的骨髓间充质干细胞分离培养鉴定方法，减少操作过程中的人为失误和易犯问题。方法：取16只幼年新西兰大白兔作为实验对象，进行髂骨穿刺抽取骨髓液。采用密度梯度离心法联合贴壁培养法体外筛选纯化细胞，并且通过倒置相差显微镜观察其形态学特点、生长曲线和流式细胞术鉴定骨髓间充质干细胞表型。结果与结论：实验过程中前5只兔骨髓抽吸、骨髓间充质干细胞分离过程中遇到不同的问题和困难，经认真总结和分析，后11只兔骨髓抽吸、骨髓间充质干细胞分离均获成功，在细胞培养过程中未发现细菌污染和细胞老化，第3代骨髓间充质干细胞高表达CD29、CD44抗原，而CD14、CD34抗原低表达，MTT测细胞生长曲线显示P3和P5增殖活性较高。尽管骨髓间充质干细胞分离培养鉴定技术已较为成熟，但是如果操作过程中不注意细节问题，也将会导致实验困难重重或失败。严格执行常规操作步骤可以得到纯度较高的骨髓间充质干细胞，提高成功率，为后续相关细胞实验和动物实验做好准备。
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低氧环境下骨髓间充质干细胞中血管内皮生长因子的表达
背景：作为种子细胞来源的骨髓间充质干细胞移植后能否在相对缺氧的体内环境下生存，是移植成功与否的重要环节。因此研究体外低氧环境下骨髓间充质干细胞的生长状态，可以为体内细胞移植提供实验依据。目的：观察体外低氧环境对大鼠骨髓间充质干细胞生长及血管内皮生长因子表达的影响。方法：分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，光镜观察细胞的形态；取第3代骨髓间充质干细胞，按氧浓度分为两组，分别在常氧条件下(体积分数为21%氧气)和低氧条件下(体积分数为3%氧气)培养72 h。用CCK-8法和流式细胞术检测两组细胞的增殖情况，Western-blot印迹法检测常氧组和低氧组细胞中缺氧诱导因子1α与血管内皮生长因子蛋白的表达。结果与结论：①成功分离和培养了骨髓间充质干细胞，光镜下细胞呈长梭形，形态均一。②CCK-8法结果显示各时间点低氧组的细胞数目均高于常氧组，在36，48 h时活力增加显著(P <0.05)。③流式细胞术结果显示，与常氧组比较，低氧组处于S期的细胞数量增加，且细胞增殖指数也显著增加(P<0.05)。④W estern-blot印迹法结果显示，常氧组细胞缺氧诱导因子1α及血管内皮生长因子蛋白仅有少量的表达，而低氧组两蛋白表达量均呈时间依赖性上调(P<0.05)。以上结果说明低氧可诱导体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞的增殖，又上调了缺氧诱导因子1α与血管内皮生长因子蛋白的表达，随着低氧时间的延长呈升高趋势。
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山羊神经干细胞的分离培养及体外诱导分化
背景：文献报道不同种类的神经调控因子及神经胶质细胞对神经干细胞分化成熟具有不同的作用，但大动物的神经干细胞培养报道则相对较少。目的：探究山羊神经干细胞的培养条件及体外诱导分化结果。方法：取幼羊脑组织分离神经干细胞后于神经干细胞全培养液中悬浮培养，后期行抗-巢蛋白一抗免疫组织化学染色鉴定，同时取坐骨神经分离培养许旺细胞；以血清诱导干细胞体外诱导分化后行抗-S100一抗、抗-胶质纤维酸性蛋白一抗、抗-MAP2一抗染色分别标记许旺细胞及神经胶质细胞，以未添加一抗做对照，计算图像灰度值与对照组进行统计学比较。结果与结论：成功分离培养抗-巢蛋白染色阳性神经球及抗-S100染色阳性许旺细胞，后期神经干细胞体外诱导分化得抗-胶质纤维酸性蛋白、抗-MAP2染色阳性细胞，其免疫组织化学染色灰度值显著高于对照组；分化产物抗-S100染色为阴性，其免疫组织化学染色灰度值显著低于对照组。结果表明山羊神经干细胞可经体外诱导分化为神经元及星形胶质细胞，未发现神经干细胞诱导分化为许旺细胞。
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细胞质膜微囊蛋白1敲除小鼠神经干细胞培养与生物学特性
背景：研究发现细胞质膜微囊蛋白1在哺乳动物脑内表达，参与脑的正常发育，能影响脑内神经干细胞的增殖。目的：从细胞质膜微囊蛋白1敲除小鼠脑内获取神经干细胞并观察其生物学特性。方法：分别取E14-E16正常C57BL/6胚胎小鼠和细胞质膜微囊蛋白1敲除C57BL/6胚胎小鼠全脑，采用酶消化法获得单细胞悬液，置神经干细胞条件培养基中培养，原代培养7 d后，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基诱导7 d。结果与结论：从两种胎鼠脑内获取的细胞悬液培养1d后较多细胞发生死亡，可见单个细胞漂浮于培基中，透光度较好，3 d后逐渐形成悬浮生长的多细胞团。传代后培养板底部可见少量细胞发生贴壁，7 d后可见大量细胞团出现，且细胞质膜微囊蛋白1敲除胎鼠源细胞增殖速度更明显。免疫细胞化学检测显示，两种胎鼠来源细胞团均为巢蛋白阳性，分化细胞可见神经丝蛋白200、胶质纤维酸性蛋白或O4阳性表达；正常C57BL/6胎鼠来源细胞团呈细胞质膜微囊蛋白1阳性表达，而细胞质膜微囊蛋白1敲除C57BL/6胎鼠来源细胞团呈细胞质膜微囊蛋白1表达阴性，且神经干细胞成球速度和成球数量优于正常胎鼠神经干细胞。说明实验成功从细胞质膜微囊蛋白1敲除胎鼠脑内培养出细胞质膜微囊蛋白1缺失神经干细胞，细胞质膜微囊蛋白1可促进神经干细胞的增殖，并抑制其分化。
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小鼠心肌祖细胞的永生化及筛选
背景：移植外源干细胞治疗功能性心肌细胞死亡或凋亡，易导致移植并发症，因此心脏本身存在的心肌祖细胞成为理想的种子细胞。目的：建立稳定来源于小鼠心脏的心肌祖细胞株，为研究影响心肌祖细胞在成体心肌细胞受损时的增殖分化因素提供理想的细胞模型。方法：①分离培养胚胎15.5 d的小鼠心肌细胞。②感染反转录病毒SSR69使心肌细胞永生化，通过抗生素筛选和无限稀释法获得永生化的单克隆心肌祖细胞。③筛选出具有心肌祖细胞特性的单克隆细胞株。结果与结论：①成功分离培养出心肌细胞，部分细胞可见明显搏动。②感染病毒后，通过潮霉素筛选成功选出76个单克隆，并将其进行命名为CP15-#。③对第1-20号克隆，根据心肌细胞标志基因筛选出具有心肌祖细胞特性的克隆。表明通过可逆SV40 T抗原介导的途径成功建立永生化心肌祖细胞。
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人羊膜间充质干细胞生物学特征及向多巴胺能神经元样细胞的分化
背景：羊膜间充质干细胞具有类似胚胎干细胞多潜能的特点，在再生医学等多种领域的临床应用具有广泛的实用性和明确的良好前景。然而，目前对于羊膜间充质干细胞的生物学特性和分化潜能的认识仍然了解甚少。目的：建立体外分离和纯化人羊膜间充质干细胞的方法，检测羊膜间充质干细胞的体外分化特点，确定羊膜间充质干细胞在体外诱导条件下向多巴胺能神经元样细胞分化的潜能。方法：采用胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ分步消化法从羊膜中分离羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞；采用percol 梯度离心方法对羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞进行纯化；流式细胞术检测羊膜间充质干细胞的表面标志，确定羊膜间充质干细胞细胞表面抗原的表达特征；对体外培养的羊膜间充质干细胞进行成脂肪和成骨诱导，确定其多向分化的潜能；采用神经细胞条件培养体系诱导羊膜间充质干细胞向多巴胺神经细胞分化，通过免疫荧光染色和激光共聚焦荧光显微镜观察和鉴定诱导后多巴胺神经元样细胞的生成。结果与结论：从羊膜组织成功分离、纯化和培养出羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞。羊膜来源的间充质干细胞不仅具有典型的间充质干细胞标志，而且保留了一些胚胎干细胞的OCT-4，SOX-2和KLF4等特有干细胞标志，可以诱导分化成为脂肪细胞和骨细胞，显示羊膜间充质干细胞保持了较为原始的胚胎干细胞的特点，具有多向分化的潜能。诱导分化之前的原代羊膜间充质干细胞表达固有的多种神经细胞标记，体外诱导后羊膜间充质干细胞可分化成为β-微管蛋白Ⅲ、神经元特异性核蛋白、酪氨酸羟化酶、胶质纤维酸性蛋白、髓鞘碱性蛋白和巢蛋白等阳性表达的多巴胺能神经元样细胞。结果表明人羊膜来源的间充质干细胞所保留的多向分化潜能和有效分化成为多巴胺能神经元样细胞的特性。
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小鼠精原干细胞体外培养诱导成骨的能力
背景：精原干细胞具有自我更新及多向分化潜能，并可将其体外定向诱导为特异性细胞，提示精原干细胞亦可能具有向成骨细胞转化的可能性，但有关这方面的研究尚未见报道。目的：观察小鼠精原干细胞在体外成骨细胞培养条件下的生物学特征变化。方法：取生后15-20 d小鼠胫骨骨髓，分离、培养骨髓基质细胞，5 d后丝裂霉素C处理制备成饲养层；取生后七至八天小鼠睾丸，经酶消化后制成单细胞悬液并接种于饲养层上。3d后实验组和对照组分别用条件培养液和基本培养液进行诱导培养，通过倒置相差显微镜观察培养细胞生长状况及形态变化，并结合碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原免疫荧光染色等方法进行结果检测。结果与结论：实验组精原干细胞在条件培养液中较对照组细胞贴壁生长快，条件培养3-6d后见细胞生长迅速，呈集落样增长，细胞立体感增强，细胞团、簇的大小继续增加，细胞外基质增多，但未见明显细胞间桥。培养15 d后，对两组细胞进行碱性磷酸酶染色可见胞质、胞膜染为黑色，呈阳性。在荧光显微镜下可见实验组细胞浆内出现绿色荧光，呈阳性荧光反应；对照组细胞呈阴性反应，说明实验组细胞Ⅰ型胶原染色阳性，这与成骨细胞的生物学特性相似。提示精原干细胞在一定的诱导条件下具有成骨能力，有望为骨组织工程学研究提供种子细胞。
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长链非编码RNA AK089560在间质干细胞成骨与成脂分化中的表达
背景：近研究发现众多长链非编码RNA调控干细胞多潜能性和分化。长链非编码RNA AK089560在干细胞多向分化中的表达变化及作用，目前尚不清楚。目的：观察间质干细胞C3H10T1/2成骨分化与成脂分化过程中AK089560的表达。方法：重组人骨形态发生蛋白2诱导间质干细胞C3H10T1/2成骨分化，碱性磷酸酶染色鉴定早期成骨分化。地塞米松、吲哚美辛和胰岛素三因子联合诱导C3H10T1/2成脂分化，油红O染色鉴定成脂分化结果。采用qRT-PCR检测诱导前后不同时间点AK089560表达的变化。采用RNAfold软件预测AK089560二级结构， UCSC基因组浏览器分析AK089560邻近编码蛋白基因，fancyGENE在线软件构件长链非编码RNA与编码基因关系图。结果与结论：C3H10T1/2经成骨诱导后，70%以上细胞碱性磷酸酶染色阳性；成脂分化诱导后，80%以上细胞油红O染色阳性。qRT-PCR结果显示，长链非编码RNA AK089560在成骨分化与成脂分化第2，4，6天表达均明显下降，成骨分化与成脂分化第2，4，6天与相应时间未分化组相比均差异有显著性意义(P<0.05)。生物信息学分析表明，LncRNA AK089560具有复杂茎环结构，与编码基因Sema3a形成sense overlap关系。结果表明AK089560在间质干细胞成骨与成脂分化中下调表达，提示其可能参与调控间质干细胞多向分化。
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人牙髓干细胞的体外培养及神经样诱导分化
背景：牙髓组织来源干细胞的发现及概念的确立有助于从细胞水平上认识牙齿发育和再生修复机制。目的：了解人牙髓干细胞向神经元样细胞诱导分化能力和诱导分化条件。方法：取健康青年人的第三磨牙的牙髓组织后，制成单细胞悬液，加入含有体积分数为15%胎牛血清α-MEM培养基在6孔板培养，传代培养后加入丁羟基茴香醚、forskolin、β-巯基乙醇、碱性成纤维细胞生长因子诱导剂进行培养。结果与结论：免疫荧光和反转录-聚合酶链反应检测显示，诱导2周后人牙髓细胞除了stro-1，Col-Ⅰ，牙本质涎蛋白表达阳性外，还有巢蛋白，神经元特异性烯醇化酶的表达也是阳性，而牙龈纤维细胞表达均为阴性。说明人牙髓组织中存在成体干细胞，在一定的诱导培养条件下，牙髓干细胞有向神经元样细胞分化的潜能。
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Cdc42参与脐带间充质干细胞向炎性因子的趋化
背景：间充质干细胞移植后的归巢能力关系到细胞移植的疗效，研究其趋化和迁移的调控将有助于提高间充质干细胞临床应用的价值。目的：观察Cdc42在人脐带间充质干细胞定向迁移中的作用。方法：首先以组织块法分离培养人脐带间充质干细胞，与炎性因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、转化生长因子β共培养后 Western 检测 Cdc42表达变化。化学合成 Cdc42的干扰 RNA，转染细胞后分别采用Transwel 和Matrigel胶观察细胞迁移和黏附能力。应用Western检测Cdc42下游靶分子ERK1/2的变化。结果与结论：与炎性因子共培养后的人脐带间充质干细胞中Cdc42表达明显增加，接近无因子对照组的2倍水平。siRNA下调Cdc42的表达能够显著抑制人脐带间充质干细胞的迁移和黏附，且其下游信号分子ERK1/2的表达以及磷酸化水平均相应受到抑制。提示体外培养环境下Cdc42参与了人脐带间充质干细胞的趋化过程。
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Notch信号通路阻断剂对人脐带间充质干细胞软骨分化的影响
背景：Notch 信号通路作为一条在细胞增殖和分化过程中起重要作用的信号通路，目前它在人脐带间充质干细胞在体外向软骨细胞诱导分化过程中的作用仍然未知。目的：首次探讨 Notch 信号通路特异性阻断剂2，4-二氨基-5-苯噻唑(DAPT)对人脐带间充质干细胞向软骨细胞诱导分化的影响。方法：从人脐带中分离获得间充质干细胞，体外向软骨细胞诱导分化。实验分4组：①无诱导组换成含体积分数5%胎牛血清和1%双抗的DMEM高糖培养基培养。②单纯诱导组换成终浓度为6.25 mg/L胰岛素、6.25 mg/L转铁蛋白、10μg/L转化生长因子β1、0.1μmol/L地塞米松、50 mg/L维生素C、体积分数5%胎牛血清和1%双抗的软骨诱导培养基培养。③二甲基亚砜组在软骨诱导培养基中加入终浓度为0.1%的二甲基亚砜培养。④2，4-二氨基-5-苯噻唑组在软骨诱导培养基中加入终浓度为5μmol/L的2，4-二氨基-5-苯噻唑(溶于二甲基亚砜)培养，二甲基亚砜终浓度为0.1%。结果与结论：诱导人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化后，细胞形态由长梭形变为多边形，且甲苯胺蓝染色和免疫荧光染色均呈现阳性；软骨诱导分化后Jag-1、PS-1、Notch-1、Hes-1的基因表达均明显下降(P<0.01)；添加2，4-二氨基-5-苯噻唑后，与单纯诱导组相比，人脐带间充质干细胞中Jag-1、PS-1、Hes-1(P<0.01)和Notch-1(P<0.05)的基因表达显著降低；蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白含量均降低(P<0.01)；蛋白聚糖的基因表达显著降低(P<0.01)，Ⅱ型胶原蛋白的基因表达也出现一定程度的下降。提示Notch信号存在于人脐带间充质干细胞中，诱导人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化后，这种信号强度迅速减弱；2，4-二氨基-5-苯噻唑可能通过Jag-1-Notch-1-Hes-1途径抑制人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化。
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碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒转染兔骨髓间充质干细胞的表型变化
背景：外源性碱性成纤维细胞生长因子在韧带组织的愈合过程中发挥着重要作用，采用转基因方法将外源性基因转入细胞内能促进碱性成纤维细胞生长因子分泌。目的：观察碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞后表型变化及碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达。方法：取 P2代骨髓间充质干细胞，分为3组，正常培养组为对照组，其他2组分别转染重组腺病毒(Ad.bFGF-eGFP)及空病毒(Ad.eGFP)。相差显微镜观察各组细胞形态变化，MTT法测定细胞增殖曲线，ELISA法分析各组细胞上清液中碱性成纤维细胞生长因子蛋白质量浓度。结果与结论：转染后细胞呈现均一的成纤维细胞表型；碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒组细胞增殖活性高于空病毒组及对照组；ELISA结果提示碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒组在7 d内上清液中碱性成纤维细胞生长因子蛋白质量浓度较空病毒组及对照组增加，差异有显著性意义(P<0.05)。提示碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒转染骨髓间充质干细胞可促进其向成纤维细胞分化，增加增殖活力，促进其碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达。
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转化生长因子β3诱导人乳牙牙髓干细胞向成牙本质样细胞的分化
背景：转化生长因子β3与肝素联合作用后对人乳牙牙髓干细胞的增殖和矿化能力的作用目前仍有待研究。目的：探讨转化生长因子β3对人乳牙牙髓干细胞向成牙本质样细胞分化的作用。方法：采用酶消化法将人乳牙牙髓分离培养，获得人乳牙牙髓干细胞；对体外培养的第3代人乳牙牙髓干细胞单独加入25μg/L重组转化生长因子β3、10 U/mL 肝素，或者二者联合进行培养；通过Q-PCR和Western-blotting 方法，分别检测乳牙牙髓干细胞中牙本质涎磷蛋白基因及牙本质涎蛋白表达的情况；通过碱性磷酸酶试剂盒检测乳牙牙髓干细胞碱性磷酸酶活性的改变。结果与结论：乳牙牙髓干细胞在诱导体系中生长状态良好。25μg/L转化生长因子β3+10 U/mL肝素联合作用组的碱性磷酸酶活性明显增强，与转化生长因子β3单独作用组、肝素单独作用组以及对照组相比差异有显著性意义(P <0.01)；转化生长因子β3+肝素联合作用组的茜素红染色呈强阳性，Q-PCR和Western-blotting结果均显示，转化生长因子β3+肝素联合作用组的牙本质涎磷蛋白 mRNA 和蛋白表达均明显升高。结果可见在转化生长因子β3与肝素联合作用的诱导下，可促进乳牙牙髓干细胞分化为成牙本质样细胞。
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植物凝集素刺激外周血单个核细胞增殖及分泌因子表达的变化
背景：植物凝集素可以刺激外周血单个核细胞分裂并引起免疫细胞的活化，是常用的细胞增殖模型。但是全血中的非外周血单个核细胞成分(血浆和无核细胞)在植物凝集素参与的体外培养过程中起到什么作用，以及内皮分泌因子的表达情况尚不明确。目的：在体外单独培养或全血培养外周血单个核细胞过程中，观察植物凝集素对其增殖和凋亡的影响，以及相关炎症因子以及内皮分泌因子的表达变化。方法：分离正常核型成人的外周血单个核细胞，应用无植物凝集素培养基和加入植物凝集素培养基分别进行单独培养，观察细胞形态学变化。收集全血培养或不同条件单独培养的外周血单个核细胞，提取mRNA，荧光定量RT-PCR检测细胞增殖、凋亡，以及炎症因子和内皮分泌因子的表达变化，并进行统计学分析。结果与结论：外周血单个核细胞单独培养和全血培养存在差异，植物凝集素会促进外周血单个核细胞 Ki67、增殖细胞核抗原、蛋白水解酶3、γ-干扰素、肿瘤坏死因子β和白细胞介素6的基因表达，抑制蛋白 C表达。提示植物凝集素促进体外培养外周血单个核细胞的增殖及凋亡，促使炎症因子表达上调，部分血液生物学相关的内皮分泌因子下调。
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巴斯德消毒法可否影响血红蛋白理化性质及生物学功能？
背景：巴斯德消毒法对白蛋白的病毒灭活条件已很完善，可不要求进行病毒灭活验证，但将其应用于血红蛋白类血液代用品病毒灭活的研究在国内外尚未见有系统报道。目的：探讨巴斯德消毒法对血红蛋白类血液代用品理化性质及生物学功能的影响。方法：取适量脐血，经离心、洗血、破膜、添加稳定剂处理后，对照组于55℃水浴加热，待血红蛋白溶液温度达到(55±1)℃开始计时，2 h后加热处理完成；巴氏消毒组于60℃水浴加热，待血红蛋白溶液温度达到(60±1)℃开始计时，10 h后加热处理完成，该过程持续通氮保护。然后置冰浴冷却到4℃以下，低温高速离心，微孔滤膜过滤，得到纯化及病毒灭活的脐血血红蛋白。结果与结论：巴氏消毒组与对照组制品外观都为红色澄明液体；在得率、高铁血红蛋白含量、氧结合量方面两组差异无显著性意义；两组的纯度都在98%以上；两种纯化方法并没有对血红蛋白携氧功能造成影响。因此，可以用巴斯德病毒灭活的方法来代替一直在使用的55℃，2 h的热敏法纯化方式。这样不仅能保证血红蛋白的理化性质、生物学性质，还能同时达到病毒灭活的目的。
