中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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骨髓间充质干细胞对CD117+心脏干细胞分化过程中转化生长因子βⅢ型受体表达的影响
背景:骨髓间充质干细胞能够促进心肌细胞、血管生成,减轻心肌重构、改善心功能.但其旁分泌作用能否能够通过影响转化生长因子βⅢ型受体促进CD117+心脏干细胞的分化尚不清楚.目的:观察骨髓间充质干细胞对CD117+心脏干细胞分化过程中转化生长因子βⅢ型受体表达的影响.设计、时间及地点:细胞学体外对比观察,于2008-02/2009-02在新华医院完成.材料:新生大鼠,体质量5～8 g,用于心脏干细胞分离培养;4周龄SD大鼠,体质量200-250 g,用于骨髓间充质干细胞培养.方法:分离大鼠心肌组织进行植块培养,体外磁珠分离培养大鼠心脏干细胞,免疫荧光鉴定其表型为CD117+.将获得的CD117+心脏干细胞吹打制成单细胞悬液,无血清同步化24 h,PBS冲洗3次,加入DMEM/F12培养基,接种至被咀胶包被的6孔板.实验分为对照组和共培养组,对照组用心肌球培养液诱导分化的心脏干细胞,共培养组用Transwell小室避免细胞融合建立心脏干细胞与骨髓间充质干细胞共培养体系.主要观察指标:①倒置显微镜下观察心脏干细胞生长情况.②western blot检测CD117+心脏干细胞向心肌细胞系分化过程中培养第1,3,5,7天心肌钙蛋白T、缝隙连接蛋白43、转化生长因子βⅢ型受体和smad2及其磷酸化程度的改变.结果:①植块培养和磁珠分离法结合分离出CD117+心脏干细胞,传代后心脏干细胞分散生长,细胞略小于普通心肌细胞.②诱导分化后第5,7天,共培养组心肌钙蛋自T和缝隙连接蛋白43的表达高于对照组(P<0.05);诱导分化后第1～7天,转化生长因子βⅢ型受体的表达均高于对照组(P<0.05);同时,磷酸化smad2/smad2的值也高于对照组(P<0.05).结论:骨髓间充质干细胞旁分泌作用能够促进CD117+心脏干细胞内心肌钙蛋白T,缝隙连接蛋白43和转化生长因子βⅢ型受体的表达,并提高了smad2蛋白的磷酸化程度.
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腺相关病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染后人骨髓基质细胞的成骨分化
背景:现阶段诱导骨髓基质细胞分化成骨的方法大致分为在化学药物作用、细胞因子作用以及转基因作用下的分化等.目的:观察腺相关病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染对人骨髓基质细胞成骨能力的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/12在郧阳医学院附属人民医院临床研究所和骨关节科完成.材料:人骨髓基质细胞取自健康成年男性自愿者.人血管内皮生长因子165基因重组腺相关病毒、β半乳糖酐酶基因重组复制缺陷性腺相关病毒由课题组前期构建.方法:抽取健康志愿者髂前上棘骨髓,采用全骨髓法分离培养人骨髓基质细胞.体外扩增纯化后取50%融合的P2代细胞,随机分为4组:腺相关病毒介导人血管内皮生长因子组向细胞培养液中加入人血管内皮生长因子165基因重组腺相关病毒1×1010OPU/mL,孵育24 h后换为普通完全培养液继续培养.β半乳糖酐酶基因重组腺相关病毒组加入半乳糖酐酶基因重组复制缺陷性腺相关病毒,其余处理与前组相同.阳性对照组向培养液中添加地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠.空白对照组仅加入普通完全培养液,不进行特殊处理.主要观察指标:全自动生化分析仪检测培养上清碱性磷酸酶活性,免疫组化染色观察血管内皮生长因子的表达,Von Kossa染色检测人骨髓基质细胞中骨胶原结节形成.结果:处理后2周,腺相关病毒介导人血管内皮生长因子组与阳性对照组的培养上清碱性磷酸酶活性基本相似(P>0.05),而β半乳糖酐酶基因重组腺相关病毒组、空白对照组的培养上清碱性磷酸酶活性均明显降低(P<0.01).血管内皮生长因子主要在骨髓基质细胞的胞浆内表达,腺相关病毒介导人血管内皮生长因子组阳性细胞数明显多于其他3组.腺相关病毒介导人血管内皮生长因子组和阳性对照组可见大量红色骨胶原结节形成,明显多于β半乳糖酐酶基因重组腺相关病毒组、空白对照组.结论:基因重组腺相关病毒人血管内皮生长因子165转染对人骨髓基质细胞成骨能力具有促进作用.
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骨髓间充质干细胞治疗再生障碍性贫血模型鼠的机制
背景:骨髓间充质干细胞在体外抑制再生障碍性贫血T淋巴细胞的活化与增殖,并有支持骨髓造血作用.目的:观察骨髓间充质干细胞对再生障碍性贫血模型鼠存活率的影响,探讨其治疗再生障碍性贫血的机制.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2009-01/04在安徽医科大学第一附属医院中心实验室完成.材料:清洁级雌性BALB/C小鼠40只,8～10周龄,体质量16～18 g,作为受体.清洁级DBA/2小鼠5只,6～10周龄,体质量15～19 g为淋巴细胞供体.方法:取BALB/c小鼠骨髓进行间充质干细胞体外增殖培养,传至3～5代的细胞用于实验.建立免疫介导再生障碍性贫血小鼠模型.40只BALB/C小鼠随机分为3组,治疗组(n=15):造模后将1×106个骨髓间充质干细胞输注到治疗组小鼠体内进行治疗;模型组(n=15):仅造模不进行任何治疗;对照组(n=10):不进行任何干预.主要观察指标:分别于第1,2,3,4周观察各组小鼠的存活率;流式细胞仪及酶联免疫吸附法测定骨髓间充质干细胞治疗后第28天各组小鼠T淋巴细胞亚群及血浆肿瘤坏死因子α的表达.结果:①模型组小鼠3只于第2周内死亡,7只于第3周内死亡,2只于第4周内死亡,28天存活率20%;治疗组小鼠4只于第3周内死亡,28天存活率73%.②与模型组相比,治疗组和对照组CD4的表达增高(27.12±4.23)%,(32.18±6.73)%,(38.44±7.88)%,P<0.01];CD8和肿瘤坏死因子α表达均降低[CD8:(34.42±5.13)%,(27.33±5.09)%,(23.31±5.24)%,P<0.01:肿瘤坏死因子α:(47.27±10.1 1),(12.34±5.87),(9.31±3.77)ng/L,P<0.011.结论:骨髓间充质干细胞可以提高再生障碍性贫血小鼠存活率,其治疗机制可能与调节T淋巴细胞亚群及抑制T淋巴细胞分泌的肿瘤坏死因子α有关.
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体外分离培养大鼠骨髓内皮祖细胞及其生物学特性鉴定
背景:现阶段急需建立一种稳定的体外分离培养内皮祖细胞的方法,骨髓中内皮祖细胞的含量丰富,增殖能力强,而且容易获得,操作简单.目的:拟在体外分离培养大鼠骨髓内皮祖细胞,并对其生物学特性进行鉴定.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-08/12在重庆医科大学附属第一医院中心实验室完成.材料:清洁级2周龄SD大鼠20只,由重庆医科大学实验动物中心提供.方法:无菌条件下分离大鼠股骨和胫骨,用预冷至4℃的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液冲洗骨髓腔,以密度梯度离心法收集单个核细胞层,含体积分数为20%胎牛血清的M199培养液重悬细胞,制成单细胞悬液后进行细胞计数,按1×109L-1浓度接种到预先用纤维连接蛋白包被的培养瓶中,37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度恒温培养.主要观察指标:倒置显微镜观察细胞形态变化,免疫细胞化学检测内皮祖细胞表面特异性抗原CD133、内皮祖细胞表面抗原CD34和血管内皮生长因子受体KDR的表达,并进行流式细胞仪定量分析和细胞生长曲线分析.结果:新分离获得的骨髓单个核细胞为小圆形,培养4 d后贴壁细胞呈"集落"样生长,中间为圆形贴壁细胞,外周梭形细胞较多,传代后梭形细胞首尾相连,呈"毛细血管"样排列.培养第4,7,10,14天贴壁细胞CD34,KDR,CD133均呈阳性表达,CD133阳性细胞第10天时开始减少.流式细胞仪检测结果显示,CD133/KDR双阳性细胞率逐渐升高,10 d时达峰值,随后下降.KDR阳性细胞率随培养时间的延长而逐渐升高.原代细胞生长曲线显示细胞在第3～6天处于指数生长期,贴壁细胞大量增殖,呈"集落"样生长.结论:采用密度梯度离心法可成功从SD大鼠骨髓中分离获得内皮祖细胞,加入M199培养液后能够贴壁增殖,并可以分化为内皮细胞.
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成人脂肪间充质干细胞体外长期培养后的成骨分化潜能
背景:获得足够数量的种子细胞需要在体外进行长期传代扩增,目前涉及体外长期培养对成人脂肪间充质干细胞的基本生物学性状及成骨分化潜能影响的报道甚少.目的:观察体外长期培养对成人脂肪间充质干细胞的基本生物学性状及其成骨分化潜能的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/06在解放军兰州军区兰州总医院骨科研究所完成.材料:成人腹部皮下脂肪组织来源于骨盆骨折患者,由解放军兰州军区兰州总医院创伤骨科提供.方法:Ⅰ型胶原酶消化法从成人脂肪组织中分离培养脂肪间充质干细胞,体外传代扩增.收集第2,5,10,15,20代细胞,加入成骨培养液进行成骨诱导分化.主要观察指标:脂肪间充质干细胞的超微结构、表面分子标志表达、生长曲线、成骨潜能.不同代数脂肪间充质干细胞成骨诱导后骨钙素及Ⅰ型胶原的吸光度值比较.结果:脂肪间充质干细胞成骨诱导第7天,由长梭形变为椭圆形、多角形,岛状分布,胞浆中出现黑色颗粒.细胞表面有较多伪足,有一两个核仁,有分叶,具备正常细胞器结构.表达CD44(96.31%),不表达CD34(1.15%).第2,5,10,15,20代脂肪间充质干细胞的生长曲线无明显差异,均呈反"S"形.上述各代细胞诱导7 d后开始表达碱性磷酸酶,且随诱导时间的延长阳性细胞数增多,至诱导28 d出现圆形不透明结节,诱导14 d骨钙素、Ⅰ型胶原均呈阳性表达.随传代次数的增加,骨钙素及Ⅰ型胶原的吸光度值均有所减低,至第20代时差异显著(P<0.05).结论:成人脂肪间充质干细胞经体外长期培养后,其一般生物学性状可保持稳定,但成骨分化潜能有所下降.
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低强度脉冲超声波对兔骨髓基质细胞增殖和分化的影响
背景:研究发现低强度脉冲超声波对骨折愈合具有明显的促进作用,但其机制尚不明确.目的:观察低强度脉冲超声波对体外分离培养的兔骨髓基质细胞增殖和分化的影响.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2008-06/2009-01在解放军第四军医大学西京医院完成.材料:4周龄新西兰白兔2只,体质量0 8～1.0 kg,用于骨髓基质细胞的分离、培养.方法:将骨髓基质细胞以2×104个/孔的密度接种于6孔培养板中,采用辐射强度为30 mW/cm2的脉冲超声波作用于体外培养的兔骨髓基质细胞,根据低强度脉冲超声波每天作用时间分为4组:5 min/d组,10 min/d组,20 min/d组和空白对照组(无超声波处理).主要观察指标:原代及传代细胞形态变化;四甲基偶氮唑盐法检测低强度脉冲超声波作用1,3,7 d各组细胞吸光度的变化;作用3,7 d后各组骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性的变化;作用7 d各组骨髓基质细胞分泌骨钙素水平的变化.结果:①原代骨髓基质细胞7 d后融合成片,多数细胞呈梭形或多角形;第3代细胞经低强度脉冲超声波处理后,各组细胞形态较空白对照组无明显变化.②四甲基偶氮唑盐检测,各组细胞吸光度值均随时间延长而增加;且各实验组不同时间点吸光度值均明显高于空白对照组(P<0.05).③与空白对照组相比,20 min/d组低强度脉冲超声波作用3,7 d后,单位质量骨髓基质细胞总蛋白碱性磷酸酶活性均显著升高(P<0.05),其他2组与空白对照组相比,差异无显著性意义(P>0.05).④与空白对照组相比,20 min/d组低强度脉冲超声波作用7 d时,骨髓基质细胞分泌骨钙素显著增加(P<0.05),而其他2组骨钙素的分泌量与空白对照组相比,差异无显著性意义(P>0.05).结论:低强度脉冲超声波能够显著促进兔骨髓基质细胞的增殖,其诱导分化作用与作用时间有关.
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体外条件下人骨髓间充质干细胞与NZBW F1鼠T淋巴细胞的免疫调节
背景:近年研究发现系统性红斑狼疮患者的间充质干细胞存在异常,自体造血干细胞移植治疗系统性红斑狼疮复发率高,有学者提出系统性红斑狼疮不仅是造血干细胞病,也是间质干细胞病.目的:探讨入骨髓间充质干细胞在体外对NZBW F1鼠脾脏T淋巴细胞的免疫调节作用.设计、时间及地点:细胞共培养体外实验,于2008-03/09在江苏大学附属医院中心实验室完成.材料:健康人骨髓由江苏大学附属医院研究生自愿捐献.SPF级20周龄NZBW F1雌鼠9只,购自南京大学动物模式研究所.方法:Percoll密度梯度离心法分离培养人骨髓间充质干细胞,取P3代细胞用于实验.20周龄NZBW F1小鼠适应性饲养至24周龄时,无菌分离脾淋巴细胞,在刀豆球蛋白A刺激下,将T淋巴细胞与骨髓间充质干细胞分别以不同比例(1:0.01,1:0.02,1:0.1)共培养72 h,并设立对照组.主要观察指标:MTT法检测T淋巴细胞增殖,流式细胞仪检测T淋巴细胞凋亡和CD69,CD28表达,实时荧光定量PCR检测T淋巴细胞白细胞介素10、干扰素γ mRNA水平.结果:与对照组比较,在体外人骨髓间充质干细胞能抑制NZBW F1鼠T淋巴细胞的增殖,且呈剂量依赖性(P<0.05).与对照组比较,T淋巴细胞与骨髓间充质干细胞比例为1:0.002和1:0.1时,骨髓间充质干细胞可抑制T淋巴细胞的凋亡,并促进T淋巴细胞干扰素γ mRNA表达,抑制白细胞介素10 mRNA表达;T淋巴细胞与骨髓间充质干细胞比例为1:0.01时,T淋巴细胞凋亡情况和干扰素γ、白细胞介素10 mRNA表达无明显差异(P>0.05).结论:人骨髓间充质干细胞体外在一定比例下可能通过抑制NZBW F1鼠T淋巴细胞的增殖和凋亡、干预Th1/Th2细胞因子mRNA表达,继而下调T淋巴细胞的免疫功能.
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骨形态发生蛋白2和音猬因子体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化
背景:研究表明,骨形态发生蛋白2和音猬因子联合诱导干细胞的定向分化存在理论上的可能性,但目前联合诱导间充质干细胞的方向纷繁复杂,且众说纷纭.目的:观察骨形态发生蛋白2和音猬因子在体外联合和单独应用促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的能力.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2008-12在江苏大学临床医学院实验室完成.材料:6周龄SPF级SD大鼠10只,体质量140～160 g,雌雄不拘,用于间充质干细胞的获得、培养和传代.重组人骨形态发生蛋白2、音猬因子为PeproTech公司产品.方法:将SD大鼠的间充质干细胞分离培养后分为4组:重组人骨形态发生蛋白2组:加入100 mg/L重组人骨形态发生蛋白2:音猬因子组:加入20 μg/L音猬因子:联合组:100 mg/L重组人骨形态发生蛋白2联合20 μg/L音猬因子作用于SD大鼠间充质干细胞:对照组:不加任何干预措施.主要观察指标:倒置相差显微镜观察细胞形态学的变化;MTT法检测细胞培养第3,6,9,12天细胞增殖数和细胞碱性磷酸酶活性;以及成骨细胞表型的检测和Ⅰ型胶原蛋白免疫印迹分析,以比较各组诱导成骨能力的差异.结果:①间充质干细胞培养24 h后部分贴壁,贴壁细胞呈圆形或椭圆形,第7天左右细胞铺满瓶底,多为梭形.条件培养基培养3 d后,联合组细胞由长梭形转变为多角形.随后重组人骨形态发生蛋白2组细胞发生成骨样改变,音猬因子组细胞未见明显形态学改变.②相同时间点联合组、重组人骨形态发生蛋白2组、音猬因子组细胞吸光度均高于对照组(P<0.05).联合组和重组人骨形态发生蛋白2组在各时间点碱性磷酸酶表达量均高于音猬因子组和对照组(P<0.05).③间充质干细胞经诱导培养7 d后,碱性磷酸酶细胞化学染色联合组和重组人骨形态发生蛋白2组呈阳性,联合组可见胞质中棕黄色颗粒,音猬因子组和对照组阴性.诱导培养14 d后,Ⅰ型胶原免疫荧光染色音猬因子组和对照组均为阴性,联合组和重组入骨形态发生蛋白2组为阳性,但联合组细胞数量明显增多,细胞间融合较好,重组人骨形态发生蛋白2组细胞融合欠佳.矿化沉积茜素红染色音猬因子组和对照组仍为阴性,联合组和重组人骨形态发生蛋白2组为阳性,联合组细胞间可见红色的钙结节.④蛋白免疫印迹分析显示,与对照组相比,联合组和重组人骨形态发生蛋白2组Ⅰ型胶原蛋白表达增加,联合组尤其明显,音猬因子组与之接近.结论:骨形态发生蛋白2和音猬因子在体外能明显促进间充质干细胞向成骨细胞分化并且具有明显的协同相关性.
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小鼠胚胎肝干细胞体外向肝样细胞的诱导分化
背景:目前肝干细胞尚无特异性标志物,故其分离、培养尤其是纯化技术尚不成熟.目的:观察体外培养的小鼠胚胎肝干细胞生物学特性,及其向肝样细胞的诱导分化能力.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/06在厦门大学附属中山医院消化中心实验室完成.材料:SPF级BALB/c胎鼠20只,13.5 d龄,由厦门大学生命科学学院实验动物中心提供.方法:无菌操作取出胎鼠肝脏,用细胞刮梳理后用Ⅳ型胶原酶消化.取分离纯化后的第2代细胞进行免疫荧光染色.细胞培养到第3代时,分别用3mmol/L丁酸钠盐与0.1%DMSO进行诱导,5 d后收集细胞进行Western blotting实验.主要观察指标:胚胎肝干细胞的形态及表面分子的表达,诱导后胚胎肝干细胞mRNA与蛋白水平的变化.结果:分离培养的细胞第2代即可得以纯化,呈克隆样生长,高表达白蛋白、甲胎蛋白、C-met及角蛋白19,且多数细胞共表达白蛋白与角蛋白19、C-met与角蛋白19,双阳性率约80%.细胞诱导后肝细胞标志物白蛋白表达明显增加,而作为不成熟肝细胞的经典标志物甲胎蛋白表达减少,同时干细胞标志物c-kit mRNA水平也明显下降,角蛋白19水平无明显变化.结论:胚胎肝干细胞具有双向分化潜能,经丁酸钠盐与DMSO诱导后可以向肝样细胞分化.
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人脐带间充质干细胞体外成骨及其免疫学特征
背景:目前关于脐带源性干细胞的研究主要是针对其多向分化、组织修复方面,而对脐带干细胞的同种异体之间移植免疫学的报道较少.目的:观察体外培养的人脐带间充质干细胞生物学特性、成骨分化潜能及移植免疫学特征.设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008-11在吉林大学药学院病理学实验室完成.材料:脐带来源于健康产妇足月剖腹产的胎儿,靠近胎儿侧5cm,均征得孕妇同意.方法:应用组织块贴壁法分离培养脐带间充质干细胞,胰酶消化传代.取传至第5代细胞,加入含地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠的α-MEM完全培养基进行成骨诱导.另取传至第5代细胞,分别进行正常培养及应用γ-干扰素刺激48 h.主要观察指标:脐带间充质干细胞形态观察、生长曲线分析、免疫表型分析.碱性磷酸酶染色观察细胞成骨分化情况.流式细胞仪检测γ-干扰素刺激后细胞免疫表型变化.结果:培养7 d倒置显微镜下可见组织块边缘出现呈长梭形、多角形或三角形的贴壁细胞,且随时间延长组织块周围细胞数量逐渐增多.第2,5,9代细胞之间的生长曲线无明显变化,培养20代内未见细胞衰老及增殖速度减慢等现象发生.第2代贴壁细胞CD44,CD105均呈阳性表达,CD34,CD45均呈阴性表达.成骨诱导14 d后,碱性磷酸酶染色可见胞核染成均一的淡蓝色.第5代脐带间充质干细胞HLA-ABC呈弱阳性(40.50%),HLA-DR,CD80,CD86呈阴性表达;γ-干扰素刺激48 h后,HLA-ABC阳性率增加至87.44%,HLA-DR,CD80,CD86仍呈阴性表达.结论:人脐带间充质干细胞体外诱导成骨能力确切,具有类似骨髓间充质干细胞的特异性表面标记,且具有同种异体移植的低免疫原性.
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全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化
背景:骨髓中的间充质干细胞含量极少,每1×104～1×105个单核细胞中约有1个骨髓间充质干细胞,需要在体外分离、纯化、扩增后才能满足体内移植要求.目的:观察体外分离培养的骨髓间充质干细胞生物学特性及多向分化潜能.设计、时间及地点;细胞学体外观察,于2007-10/2008-12在福建医科大学附属协和医院泌尿外科研究室完成.材料:清洁级雄性近交系SD大鼠30只,由上海斯莱克实验动物有限公司提供.方法:通过全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,待细胞融合至80%～90%胰蛋白酶消化传代.取传至第3代细胞,分别向成骨、成脂方向诱导分化.主要观察指标:倒置相差显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测其表面标记,茜素红染色检测其成骨能力,油红O染色检测其成脂能力.结果:原代及传代的骨髓间充质干细胞均呈长梭形成纤维细胞样,连续传代10代以上,细胞始终保持旺盛的生长及扩增能力.第3代骨髓间充质干细胞CD90,CD44,CDl06均呈阳性表达,而CD34,CD45,CD11b呈阴性.成骨诱导21 d后,可见大量橘红色矿化结节形成.成脂诱导2周后,可见细胞的胞浆内出现大量红染脂滴. 结论:全骨髓贴壁培养法可大量分离纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能.
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微囊微环境体外扩增人脐血造血干/祖细胞
背景:由于单份脐血所含的造血细胞数量有限,目前只能用于儿童或低体质量成人血液病和急性辐射损伤等疾病患者,有效扩增脐血造血干,祖细胞已成为研究热点.目的:观察微囊微环境对脐血造血干,祖细胞扩增的影响,以及此过程中可否使造血干,祖细胞在扩增的同时仍维持其未分化状态.设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-06/2007-09在中国科学院大连化学物理研究所完成.材料:正常足月产新生儿脐带血由大连市妇产医院提供,提供者知情同意.方法:Ficoll法梯度分离人脐血单个核细胞,采用静电液滴法在生理条件下进行微囊化包封和体外培养.以同条件平面培养的脐血单个核细胞作为对照.主要观察指标:观察微囊化脐血细胞的生长特点及脐血细胞总数的变化;流式细胞仪检测培养过程中CD34+细胞扩增情况:应用甲基纤维素半固体培养法观察扩增细胞的集落形成能力.结果:脐血细胞在微胶囊内持续增殖,并以聚集成团的三维方式生长,两种培养方式对脐血细胞总数均无明显影响(P>0.05).对比CD34+细胞扩增和细胞集落的生成发现,微囊化培养脐血细胞的CD34+细胞数量和集落密度均在培养第6天达到高峰,明显高于平面培养3 d时所达到的峰值:之后逐渐下降,至12 d后平面培养细胞的CD34+细胞和集落形成能力几乎检测不到,而此时微囊化培养的CD34+细胞数量和集落密度仍与平面培养的扩增高峰相近.结论:微囊化培养能有效扩增人脐血造血干/祖细胞,并显著减缓造血干/祖细胞的分化进程,维持其多分化潜能,提示微囊为造血干/祖细胞维持未分化状态的扩增提供了特殊的微环境.
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黄芪诱导人骨髓间充质干细胞向表皮样细胞的分化
背景:课题组以往的研究证实黄芪对体外培养的人表皮体外扩展生长和表皮干细胞增殖均具有促进作用,但它对人骨髓间充质干细胞的体外作用如何特别是是否具有诱导骨髓间充质干细胞向表皮样细胞分化的效应,仍不清楚.目的:观察黄芪体外定向诱导人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞的可行性.设计、时间及地点;细胞学体外对比观察,于2006-09/2008-06在南昌大学第一附属医院完成.材料:骨髓来源于临床骨髓穿刺检查正常患者,无血液系统疾病和家族遗传病史.方法:用密度梯度离心结合贴壁法分离纯化培养人骨髓间充质干细胞,以含黄芪、胎牛血清、角质细胞无血清培养基组成的诱导培养液进行体外培养,以不含黄芪的上述培养液作为对照.主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞形态学变化,免疫细胞化学染色法检测D63和广谱细胞角蛋白的表达.结果:经黄芪诱导后部分细胞由长梭形转变为扁园形,呈表皮样细胞形态特征;免疫细胞化学染色显示部分诱导细胞p63、广谱细胞角蛋白表达均呈阳性.结论:黄芪可诱导人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞.
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脐血与骨髓间充质干细胞生物学性状的比较
背景:实验证实脐带血与骨髓在体外均可分离培养出间充质干细胞,且两种不同来源的间充质干细胞均具有自我更新及多向分化的能力.目的:比较脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞的表型和生物学性状差异.设计、时间及地点:对比观察,于2007-10/2008-05在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成.材料:3份正常成人骨髓血,取自青岛大学医学院附属医院3例行自体干细胞移植治疗的糖尿病患者(40～50岁),3份胎儿脐带血取自青岛大学医学院附属医院妇产科.方法:在无菌条件下抽取糖尿病患者骨髓血0.5 mL,肝素抗凝后与1.5 mL PBS混匀,然后按1:1比例加入2 mL percoll淋巴细胞分层液中,2 000 r/min离心10 min,吸取其云雾状自膜层,PBS冲洗稀释后1 000 r/min离心10 min.离心后的沉淀细胞加入含体积分数为10%胎牛血清的LG-DMEM培养液,制成单细胞悬液后接种于培养瓶中.取胎儿脐带血,用PBS1:1稀释,分离及培养方法同上.主要观察指标:显微镜下观察第3代培养的间充质干细胞形态变化;四甲基偶氮唑盐法测定细胞生长曲线;碱性磷酸酶染色观察间充质干细胞向成骨的分化.结果:①分离的脐血接种到培养瓶中的白膜层细胞在两三天时开始贴壁,2周左右达到80%～90%汇合.细胞形态不均一,随培养时间延长,细胞体积逐渐增大伸展;骨髓间充质干细胞大部分于24 h内贴壁.倒置显微镜下可见贴壁细胞呈圆形,有小的胞浆突起.瑞特染色后,可见成纤维样细胞形态,细胞呈平行排列生长或漩涡状生长,与脐血间充质干细胞相比,贴壁早,增殖快.②电镜观察可见间充质干细胞为成纤维样细胞,为长形或梭形,少数细胞核质比大,胞浆少,核仁明显,具有干细胞特征.③在细胞生长的对数期,脐血和骨髓间充质干细胞倍增时间分别为150 h和50 h.④脐血和骨髓间充质干细胞成功诱导后细胞形态由原来的梭形变成了立方形,随着细胞生长形成结节结构,碱性磷酸酶染色阳性.结论:两种不同来源的间充质干细胞均具有自我更新及多向分化的能力.骨髓间充质干细胞支持造血、促进造血功能恢复和重建造血的功能强于脐血间充质干细胞.
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白细胞介素3基因cDNA克隆与转导及其在脐血CD34+细胞中的表达
背景:单份脐血难以满足成人造血干细胞移植的要求,需对其进行体外扩增,这不仅需要较长的时间和较高的培养条件,而且容易导致干细胞自身分化,从而影响移植效果.目的:克隆人白细胞介素3基因cDNA,构建其真核表达载体并转导脐血CD34+细胞,观察白细胞介素3的表达情况.设计、时间及地点:细胞一基因组学体外实验,于2008年在承德医学院完成.材料:健康成人外周血由承德市中心血站提供,脐血由承德市妇幼保健院提供,提供者对实验均知情同意.方法:采集健康成人外周血,应用Ficoll密度梯度法分离单个核细胞,免疫磁珠法分离脐血CD34+细胞.提取白细胞介素3 mRNA,应用RT-PCT扩增白细胞介素3 cDNA,构建真核表达载体pcDNA3/IL-3.设立2组:实验组利用基因枪技术将pcDNA3/IL-3导入脐血CD34+细胞中,对照组未行转染.主要观察指标:采用人白细胞介素3 ELISA试剂盒检测脐血CD34+细胞上清液中白细胞介素3水平.结果:扩增的白细胞介素3基因cDNA理论上应为616 bp,实际PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后,紫外线下可见预期大小的条带,反转录合成的cDNA完整.BamH Ⅰ和XbaⅠ双酶切后,电泳可见616 bp的插入片段,与白细胞介素3基因序列相同.转染第1～7天,实验组脐血CD34+细胞上清液中白细胞介素3水平明显高于未转染对照组(t=3.46,P<0.05).结论:白细胞介素3基因cDNA克隆成功,并成功构建了真核表达质粒pcDNA3/IL-3,pcDNA3/IL-3能在脐血CD34+细胞中短期有效表达.
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不同缺氧状态下骨髓间充质干细胞表达血管内皮生长因子的差异
背景:骨髓间充质干细胞在植入心肌缺血,梗死区域后,面临缺氧缺血微环境,其如何通过旁分泌细胞因子来发挥重建侧支微循环、修复心肌的作用,是目前存在争论的焦点之一.目的:探讨骨髓间充质干细胞在不同时程缺氧环境下血管内皮生长因子的表达规律.设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008-03/1 1在南昌大学第二附属医院分子医学实验中心完成.材料:清洁级新西兰大白兔2只,由南昌大学医学院实验动物中心提供.方法:常规差速贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞.细胞缺氧微环境在AnaeroPack密闭方盒中产生,盒中置入一次性缺氧催化袋GENbox anaer(可吸收O2,产生CO2),指示条监测氧的耗竭,根据缺氧培养时程分为缺氧0,6,12,24 h组.主要观察指标:RT-PCR法检测血管内皮生长因子mRNA的表达,Western Blot法检测血管内皮生长因子蛋白的表达.结果:血管内皮生长因子mRNA及蛋白的表达水平均为缺氧0 h组<6 h组<12 h组<24 h组(P<0.01).结论:缺氧24 h以内的培养环境下,骨髓间充质干细胞表达血管内皮生长因子的水平呈缺氧时程依赖性增加.
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羊水来源OCT-4阳性胎儿间充质干细胞向血管内皮细胞的体外诱导分化
背景:已证实将血管内皮细胞与具有良好组织相容性的生物材料复合,并移入体内后可增殖分化形成血管.但由于获取内皮细胞时创伤较大,所以细胞来源是一个急需解决的问题.目的:探讨羊水来源OCT-4阳性胎儿间充质干细胞分化为内皮细胞的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-06/2009-03在上海交通大学医学院附属新华医院科研中心完成.材料:羊水标本来自孕16-22周行产前诊断的孕妇,在超声引导下行羊膜腔穿刺取得60 mL羊水.方法:采用免疫磁珠细胞分选法去除人羊水细胞中CD44和SSEA-4阳性细胞,使OCT-4阳性胎儿间充质干细胞间接得到分离,并在体外进行培养扩增.取第3代羊水来源OCT-阳性胎儿间充质干细胞,诱导组换用含体积分数为15%胎牛血清的内皮细胞生长培养液,对照组持续用原培养液培养细胞.主要观察指标:倒置相差显微镜观察诱导过程中细胞形态变化,采用间接细胞免疫荧光法、内皮细胞吞噬Dil-acLDL法检测诱导效果.结果:诱导30 d后,镜下观察细胞集落相互连接,呈典型的"鹅卵石"样外观,经诱导的羊水来源OCT-4阳性胎儿间充质干细胞可在体外保持良好的增殖活力.诱导后的贴壁细胞eNOS和、vWF呈阳性表达,细胞胞浆内可见发出红色荧光的Dil阳性细胞;对照组细胞免疫荧光染色eNOS和vWF均呈阴性,且无红色荧光细胞出现.结论:羊水来源的OCT-4阳性的胎儿间充质干细胞在适当的体外微环境下,可诱导分化为血管内皮细胞.
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改良诱导方案诱导SD大鼠脂肪源性干细胞定向分化为软骨细胞
背景:软骨组织工程是骨科研究的热点,在种子细胞的研究上由于软骨细胞存在老化现象更多的研究集中在干细胞向软骨细胞分化上.分化条件经历单细胞因子、联合细胞因子及贯续细胞因子的应用.目的:观察改良诱导方案诱导SD大鼠脂肪源性干细胞定向分化为软骨细胞的能力.设计、时间及地点;观察性实验,于2008-06/12在遵义医学院珠海校区中心实验室完成.I材料:SPF级健康SD大鼠5只,鼠龄18～22 d,体质量约25g,用于脂肪干细胞的培养基扩增.方法:在无菌条件下从SD大鼠腹股沟区取皮下脂肪组织约3 g,Ⅰ型胶原酶消化后,1 000 r/min离心10 min,待细胞长满瓶底80%时用2.5 g/L胰蛋白酶消化,按1:2或1:3比例传代培养.加入软骨诱导培养基14 d后阿新蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测脂肪干细胞向软骨细胞的诱导分化.主要观察指标:流式细胞仪检测大鼠脂肪干细胞表面CD44、CD45和CD49d的表达.结果:SD大鼠脂肪组织分离培养出的细胞经流式细胞仪检测CD44、CD49d表达阳性,CD45表达阴性.加入软骨诱导培养基定向诱导72 h后,细胞生长缓慢,逐渐变成圆形,并渐渐有软骨结节形成;诱导分化2周后,阿新蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性.结论:SD大鼠脂肪组织能够分离培养出脂肪干细胞,生物学特性与骨髓间充质干细胞相似,能向软骨细胞分化.
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犬脐血干细胞肌源性诱导分化移植对细胞间连接的影响
背景:脐血间充质干细胞诱导分化为心肌细胞后移植入心肌缺血组织,可以通过与宿主细胞建立联系来修复取代缺血心肌组织.目的:对犬脐血干细胞进行肌源性诱导,观察其植入后与宿主细胞间的连接情况.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-07/2007-10在上海交通大学医学院附属新华医院动物实验中心完成.材料:接近足月的妊娠杂种犬2只,用于分离培养脐血间充质干细胞.成年杂种犬36只,随机数字表法分为细胞移植组、模型对照组,18只/组.方法:取传至第4代的犬脐血间充质干细胞,加入含lacZ基因的重组腺相关病毒载体进行基因转染,继续培养3 d后,行10 μmol/L5-氮杂胞苷肌源性诱导,常规培养3周.两组犬均建立心肌梗死模型,造模后细胞移植组经冠状动脉和局部注射将2 mL细胞悬液(约107个脐血间充质干细胞)移植到梗死区,模型对照组同法注射等量生理盐水.分别于移植后2,4,8周取材制备心肌组织切片,免疫组化检测细胞间连接情况.主要观察指标:脐血间充质干细胞的基因转染、肌源性诱导分化情况,移植细胞与宿主心肌细胞的细胞间连接情况.结果:转染72 h后大部分细胞表达LacZ基因,并合成半乳糖苷酶,X-gal染色呈蓝色.5-aza诱导3周后,脐血干细胞α-Actin(+),Desmin(+),Connexin43(+),而诱导前均呈阴性.移植后第8周,心肌切片中移植细胞和宿主心肌相连处可形成连接,连接处可见cadherin和connexin43绿色荧光阳性表达;模型对照组仅表达cadherin和connexin43,未见带红色荧光的移植细胞.结论:脐血间充质干细胞可在体外诱导为心肌样细胞,移植后能与宿主心肌可能形成有效连接,从而具有通讯联系.
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胚胎肝干细胞癌变实验
背景:目前针对肝癌是起源于成熟肝细胞的去分化还是肝干细胞的成熟受阻这一问题仍存在争议.目的:观察胚胎肝干细胞癌变的可能性.设计、时间和地点:随机对照动物实验,于2006-01/12在中山大学动物实验中心完成.材料:6～8周龄BALB/c雌性小鼠70只,体质量20～25 g,随机分为3组:空白对照组10只、模型组30只、实验组30只.另取孕14 d胎鼠用于制备胚胎肝细胞.方法:3组小鼠麻醉后均行2/3肝切除.模型组诱导肝癌,在饮水中加入100 μg/L二乙基亚硝胺,连续饮用12周.实验组在诱导肝癌的基础上行肝干细胞移植,即分离的胚胎肝细胞经肠系膜静脉注射到肝脏,每只小鼠移植1×106个细胞.空白对照组仅行肝干细胞移植,同时饮正常水.6个月后处死小鼠,制备肝脏标本,取肝癌结节做连续切片进行指标检测.主要观察指标:采用免疫组化或免疫荧光方法检测Y染色体性别决定区域蛋白、甲胎蛋白、胎盘型谷胱苷肽转移酶或细胞角蛋白19的表达,以分析肝癌的细胞来源和特征.结果:6个月后,实验组有8只小鼠成功诱癌,其中7只为肝细胞性肝癌,1只为胆管细胞性肝癌;模型组有7只小鼠成功诱癌,其中6只为肝细胞性肝癌,1只为胆管细胞性肝癌;两组诱癌率、肿瘤病理类型比较均无明显差异(P>0.05).实验组17.1%的肝细胞癌结节Y染色体性别决定区域蛋白染色阳性,胆管细胞癌结节Y染色体性别决定区域蛋白染色均为阴性.肝细胞癌结节表达甲胎蛋白和谷胱苷肽转移酶,而不表达细胞角蛋白19;胆管细胞癌结节不表达甲胎蛋白和谷胱苷肽转移酶,而表达角蛋白19.结论:在诱导肝癌过程中移植的肝干细胞有癌变的潜能,并保持了胚胎肝干细胞未成熟的特征,仍表达谷胱苷肽转移酶和甲胎蛋白.
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自体骨髓干细胞移植治疗脊髓损伤420例
目的:总结分析骨髓干细胞移植治疗脊髓损伤的效果.方法:2003 09/2008 04解放军第四六三医院神经外科细胞治疗康复中心行干细胞移植的脊髓损伤患者420例,按病情分为2组:完全性脊髓损伤组42例,不完全性脊髓损伤组378例,两组患者在性别、年龄、受伤时间、损伤部位、损伤原因等方面比较差异无显著性意义(P>0.05).两组首先通过手术或立体定向的方法把干细胞直接移植在脊髓损伤部位,然后再根据患者病情经腰穿途径或经静脉途径移植,每次移植间隔为1周,干细胞移植量为(2～3)个×102/kg.移植过程中为促进干细胞的生长和分化,根据患者病情及身体状况给予相应的康复功能锻炼.结果:与入院时比较,骨髓干细胞移植1,3,12个月后,不完全性脊髓损伤患者针刺觉评分、轻触觉评分、运动评分均有明显改善(P<0.05或0.01),完全性脊髓损伤患者针刺觉评分、轻触觉评分、运动评分均无明显变化(P>0.05),两组残损分级均无明显改善(P>0.05).结论:骨髓干细胞移植治疗脊髓损伤有效可行.
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不同种类超顺磁性氧化铁标记猪骨髓间充质干细胞的体外MR成像
背景:干细胞磁性标记是新近开展的一项干细胞体外标记技术,结合MR成像设备可以活体监控移植入体内的干细胞.目的:明确超顺磁性氧化铁粒子体外标记猪骨髓间充质干细胞的方法、不同种类超顺磁性氧化铁标记细胞经MR成像的特征及可成像的低标记细胞量.设计、时间及地点:对比观察,于2006-09/2007-03在苏州大学医学部心血管外科实验室及苏州大学附属第一医院影像中心完成.材料:猪髂骨骨髓由太湖梅山猪新鲜采集:超顺磁性氧化铁纳米颗粒为德国Schering公司产品;超微型超顺磁性氧化铁纳米颗粒由苏州大学化学与化工学院提供:铁颗粒晶核表面包被葡聚糖,3种超微型超顺磁性氧化铁包被葡聚糖后根据颗粒大小(12,15,20 nm)分别依次简称为1#,2#,3#.方法:分离、纯化、培养猪骨髓间充质干细胞,体外进行不同种类超顺磁性氧化铁标记,染色及荧光显微镜观察;测量并绘制未标记细胞和标记细胞的MTT生长曲线;选取不同的细胞量组(Feridex标记细胞分别选取1×106、5×105及1×105L-1量组,未标记细胞选取5×105L-1量组,1#、2#及3#超微型超顺磁性氧化铁标记细胞均选取5×105L-1量组)进行标记后MR成像,测量不同扫描序列标记细胞管的信号强度改变,并进行统计学分析.主要观察指标:超顺磁性氧化铁标记干细胞的普鲁士蓝染色检测标记率:标记干细胞的MTT生长曲线;双染色法检测细胞凋亡;不同Ependoff管内细胞团T1WI、T2WI和FFE图像的信号强度.结果:应用多聚赖氨酸介导干细胞磁标记方法标记骨髓间充质干细胞有效率为100%,普鲁士蓝染色见细胞浆内有多少不等的蓝染铁颗粒;超顺磁性氧化铁标记的间充质干细胞在T2WI尤其是FFE(T2WI)序列信号明显降低;在25 mg/L Fe培养液标记浓度下,MR成像的低细胞量为1×105;在不同种类超顺磁性氧化铁标记下,2#、3#USPIO与Feridex在T2WI及T2*WI上有显著性差异(P<0.01);而1#USPIO与Feridex在T2WI及T2WI上差异无显著性意义(P>0.05):Feridex标记间充质干细胞在T2WI及T2WI上与T1WI相比,差异均有显著性意义(P<0.01).结论:超顺磁性氧化铁可以简便标记间充质干细胞并且在适当浓度下对间充质干细胞的生物学活性没有影响,MR T2WI和T2*WI序列可敏感显像磁性标记的干细胞.
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PKH26荧光标记大鼠内皮祖细胞在慢性损伤肝内迁移示踪
背景:课题组早期研究发现门静脉回输内皮祖细胞可以改善肝纤维化,但是将其应用于临床尚有很多问题需要解决,如回输路径、细胞的分布情况等.目的:探讨PKH26荧光标记的大鼠内皮祖细胞在慢性肝损伤肝内迁移过程中的示踪.设计、时间及地点:细胞学体内实验,于2008-08/2009-02在北京大学人民医院肝病研究所完成.材料:SPF级健康成年SD大鼠100只,由解放军军事医学科学院动物中心提供.红色荧光染料PKH26为SIGMA公司产品.方法:取16只大鼠,贴壁法分离培养内皮祖细胞,并行PKH26体外标记.实验设立3组:正常对照组4只大鼠,不进行任何干预;二甲基亚硝胺组40只大鼠,通过腹腔注射二甲基亚硝胺10 mg/kg建立肝纤维化模型:四氯化碳组40只大鼠,通过四氯化碳/橄榄油灌胃建立肝纤维化模型.造模后,二甲基亚硝胺组、四氯化碳组大鼠经尾静脉注入1 mL PKH26标记的内皮祖细胞悬液(1×106个细胞).主要观察指标:PKH26标记率和细胞存活率,通过荧光共聚焦显微镜观察大鼠损伤肝内内皮祖细胞的迁移及CD31的表达.结果:流式细胞仪检测结果显示PKH26标记的内皮祖细胞阳性率为99%,荧光显微观察发现锥虫蓝染色后PKH26标记细胞存活率均>90%.输注1 d后,两种慢性肝损伤模型中的肝内均可见PKH26标记阳性的细胞出现在肝小叶内,并且随时间延长阳性细胞数增加.PKH26标记阳性的细胞主要存在于沿纤维分布的血管内皮和肝小叶内的窦内皮,且血管内皮可见CD31/PK26双阳性细胞.结论:PKH26可以在体外成功标记大鼠内皮祖细胞,并在损伤肝内示踪.
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非血缘及HLA配型不合移植预防急性移植物抗宿主病13例
目的:探讨非血缘及人类白细胞抗原配型不合的异基因外周血造血干细胞移植时,环孢素A、麦考酚酸酯、抗胸腺细胞球蛋白、白细胞介素11及短程甲氨蝶呤联合预防急性移植物抗宿主病的疗效.方法:2004 09/2008-11海口市人民医院采用环孢素A等五联用药预防非血缘及血缘HLA配型不合异基因外周血造血干细胞移植患者13例.供受者HLA相合情况:非血缘供者7例,单倍型移植3例,人类白细胞抗原1个位点不合同胞供者3例.具体预处理方案为移植前7d开始,环孢素A5-10mg/(kg·d),12 h静滴1次,2次/d,无呕吐后改为口服维持:移植前7 d开始,麦考酚酸酯1次/d;移植前5 d～移植前2 d予抗胸腺细胞球蛋白2.5 mg/(kg·d);移植前2 d～移植后10 d予白细胞介素11,1.5 mg/d皮下注射;移植后1 d予甲氨蝶呤15 mg/m2,移植后3,6,11 d各予甲氨蝶呤10 mg/m2静脉滴注.临床若无移植物抗宿主病出现,3～6个月逐渐减量至停药,单倍型移植者适当延长.移植前3 d,供者行重组人粒细胞集落刺激因子皮下注射,于用药第4,5天采集外周血干细胞,并分别于当天由锁骨下静脉输入患者体内,回输单个核细胞数为(7.82～9.1 1)×108/kg,CD34+细胞数为(2.9～7.7)×106/kg.结果:13例患者均获得造血重建,急性移植物抗宿主病的发生率为46%(6/13),Ⅲ～Ⅳ度急性移植物抗宿主病发生率为8%(1/13).随访至2009-04,除1例患者尚未能到公共场所外,余12例目前均正常生活或工作.结论:环孢素A、麦考酚酸酯、抗胸腺细胞球蛋白、白细胞介素11及短程甲氨蝶呤联合预防急性移植物抗宿主病可获得较好的疗效.
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以α6-integrin和c-kit为特异性表面标志分离筛选小鼠精原干细胞的可行性
背景:从目前文献报道来看,精原干细胞分离效率较高且较为公认的方法是通过隐睾模型结合表面标志进行多参数筛选.目的:探讨06-integrin和c-kil作为分离筛选精原干细胞特异性表面标志的可行性.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-05/12在武汉大学人民医院完成.材料:6周龄雄性昆明白小鼠40只,随机分为隐睾组、正常对照组,20只/组.方法:隐睾组小鼠建立隐睾模型,麻醉后腹部正中切口,将两侧睾丸拉入腹腔,将脂肪垫靠近附睾处各缝一针,分别固定在侧腹壁.正常对照组小鼠不进行任何干预.造模后两三个月,采用传统的两步消化法获取生精上皮单细胞悬液,加入FITC标记的抗α6-integrin抗体和PE标记的抗c-kit抗体,利用流式细胞仪进行α6-integrin+和c-kit双重筛选,锥虫蓝染色监测细胞活性.主要观察指标:隐睾的形态学变化,精原干细胞分选结果.结果:隐睾小鼠的生精小管内细胞排列紊乱,层次及管腔消失,小管中央可见分裂相细胞,细胞数明显减少.与正常对照组比较,隐睾组side scatter(low)、Forward scatter(hi)区的睾丸细胞增多,图形向左上移位.α6-integrin+和c-kit-细胞分布存在明显的相互偏离,即α6-integrin+细胞绝大多数不是精原干细胞,c-kit-细胞绝大多数也不是精原干细胞.从隐睾组筛选出具有sidescatter(low)、α6-integrin+、c-kit-特征的细胞数占睾丸细胞总数的2.8%,此即为精原干细胞,锥虫蓝监测结果显示细胞活性达95%以上.结论:采用α6-integrin和c-kit这两种表面标志进行精原干细胞的筛选,尽管可以提高细胞悬液中的精原干细胞纯度,但均缺乏特异性.
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骨髓和脐血间充质干细胞联合移植治疗杜氏型肌营养不良
背景:杜氏型肌营养不良的肌细胞损伤并非单一细胞受损,而是多因素缺陷导致肌细胞进行性萎缩的严重后果,患儿一经确诊即被告之无法医治.近年来国内外学者把目光转向具有修复和再生功能的干细胞,研究发现干细胞技术可以改善肌营养不良的运动功能.目的:首次采用骨髓和脐血间充质干细胞联合移植方法,首次采用静脉注射和局部2种治疗途径,观察治疗杜氏型肌营养不良患者的安全性和有效性.设计:自身前后对照.对象:2007-06/2008-09解放军第四六三医院细胞治疗中心应用骨髓和脐血间充质干细胞联合移植方案治疗杜氏型肌营养不良患者31例,男29例,女2例(双胞胎),平均年龄9.7岁,平均病程5.1年,阳性家族史11例,均经临床症状、酶学、肌电图、基因分析、肌肉活检、肌肉核磁共振检查确诊.方法:经双侧髂后上棘抽取患者自体骨髓80～150 mL,采用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞,并诱导分化为骨髓间充质干细胞,调整细胞悬液浓度为1×1010L-1,采用多点注射法移植于患者四肢肌肉内,移植细胞数为(1.5-6.0)x10.个.选择健康足月产妇脐带血80-145 mL,同法制备脐血间充质干细胞,经静脉植入(1.0～4.8)×107个细胞,1次/周,共3次.主要观察指标:干细胞移植前后患者日常生活活动能力评价,临床分级评价,以及酶学、肌电图、肌肉MRI变化.结果:31例患者均完成15个月随访,中途无脱落.与移植前比较,干细胞移植后3,6,9,12,15个月,26例(84.7%)动作灵活度增强,运动功能改善,日常生活活动能力评分升高(P<0.05);干细胞移植后6个月,血清肌酸肌酶、乳酸脱氢酶水平降低11例,升高8例;5例复查肌电图,波幅改善2例;5例复查MRI,肌肉轮廓较前清晰2例.临床分级评定显效12例(38.7%),有效14例(45.2%),无效5例(16.1%),总有效率为83.9%,未发生不良反应及并发症.结论:骨髓和脐血间充质干细胞联合移植治疗杜氏型肌营养不良可使83.9%患者获得临床症状改善,运动功能及肌力提高,6个月后部分患者血清酶学、肌电图及肌肉MRI轻度改善,安全性好,无排斥反应,是一种治疗杜氏型肌营养不良的新手段.
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嗅鞘细胞移植治疗中枢神经系统疾病的基础研究
中枢神经系统疾病可以导致人们的神经功能缺损.同时,损伤区出现轴突受损,形成胶质瘢痕、空腔和裂隙.嗅鞘细胞作为自体移植佳的候选细胞,它可以分泌神经营养因子等起到不同程度地神经保护作用,刺激血管再生,促进未受损和受损害轴突的生长.嗅鞘细胞还可以改变损伤后内源性神经胶质的应答情况,并且在受到一定程度的脱髓鞘损害时能够将轴突再髓鞘化.近几年来,嗅鞘细胞移植逐渐成为了一种临床治疗手段应用于人类的中枢神经系统疾病.因此,嗅鞘细胞移植可以成为由细胞介导的神经修复策略,治疗许多中枢神经系统疾病.文章通过该研究领域大量的实验结果来阐述嗅鞘细胞移植治疗中枢神经系统疾病基础研究目前的情况.
