中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
-
降钙素基因相关肽诱导脂肪干细胞向成骨细胞的分化
背景:已证实降钙素基因相关肽可促进成骨细胞的增殖与分化,并加速骨折的愈合、促进异位骨化的形成,但其是否具有促使脂肪干细胞向成骨细胞定向分化的作用作者末查到相关报道.目的:探讨降钙素基因相关肽在体外定向诱导脂肪丁细胞向成骨细胞增殖分化的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,基因及蛋白质学检测,于2006-10/2007-08在武汉大学医学院中心实验室和三峡大学医学院病理实验室完成.材料:清洁级4月龄健康新两兰大耳白兔2只.方法:密度梯度离心+贴瞳法体外分离培养兔脂肪干细胞,传至第3代分为2组:对照组加入含10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L抗坏血酸、1×10-8mol/L地塞米松、体积分数为0.15的胎牛血清的RPMI 1640骨诱导培养基,实验组在此基础上加入1 μg/L降钙素基因相关肽进行诱导培养.主要观察指标:细胞形态学变化,免疫组织化学染色测定细胞碱性磷酸酶活性,四环素标记法检测矿化结节的形成.RT-PCR和Western blot法榆测成骨细胞标志性蛋白Ⅰ型胶原、骨钙素的表达.结果:实验组脂肪干细胞经成骨诱导培养后,形态规则、多角型细胞增多,细胞倍增时间明显短于对照组.随诱导时间的延长,实验组细胞碱性磷酸酶活性呈增加趋势,诱导7,10,14d细胞碱性磷酸酶活性均显著高于对照组(t=13.26,P＜0.01).诱导21 d与对照组比较,实验组形成的金黄色圆形矿化结节数量增多,结节增大.诱导7d,14d实验组Ⅰ型胶原及骨钙素mRNA.蛋白水平的表达均强于对照组.结论:在体外降钙素基因相关肽能诱导并促进兔脂肪干细胞向成骨细胞方向分化.
-
脐血间充质干细胞分离扩增及向成骨与脂肪细胞的分化
背景:和骨髓间充质干细胞相比,脐血间充质干细胞取材方便,其免疫原性较低,能耐受更大程度卜的HLA配型不符,分离出的间充质干细胞纯度更高.目的:分析新生儿脐血间充质干细胞体外分离、纯化、扩增,以及向成骨及脂肪细胞定向诱导分化的方法与条件.设计、时间及地点:观察性实验,于2004-09/2005-11在四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室,干细胞与组织工程研究室完成.材料:胎龄37～40周的新生儿脐血.方法:以Ficoll-HyPaque淋巴细胞分离液密度梯度法、沉降红细胞后密度梯度法及CD34+免疫磁珠负选法分离脐血单个核细胞.将分离获得的单个核细胞采用L-DMEM培养基+体积分数0.1胎牛血清或Mesencult TM 培养基+体积分数0.1胎牛血清进行间充质干细胞培养传代,获得的第3代集落牛长细胞进行流式细胞仪表面抗原测定,并诱导其向成骨、脂肪细胞分化.主要观察指标:①脐血间充质干细胞的鉴定.②经茜素红染色及油红染色证实其诱导分化.结果:经沉降红细胞后密度梯度离心分离的单个核细胞,使用Mesencult TM培养基+体积分数0.1胎牛血清培养成功率高,第3代可出现明显的集落生长,而另两种方法分离培养的细胞则难以形成集落;集落细胞表面抗原测定表达CD29,CD59,D71,不表达CD34,CD45及HLA-DR等分子.成骨定向诱导分化的集落细胞经茜素红染色胞浆中出现有大量的钙沉积,成脂肪定向诱导分化的集落细胞油红染色示胞浆充满油滴空熔泡.结论:使片j MesencultTM培养基+体积分数0.1胎牛血清培养由甲基纤维素沉降脐血红细胞后密度梯度离心分离的单个核细胞培养成功率高,第3代可出现明显的集落生长.经诱导后可分化为成骨细胞和脂肪细胞.
-
大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化
背景:提供肝细胞牛长因子的微环境可体外诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞.目的:实验拟验证并简化成年大鼠骨髓间充质干细胞体外向肝细胞的诱导分化.设计、时间及地点:观察实验,于2006-10/2008-05在北华大学完成.材料:实验动物为成年SD大鼠,雌雄不限,体质量180～230 g.方法:采用Percoll 梯度离心方法获取骨髓间充质十细胞,调整细胞密度为1×10嚣L-1,加入含有20 μ g/L肝细胞生长因子培养液培养,定期更换培养液.主要观察指标:流式细胞仪检测细胞表面标志和碱性磷酸酶染色鉴定细胞类型.倒置显微镜连续观察细胞分化过程的形态学变化.培养的1,3,7,14,21,28 d以细胞免疫组织化学检测细胞甲胎蛋白、细胞角蛋白18和清蛋白的表达.结果:接种后,细胞体积增大,形态多样贴壁细胞分化为体积较大的多角形和部分梭形,胞浆丰富,可见多核,接种早期细胞生长比接种晚期生长较快.分离纯化的SD大鼠骨髓间充质十细胞的表面标志为CD29+ ,CD44+ ,CD34",CD45和CD90+,细胞的碱性磷酸酶染色阴性,细胞纯度达98%以上.骨髓间充质干细胞的甲胎蛋白细胞免疫组织化学染色培养第7天即出现阳性,第14天清蛋白和细胞角蛋白18免疫组织化学染色阳性.结论:成年大鼠骨髓间充质干细胞在20 μ g/L肝细胞生长因子的诱导下,可分化为肝细胞.
-
骨髓间充质干细胞向心肌细胞诱导过程中脉动电流刺激对肌细胞增强因子2C基因表达的影响
背景:一些研究发现电刺激可以改变成熟心肌细胞的分布和电生理特性,其是否对骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的过程产生影响目前还不清楚.目的:在诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化过程中,观察低压脉动电刺激对肌细胞增强因子2C基因表达的影响.设计、时间及地点:对比观察电刺激细胞学体外实验,于2005-09/2007-03在四川大学老年病研究室完成.材料:清洁级4周龄雄性SD大鼠5只,由四川大学华西医学中心动物实验室中心提供.诱导剂5-氮胞苷为Sigma产品.使用一次性100 mL培养瓶、镍钛合金会属丝、心脏起搏器和连接导线设计制作电场.方法:密度梯度离心+贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3代按1×107 L-1接种到电场内,细胞爬满80%后,加入终浓度为10 μmol/L 5-氮胞苷进行诱导.分别于诱导第1,2,3,4周收集细胞,分为2组:刺激组施加电场刺激,刺激参数选择1.5V/cm电压,2ms方波,频率1 Hz,刺激2周;对照组单纯以5-氮胞苷诱导.主要观察指标:免疫细胞化学法和western blot技术检测肌钙蛋白Ⅰ表达,RT-PCR法分析肌细胞增强因子2C基因的表达.结果:诱导后细胞停止生长,并倾向集落化,诱导第2周两组均开始出现肌钙蚩白Ⅰ阳性细胞,第3、4周明显增强,诱导各时间点刺激组肌钙蛋白表达量均显著高于对照组(P＜0.05).诱导第1周两组均开始表达肌细胞增强冈子2C基因,第2周明显增强,第3周达高峰,持续到第4周,诱导各时间点刺激组肌细胞增强因子2C基因的表达量均显著高于对照组(P＜0.05).结论:肌细胞增强因子2C基因可能参与调控心肌细胞的形成过程,而电场刺激通过上调肌细胞增强因子2C基因的表达,进而促进肌钙壁白Ⅰ的表达和心肌细胞的形成.
-
无细胞接触条件下成人骨髓间充质干细胞培养上清对异体淋巴细胞增殖的负调控作用
背景:成人骨髓间充质干细胞对异体淋巴细胞增殖具有负调控作用的理论已公认,但证实其具体机制的资料有限.目的:在无细胞接触的条件下,观察成人骨髓间充质十细胞培养上清对异体淋巴细胞增殖的负调控效果.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-10/2007-12在解放军兰州军区兰州总医院完成.材料:骨髓标本来源于行异摹因造血干细胞移植的健康供者,外周血来源于健康志愿者.方法:无菌条件下采集成人骨髓,Percoll+贴壁法体外分离培养骨髓间充质干细胞.取新鲜肝素抗凝的外周血,Ficoll法分离出淋巴单个核细胞,调整浓度为2×109 L-1,分别取100 μL淋巴细胞悬液,置入96孔板中,设立4组:培养上清组加入培养3d的骨髓间充质干细胞培养上清,100 μL/孔;培养上清+植物血凝素组在前组基础上加入1 g/L植物血凝素5 μL;空白对照组加入含体积分数0.1胎牛血清的LG-DMEM培养液100 μ L;植物血凝素组在空白对照组基础E加入1 g/L植物血凝索5 μL.置37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度孵箱中培养3 d.主要观察指标:骨髓间充质干细胞培养上清对片体淋巴细胞增殖转化的影响.结果:与空白对照组和植物血凝素组比较,加入骨髓间充质干细胞培养上清后淋巴细胞增殖活性明显下降(P＜0.05),其增殖转化抑制率为9.00%:与培养上清组比较,在有植物血凝素刺激的情况下,淋巴细胞增殖活性进一步下降(P＜0.01),其增殖转化抑制率达20.91%.结论:成人骨髓间充质干细胞培养上清能够抑制异体淋巴细胞增殖转化,且在外源性刺激源植物血凝素存在的情况下,其抑制效果明显增强,提示其负调控作用至少是部分通过分泌可溶性细胞因子而间接对淋巴细胞产生抑制的.
-
人脐血干细胞移植修复大鼠脊髓损伤的功能评价
背景:在脊髓损伤模型的研究中,BBB评分系统和斜板试验均与脊髓损伤程度高度相关.目的:建立改进大鼠脊髓全横断模型,对比舰察BBB评分和斜板试验在人脐干细胞移植术后功能评价中的作用.设计、时间及地点:观察对比实验,于2007-04/2008-07在广东省组织构建与榆测重点实验室完成.材料:脐血来自健康足月产妇.实验动物为SPF级健康成年雌性SD大鼠50只,随机分为假手术对照组(n=10)、磷酸盐注射组(n=20)、脐血干细胞移植组(n=20).方法:分离和体外培养人脐血十细胞.在显微镜下纵行剖开SD大鼠硬脊膜囊后,于硬脊膜内、蛛网膜外将超薄刀片刀尖直抵椎体骨质,将蛛网膜、脊髓、两侧壁和腹侧的硬脊膜作为一个整体完全划断,制作大鼠脊髓伞横断模型,假手术对照组仪打开椎板,脐血干细胞移植组人鼠于脊髓两断端分别显微注射人脐血干细胞悬液6×109～7×109L-1,磷酸盐注射组注射等量磷酸盐缓冲液.主要观察指标:术后12周内每2周分别应用BBB评分和斜板试验进行1次后肢运动功能评价.结果:假手术对照组后肢运动功能于手术前后无显著变化.从术后第2周开始,磷酸盐注射组和脐血干细胞移植组逐渐恢复部分后肢运动功能,两组的BBB评分和斜板试验榆测结果均表现出一致的增长趋势,呈线性正相关关系.从术后4周开始,BBB评分＜13分的磷酸盐注射组和BBB评分≥13分的脐血十细胞移植组人鼠,在斜板试验中差异非常显著(P＜0.01).到术后第12周时,磷睃盐注射组和脐血干细胞移植组斜板试验角度和恢复程度分别为34.25°和52.94%、53.85°和83.23%,并凡脐血干细胞移植组高于磷酸盐注射组(P＜0.01),而同期磷酸盐注射组和脐血干细胞移植组对应的BBB评分和恢复程度仅分别为8.15和38.81%、13.90和66.19%,可见两组斜板试验角度恢复程度亦明显高于其自身对应的BBB评分结果.结论:与BBB评分系统相比,斜板试验能更敏感地反映大鼠爪的功能恢复,但不能特异性地反映爪的精细运动.而作为主观评分体系的BBB评分系统,虽然特异件很高,但容易受主观凶素的影响,敏感性较低.因此,联合应用BBB评分和斜板试验能更好地反映脊髓神经功能恢复情况.
-
肌电图评价肌萎缩侧索硬化389例嗅鞘细胞脑内移植的效果
背景:肌萎缩侧索硬化尚缺乏有效治疗手段,细胞学治疗是研究的重要方向之一.目前研究表明,嗅鞘细胞、骨髓摹质细胞、脐血间质干细胞等具有一定临床疗效.目的:观察嗅鞘细胞脑内移植治疗肌萎缩侧索硬化的肌电图改变,分析肌电图检查对肌萎缩侧索硬化疗效的评定价值.设计、时间及地点:病例自身对照观察,于2003 09/2007-12在北京市虹天济神经科学研究院及北京康复中心神经外科完成.对象:选择389例接受胚胎嗅鞘细胞脑内移植治疗的肌萎缩侧索硬化患者.方法:局麻下作双额发际内2.0～3.0 cm,旁升中线2.5～2.9 cm,长约0.5 cm小切门2个,两侧共缓慢注射细胞数2×104/μ L嗅鞘细胞悬液100 μ L.移植前及移植后三四周分别采用丹麦Keypoint-4犁肌电,诱发电位仪检查患者肌电图.主要观察指标:每例患者检查8～12块肌肉,包括四肢近、远端肌肉以及舌肌、胸锁乳突肌.移植前后肌电图主要对比自发电位、运动单位电位以及大力收缩时募集波型的改变.结果:①389例患者中332例(85.3%)肌电图检查显示不同程度改善,主要有3类:a.自发电位减少:122例出现不同程度此项政变.b.300例出现数量不等的肌肉募集波犁由低级向高级转变,电位密度明显增加,如单纯相转变为混合相:混合相转变为十扰相.c.移植前未能测到运动单位电位而术后新出现者51例.②51例(13.2%)肌电图无变化,移植前后肌电图大致相同.③6例(1.5%)比移植前筹,丰要变化为自发电位增多或肌肉大力收缩时募集波型减弱.结论:嗅鞘细胞移植近期能改善肌萎缩侧索硬化患者的神经功能,延缓病情的进行性恶化.肌电图检测用于胚胎嗅鞘细胞移植治疗肌萎缩侧索硬化疗效评定具有较好的应用价值,通过移植前后肌电图改变可以较客观反映治疗的有效性.
-
接受骨髓间充质干细胞移植的心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠心肌组织基质金属蛋白酶及抑制剂的变化
背景:Ⅰ型及Ⅲ型胶原含量与比例的变化是促使心脏几何形态改变、心肌收缩和舒展功能的重要因素,基质金属蛋白酶2及抑制剂是胶原代谢的土要调节物质.心肌梗死后心力衰竭大鼠接受骨髓干细胞移植后,心肌组织中这些指标会发生哪些变化?目的:观察接受骨髓十细胞移植治疗的心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠,心肌组织中胶原含量与比例、基质金属蛋白酶2及抑制剂的变化.设计:随机对照实验.单位:解放军总医院老年心血管病科和北京医科大学生物化学系.材料:实验于2004-0712005-12在北京医科大学生物化学系周春燕实验室完成.实验动物由北京医科大学动物实验中心提供,选取4周龄清洁级雄性SD大鼠用于骨髓间充质干细胞的制备,200～250 g清洁级雌性SD大鼠14只用于心肌梗死后心力衰竭模型的制备,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.方法:采用梯度离心法与贴壁培养法分离纯化、扩增骨髓间充质干细胞.结扎雌性SD大鼠左冠状动脉制作急性心肌梗死后心力衰竭模型.造模成功4周后将14只大鼠随机分为2组:移植组大鼠梗死后心肌瘢痕区接受雄性SD大鼠来源的5×106骨髓间充质干细胞.对照组大鼠梗死后心肌瘢痕区接受等体积磷酸盐缓冲液.每组7只.主要观察指标:移植治疗后21 d:①以苏木精一伊红染色和Masson染色评价左心室形态.②以免疫组织化学分析心肌基质金属蛋白酶2及抑制剂与瘢痕区Ⅰ型及Ⅲ型胶原的变化.③以Western杂交检测基质金属蛋白酶2及抑制剂蛋白的变化.结果:14只大鼠均进入结果分析,无脱失值.与对照组大鼠比较,骨髓间充质干细胞移植大鼠心肌梗死瘢痕区Ⅰ型胶原增加,Ⅲ型胶原降低,心肌组织基质金属蛋白酶抑制剂表达增加,基质金属蛋白酶2表达降低,心室壁增厚,心室腔缩小,心功能增强.结论:骨髓间充质干细胞移植心力衰竭大鼠后,基质金属蛋白酶2及抑制剂发生了动态变化,进而影响瘢痕区胶原比例重建,逆转心力衰竭心脏异常的胶原平衡.
-
成体组织来源的Sca-1+CD117-Lin-多潜能干细胞生物学特性分析
背景:关于成体干细胞可塑性机制的解释,目前多数学者接受的观点是多种组织器官内存在的成体干细胞其实并非均一的细胞群体,其中包含着更为原始的多潜能干细胞,但对于多潜能下细胞的起源、鉴别及其生物学特性仍缺乏了解.目的:探讨从成体组织中能否分离出一群具有独特表犁的更为原始的多潜能干细胞.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-03/2008-01在北京协和医学院基础学院组织工程中心完成.材料:清洁级12.5～14.5 d BALB/C孕鼠10只.方法:无菌条件下打开BALB/C孕鼠子宫获取胚胎体壁组织,胰蛋白酶消化后贴壁法制成细胞悬液,接种后免疫磁珠分选Sca-1+CD117Lin 细胞群,当细胞达70%～80%融合时消化传代,取第5代细胞用于实验.主要观察指标:倒置相差显微镜和扫描电子显微镜观察该类细胞的显微和超微形态,通过牛长曲线和细胞周期观察其基本生长特性,采用流式细胞技术分析该群细胞免疫型,以RT-PCR法检测胚胎干细胞相关抗原的表达情况,通过Von Kossa染色、油红O染色、甲苯胺蓝染色及免疫细胞荧光染色观察其向三胚层细胞分化的潜能.结果:Sca-1+CD117 Lin细胞贴壁生长,呈纺锤或短梭形,可在体外快速稳定扩增50代以上;传代后3～7d为对数生长期,此后即进入平台期生长,倍增时间约为32 h,90.43%细胞处于G0/G1期.G2/M+S期的细胞比例为9.57%:细胞表刮稳定,高表达Sca-1,不表达CD117,CD14,CD19,CD31,CD34,CD45和Flk-1,中度表达CD44:胚胎干细胞相关抗原Sox2,Oct-4及Nanog均呈阳性表达:诱导分化实验表明该细胞可以向中胚层来源的成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、外胚层来源的神经胶质细胞以及内胚层来源的肝细胞分化.结论:从成体组织内可以分离出Sca-1+CD117 Lin 细胞群,其表达胚胎干细胞相关抗原,能够向三胚层分化,是一群更为原始的多潜能成体干细胞.
-
成骨诱导或干扰素γ预处理对胎儿骨髓源Flk-1+间充质干细胞免疫活性的调节
背景:骨髓间充质干细胞在修复异基因组织终分化为特定细胞后,理论上会因MHC及共刺激分子上调而引起组织排斥,但实际上并没有发生排斥反应.推测骨髓间充质干细胞在异荩因组织分化诱导及炎性因子微环境作用下,有可能分化成一种仍具有免疫调节活性的终末细胞,不被机体的免疫识别系统清除掉.目的:在体外运用成骨诱导及干扰素γ预处理来模拟体内组织分化及炎性因子微环境,观察在此作用下胎几骨髓源Flk-1+间充质干细胞是否能够保持其在自然条件下所呈现的免疫学活性.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007 09/2008-05在北京协和医学院基础学院完成.材料:2例骨髓样品取自流产胎儿,由北京回龙冠妇产医院提供.外周血样品取自15～35岁健康志愿者,由北京三○七医院提供.地塞米松等诱导因子和干扰素γ为美国Sigma公司产品.方法:Ficoll法分离胎儿骨髓单个核细胞,取白环层以上细胞,以1×106/cm2密度接种,贴壁法纯化,采用阴性分选法去除CD45+ 、G1yA+ 和CD34+ 细胞,分离扩增得到F1k-1+骨髓间充质干细胞.以淋巴细胞分离液梯度离心分离外周血单个核细胞,用于混合淋巴细胞培养实验及有丝分裂原刺激的淋巴细胞增殖实验.主要观察指标:流式细胞仪鉴定细胞表型,用成骨、成脂、成软骨和成内皮诱导液检测其分化潜能,成骨诱导或干扰素γ预处理后细胞表面抗原表达、对淋巴细胞增殖及活化抗原CD69、CD25表达的影响,对臼细胞介素10和转化生长因子β分秘水平的影响.结果:光镜下骨髓来源的间充质干细胞为成纤维细胞样贴擘牛长,均高表达Flk-1,同时高表达黏附分子CD29、CD44、CD105,造血细胞标志CD34、CD45呈阴性:可向成骨、成脂肪、成软骨和成内皮方向分化:低表达MHC-1类分子,不表达MHC-Ⅱ类分子,成骨诱导能上调MHC-1表达,干扰素γ预处理可上调MHC-Ⅱ表达.骨髓源Flk-1+间充质干细胞经成骨诱导 7d 或干扰素γ预处理48 h后,仍呈低免疫原性,不激发异基因淋巴细胞增殖,抑制植物血凝素刺激的淋巴细胞增殖效果明显增强(t=2.57,P＜0.05),可进.步抑制CD69和CD25的表达,ELISA检测显示其培养卜清分泌白细胞介素10水平增强(t=2.66,P＜0.05),但分泌转化生长因子βB水平经成骨诱导后无明显变化,干扰素γ预处理后则明显升高.结论:经成骨诱导或干扰素γ预处理后,骨髓源Flk-1+间充质干细胞仍能保持低免疫原性,且免疫调节活性进一步提高.
-
骨康含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的影响
背景:研究发现骨质疏松症与骨髓间充质干细胞的分化关系密切,随着年龄的增加,骨髓间充质干细胞绝对含量下降,向成骨分化能力减弱,向成脂分化能力增强.目的:在成脂诱导条件下,观察中药骨康含药血清对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞分化特性的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-01/08在广州中医药大学附属骨伤科医院细胞室完成.材料:清洁级6月龄新西兰大白兔4只,SPF级2月龄SD大鼠5只,购自广州中医药大学动物实验中心.中药骨康方的主要成分为丹参、补骨脂、淫羊藿等,含生药量1.43 g/mL,由广州中医药大学附属骨伤科医院制剂室提供.方法:2只兔按4.8 g/kg给予生药灌胃制备含药血清,相当于临床剂量的10倍,2次/d.每次间隔5 h,连续灌胃7 d:另2只兔给予等体积生理盐水灌胃.分别于后1次给药后2 h行心脏采血,离心后取上清,-20℃保存备用.密度梯度离心+贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,胰蛋白酶扩增纯化,将传至第4代的骨髓间充质干细胞按2 ×108 L-1接种,加入成脂诱导液的同时,骨康组加入上述含药血清,对照组加入空白血清,均调整浓度为10%.主要观察指标:流式细胞仪检测细胞表面标志,油红O染色观察脂滴形成情况,计数脂肪细胞转化率.结果:第2代骨髓间充质干细胞均一性＞90%,CD44呈阳性表达,CD34、CD45呈阴性表达.培养第4,7,10天后,两组细胞中均含大小不等的橙红色脂肪滴,细胞核被脂滴挤于细胞一侧,骨康组脂肪细胞转化率均明显低于空白组(F=0.025～0.037,P＜0.05).结论:中药骨康含药血清可抑制成脂诱导剂对骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化的促进作用.
-
骨髓间质干细胞的胞质体制备及其活性
背景:细胞质在细胞分化过程中起着决定作用,但目前的实验很难获得大量的、有活性的胞质体.目的:分析影响大鼠骨髓间质干细胞胞质体制备的因素,并观察胞质体活性,以期为细胞重组提供实验依据.设计、时间及地点:以细胞为观察对象的多因素设计实验,于20016-09/2007-01在南京医科大学基础医学院卫生部抗体技术重点实验室完成.材料:选用1月龄SD大鼠,用于分离骨髓间充质干细胞.方法:骨髓间质干细胞经分离培养、扩增后,用松胞素B、秋水仙碱结合离心术制备胞质体.主要观察指标:应用苏木精-伊红、Alexa-Flour(R)488anti-rat CD106及Bis-Benzimide染色进行形态学观察,计算胞质体纯度;应用Rhodamine123标记后用流式细胞仪检测胞质体中线粒体膜势能.结果:①胞质体纯度可达95%.80%的胞质体在一两个小时内恢复原来形态,但其生活力不会超过18 h.胞质体活性随时间延长而F降.②骨髓间质干细胞的胞质体制备与松弛素B、秋水仙碱剂量、离心速度、离心时间,特别是离心温度有关.结论:骨髓间质干细胞的胞质体制备可受多因素影响.当胞质体具有活性,具有有核细胞的一些行为特征时,可以进行细胞重组.
-
细胞因子联合纹状体条件培养液定向诱导间充质干细胞体外分化为多巴胺能神经元
背景:在众多体外诱导间充质干细胞向多巴胺能神经元的诱导分化研究中,诱导阳性率仍不理想.目的:实验应用碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和纹状体条件培养液定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为多巴胺能神经元,拟探讨提高诱导阳性率的方法.设计、时间及地点:以细胞为对象的对照观察细胞学实验,于2006-07/2007-12在山东大学齐鲁儿童医院和山东大学第二医院血液实验窜完成.材料:健康成年Wistar大鼠用于骨髓间充质干细胞的分离,新生Wistar大鼠用于纹状体条件培养液的制备.方法:采用贴壁法分离纯化健康成年Wistar大鼠骨髓间充质干细胞进行传代培养.取出生24 h内新生Wistar大鼠,完整剥离其大脑组织制备纹状体条件培养液.取体外培养的第5代间充质干细胞,用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的预诱导液进行预诱导,24 h后去除预诱导液,换用纹状体条件培养液进行诱导.主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞形态变化,并应用细胞免疫化学技术检测细胞内神经元特异烯醇化酶和酪氨酸羟化酶表达.结果:大鼠骨髓间充质干细胞经碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和纹状体条件培养液诱导后细胞胞体逐渐同缩成团,形成梭形,部分细胞可见突起伸出,类似神经元.细胞免疫化学检测,诱导后细胞神经元特异烯醇化酶阳性表达率为(72.70~14.81)%,酪氨酸羟化酶阳性表达率为(34.50±15.93)%.结论:应用碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子联合纹状体条件培养液诱导分化体系,获得了高比例的神经元,其中包括较多的多巴胺能神经元.
-
兔骨髓源单个核细胞诱导血管内皮祖细胞修复尿道缺损
背景:如何解决尿道替代修复材料来源和改善新尿道的血液供应已成为尿道修复与重建研究的瓶颈问题.目的:观察血管内皮祖细胞对尿道缺损修复后改善新尿道组织血液循环的效果.设计、时间及地点:组织工程体内实验,于2006-01/2008-02在郑州大学第一附属医院外总实验室完成.材料:3～5月龄雄性日本大耳白兔13只,1只用于制各骨髓源单个核细胞,剩余12只随机分为细胞修复组8只,模型组4只.方法:无菌抽取兔两侧髂前上嵴骨髓,Percoll法贴壁分离培养单个核细胞,加入含VEGF、bFGF的培养基进行体外诱导分化,待细胞长满培养瓶底后胰蛋白酶消化传代.两组兔均建立尿道缺损模型,将脱细胞处理的无菌新鲜人羊膜修剪成1 cm2 置于尿道缺损处,用0/6DG线将其两端分别与尿道残端连续缝合,形成抹道.细胞修复组将传至第3代的兔骨髓源单个核细胞浓度调整至1010 L-1,注射于新尿道两端的吻合口处,每处0.1 mL,0/6DG线间断缝合皮下组织覆盖成形后的尿道,并在近吻合口处和新修复尿道之中间处注射细胞悬液,每处0.5 mL;模型组在同样位点注射等量的空白细胞培养液.移植后4,12周制作尿道组织石蜡切片.主要观察指标:细胞形态及鉴定结果,修复后尿道组织的血管再生情况.结果:兔骨髓源单个核细胞在体外呈贴壁生长,4 d后生长加速,呈克隆样生长;第10天出现典型的铺路石样改变,并迅速表现出条索状、草束状生长形式:所培养的细胞表型由CD34+/CD133+/CD31+逐渐转变成CD34+/CD133+/CD31+.与模型组比较,移植后第4,12周细胞修复组尿道组织内毛细血管再生数量均明显多于模型组(t=-9.034～5.985,P＜0.01).结论:兔骨髓源单个核细胞可在体外诱导分化为血管内皮祖细胞,且血管内皮祖细胞对,改善尿道缺损修复后局部血液循环的效果非常明显.
-
自体骨髓单个核细胞移植治疗老年冠状动脉粥样硬化性心脏病的临床观察
2003-06/2007-11河南省人民医院心内科收治的老年心肌梗死患者76例,行骨髓干细胞移植患者46例,男34例,女12例,除常规治疗外,将骨髓单个核细胞悬液在冠状动脉造影时经导管注入冠状动脉内;未行骨髓干细胞移植患者30例为对照组,男22例,女8例,仅采用常规治疗.随访1年,经胸超声心动图显示,骨髓干细胞移植组和对照组左室射血分数分别由治疗前(43.1±5.6)%、(44.9±7.5)%增加到(54.8±4.6)%、(50.1±7.1)%:骨髓干细胞移植组和对照组脑钠肽水平由治疗前(696±102)、(680±93)ng/L下降至(303±89)、(396±88)ng/L;单光了放射计算机断层显像术显示,骨髓干细胞移植组和对照组心肌灌注缺损面积分别由(25.8±8.5)%、(26.2±6.4)%降低至(14.8±4.6)%、(20.4±7.3)%.骨髓下细胞移植组在移植过程中和移植后均无并发症发牛.表明经皮冠状动脉内移植骨髓十细胞治疗老年心肌梗死患者安全可行,移植后能改善左室收缩功能及心肌血流灌注.
-
兔骨髓间充质干细胞体外分离培养条件的优化组合
背景;骨髓间充质干细胞分离培养方法的不同可导致其活性与纯度各异,商接影响组织工程的修复效果.目的:对骨髓间充质干细胞体外分离培养条件进行优化组合,并验证其获取骨髓间充质干细胞的效果.设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2007-10/12在山西医科人学第二医院骨科实验室完成.材料:清洁级3月龄新两兰白兔2只,由山西畜牧研究所提供.方法:向含有新鲜骨髓的DMEM培养液中加入等量淋巴细胞分离液,采用密度梯度离心和差速贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞,每间隔8 h将未贴壁细胞转移入新的培养瓶,接种5 d后首次换液,细胞融合率达90%时胰酶消化传代,第1、3、5代细胞用于实验.主要观察指标:镜下观察细胞形态及生长状态,绘制细胞生长曲线,测定倍增时间,流式细胞仪检测细胞表面抗原CD44标记率.结果:原代培养的骨髓间充质干细胞呈圆形、梭形、多角形等,48 h可见贴壁细胞有伸展现象,呈梭形,多角形,成纤维细胞样展开,细胞核清晰,首次换液后可见细胞透亮并充分展开,14 d左右可达90%融合.第1、3,5代骨髓间充质干细胞整体呈S型,1～3d为潜伏期,3 d后进入对数生长期,7～8d为平台期,平均倍增时间为24.22 h.第2代骨髓间充质干细胞CD44呈阳性表达,标记率为93.0%.结论:采用密度梯度离心联合差速贴壁、离心介质选择淋巴细胞分离液、接种5 d首次换液的体外分离培养纯化方法,获得的骨髓间充质干细胞生长状态良好,且纯度较高.
-
大鼠真皮成纤维细胞肌肉转录调节因子基因转染后生物学特性观察
背景:利用转基因技术诱导皮肤真皮成纤维细胞分化为特殊器官组织功能的前驱细胞具有重要意义.目的:观察肌肉转录调节因子(myogenic determination,MyoD)基因转染对大鼠真皮成纤维细胞生物学特性的影响.设计、时间及地点:单一样本观察,细胞基因工程学实验,于2005-01/2007-02在同济大学附属东方医院心胸外科和细胞治疗室完成.材料:清洁级雄性SD大鼠6只,购自上海西普尔.必凯实验动物有限公司.Ⅱ型胶原蛋白酶为GIBCO公司产品,稻瘟菌素粉剂为美国Promega公司产品,慢病毒载体pLenti6/V5-DEST为Invitrogen公司产品,BrdU为美国Sigma公司产品.方法:无菌条件下切取大鼠腹侧全层皮肤,采用200 IU/mL的Ⅱ型胶原蛋白酶在4℃下解离大鼠皮肤真皮组织,组织块培养法获取贴擘的真皮成纤维细胞,待生长近融合状态时传代扩增.取传军第3-6代细胞,利用携带MyoD cDNA的真核表达载体pLenti6/V5-DEST-MyoD进行转染:经终浓度为50 mg/L稻瘟菌素筛选后,挑选转基因单克隆细胞传代培养,向细胞培养液中加入10μmol/L BrdU于37℃条件下孵育48 h.主要观察指标:细胞形态学观察.免疫细胞化学染色鉴定,体外BrdU标记情况.结果:体外分离培养的真皮成纤维细胞纯度高,形态良好,生长增殖功能正常,转染后经稻瘟菌素筛选2周即可见克隆形成.光镜下真皮成纤维细胞免疫细胞化学染色后波形蛋白呈阳性表达,转染MyoD基因后肌动蛋白亦呈阳性表达.10 μmol/LBrdU孵育48 h的标记率＞98%,且连续传代5次后仍可检测到BrdU阳性细胞.结论:真核表达载体成功介导MyoD基因转染体外分离培养的大鼠真皮成纤维细胞,并诱导其转化为具有潜在功能的类骨骼肌细胞,可在体外稳定生长扩增.
-
同种异体骨髓间充质干细胞穴位移植对梗死心肌及周围区细胞凋亡及相关蛋白的影响
背景:骨髓间充质干细胞移植途径主要包括外周静脉注射移植、冠状动脉移植以及心肌内注射移植,但存在迁移缺少靶向性,价格高昂等局限性.目的:观察兔骨髓间充质干细胞穴位注射对梗死区心肌细胞凋亡及凋亡调控蛋白Fas,FasL,Bcl-2表达的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-06/08在辽宁中医药大学针灸系电生理实验室完成.材料:抽取健康日本大耳白兔骨髓,分离培养骨髓间充质干细胞并传代;结扎日本大耳臼兔左室支建立急性心肌梗死模型.干预:将造模成功的日本大耳白兔30只随机分为3组.模型对照组不干预:穴位注射十细胞组于急性心肌梗死形成后l周,取心俞(双侧)、至阳、膻中4穴,穴位注射干细胞混悬液,1×106细胞,穴;穴位注射生理盐水组在相同部位穴位注射等量生理盐水.以10只未造模兔为正常对照组.主要观察指标:干预后第5周取心脏,TUNEL染色观察梗死区心肌细胞凋亡;免疫组化观察心肌Fas,FasL及Bcl-2蛋白的表达.结果:模型对照组和穴位注射牛理盐水组梗死区心肌细胞凋亡高于正常对照组和穴位注射干细胞组(P＜0.001,0.05).穴位注射干细胞组Fas和FasL蛋白的表达明显低于模型对照组(P＜0.001),模型对照组则高于正常对照组(P＜0.05,0.001).穴位注射干细胞组及正常对照组Bcl-2蛋白表达明显高于模型对照组和穴位注射生理盐水组(尸＜0.001).结论:穴位移植骨髓间充质十细胞可使梗死及周围区心肌细胞凋亡数减少,其机制可能是通过Fas、FasL蛋白的减少、Bcl-2蛋白的增多来调节的.
-
卵黄囊移植人脐血CD34+细胞构建人源化血液系统小鼠模型
背景:与较为成功的羊等大型动物宫内移植方法相比,利用小鼠等小型动物宫内移植异种造血干细胞仍面临困境,在外周血内检测到的异种血液细胞重建率仍在1%以下.目的:观察小鼠卵黄囊移植入脐血来源CD34+ 造血干细胞后的异种造血重建效率,并与腹腔移植的效果进行比较.设计、时间及地点:细胞学体内移植实验,于2007-10在北京大学十细胞与再牛牛物学实验室完成.材料:健康新生儿脐血取自北京海淀区妇幼保健院.ICR小鼠由北京大学医学部实验动物中心提供,孕8.5 d鼠8只,孕12.5 d鼠9只.藻红蛋白标记的抗人CD45单克隆抗体与流式细胞仪均为BD公司产品.方法:采用Ficoll 法梯度离心获得人脐血单个核细胞,经磁珠分选系统纯化获得CD34+ 细胞.将孕8.5 d鼠麻醉后,打开腹腔并暴露子宫,显微镜下抽取5～10 μL脐血CD34+ 细胞(5×104个),缓慢注入胎鼠的卵黄囊中.相同操作条件下将等量脐血CD34+ 细胞注射到孕12.5 d胎鼠的腹腔中.快速抽针,将孕鼠子宫归位并缝合腹腔,继续妊娠,等待分娩.待小鼠出牛后3个月,经尾静脉取血,在避光状态下加入藻红蛋白标记的抗人CD45单克隆荧光抗体,流式细胞仪检测血细胞表面标记CD45的表达,通过其阳性率判断人血液细胞在小鼠体内的重建效果.主要观察指标:不同移植方式对小鼠造血重建的影响.结果:CD34+ 细胞通过卵黄囊移植方式共获得健康出生小鼠52只,3个月后86.5%(45152)小鼠CIM5争阳性表达.嵌合率高达4.34%.通过腹腔移植方式共获得健康出生小鼠48只,3个月后81.3%(39/48)小鼠CD45呈阳性表达,明显低于卵黄囊移植方式(t=2.363,P＜0.05).结论:早期卵黄囊移植町以获得人造血干细胞在小鼠体内的长期重建,效果优于腹腔移植,同时也证明了通过胎鼠卵黄囊移植人脐血造血干细胞取得人源化造血系统小鼠模型的可行性.
-
负载自体骨髓间充质干细胞人羊膜贴片移植对切除翼状胬肉患者损伤角膜的保护
背景:近年来国内外对单纯羊膜移植和羊膜负载细胞移植治疗角膜损伤的研究逐渐增多,在动物实验中已取得确切疗效,但临床应用报道甚少.目的:拟制备人羊膜负载的自体骨髓间充质干细胞贴片,观察贴片移植后角膜损伤的改善.设计、时间及地点:细胞组织工程学体内观察,于2008.02在四平市中心医院中心实验室完成.对象:同期四平市中心医院收治的1例翼状胬肉患者.羊膜取自正常剖腹分娩产妇的胎盘.方法:无菌条件下钝性分离人羊膜与绒毛膜,胰蛋白酶消化去除羊膜表面七皮细胞,将硝酸纤维素膜剪成适合眼部大小的圆形支架贴于基底面,将膜片浸泡在α-MEM培养基中,上皮面向上,4℃保存备用.采集翼状胬肉患者自体骨髓,Ficoll法密度梯度分离骨髓单个核细胞,于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中孵育扩增,将鉴定后的第3代骨髓间充质干细胞按2x105密度接种至羊膜上,加入含10%血清的α-MEM培养基,细胞长满后进行移植.沈涤负载骨髓间充质干细胞的人羊膜贴片至无橙红液体,通过眼科手术去除病变组织后,将羊膜贴片细胞面向上覆盖于翼状胬肉患者角膜病变表面,缝合固定后,另缝合一层单纯羊膜用于保护移植细胞.主要观察指标:人羊膜负载的骨髓间充质干细胞鉴定结果,贴片移植效果.结果:接种到人羊膜上4h细胞开始贴壁,培养24h细胞变为梭形且数量增多,48 h后细胞紧密排列,倒置显微镜下人羊膜上的骨髓间充质干细胞覆盖面积大于80%,锥虫蓝染色细胞存活率大于90%,免疫荧光染色细胞CD44和CD90阳性率均大于90%.人羊膜负载的骨髓间充质干细胞贴片移植后1周内,羊膜贴片无溶解和脱落,患者眼表透明,无水肿;移植后8个月内无新生血管生成.结论:骨髓间充质干细胞接种到人羊膜上生长状态良好,将该贴片移植至切除翼状胬肉患者后短期内未发生溶解和脱落,患者视力得到改善.
-
兔肌源性干细胞的生物学特性及表型分析
背景:骨髓间质干细胞作为种子细胞具有巨大的分化潜力和优势,但对于再牛障碍性贫血或骨髓源性肿瘤等疾病的应用受限.现已发现肌源性干细胞具备与其相似的优越性,已引起相关领域研究者的注意.目的:观察兔肌源性干细胞的生物学特性,并对其进行表犁分析.设计、时间和地点:细胞体外观察,于2005-08/2006-03在中山大学附属第二医院医研中心完成.材料:清洁级1.5月龄新西兰大向兔1只,增殖培养基为DMEM-LG+体积分数0.1胎牛血清+100 g/L马血清,融合培养基为DMEM-LG+2%胎牛血清.方法:兔麻醉后取大腿肌肉,采用差速贴壁Preplate技术分离培养肌源性干细胞,以Ⅺ胶原酶、disperse蛋白酶及胰蛋白酶分步消化,沉淀用增殖培养基重悬,接种在胶原包被的培养瓶中,该培养瓶为PP1.PP1于37℃、含体积分数为0.05的CO2培养箱中静置过夜,随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶,此为PP2.随后同法建立PP3,PP4,PP5,PP6.将PP6接种到6孔板进行融合实验,分为两组:一组使用增殖培养基培养,在汇合度超过50%后继续培养,不传代:另一组使用融合培养基进行培养,汇合度达30%时传代培养.主要观察指标:收集PP1-PP6,采用流式细胞仪、免疫细胞化学及Western Blot法鉴定细胞表型.通过不同汇合度及不同浓度血清培养,检测PP6融合情况.结果:PP6细胞＞80%为desmin+,＞70%为Bcl-2+,＞95%为CD45,提示为高浓度肌源性干细胞,随着纯化步骤的进行,α-SMA表达逐渐减弱,至高度纯化的PP6时已无α-SMA表达.PP6在高汇合度(＞50%)或低血清(仅含2%血清)培养时,极易融合成肌管或肌细胞链,骨骼肌肌球蛋白呈阳性表达.结论:肌源性干细胞具有高水平表达desmin,Bcl-2,极低水平表达CD45,不表达α-SMA的生物学特性,在高汇合度或低血清培养条件下能够多向分化.
-
损伤胰腺提取液对骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞的作用
背景:损伤胰腺提取液含有胰腺再生过程的特异性生长因子,能够促进β细胞系增殖和胰岛素分泌,可能有助于胰岛再生和细胞分化.目的:规察损伤胰腺提取液对骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-06/2007-03在解放军军事医学科学院牛物工程研究所完成.材料:清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠6只,由解放军军事医学科学院实验动物中心提供.活化素A、视黄酸、胰蛋白酶抑制剂为Sigma公司产品,链脲菌素为Sigma公司产品.方法:大鼠腹腔注射链脲菌素,2d后血糖浓度超过10 mmol/L时取其胰腺组织,在含有胰蛋白抑制剂的磷酸盐缓冲液中制备匀浆,2次离心后取上清,即为损伤胰腺提取液.采用密度梯度离心法分离人鼠骨髓间充质干细胞,当传代细胞生长至70%～80%融合时,随机分为4组:埘照组以体积分数为0.02的胎牛血清的低糖DMEM培养11 d:活化索A+视黄酸组以活化素A、视黄酸各自诱导24 h,再以碱性成纤维牛长因子、尼克酰胺、尼克酰胺+exendin 4各自诱导3 d:活化素A+视黄酸+损伤胰腺提取液组在前组基础上添加损伤胰腺提取液;损伤胰腺提取液组单纯以损伤胰腺提取液诱导11 d.主要观察指标:应用免疫细胞化学和反转录聚合酶链反应等方法对分化细胞表型进行检测,ELISA法检测细胞胰岛素的分泌水平.结果:活化素A+视黄酸组、活化素A+视黄酸+损伤胰腺提取液组有较多的胰岛素阳性反应细胞出现,且后者形成的胰岛样结构较前者大而多:损伤胰腺提取液组可见较少的胰岛素阳性反应细胞及胰岛样结构.各诱导组均检测胰岛素1 mRNA的表达,培养上清中均可检测到胰岛素的分泌,且活化素A+视黄酸+损伤胰腺提取液组胰岛素分泌水平＞活化素A+视黄酸组＞损伤胰腺提取液组(P＜0.05).对照组子项指标均呈阴性表达.结论:摹丁前期活化素A、视黄酸及其他成熟因子的诱导方案基础上,损伤胰腺提取液对骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞具有促进作用,能够提高诱导分化效率.
-
新生大鼠前软骨干细胞株的体外培养分选、鉴定及永生化研究
背景:前软骨干细胞虽然具有较强的自我增殖能力和多向分化潜能,但生物学性状不稳定,易分化.导入外源性基因能使其永生化,且不改变细胞的表型和性状.目的:建立永生化大鼠前软骨干细胞株,为以后精确调控前软骨干细胞的增殖与分化打下基础.设计、时间及地点:单一样本观察,于2005-10/2006-09在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室完成.材料:出生＜24 h的新生SD大白鼠,雌雄不限,用于取前软骨干细胞.方法:用LipofectamineTM2000介导基因转染,将含有SV40T抗原基因的真核表达载体pCMVSV40T/PUR导入经免疫磁珠分选出的原代前软骨干细胞进行稳定表达,用嘌呤霉素筛选出阳性克隆并扩大培养.主要观察指标:①前软骨干细胞的生物学性状.②质粒鉴定.③用免疫细胞化学方法和反转录聚合酶链反应鉴定SV40T抗原基因在转染细胞中的表达.④反转录聚合酶链反应结果.⑤细胞生长曲线.结果:①免疫磁珠分离获得细胞阳性克隆,用免疫组织化学证实FGFR-3表达阳性.②双酶切质粒,电泳证实pCMV为3 kb,SV40T基因为2.3 kb.③嘌呤霉素分离获得转化后细胞阳性克隆,用免疫组织化学证实FGFR-3表达阳性.④提取RNA后用反转录-聚合酶链反应法成功扩增出588 bp的片段.转染细胞经扩大培养,命名为永生化前软骨干细胞.⑤贴壁培养的转染细胞群体倍增时间为(22.98±2.77) h,传代、冻存和复苏对细胞形态及生长无明显影响.结论:在体外培养条件下,可以从新生大鼠干骺端中分离、培养出前软骨干细胞.pCMVSV40T/PUR转染能使其永生化.
-
兔肝纤维化模型建立与自体骨髓干细胞移植的疗效
背景:国内外已基于不同研究需要建立了多种肝纤维化动物模型方法,多采用大鼠为实验对象,但大鼠血容量少.不利于生化指标的检测.目的:探讨容易重复而且可靠的肝纤维化模型制作方法,并通过骨髓干细胞自体肝门静脉移植给予治疗,判定其疗效和安全性.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2004～09/2006-03在解放军昆明总医院干细胞与组织工程研究中心完成.材料:肝功能检查正常的健康日本大耳白兔38只,体质量2.0～2.5 kg,随机分为2组:健康对照组8只,模型组30只.方法:连续12周皮下注射硫代乙酰胺诱导兔肝纤维化,将造模成功的17只大鼠分为移植组与空白对照组.采集移植组兔骨髓,分离获得骨髓单个核细胞,加入细胞生长因子和粒单细胞集落刺激因子对骨髓干细胞进行诱导分化72 h,经肝门静脉自体移植.主要观察指标:移植后4周通过病理与生化指标分析诱导后骨髓干细胞对肝纤维化的治疗作用.结果:注射硫代乙酰胺12周时,病理切片显示肝小叶结构破坏,肝索排列紊乱,肝细胞脂肪变性,有少许坏死,间质纤维组织增生,有部分伸入小叶,有炎性细胞浸润,为肝纤维化症状.经兔肝门静脉移植骨髓干细胞4周后,总蛋白、清蛋白和白球蛋白比值均有所提高,总胆红素、直接胆红素、谷丙转氨酶和谷草转氨酶均有所降低,空白对照组也有改善,移植组肝纤维化病变较空白对照组改善程度明显.结论:皮下注射硫代乙酰胺能成功诱导兔肝纤维化,且致死率低,容易重复;骨髓干细胞移植有治疗肝纤维化的作用,有助于肝组织结构恢复和改善肝功能.
-
Ⅳ型胶原快速黏附法体外分选人胎儿表皮干细胞
背景:发育生物学研究表明,表皮干细胞是皮肤及其附属器发生、修复、重建的关键性源泉,如何从皮肤组织中分离获得更多的表皮干细胞,并在体外培养过程中保持干细胞特性足其在皮肤组织工程中应用的重要前提.目的:观察Ⅳ型胶原快速黏附法分选的人胎儿表皮干细胞体外生长状态及克隆形成情况,并与角质细胞进行对照.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/06在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成.材料:因创伤等原因致意外流产的妊娠24～26周龄胎儿皮肤标本,由南昌大学第一附属医院产科提供.Ⅳ型胶原为美国Sigma公司产品,角质细胞无血清培养基为美国Gibeo公司产品.方法:将Ⅳ型胶原用磷酸盐缓冲液稀释成100 mg/L,均匀涂被培养板后于超净工作台中风干备用.无菌条件下取胎儿皮肤标本,剪成3.0 mm×5.0 mm皮条片,4℃胰蛋白酶+EDTA联合消化8～10 h,表皮真皮分离,用角质细胞无血清培养基将表皮反复吹打,获得单细胞悬液接种于预处理好的Ⅳ型胶原培养板,置37℃、体移J分数为0.05的C02饱和湿度培养箱中,20 min后吸去培养液和未黏附细胞,加入含体积分数为0.1的胎牛血清、10 μ g/L表皮生长因子及角质细胞无血清培养基的表皮十细胞培养液,细胞约70%～80%融合后传代扩增;将未黏附细胞接种于另一培养板中,相同条件下作为角质细胞对照培养.主要观察指标:表皮干细胞的形态变化、免疫细胞化学染色鉴定结果及克隆形成率.结果:经贴壁筛选的表皮干细胞接种后呈圆形,折光性较强:1 d后细胞略伸展为扁平的多角形.胞质近中央处有圆形核:3 d时出现表皮十细胞克隆;5 d时克隆数量明显增多,细胞之间紧密衔接,呈铺路石状:14 d左右细胞基本融合.分离培养的人表皮干细胞克隆β整合素、角蚩白19、p63均呈阳性表达.表皮干细胞克隆形成率明显高于角质细胞克隆形成率(t=1.972,P＜0.05).结论:采用Ⅳ型胶原快速黏附法成功筛选出纯度较高的人胎儿表皮干细胞,且呈明显克隆性生长,具有典型的干细胞生物学特性.
-
成人骨髓间充质干细胞的分离、鉴定和生物学特性
背景:骨髓间充质干细胞具有自我复制的能力、多向分化和增殖的潜能,但骨髓中间充质干细胞的含量极少,因此体外纯化和扩增极其重要.目的:拟建立体外分离培养、纯化骨髓间充质干细胞的方法,观察其增殖及生长特性.设计、时间及地点:单一样本观察实验,于2006-05/2007-12在北京协和医院胸心外科实验室和桂林医学院附属医院中心实验室完成.材料:骨髓血来源于成人肋骨骨髓.方法:收集成人骨髓血,采用密度为1.077的Ficoll淋巴细胞分离液提取成体人骨髓单个核细胞,根据骨髓间充质干细胞易于贴璧的特性除去末贴擘细胞获取骨髓间充质干细胞.取第2～3代细胞在-80℃条件下冻存,24 h后复另:,规察活细胞数,按2×103/cm2种植扩增,扩增时保持细胞密度为2×103/cm2～8×103/cm2主要观察指标:倒置显微镜和相差倒置显微镜观察细胞形态变化,流式细胞仪检测细胞抗原表达,采用细胞计数方法绘制原代培养和传代培养细胞生长曲线.结果:原代培养接种三四小时后细胞开始贴擘,24 h后贴壁细胞数量明显增多,3 d后贴壁细胞为单个或几个细胞克隆,散在分布,大部分细胞呈纺锤形.7～9 d后集洛迅速增多细胞融合,细胞数量约增加了10倍:10～12d,细胞数量增加了约20倍,铺满了全层,细胞排列也有一定的方向性,呈旋涡样生长,旋涡中心细胞呈多层分布.骨髓间充质干细胞表达KDR、CD105,不表达CD34、CD45、CD11a、CD14、HLADR等.原代细胞培养曲线显示,第2～6天为牛长潜伏期,第8～10天进入对数增长期,第12～14天进入个平台期;传代培养的潜伏期为24～48 h,对数增长期为4～6 d,细胞的增殖、生长逐渐缓慢,接种后8到9天进入平台期.结论:利用密度梯度离心和贴壁的方法获取的骨髓间充质干细胞具有大量增殖的能力,表达CD105、KDR,不表达HLA-DR、CD34、CD45、CD11a、CD14.
-
脐带血干细胞的基础与临床应用进展
脐带血含有丰富的造血干细胞,已经成为替代骨髓移植治疗多种疾病的良好资源,但尚存多种不足与难题.国内外大量研究证实,脐带血干细胞具有肯定的支持造血功能,在体外培养条件下可以扩增,并且在一定的诱导作用下可分化为骨、软骨、肝、内皮等多种组织细胞.脐带血干细胞具有低免疫原件等很多优点,己成为干细胞研究领域的热点.目前分离培养脐带血干细胞的方法多样,日趋成熟,临床应用脐带血干细胞移植治疗的疾病已达80余种,但仍存在许多弊端,尚需进一步的研究.
-
肿瘤干细胞的调控机制及其临床意义
肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中的少部分具有干细胞性质的细胞群,其自我更新和分化受到严格的调控.肿瘤干细胞是肿瘤形成、复发与转移的根源.目前,对于肿瘤干细胞的调控机制存在着若干理论,包括异常信号传导通路、非整倍核型发生、原癌基因激活与抑癌基因失活和端粒酶耗损理论等.通过研究肿瘤十细胞的各种调控机制,寻找和鉴定特异性的肿瘤干细胞表面分子标志物,寻找肿瘤干细胞与肿瘤发生密切相关的基因,确定出针对肿瘤干细胞进行治疗的靶位并选择性地杀伤肿瘤干细胞,从而为临床可能根治肿瘤和防止肿瘤复发与转移提供新的思路.
-
胚胎干细胞在帕金森病治疗中的应用
目前临床治疗帕金森病主要以左旋多巴为代表的多巴胺替代疗法为主,存在着药物副作用较多,不能阻止病情进展等不利因素;手术治疗在近年宵所发展,但也存在患者适应证有限,长期疗效较差等缺陷:因而干细胞成为帕金森病等各种神经退行性疾病治疗研究的焦点.胚胎干细胞可以在相关因素作用下定向诱导分化形成神经细胞,通过移植干细胞分化成为多巴胺能神经元而行使正常细胞功能、多巴胺能神经元保护及营养作用、促进内源性多巴胺能神经发生等途径应用于治疗帕金森病等神经系统退行性疾病,但是依然存在一定的副作用,还需要进行大量的实验研究和临床试验.胚胎干细胞为治疗帕金森病开辟了一个新的技术平台,在神经系统退行性疾病治疗领域临床应用前景广阔.
-
表皮干细胞的鉴定方法
获得纯化的人类和动物表皮干细胞不仅可为构建有生理功能的人工皮肤提供种子细胞,对了解皮肤组织器官发育、肿瘤疾病发生也具有重要意义,是转基因和组织工程技术中的重要靶细胞.利用慢周期性和自我更新能力是鉴别表皮干细胞基本且较可靠的实验于段,但这两种方法的应用很不方便.目前位于表皮干细胞表面的糖蛋白已作为其特异性标志而受到关注.因表皮干细胞的特异性分子标志、识别标准、分布定位及体外培养条件下生物学特性的变化等诸多方面i都还存在争议,限制了其基础研究与临床应用.
-
人表皮干细胞的体外分离和培养
背景:如何获得高纯度的表皮干细胞以及维持其干细胞表型和体外增殖特性,是目前表皮干细胞体外培养过程中急需解决的问题.目的:建立人表皮干细胞体外分离和培养的技术方法.设计、时间及地点:细胞观察,于2005-03/2006-05在南昌大学第一附属医院?汉烧伤科完成.材料:所用包皮来自2～12岁行包皮环切术的患者,患者无泌尿系统感染等疾病.方法:取包皮皮片,采用Dispase Ⅱ酶和胰蛋白酶两步法分离出角朊细胞和成纤维细胞,Ⅳ型胶原快速黏附法富集分离表皮干细胞.收集处于指数牛长期第二三代成纤维细胞的上清液,过滤后与角朊细胞无血清培养基等比例混合,并加入胎牛血清、表皮生长因子、牛垂体提取物等组成表皮干细胞培养液,用以人表皮十细胞的体外扩增培养,以角朊细胞作对照.主要观察指标:传至第2代,通过平板克隆形成实验计算克隆形成率和克隆维持时间,采用免疫组织化学染色检测β1整合素和角蛋白19的表达.结果:①与同一标本同一批次培养的角朊细胞相比,人表皮干细胞的克隆形成率明显升高,克隆维持时间延长(P＜0.01).②表皮干细胞β 1整合素及角蛋白19免疫组织化学染色均呈阻性.结论:应用Ⅳ型胶原快速黏附法及人成纤维细胞条件培养基,对人表皮干细胞成功进行了体外分离和培养.
