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脂磷壁酸诱导人成牙本质样细胞炎症微环境的机制研究
目的 研究脂磷壁酸(LTA)诱导的体外培养人成牙本质样细胞(hOB)炎症反应及其上游信号通路的作用机制.方法 从人牙髓组织中分离并培养hOB,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白印迹法(Western blot)检测成牙本质细胞标志物,对hOB进行鉴定,结果采用独立样本t检验;采用Western blot和免疫荧光法检测hOB中TLR2的表达,结果采用t检验;以10 μg/ml LTA刺激hOB,炎性因子蛋白芯片检测42种炎性因子蛋白的表达,实时荧光定量PCR及酶联免疫吸附法(ELISA)对白细胞介素6(IL-6)和IL-8的表达进行验证,Western blot检测不同时间点LTA刺激下TLR2的表达情况,结果采用单因素方差分析;Western blot检测LTA对核转录因子(NF-κB)和活化的丝裂酶原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路关键蛋白IKKα/β、IκBα、p65、ERK、JNK及p38磷酸化程度的影响,结果采用方差分析.结果 分离培养获得的hOB中牙本质基质蛋白1(DMP1;tmRNA=6.206,PmRNA=0.0024;t蛋白=11.48,P蛋白=0.001)、牙本质涎磷蛋白(DSPP;tmRNA=4.284,PmRNA=0.0155;t蛋白=34.93,P蛋白＜0.0001)和巢蛋白(Nestin;tmRNA=6.397,PmRNA=0.0021;t蛋白=19.04,P蛋白=0.0001)的表达均较人牙髓细胞(hDPC)高,提示已成功获得hOB.炎性因子蛋白芯片结果显示,LTA刺激后14种炎性因子均升高(P＜0.05),其中IL-6和IL-8升高为明显且经实时荧光定量PCR(FIL.6=40.62,PIL.6＜0.0001;FIL.8=1768,PIL-8＜0.0001)和ELISA(FIL-6=380.9,PIL.6＜0.0001;FIL-8=252.5,PIL.8＜0.0001)验证.10μg/ml LTA刺激16h后,hOB中TLR2蛋白表达显著性升高,差异具有统计学意义(F=3.175,P=0.0469).LTA刺激可使NF-κB和MAPK信号通路关键蛋白IKKα/β (F=28.7,P＜0.0001)、IκBα(F=106.3,P＜ 0.0001)、p65(F=44.58,P ＜0.0001)、ERK (F=45.49,P＜0.0001)、JNK(F=12.43,P=0.0007)及p38(F=28.28,P＜0.0001)磷酸化程度升高.结论 LTA可能通过TLR2/NF-κB/MAPK信号通路促进hOB释放炎性因子.
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转化生长因子β3诱导人乳牙牙髓干细胞向成牙本质样细胞的分化
背景：转化生长因子β3与肝素联合作用后对人乳牙牙髓干细胞的增殖和矿化能力的作用目前仍有待研究。目的：探讨转化生长因子β3对人乳牙牙髓干细胞向成牙本质样细胞分化的作用。方法：采用酶消化法将人乳牙牙髓分离培养，获得人乳牙牙髓干细胞；对体外培养的第3代人乳牙牙髓干细胞单独加入25μg/L重组转化生长因子β3、10 U/mL 肝素，或者二者联合进行培养；通过Q-PCR和Western-blotting 方法，分别检测乳牙牙髓干细胞中牙本质涎磷蛋白基因及牙本质涎蛋白表达的情况；通过碱性磷酸酶试剂盒检测乳牙牙髓干细胞碱性磷酸酶活性的改变。结果与结论：乳牙牙髓干细胞在诱导体系中生长状态良好。25μg/L转化生长因子β3+10 U/mL肝素联合作用组的碱性磷酸酶活性明显增强，与转化生长因子β3单独作用组、肝素单独作用组以及对照组相比差异有显著性意义(P <0.01)；转化生长因子β3+肝素联合作用组的茜素红染色呈强阳性，Q-PCR和Western-blotting结果均显示，转化生长因子β3+肝素联合作用组的牙本质涎磷蛋白 mRNA 和蛋白表达均明显升高。结果可见在转化生长因子β3与肝素联合作用的诱导下，可促进乳牙牙髓干细胞分化为成牙本质样细胞。
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MIP-3α联合成骨诱导因子诱导大鼠脂肪干细胞向成牙本质样细胞分化
目的:观察巨噬细胞炎性蛋白-3α( MIP-3α)对大鼠脂肪干细胞(Adipose derived stem cells,ASCs)向成牙本质祥细胞体外分化作用的影响.方法:分离、培养并鉴定大鼠ASCs;以MIP-3α联合成骨诱导因子(地塞米松,β-甘油磷酸钠,以及抗坏血酸)诱导第3代大鼠ASCs向成牙本质样细胞定向分化.诱导培养1、4、7d后,分别测定碱性磷酸酶(alkaline phosphatese,ALP)活性,并用RT-PCR及Western Blot检测成牙本质细胞的标志基因dspp及标志物牙本质涎蛋白(DSP).结果:与单独加入成骨诱导因子相比,MIP-3α与成骨诱导因子联合应用能使ALP活性、dspp的mRNA表达以及DSP升高.结论:本研究显示MIP-3α与成骨诱导因子联合应用可以增强成牙本质细胞相关基因以及蛋白的表达,为牙齿再生种子细胞的寻找开辟了一条新思路.
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小鼠胚胎干细胞向成牙本质样细胞的诱导分化
目的:探讨胚胎干细胞(ES细胞)向成牙本质样细胞诱导分化的方法.方法:首先通过悬浮培养的方式,将ES细胞诱导分化形成拟胚体,然后将拟胚体细胞与牙髓成纤维细胞通过Transwell培养系统共培养,研究拟胚体细胞向成牙本质样细胞的分化情况.结果:RT-PCR结果显示,拟胚体细胞与牙髓成纤维细胞共培养10d后,可检测到成牙本质细胞的特征性分子--牙本质涎磷蛋白(DSPP)的表达;共培养15d后,表达有所增强.而单独培养的拟胚体细胞,则始终未检测到DSPP的表达.结论:通过与牙髓成纤维细胞共培养,可以促进胚胎干细胞向成牙本质样细胞分化.
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牙胚细胞条件培养液诱导大鼠胚胎面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化
目的:探讨牙胚细胞条件培养液(TGC-CM)在诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化中的作用.方法:取妊娠12.5 d SD大鼠胎鼠第4代下颌突外胚间充质细胞,在牙胚细胞条件培养液(TGC-CM)的诱导下,通过形态学观察、免疫组化、RT-PCR等方法,探索牙胚细胞条件培养液诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化的可能.结果:面突外胚间充质细胞在诱导培养基中生长良好.培养7 d,在诱导组中细胞出现核极化,有很长的突起,细胞平行排列.抗牙本质涎蛋白(DSP)呈阳性反应.RT-PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白(DSPP)和牙本质基质蛋白-1(DMP-1).结论:面突外胚间充质细胞在含有多种细胞因子的TGC-CM的作用下能分化为成牙本质样细胞,能为研究牙齿的分化和发育提供良好的模型和实验依据.
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转化生长因子β3联合肝素在人乳牙牙髓干细胞向成牙本质样细胞分化中的作用
目的：探讨转化生长因子β3（TGF-β3）诱导人乳牙牙髓干细胞（SHED）向成牙本质样细胞分化的能力。方法：采用酶消化法将人乳牙牙髓分离培养，获得SHED；对体外培养的第3代SHED 分别单独加入25 ng/mL 的重组 TGF-β3，或与肝素联合进行培养；通过 Q-PCR 和 Western-blotting 方法，分别观察SHED 表达成牙本质细胞特异性标志物-牙本质涎磷蛋白（ DSPP ）基因及其基因表达产物-牙本质涎蛋白（ DSP ）的情况；通过碱性磷酸酶（ AKP ）试剂盒检测 SHED 的 AKP 活性的改变；细胞爬片行免疫化学染色和茜素红染色。结果：SHED 在诱导体系中生长状态良好。25 ng/mL TGF-β3联合10 U/mL 肝素作用组的AKP 活性明显增强，与 TGF-β3单独作用组、肝素单独作用组以及对照组相比差异具有统计学意义（ P ＜0．01）；TGF-β3联合肝素作用组的茜素红染色呈强阳性，Q-PCR 和 Western-blotting 结果均显示，该组的DSPP表达在mRNA水平和蛋白质水平上均明显升高。结论：在TGF-β3与肝素联合作用的诱导下，可促进SHED分化为成牙本质样细胞。
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经典Wnt通路调节骨髓间充质干细胞向成牙本质样细胞的分化
目的:探讨经典Wnt通路在骨髓问充质干细胞向成牙本质样细胞分化中的作用,以期为临床治疗牙髓损伤提供新策略.方法:用牙胚细胞条件培养液诱导骨髓问充质干细胞向成牙本质样细胞的分化,培养液内分别加入外源性Wnt激活剂Wnt3a/抑制剂DKK-1,检测经典Wnt通路中β-eatenin、LEF1、TCF4及成牙本质样细胞特异表达物DSPP、DMP-1变化.结果:骨髓间充质干细胞经Wnt激活剂/抑制剂处理后,胞浆内β-catenin水平明显上升/下降,其下游核内转录因子LEF1、TCF4基因水平明显上升/下降,而细胞内DSPP、DMP-1的表达明显降低/升高.结论:Wnt信号通路抑制骨髓问充质干细胞向成牙本质样细胞分化.
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脂肪来源干细胞诱导分化为成牙本质样细胞的体外培养研究
目的:探讨大鼠脂肪来源干细胞(ADSCs)向成牙本质样细胞分化的可能性.方法:SD仔4只,处死后取腹股沟处脂肪组织.采用细胞体外共培养的方法,在牙胚细胞条件培养液(TGC-CM)的诱导下,通过形态学观察、免疫组化、RT-PCR等方法,观察脂肪来源干细胞向成牙本质样细胞分化的过程.结果:大鼠脂肪来源干细胞在诱导培养基中生长良好.培养7 d,在诱导组中细胞出现核极化,有很长的突起,细胞平行排列.抗牙本质涎蛋白(DSP)呈阳性反应.RT-PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白(DSPP)和牙本质基质蛋白(DMP-1).结论:含有多种细胞因子的TGC-CM能提供较好的微环境,诱导大鼠脂肪来源干细胞向成牙本质样细胞分化,能为组织工程牙体再生提供种子细胞来源和微环境选择.
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骨髓间充质干细胞向成牙本质样细胞分化的体外实验研究
目的:观察骨髓间充质干细胞向成牙本质样细胞分化的能力.方法:分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞、胎鼠牙胚细胞,制备牙胚细胞条件培养液;用牙胚细胞条件培养液诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞7 d,通过免疫荧光染色和RT-PCR方法,观测其表达成牙本质细胞特异性标志物--牙本质涎蛋白(DSP)、牙本质基质蛋白1(DMP-1)的情况,明确骨髓间充质干细胞能否向成牙本质样细胞分化.结果:大鼠骨髓间充质干细胞在诱导体系中生长状态良好.培养7 d后,部分细胞抗牙本质涎蛋白(DSP)、抗牙本质基质蛋白1(DMP-1)免疫荧光染色呈阳性;RT-PCR显示mRNA水平表达牙本质涎磷蛋白(DSPP)和牙本质基质蛋白(DMP-1).结论:大鼠骨髓间充质干细胞在牙胚细胞条件培养液的诱导下可以分化为成牙本质样细胞.
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多种生长因子对胚胎面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化的诱导作用
目的: 探讨转化生长因子β1(TGFβ1)、牙本质非胶原蛋白(DNCP)、TGFβ1+DNCP、肝素+胰岛素样生长因子1(IGF-1)在诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化中的作用.方法:取妊娠12.5 d SD大鼠胎鼠颌突外胚间充质细胞(第4代),在转化生长因子β1(TGFβ1)(2 ng/mL)、牙本质非胶原蛋白(DNCP)(100 μg/mL)、TGFβ1(2 ng/mL)+DNCP(100 μ/mL)、肝素(1 μg/mL)+IGF-1(100 ng/mL)的诱导下,通过形态学观察、免疫组化、RT-PCR等方法,探索生长因子在外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化中的作用.结果:6 d后,在DNCP、TGFβ1+DNCP作用下,胎鼠面突外胚间充质细胞出现明显的形态改变,细胞由成纤维样变为梭形,部分核极化,有很长的突起,部分细胞呈现平行排列趋势.TGFβ1组部分细胞出现极化改变.DNCP、TGFg 1+DNCP诱导组抗牙本质涎蛋白(DSP)呈阳性反应,RT-PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白(DSPP),另外DMP1亦呈阳性表达.TGFβ1组不表达DSPP、DMP1.肝素+IGF-1组在细胞形态和蛋白、mRNA上均未出现成牙本质细胞特异的表达.结论:胎鼠面突外胚问充质细胞在DNCP和TGFβ1+DNCP的作用下能分化为成牙本质样细胞.表明在诱导中起关键作用的是DNCP.TGFβ1可诱导细胞在形态学上分化成类成牙本质细胞.本结果与该细胞在三维体系中的诱导分化结果相似,表明胚胎面突外胚间充质细胞在体外被诱导分化为成牙本质样细胞不是偶然现象,这为研究牙齿的分化和发育提供了良好的模型和实验依据.
关键词： 面突外胚间充质干细胞 成牙本质样细胞 生长因子 分化 -
体外三维培养下诱导人胚胎面突外胚间充质干细胞向成牙本质样细胞分化
目的: 探讨人胚胎面突外胚间充质干细胞向成牙本质样细胞分化的过程.方法:采用体外细胞三维立体培养的方法在转化生长因子β1(TGFβ1)、牙本质非胶原蛋白(DNCP)的诱导下通过形态学观察、免疫组化、RT-PCR等方法探索外胚间充质干细胞向成牙本质样细胞分化的可能性及生长因子在其中所起的作用.结果:人胚胎面突外胚间充质干细胞在胶原中生长良好.培养4 d在TGFβ1+DNCP组中细胞出现核极化有很长的突起细胞平行排列.诱导的细胞有许多与成牙本质细胞相似的超微结构.抗牙本质涎蛋白(DSP)呈阳性反应.碱性磷酸酶活性增强.细胞在矿化液中能形成矿化结节.RT-PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白(DSPP).结论:三维立体培养下人胚胎面突外胚间充质干细胞在TGFβ1及DNCP的作用下能分化为成牙本质样细胞.本结果将外胚间充质干细胞作为前体诱导分化出成牙本质样细胞为研究牙齿的发育及分化提供了良好的模型和实验依据.
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诱导成牙本质样细胞在体内外的矿化研究
目的:人早期胚胎颌突外胚间充质细胞在体外能被诱导分化为成牙本质样细胞,表达牙本质特异的涎磷蛋白.本研究探讨该诱导分化细胞在体内外矿化的可能.方法:转化生长因子-β1(TGF-β1)和牙本质非胶原蛋白(DNCP)作用于三维培养的外胚间充质细胞,诱导10 d,然后将诱导的成牙本质样细胞接种于裸鼠皮下,X线照相,组织切片,HE染色,观察细胞在体内的矿化情况.同时消化细胞,培养于矿化液中,观察细胞在体外的矿化能力.结果:8周后,裸鼠皮下接种的胶原细胞密度明显高于对照组.5周,胶原内的细胞为单极长突起;8周时,细胞周围可见牙本质样基质结构沉积.矿化液中的细胞3 d出现复层生长,21 d,Von Kossa染色阳性.结论:诱导的成牙本质样细胞在体内可以形成类似牙本质样基质,在体外能形成矿化结节,为有功能的终末分化的成牙本质细胞.
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牙髓干细胞与骨再生的研究进展
1 牙髓干细胞的鉴别Gronthos和他的同事在2000年首先从人体牙髓中分离出干细胞,并称之为DPSCs(DPSCs).DPSCs具有向成牙本质细胞,脂肪细胞和神经嵴细胞分化的潜能.另一种与DPSCs相似,由乳牙牙髓中提取的干细胞被称之为SHEDs(乳牙牙髓干细胞).与骨髓基质细胞相比,DPSCs具有更强的形成钙化组织的能力,将两种细胞接到HA-TCP支架材料上进行培养,DPSCs分化成为成牙本质细胞,而不是像骨髓基质细胞一样分化为成骨细胞[1].当把DPSCs移植到人体内牙本质表面或在牙胚条件培养基中,就会分化成为类成牙本质样细胞,这探索了其其向牙源性分化的条件.
