中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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骨髓间充质干细胞分泌基质细胞衍生因子1对异体T淋巴细胞和白血病细胞HL-60增殖的影响
背景:骨髓间充质干细胞持续分泌的基质细胞衍生因子1与其受体CXCR4的相瓦作用,不仅在细胞的炎症反应、造血干细胞的迁移与归巢等生物学过程中发挥作用,还在肿瘤的发生、转移、复发、免疫耐受及血管新生过程中扮演重要角色.目的:探讨骨髓间充质干细胞分泌的基质细胞衍生因子1对T淋巴细胞及白血病细胞HL-60增殖的影响.设计:细胞学体外对照观察.材料:骨髓标本来自本院血液科异基因骨髓移植供者及骨髓象正常的非白血病患者,T淋巴细胞来源于健康志愿者,急性髓性白血病细胞株HL-60为本实验室液氮冷冻保存,CXCR4单克隆抗体12G5为eBioscience公司产品.方法:应用Ficoll密度梯度离心法分离骨髓洲充质干细胞,传至第3代后收集培养5 d的细胞上清,离心去沉淀后备用.应用尼龙棉柱法分离异体外周血T淋巴细胞,调整细胞密度为2×10<'9>L<'-1>备用.T淋巴细胞与骨髓间充质干细胞的共培养实验设立3组:T淋巴细胞组、T淋巴细胞+细胞上清组、T淋巴细胞+细胞上清+单抗组.HL.60细胞与骨髓间充质干细胞的共培养实验设立3组:HL-60细胞组、HL-60细胞+细胞上清组、HL-60细胞+细胞上清+单抗组.主要观察指标:MTT法检测T淋巴细胞及HL-60细胞在应用单克降抗体12G5前后的增殖情况.结果:与T淋巴细胞组比较,T淋巴细胞+细胞上清组、T淋巴细胞+细胞上清+单抗组的吸光度值均明显降低(P<0.05),后两组间比较差异无显著性意义(P>0.05).与HL-60细胞组比较,HL-60细胞+细胞上清组吸光度值明显升高(P<0.05);与HL-60细胞+细胞上清组比较,HL-60细胞+细胞上清+单抗组的吸光度值明显降低(P<0.05).结论:加入单克隆抗体12G5阻断基质细胞衍生因子 1的生物学效应后,不影响骨髓间充质干细胞上清液抑制T淋巴细胞增殖的效果,但可以抑制白血病细胞HL-60的增殖.
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兔骨髓基质细胞的体外培养及鉴定
背景:骨髓基质细胞的分离纯化、细胞培养、细胞标记、诱导因子、基因转染对细胞生物学影响、细胞载体构建及细胞复合物回植时间的选择等尚处于实验研究阶段.目的:摸索一种较为简便且可有效获得骨髓基质细胞的体外培养方法.设计、时间及地点:细胞学体外实验.于2006-06/2007-01在中国科学院北京基因组研究所完成.材料:SPF级6周龄新西兰大白兔8只,由中国科学院遗传发育研究所实验动物中心提供.方法:无菌条件下抽取兔骨髓1 mL,D-Hanks液稀释后,离心弃上清,DMEM培养基重悬,制备单细胞悬液,叠加在密度为1.077的等体积淋巴细胞分离液的液面上,离心后取界面云雾状的单个核细胞层,用含有20%胎牛血清的DMEM培养基重悬.以1×10/cm2接种后贴壁法纯化细胞,待70%～80%长满单层后消化传代.主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞生长情况,锥虫蓝染色计数活细胞,苏木精.伊红染色对细胞进行鉴定,MTT法检测细胞活性,观察传代培养的细胞冻存后复苏情况.结果:接种24h后细胞开始贴壁,呈短梭形或三角形,且有长短不等的细胞突起;3 d后贴壁细胞开始分裂增殖,部分区域形成细胞团簇:1周后大部分细胞呈成纤维状散落在培养瓶底生长:传代后细胞均匀分布,形态呈细长梭形,并沿一定方向排列,1 mL骨髓基质细胞悬液传3代后的贴擘细胞数可达5×106～1 × 107数量级.骨髓基质细胞成活率约为90%,经鉴定为单核细胞,接种后1～6d细胞持续旺盛生长,至第8天细胞活性高,随后生长活性下降.复苏冻存56 d的细胞,其生长良好,增长迅速.结论:以淋巴细胞分离液梯度离心后可获得纯度较高的骨髓基质单核细胞,经体外扩增培养能够得到足够数量的种子细胞,冻存复苏后细胞活性无变化.
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骨髓间充质干细胞不同移植途径治疗大鼠脊髓损伤的比较
背景:在适当的生长环境下,中枢神经系统内的一些受损的神经元轴突有少许再生,并能与靶细胞形成功能性的突触联系.目的:比较局部注射和尾静脉注射途径移植骨髓间充质干细胞对大鼠脊髓损伤神经功能恢复的作用.设计、时间及地点:细胞组织学对照观察,于2007-03/2008-04在承德医学院完成.材料:健康成年雄性SD大鼠40只,由解放军军事医学科学院动物中心(北京)提供.方法:取4只大鼠,采用密度梯度离心法和贴壁法体外分离培养骨髓间充质十细胞.传至第2代于临用前24 h行BrdU标记.余36只大鼠均建立T12脊髓损伤模型,1周后随机分为3组,局部注射组于损伤部位上下位点注射1×106个骨髓间充质干细胞至损伤大鼠体内;尾静脉注射组通过尾静脉移植等量骨髓间充质干细胞至损伤大鼠体内;模型对照组不行细胞移植.主要观察指标:神经功能缺损BBB评分,苏木精.伊红染色病理学检测,细胞分化免疫组化染色结果.结果:细胞移植后2,4,6周,模型对照组神经功能缺损BBB评分均显著低于局部注射组、尾静脉注射组(F=721.373,F=1 114.450,F=1 004.099,P均(0.01);局部注射组神经功能缺损BBB评分均显著高于尾静脉注射组(t=55.261,t=71.385,t=78.135,P均<0.01).苏木精-伊红染色结果显示,模型对照组损伤脊髓组织有较多空腔,横断处形成大量空泡;局部注射组无明显空腔,空泡小而少,间质水肿较轻.移植后4,6周,部分植入的骨髓间充质干细胞呈微管相关蛋白2及胶质纤维酸性蛋白双阳性表达.结论:局部注射和尾静脉注射两种途径移植的骨髓问充质干细胞均可在脊髓损伤处存活、分化并改善神经功能,且局部注射的效果优于尾静脉注射.
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肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对骨髓基质细胞的毒性作用
背景:已证实肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumot necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)能选择性诱导白血病细胞凋亡,并且不影响正常造血干/祖细胞的功能.但TRAIL对作为造血微环境核心的骨髓基质细胞的毒性作用如何,据作者查新检索目前尚未见系统报道.目的:通过观察TRAIL对骨髓基质细胞的凋亡诱导效应及其造血支持功能的影响,继而评价TRAIL对骨髓基质细胞的毒性作用.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2006-03/10在解放军沈阳军区总医院中心实验室完成.材料:血常规、骨髓涂片细胞检查正常的骨髓标本11份,取自解放军沈阳军区总医院血液科.化疗药物柔红霉素为浙江海正药业股份有限公司产品,国药准字H33020925.方法:Percoll+贴壁法体外分离培养骨髓基质细胞,达80%融合时胰蛋白酶消化扩增,取处于对数生长期的细胞,分为4组.空白对照组不进行任何干预,柔红霉素组加入0.5 μmol/L柔红霉素作用24 h,TRAIL组加入200 μg/L TRAIL作用18h.联合组加入0.5 μ mot,/L柔红霉素作用6 h后再以200 μ g/L TRAIL作用18 h.取第2代骨髓基质细胞,60Co射线照射消除内源性造血集落,接种后去除悬浮细胞,TRAIL组以200 μg/L TRAIL作用基质细胞层18 h,按1×105/孔将骨髓单个核细胞核种于基质细胞层,扩增5 d后加入甲蕈纤维素培养体系,于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度条件下培养10d.主要观察指标:荧光显微镜观察诱骗受体在骨髓基质细胞的表达及定位,流式细胞仪检测柔红霉素对骨髓基质细胞诱骗受体表达的影响,AnnexinV/PI标记TRAIL对骨髓基质细胞的凋亡诱导作用及对其造血支持功能的影响.结果:诱骗受体DcR1和DcR2在骨髓基质细胞中均有表达,主要定位于胞膜及胞浆.0.5 μ mol/L柔红霉素作用24 h后,基本不影响诱骗受体DcR1和DcR2的表达水平.与空白对照组细胞凋亡率比较,TRAIL组无明显变化(t=0.973,P>0.05);柔红霉素组、联合组均显著升高(t=5.141,P=0.001;r=4.187,P=0.002),此两组间比较差异无显著性意义(t=1.222,P>0.05).与空白对照组比较,TRAIL组骨髓单个核细胞数、粒-巨噬集落形成单位均无明显变化(t=1.313,P>0.05:t=1.172.P>0.05)结论:TRAIL的诱骗受体DcR1及DcR2在骨髓基质细胞均有表达,使骨髓基质细胞免于TRAIL的凋亡诱导效应,且TRAIL不增强柔红霉素对骨髓基质细胞的细胞毒性作用.
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体外早期培养免脂肪源性间充质细胞的增殖能力
背景:新研究表明人脂肪源性间充质细胞的表面标志分子及分化能力会随着培养时间的延长而有所改变.目的:观察体外早期培养的兔脂肪源性间充质细胞形态学特点及集落形成能力.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/03在复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科研究所和中心实验室完成.材料:3月龄雌性新西兰大白兔9只,由上海市银根养兔室提供.方法:兔麻醉后取颈背处的皮下脂肪,Ⅰ型胶原酶消化法获得原代细胞,接种至含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养液中,细胞达80%融合时传代,取第2,3,4代细胞用于实验.主要观察指标:倒置显微镜观察细胞形态,流式细胞仪分析细胞表型,计数细胞集落形成率.结果:第2,3,4代兔脂肪源性问充质细胞均争成纤维细胞样生长,体外生长迅速,CD29及PCNA均呈阳性表达,集落形成率分别为(8.0±0.6)%. (6.7±0.4)%. (4.6±0.5)%,经方差分析差异有显著性意义(F=12.18,P<0.05).结论:体外早期培养的兔脂肪源性间充质细胞生长增殖旺盛,集落形成能力随着传代次数增加呈显著下降趋势.
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地中海贫血患者找到人类白细胞抗原A-B-DR单倍型及抗原全相合供者的可能性
背景:选择适合的人类白细胞抗原匹配供者是实施造血干细胞移植治疗的关键,不同人种、地区和疾病人群的人类白细胞抗原与单倍型频率分布是评估地中海贫血患者选择适合供者的重要遗传学依据.目的:分析地中海贫血患者人类白细胞抗原A-B-DRB1单倍型和表型频率分布格局,估算其与骨髓库相合供者相配的概率.设计:病例-对照分析.对象:患者组为2000-06/2006-12广东地市级以上13家医院诊断为地中海贫血的108例患者,广东籍,彼此无血缘关系.正常对照组为2000-08/2006-12中华骨髓库招募的5 352名广东籍健康供者,与患者无血缘关系.方法:应用大似然性算法计算两组人炎白细胞抗原A,B,DRB1单倍型及表型频率分布.根据人类白细胞抗原单倍型遗传特征,某一个体人类白细胞抗原A,B,DRB1表型频率等于相应的基因型频率之和.在由n个供者组成的供者群体找到至少1例与忠者表型全相同供者的概率P,应用公式P=1-(1-Df)"计算,Df为供者表型频率.结果:患者组和对照组常见单倍型和表型频率分布格局不同.正常对照组常见的学倍型为A2-B46-DR9,A33-B58-DR17,A11-B75-DR12,A11-B13-DR15和A33-B47-DR13;患者组常见的单倍型为A2-B46-DR9,A33-B58-DR17,A2-B46-DR14,A11-B60-DR12和A11-B75-DR12.正常对照组常见的表型频率分布情况为A2,33;B46,58;DR9,17,A2,Il:1346, 75:DR9,12,A11,33;B58,75;DR12,17,A2,2;B46,46;DR 9,9和A2,11;B13,46:DR9,15:患者组常见的表型为A2,33;1346,58;DR9,17,A2,2; B46,46;DR9,9,A2,2;B46,46;DR9,14,A2,11:B46,60:DR9,12和A2,11:B46,75:DR9,15.两组之间相匹配的表型有19种,表型匹配概率为0.44%(19/4282).人炎白细胞抗原A24-B51-DR8,A3-B38-DR7,A24-B50-DR12, A3-B38-DR4,A24-B51-DR8和A24一B60-DR7等34条单倍型及A2,33;B46,58;DR9,17,A2,2;B46,46;DR9,9和A2,11;B46,75;DR9,15等67种表型,其频率在正常对照组有不同程度的降低,携带有这些甲倍型或表犁患者找到人类白细胞抗原单倍型相合或全相合供者的概率降低.结论:地中海贫血忠者人炎白细胞抗原A-B-DR单倍型频率分布呈高度遗传多态性,患者找到人类白细胞抗原全相合供者的概率取决于供者群体人类白细胞抗原表型频率.
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黄芪和三七对下肢缺血患者骨髓间充质干细胞体外分化的影响
背景:目前临床观察已经证实中药黄芪、三七能够改善下肢缺血症状,假设这种治疗作用与其促进骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化有关.目的:验证黄芪、三七是否能够有效促进骨髓间充质干细胞增殖并向血管内皮细胞分化.设计、时间及地点:骨髓间充质干细胞的体外分化实验,于2005-04/06在北京中医药大学附属东直门医院教育部重点实验室完成.材料:抽取北京中医药大学东直门医院收治的下肢血管缺血性病变患者23例骨髓血,密度梯度法分离骨髓单个核细胞,即骨髓间充质干细胞.相当于生药材2 g/mL的黄芪注射液为成都地奥九泓制药厂产品,主要成分为三七总皂苷的血塞通粉针剂黑龙江珍宝岛制药有限公司产品,CD34抗体为美国BD公司产品,FACS Calibur流式细胞仪为美国BD公司产品.方法:将骨髓间充质干细胞与3 mL低、中、高剂量含生药4,12,36 g/L的黄芪注射液,3 mL低、中、高剂量含三七总皂苷50,100,200 mg/L血塞通混悬液进行共培养,并设未加入药物的单纯培养干细胞为空白对照组:隔日换液一次.连续培养3周.主要观察指标:培养3周后,倒置相差显微镜下观察细胞形态;流式细胞仪检测CD34+细胞百分比.结果:①骨髓间充质干细胞培养3周后贴壁细胞大部分里梭形,束状排列,具有内皮细胞形态和特性.②与空白对照组比较,黄芪低、中剂量组和三七中、高剂量组CD34+细胞百分比显著增加(P<0.05～0.01).结论:黄芪、三七有促进骨髓间充质千细胞增殖并向血管内皮细胞分化的作用,此作用呈剂量依赖性.
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甲磺酸伊马替尼与亲缘异基因造血干细胞移植治疗慢性期慢性粒细胞白血病的有效性及安全性差异
背景:异基因造血干细胞移植足目前公认的惟一可以治愈慢件粒细胞白血病的方法,但存在供体来源少,移植相关并发症较多等问题.甲磺酸伊码替尼作为近年来人工合成的基因产物靶向药物的代表,被越来越多地运用于Ph染色体阳性慢性粒细胞白血病患者的治疗中.目的:与亲缘异基因造血干细胞移植的历史资料对照,评价酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼治疗慢性粒细胞白血病的有效性及安全性.设计、时间及地点:非随机化同系对照,于2002-04/2006-10在华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所完成.对象:选择华中科技大学同济医学院附属协和医院收治的慢性期慢性粒细胞白血病患者90例,所有患者在治疗前均经骨髓细胞学、细胞遗传学和,或分子遗传学检查确诊.方法:将90例慢性粒细胞白血病慢性期患者根据治疗方案分为两组.甲磺酸伊马替尼组67例,2002-04/2006-06陆续开始应用甲磺酸伊马替尼,观察截止时间为2006-10.口服甲磺酸伊马替尼400 mg/d,每周复查血常规,每3个月进行骨髓象及细胞遗传学检查,根据血象和骨髓象渊整剂量.亲缘异基因造血干细胞移植组23例,于1999-93/2006-04收治,均采用经典或改良白消安联合环磷酰胺方案预处理,短程甲氨蝶呤联合环孢素A方案预防移植物抗宿主病.主要观察指标:细胞遗传学反应以及两组患者的2年生存情况.结果:观察截止时,甲磺酸伊马替尼组患者的细胞遗传学完伞缓解率显著低于亲缘片基因造血干细胞移植组(60%,100%,P<0.01).亲缘异基因造血干细胞移植组和甲磺酸伊马替尼组患者的2年生存率分别为83.33%和77.03%,差异无显著件意义(P>0.05).甲磺酸伊马替尼组治疗期间没有患者因药物副作用而停药、死亡,4例(5.97%)发牛Ⅲ/Ⅳ级白细胞和/或血小板减少.亲缘异基凶造血干细胞移植组中7例患者(30.4%)发生Ⅱ～Ⅳ度急性移植物抗宿主病,4例治疗无效死亡.结论:与亲缘片基因造血干细胞移植相比,甲磺酸伊屿替尼治疗慢性粒细胞白血病患者2年生存率无差别,治疗相关并发症较少,但获得细胞遗传学完伞缓解率较低.
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体外扩增法分离培养兔骨髓来源的血管内皮祖细胞
背景:体外扩增法培养血管内皮祖细胞操作简便、费用低廉是实验中获取内皮祖细胞的主要方法.目的:拟从兔的骨髓中通过体外扩增法分离培养出血管内皮祖细胞,为进一步观察自体血管内皮祖细胞移植促进血管内皮的修复提供细胞学基础.设计、时间及地点:开放性实验,于2005-03/2006-02在解放军第二军医大学长征医院内科实验室完成.材料:6～8月龄新西兰大白兔8只,雌雄不拘,体质量(2.55±0.5)kg,抽取骨髓,密度离心法分离骨髓单个核细胞方法:将骨髓单个核细胞接种于密度为l×106 cm2,加入含有血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的M199培养基中体外扩增培养7 d,通过DiL标记的乙酰化低密度脂蛋白和FTTrC标记的凝集素BS-1双染法鉴定血管内皮祖细胞,显示红色荧光的为吞噬了乙酰化低密度脂蛋白的细胞,绿色荧光为结合BS-1的细胞,双染色为橙色荧光.免疫荧光染色及流式细胞仪检测CD133,CD34,FIk-1的表达.主要观察指标:①细胞形态观察.②血管内皮祖细胞的增殖能力.③乙酰化低密度脂蛋白和凝集素BS-1双染法鉴定血管内皮祖细胞结果.④血管内皮祖细胞免疫组织化学鉴定结果.⑤血管内皮祖细胞表面标志物流式细胞仪检测结果.结果:①细胞形态观察:新分离的骨髓单个核细胞呈圆形,培养72 h后可见贴壁细胞呈集落样生长,细胞呈圆形或不规则形,核分裂相明显,至培养第7天成片生长的细胞集落相互连接,呈梭形的内皮样细胞.②血管内皮祖细胞的增殖能力:培养2～4 d血管内皮祖细胞增殖较快,之后增殖速度减缓,生长曲线里典型"S"形外观,培养第6,7天血管内皮祖细胞生长再次增快,吸光度值分别达到0.58±0.15和0.625±0.23.⑨在血管内皮祖细胞的胞质中,出现与乙酰化低密度脂蛋白结合的红色荧光聚集,阳性率达95%以上:与凝集素BS-1结合率几乎达100%;两者双染色率达90%以上.④血管内皮祖细胞免疫组织化学及流式细胞仪检测细胞表面标志物CD133,FIK-1.CD34均呈阳性.结论:体外扩增法成功地从兔骨髓中分离培养出具有血管内皮祖细胞特征的细胞群体.
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人脐血单个核细胞体外定向诱导向神经干细胞分化
背景:有文献报道应用不同的诱导剂如细胞生长因子和神经营养因子等,可将人脐血单个核细胞体外诱导为神经干细胞和,或成熟神经细胞,但诱导剂的使用方法以及剂量却备不相同.目的:联合应用不同的诱导剂将人脐血单个核细胞体外诱导分化为神经干细胞,并进行形态学观察和鉴定,以确定佳诱导剂组合及佳浓度.设计、时间及地点:观察对比实验,于2007-05/2008-09在辽宁省血液中心输血医学研究所细胞研究中心完成.材料:新鲜脐血来源于足月分娩的健康孕妇.方法:体外分离培养人脐血单个核细胞.在无血清DMEM/F12培养液中添加不同组合的诱导因子进行单个核细胞的诱导,以确定佳诱导因子组合:①10μ g/L神经生长因子(nerve growth factor,NGF)+体积分数为0.01神经营养因子N2+体积分数为0.02神经营养因子B27.⑦10μ g/LNGF+10μ g/L碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)+体积分数为0.01神经营养因子N2+体积分数为0.02神经营养因子B27.③10μ g/L bFGF+10μ g/L表皮生长因子(epidermal growthfactor,EGF)+体积分数为0.01神经营养冈子N2+体积分数为0.02神经营养因子B27.④10μ g/LbFGF+10μ g/L EGF.同时在无血清DMEM/F12培养液中添加不同浓度的bFGF和EGF进行单个核细胞的诱导,以确定佳诱导浓度:①5μ g/L bFGF+5 μg/LEGF组.②10 μg/LbFGF和10 μg/L EGF组.③20μg/L bFGF和20μg/LEGF组.主要观察指标:①倒置荧光显微镜下观察脐血单个核细胞及各诱导剂组诱导分化为神经丁细胞的形态特征.②免疫荧光检测10 μ g/L bFGF和10μg/L EGF组神经干细胞巢蛋白nestin的表达情况.③流式细胞仪检测10μg/L.bFGF和10μg/L EGF组诱导第7天和第15天的细胞nestin衷达情况.结果:①分离培养的脐血单个核细胞呈散在的圆形牛长.②至诱导第7天,分化细胞出现突触样结构和生长端样结构,并可见多个细胞之间形成网络,符合神经干细胞样形态特征.③不同的细胞因子组合诱导的神经干细胞增殖和分化情况不同,含NGF实验组细胞长势相对差,含bFGF和EGF实验组的细胞长势旺盛,胞体较大而圆,细胞突起也粗大,呈三角形或锥形,突触样结构和牛长端样结构明显可见,为佳诱导因子组合.④010μg/L bFGF+10μ g/L EGF组的细胞密度适中,伸出突起明显,神经细胞形态特异,培养周期短,为适实验浓度.⑤细胞免疫荧光检测10μg/L bFGF+10μ g/L,EGF?组诱导第7天细胞nestin阳性.⑥流式细胞仪分别检测对照组和10μg/L bFGF+10μg/L EGF组诱导第7天、第15天nestin阳性细胞数,差异均具有统计学意义(P<0.05).结论:联合应用 10μ g/L bFGF和10μ g/L EGF可较短时间内定向将人脐血单个核细胞体外诱导分化为神经干细胞.
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人脑胶质瘤中肿瘤干细胞的体外培养及生物学特性
背景:有研究者提出,脑内存在少量正常的神经干细胞能够向肿瘤组织迁移.这需要对从胶质瘤体外培养得到的肿瘤干细胞与正常的神经干细胞进行鉴别.目的:从人脑胶质瘤组织中分离脑胶质瘤干细胞进行体外培养,并对其干细胞特性加以鉴定,观察脑肿瘤干细胞的生长特性.设计、时间及地点:细胞学观察实验,于2007-02/12在解放军第四军医大学细胞工程研究中心完成.材料:7份肿瘤标本来源于胶质瘤患者,间变性星形细胞瘤标本3份,多形性胶质母细胞瘤标本4份.方法:将获取的胶质瘤细胞置于含2%B27、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、左旋谷胺酰氨、胰岛素、青霉素和链霉素生长因子的无血清DMEM/F12培养基中,重新悬浮为单细胞悬液,以1×108L-1接种于含有B27、表皮细胞生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基中培养分离培养肿瘤干细胞球.取第5代的肿瘤十细胞球,离心后除去原培养基,用含有体积分数为0.10胎牛血清的DMEM/F12培养基按种于放置有多聚赖氨酸包被盖玻片的小平皿中,观察肿瘤干细胞分化情况.主要观察指标:利用细胞免疫荧光及组织免疫组织化学法检测脑肿瘤干细胞在细胞培养或组织切片中CD133及巢蛋白表达.结果:在胶质瘤中存在一定量的细胞能在无血清培养基中存活并悬浮生长,并增殖形成克隆性脑肿瘤干细胞球,细胞核较大,核质比例高,具有肿瘤细胞的特性,与原肿瘤组织标本的苏木精-伊红染色比较,肿瘤干细胞分化后的子代细胞中大部分与胶质瘤细胞相似,原代及传代脑肿瘤干细胞表达神经干细胞的特异性标志物巢蛋白和CD133.结论:人脑胶质瘤中存在一定量的肿瘤干细胞,并能在体外将其分离培养,能够自我更新增殖、诱导分化,表达神经干细胞标志物CD133.
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肝细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞异体移植修复烧伤创面
背景:经携带人肝细胞生长因子的重组腺病毒(adenofiral vector mediated human hepatocyte growth factor,Ad-HGF)修饰的骨髓间充质干细胞创而移植后,可分化为"修复细胞",并能够在创面持续释放肝细胞牛长因子.目的:观察Ad-HGF基因转染的骨髓间充质干细胞异体移植埘大鼠烧伤创面愈合的影响.设计、时间及地点:随机对照动物观察,于2006-02/2007-03在解放军兰州军区兰州总医院临床实验科和烧伤整形科实验室完成.材料:Wistar大鼠40只,由解放军兰州军区兰州总医院动物实验科提供.Ad-HGF与携带绿色荧光蛋白的重组腺病毒(adenoviral vector mediated human hepatocyte growth factor,Ad-GFP)颗粒均由哈小琴博上惠赠.方法:取雄鼠10只,Percoll密度梯度离心法体外分离培养骨髓问充质干细胞,并行Ad-HGF转染.取雌鼠30只,随机分为未转染细胞组、Ad-HGF转染细胞组、Ad-GFP转染细胞组、Ad-HGF对照组、假伤组,6只/组.前4组人鼠复制背部深Ⅱ度烧伤模型,并分别干创丽真皮层下方多点注射对应的细胞悬液或病毒悬液1 mL;假伤组大鼠背部剃毛后浸入37℃温水12 s模拟烧伤,同法注射等量生理盐水.主要观察指标:对采集的创面标本行组织学观察和羟脯氨酸含测定,采用免疫组化分析创面肝细胞生长因子的表达.结果:苏小精伊红染色结果显示,Ad-HGF转染细胞组移值后7 d创而表皮化优于其他组,至21 d再牛表皮明显厚于其他组.并可见真皮钊脚下伸.胶原特殊染色结果显示,Ad-HGF转染细胞组移植后7,21 d创面中的胶原排列较其他组整齐.移植后7 d,Ad-HGF转染细胞组羟脯氦酸含量显著低于其他组(F=3.216,P<0.01).移植后21 d,Ad-HGF转染细胞组愈合创面中肝细胞生长因子的阳性表达位于真皮层.表达强度明显强干其他组.结论:Ad-HGF基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞异体移植后,对烧伤创面愈合存在一定的促进作用.
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Ca2+在电磁场刺激骨髓间充质干细胞增殖与分化过程中的内流变化
背景:已证实电磁场可通过cAMP-蛋白激酶A信号转导系统调控骨髓间充质于细胞的增殖与分化.但同样作为第二信使的Ca2+相关作用报道较少.目的:观察钙拮抗剂维拉帕米对电磁场刺激骨髓间充质干细胞增殖与分化的影响,以推断Ca2+在此过程中的内流变化.设计、时问及地点:电刺激细胞学体外观察,于2005-04/06在同济医院矫形外科实验室完成.材料:清洁级4～5周龄SD大鼠6只,维拉帕米为Sigma公司产品,Helmholtz线圈式磁场发生器由海军工程大学电机系设计制造.方法:贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,胰蛋白酶消化传代.取生长良好的第4代细胞,调节密度至1×107L-1,将其分种于4块96孔板内,200μL/孔.正常对照组不进行任何干预:暴磁组接种第2天将细胞放于置有Helmholtz线圈式磁场发生器的37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度细胞培养箱中进行暴磁,磁场强度0.8 mT,频率50Hz,每次暴磁30min,间隔12h,共6次;维拉帕米组加入20 μ mol/L维拉帕米;联合组加入20 μ mol/L维拉帕米后进行暴磁.主要观察指标:MTT法检测细胞增殖活性,向成骨细胞分化碱性磷酸酶的含量,改良Gomori氏钙钻法染色定性观察.结果:暴磁3 d后,与正常对照组比较,暴磁组细胞增殖活性明显升高(P<0.01),加入维拉帕米进行药物干预后这种促细胞增殖效应消失.未经暴磁的正常对照组、维拉帕米组细胞碱性磷酸酶含量基本相似,均明显高于其余2组(P<0.01);联合组细胞碱性磷酸酶含量高于暴磁组(P<0.01).碱性磷酸酶染色定性分析结果与上述数据基本一致.结论:在50Hz、0.8 mT电磁场作用下,骨髓间充质干细胞Ca2+内流发生变化,且该变化在骨髓间充质干细胞向成骨方向分化过程中产生部分抑制作用,在促其增殖过程中起主导作用.
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人胚胎视网膜前体细胞的体外培养条件及分化特性
背景:视网膜干细胞已在多种脊椎动物眼内发现,但目前对人类视网膜干细胞或前体细胞的生物学特性尚知之甚少.目的:探讨人胚胎视网膜前体细胞的体外培养条件及分化潜能.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-03/2006-02在中山大学中山眼科中心完成.材料:人胚胎神经视网膜来源于4例流产胎儿.方法:分离胚胎眼球神经视网膜,经胰酶消化法制备单细胞悬液,加入含表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、左旋谷氨酰胺的无血清高糖DMEM/F12培养基进行原代及传代培养.收集培养第1～3代的细胞克隆球体,接种到右旋多聚赖氨酸及层粘连蛋白预包被的6孔细胞培养板内,培养7 d后行免疫细胞化学染色.主要观察指标:倒置显微镜下观察视网膜前体细胞分化前后的形态变化,免疫细胞化学法鉴定分化细胞特性.结果:部分人胚胎神经视网膜细胞呈神经球体样悬浮生长,细胞球体边界清楚,折光性强,表达视网膜前体细胞标签巢蛋白;将其接种到分化条件下培养7 d后,细胞体积增大,变扁平,呈梭形、多角形,伸出大小不等的细胞突起,大部分细胞表达视网膜神经元细胞分子标签βⅢtubulin和胶质细胞标签胶质纤维酸性蛋白,少量细胞表达光感受器标签视紫红质.结论:人胚胎视网膜前体细胞可在体外扩增培养,在胎牛血清联合右旋多聚赖氨酸、层粘连蚩白特定诱导条件下,可以向视网膜神经元、胶质细胞及光感受器细胞分化.
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嗅黏膜嗅鞘细胞与肌基膜管联合移植修复脊髓损伤
目的:观察嗅黏膜来源的嗅鞘细胞与肌基膜管联合移植后对脊髓损伤的修复效果.方法:1只SD大鼠行背正中切口,顺椎旁肌纤维切除约1.5 cm×0.8 cm×0.6 cm的肌条,复温、漂洗并挤压肌条以排出肌浆,制成肌基膜管.4只SD大鼠麻醉后取出嗅黏膜,胶原酶消化法分离培养嗅鞘细胞,调整浓度至1011L-1.取SD大鼠50只,随机分成5组:嗅鞘细胞+肌基膜管联合组、嗅鞘细胞组、肌基膜管组、模犁组、正常组,10只/组.除正常组外,其余组均建立脊髓损伤模型,于 T10横断脊髓并切除约2 mm,将培养7 d的嗅鞘细胞与肌基膜管按组别分别植入脊髓断端,模型组用浸有DMEM的凝胶海绵桥接横断的脊髓.结果:移植后第8周,嗅鞘细胞+肌基膜管联合组、嗅鞘细胞组大鼠运动功能明显恢复,出现大关节大幅度运动,且前者运动功能BBB评分升高尤为显著(P<0.01):肌基膜管组大鼠仅见小关节轻微活动;模型组大鼠后肢挛缩重,无明显功能恢复.嗅鞘细胞+肌基膜管联合组后肢体感诱发电位及运动诱发电位的潜伏期显著低于其他各组(P<0.01).苏木精一伊红染色和核转录因子免疫组化染色结果显示,嗅鞘细胞+肌基膜管联合组、嗅鞘细胞组的移植物与损伤脊髓整合较好,未见明显空洞,有大量染色呈阳性的纤维,纤维较长,由近侧端长入远侧端:肌基膜管组有空洞形成,染色阳性的纤维数量少,纤维细小且排列紊乱;模型组端断间充满瘢痕组织,未见明显染色阳性纤维.结论:嗅鞘细胞移植可促进脊髓损伤后的轴突再生,肌基膜管作为一种生物管道,两者联合应用可明显促进脊髓损伤后的轴突再生及功能恢复.
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双重荧光标记验证静脉移植碱性成纤维细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞在脑缺血模型大鼠脑内的存活及分化
背景:碱性成纤维细胞生长因子可以促进骨髓间充质干细胞的增殖和向神经细胞方向分化,并被认为是胶质细胞的分裂原.目的:以顾重荧光标记验证静脉移植碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞在脑缺血模型大鼠脑内的存活及分化情况,及其向神经元样细胞和神经胶质细胞分化的趋势.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-07/2006-03在中南大学实验动物中心实验室完成.材料:选用50只SD大鼠,按随机数字表法分为4组:假手术组(n=10),脑缺血/再灌注损伤模型组(n=10),骨髓问充质干细胞治疗组(n=15).碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞治疗组(n=15).方法:除假手术组外,其余3组制各局灶性脑缺血再灌注模型.分别将骨髓间充质干细胞或碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞通过静脉移植至实验性脑缺血大鼠体内,脑缺血再灌注损伤组大鼠注入相同体积的DMEM培养基.主要观察指标:应用5-溴-2-脱氧尿苷-神经元特异核蛋白及5-溴-2-脱氧尿苷-胶质纤维酸性蛋白双重荧光标记法观察移植细胞在脑内的存活和分化情况,比较各组大鼠脑缺血后的神经功能评分及脑梗死体积变化.结果:移植7 d后,碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞组大鼠脑内5-溴-2-脱氧尿苷阳性细胞数、5-溴-2-脱氧尿苷-神经元特异核蛋白双标阳性细胞数均高于骨髓间充质干细胞治疗组(P<0.05),两组间5-溴-2-脱氧尿苷-胶质纤维酸性蛋鞍白双标阳性细胞数差异无显著性意义(P>0.05).再灌注7 d后,静脉移植骨髓间充质干细胞和碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞均能改善脑缺血后大鼠的神经功能、减少脑梗死体积,碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞的作用明显优于骨髓间充质干细胞.结论:碱性成纤维细胞生长因子诱导的骨髓间充质干细胞静脉移植后可在脑内缺血区存活,并分化为比例更合适的神经元和神经胶质细胞,发挥神经修复作用.
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小鼠胚胎干细胞源性肝细胞的培养体系及分选
背景:已证实细胞可以向肝细胞分化.目前的研究集中在诱导分化上,对分化的肝细胞进行分选和进一步扩增研究较少.目的:比较不同的培养体系对胚胎干细胞源性的肝细胞生长的影响.设计:对比观察.材料:ESD-3细胞由上海细胞生物学研究所丛笑倩教授提供.方法:采用半固体培养D3小鼠胚胎下细胞系,形成胚胎体.将来源于18 d的胚胎体用胰酶消化为单个细胞,在胶原处理过的培养皿中贴壁2 h,分别采用Novaslem培养体系、肝细胞培养液培养体系和普通培养体系培养3 d.前2种培养体系又各分为含去除肝脏小鼠血清、含正常小鼠血清和无血清组3组,普通的培养体系分为含正常小鼠血清和含体积分数为0.1的胎牛血清2组.每组细胞均加入20μ g/L肘细胞生长因子、20 μ g/L表皮生长因子.主要观察指标:细胞计数法分析细胞的增殖率,反转录-聚合酶链反应检测自蛋白的表达以及有限稀释聚合酶链反应法半定量检测胚胎源性盯细胞的含量.结果:①胚胎工细胞源性的肘细胞在不同的培养体系中,生长速度和肝细胞的含量不一样,在加有正常小鼠血清的Novastem培养基中,细胞增殖快,在无血清的Novastem培养体系中,胚胎干细胞源性的肝细胞含量明显增高.②除了DMEM+体积分数为0.1的胎牛血清组未检测到外,其他组均检测到了白蛋白表达.⑨在无血清Novastem培养体系中,肝样细胞含量明显增多.结论:无血清的Novastern培养体系能分选和扩增分化的肝细胞,提高肝细胞纯度.
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预损伤嗅黏膜对自体嗅鞘细胞体外培养的作用
目的:比较预损伤嗅黏膜与正常嗅黏膜来源的嗅鞘细胞生长特性和生物学活性的差异.方法:雄性成年SD大鼠10只,随机分为嗅黏膜损伤组、正常组.5只,组.嗅黏膜损伤组大鼠麻醉后采用自制弯头针,深入鼻腔内直至鼻中隔后1/3处,针尖抵住鼻中隔后切割数下至出血,填塞酒精棉条压迫止血.正常组大鼠不做任何处理.伤后7 d取两组大鼠鼻中隔,将双侧鼻黏膜后1/3从鼻中隔刮下,胰酶消化后体外分离培养嗅黏膜嗅鞘细胞,调整浓度至1×109 L-1,采用改良NASH差速贴壁法进行纯化.结果:嗅鞘细胞纯度达70%时.正常组需14 d,嗅黏膜损伤组需12 d.正常组培养7 d后细胞进入对数期,嗅黏膜损伤组培养5 d后细胞进入对数期,两组嗅鞘细胞进入平台期后生长趋于缓慢,数量维持在106左右.在细胞生长周期的相同时间点.嗅黏膜损伤组嗅鞘细胞活性大于正常组(t=19.001 3,P<0.001),两组嗅鞘细胞分泌的神经营养因子3质量浓度基本相似(P>0.05).结论:预损伤处理嗅黏膜能够加快嗅黏膜嗅鞘细胞的增殖分化,且活性较高.
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氯甲基苯甲酰氨荧光染料标记大鼠骨髓间质干细胞的体内示踪
背景:目前广泛应用丁骨髓间质干细胞的标记方法主要为绿色荧光蛋白标记法,但标记与固定程序复杂,操作繁琐,易出现偏差.氯甲基苯甲酰氨(Chloromethyl-benzamidodialkylearbocyanine.CM-Dil)是亲脂性膜荧光染料,能够与含有肽和蛋白质的硫氧基结合进而标记整个细胞.目的:探讨CM-Dil对大鼠骨髓间质干细胞体内示踪的可行性.设计、时间及地点:体内外细胞学观察,于2007-05/12在中山大学干细胞与组织工程研究中心、中山大学动物实验中心完成.材料:SPF级Wistar大鼠40只,由中山大学实验动物中心提供.CM-Dil为美国Sigma公司产品.方法:在体外,以标记CM-Dil的骨髓间质干细胞作为实验组,以未标记CM-Dil的骨髓问质干细胞作为对照组,比较两组细胞生长与增殖情况,MTT法检测细胞牛长增殖情况.在体内,分别将标记CM-Dil的骨髓间质干细胞经门静脉移植及肝内培养,于移植后第7,15,21,30天制备肝脏切片.主要观察指标:骨髓间质干细胞CM-Dil标记率,标记细胞在肝内定植、生长与分布.结果:体外培养结果显示,两组骨髓间质干细胞在细胞生长、增殖、分裂以及形态学上均基本相似,在绿色光激发下,CM-Dil发出红色荧光,24 h后细胞标记率为100%,21 d后CM-Dil标记的骨髓间质干细胞荧光开始淬灭.体内实验中.经门静脉移植的骨髓间质干细胞在肝脏内主要位于间质,呈椭圆形或不规则形的分化细胞;肝内培养的骨髓间质干细胞在培养孔内呈"贴壁牛长",为椭圆形分化细胞,未发现骨髓间质干细胞进入并定植于肝组织内:CM-Dil标记的骨髓间质干细胞荧光开始淬灭的时间亦为21 d.结论:CM-Dil染色简单、方便、稳定,荧光开始淬灭时间较长,可望成为大鼠骨髓间质干细胞体内示踪的新方法.
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胰腺干细胞转分化为胰岛样细胞与天然胰岛细胞的基因差异性
背景:目前胰腺干细胞在体外诱导转分化效率和分化成熟度较低,哪些基因在转分化中起关键性调控作用尚不清楚.目的:通过基因表达谱芯片分析转分化的胰岛样细胞与天然胰岛细胞在成熟度上的基因差异,筛选对转分化起关键性调节作用的基因.设计、时间及地点:基因水平的对照实验.于2004-07/2006-04在暨南大学第二临床医学院(深圳市人民医院)临床医学研究中心实验室完成.材料:SD大鼠胰腺分离的胰腺干细胞转分化的胰岛样细胞团,SD大鼠分离的天然胰岛.方法:分离和消化SD大鼠胰腺,用差异性贴壁、低血清培养等方法纯化出大鼠胰腺导管上皮细胞,利用免疫组化方法鉴定CK-19和PDX-1.通过含有exendin-4、角质细胞生长因子、尼克酰胺等细胞因子和葡萄糖的培养基,使之转分化为胰岛样细胞团,应用双硫腙染色和胰岛素免疫荧光染色鉴定.提取转分化的胰岛样细胞和天然胰岛细胞RNA,利用大鼠22000位点寡核苷酸芯片进行杂交,筛选差异性表达的基因,并进一步采用反转录-聚合酶链反应验证13个相关基因的表达.主要观察指标:转分化的胰岛样细胞团和天然胰岛鉴定,差异性基因筛选和鉴定.＃结果:筛选出差异表达基凶1 072个,其中表达上调的基因397个,上调10倍以上的基因35个;表达下调的基因有675个,其中下调20倍以上的基因37个.上调10倍以上的差异性基因中与细胞组织和生物发生相关基因多,下调20倍以下的基因中与发育相关基因多.对选定的13个与胰岛细胞发育密切相关的基因PDX-1,PDX-4,PDX.6,Nkx2.2,Nkx6.1,Nkx6.2,Ptf1a,Isll,Ngn3,Myt1,Ptf1a,capn5,Ppy,通过反转录-聚合酶链反应进一步验证与芯片检测结果一致.结论:转分化的胰岛样细胞与天然胰岛细胞基因表达差异显著,参与胰岛发育的关键基因表达明显下调.
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骨髓基质干细胞移植对脑梗死大鼠生长相关蛋白43表达的影响
背景:关于骨髓干细胞移植修复神经损伤的研究已有一些报道,但对细胞移植的时间、方式以及检测指标各有不同观点.目的:通过建立大鼠局灶性脑缺血模型,观察骨髓幕质干细胞移植内源性轴突再生标志物生长相关蛋白43的表达变化.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-03/2007-10在武汉大学人民医院神经科实验室和丝宝药业有限公司博士后科研工作站完成.材料:选取清洁级成年SD大鼠印只,按随机数字表法分为3组.模型对照组、假手术组、干细胞移植组各20只.方法:另取2月龄SD大鼠4只用于制备骨髓基质细胞,骨髓基质干细胞悬液用5-溴脱氧尿嘧啶核苷法标记.假手术组大鼠麻醉后分离结扎右侧颈总动脉:其余大鼠制备右侧大脑中动脉缺血模型,造模后24 h向干细胞移植组大鼠左侧侧脑室推注20 μ L 5×105的骨髓基质干细胞,模型对照组推注等磷酸盐缓冲液.主要观察指标:每组大鼠于移植前、移植后7,14,21和28 d应用免疫组化法检测脑梗死灶周边区生长相关蛋白43的表达和移植细胞的存活及迁移情况.并记录神经功能缺损评分.结果:培养的骨髓基质干细胞经5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记后移植到大鼠左侧侧脑室,可迁移到梗死灶周围,移植后7 d在梗死灶能检测到5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记的阳性细胞,移植后14 d增多达高峰,移植后28 d逐渐减少并消失.免疫组化图像分析结果显示干细胞移植组大鼠在移植后7,14 d脑梗死灶周边区生长相关蛋白43免疫活性显著高于模型对照组(P<0.05).假手术组大鼠无神经损伤症状,神经功能评分均为0分:随时间的推移.模型对照组和干细胞移植组的神经功能评览分逐渐降低,从移植后14 d开始,干细胞移植组的神经功能评分都明显低于模型对照组(P<0.05).结论:骨髓基质干细胞移植能上调局灶性脑缺血大鼠脑梗死灶周边区生长相关蛋白43的表达,与大鼠神经功能的恢复趋势相符.
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人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰成肌细胞移植心肌梗死大鼠心肌细胞胰岛素样生长因子Ⅰ及端粒酶反转录酶mRNA的表达
目的:检测人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞移植后,心肌梗死大鼠血浆及心肌组织内胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白浓度的变化,以及心肌细胞内胰岛素样生长因子Ⅰ和端粒酶反转录酶mRNA水平的表达.方法:人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞、未转染的止常鼠骨骼肌成肌细胞均由实验室前期制各.健康雄性SD大鼠90只,取12只作为假于术组,剩余大鼠结扎冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型,结扎后24 h存活36只,随机分为对照组和实验组,18只/组.造模后24 h.实验组在动物后肢局部分多点注射总量为0.1 mL的人胰岛素样生长因子Ⅰ基闪修饰的鼠骨骼肌成肌细胞悬液.(2～4)×1010L-1细胞;对照组和假手术组给予等量未转染的正常鼠骨骼肌成肌细胞悬液.应用ELISA法检测血浆和心肌组织胰岛素样生长因子Ⅰ的表达,RT-PCR检测心肌细胞中胰岛素样生长因子Ⅰ与端粒酶反转录酶mRNA水平.结果:①细胞移植后1,2,4周,假手术组血浆和心肌组织内鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的表达无明显变化(P>0.05);与假手术组比较,实验组和对照组血浆中鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的质量浓度均显著降低(P<0.01),心肌组织中鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的含量均明显升高,于第2周达峰值(P<0.01),且实验组较对照组升高更为显著(P<0.01).②细胞移植后1,2,4周,假手术组和对照组大鼠血浆和心肌组织内均未检测到人胰岛素样生长因子Ⅰ的表达:实验组于第1周即表达人胰岛素样生长因子Ⅰ,含量显著高于其余两组(P<0.01).③细胞移植后第1周,实验组和对照组心肌细胞鼠胰岛素样生长因子1mRNA相对表达量明显高于假于术组(P<0.01):至第2周实验组达峰值,显著高于对照组(P<0.01),然后逐步下降.实验组和对照组心肌细胞端粒酶反转录酶mRNA的表达均逐渐呈升高趋势,且实验组更为显著(P<0.01).结论:人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞植入心肌梗死大鼠体内1周后,能有效合成和分泌胰岛素样生长因子Ⅰ,明显促进心肌梗死早期大鼠心肌细胞鼠胰岛素样生长因子Ⅰ及端粒酶反转录酶mRNA的表达,同时可持续促进心肌及全身其他组织鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的分泌.
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神经干细胞与神经生长因子对豚鼠损伤内耳保护效果的比较
背景:研究证明神经干细胞在体外能自然分泌一定量的神经生长因子,因此若将神经干细胞移植入内耳,可作为神经生长因子源源不断的供体.目的:比较神经干细胞内耳移植和神经生长因子肌肉注射两种方式对豚鼠损伤内耳的保护效果.设计:随机对照动物实验.材料:新生24 h豚鼠5只.用于脑海马神经干细胞的制备.方法:①动物实验:健康豚鼠40只,随机分为6组:正常对照组4只,不施加任何处理因素;单纯耳蜗打孔组8只,仅施以耳蜗底转骨壁打孔术;单纯神经干细胞移植组8只,经耳蜗底转骨壁打孔后,向内耳注入Brdu标记的神经干细胞;致聋模型组4只,按4 mg/kg体质量连续3 d腹腔注射顺铂建立耳聋模型;致聋后神经干细胞移植组8只,先造成耳聋模型,而后经耳蜗底转骨壁打孔向内耳注入Brdu标记的神经干细胞:致聋后神经生长因子移植组8只,先造成耳聋模型.然后肌肉注射神经生长因子.移植后14,28 d测定纯音听阈值,各处死4只用于耳蜗基底膜四唑氮蓝铺片、苏木精一伊红染色、Brdu免疫组化染色、神经生长因子免疫组化染色.②RT-PCR检测实验:健康豚鼠30只,随机分为4组:正常对照组8只、致聋模型组8只、致聋后神经干细胞移植组5只、致聋后神经生长因子移植组9只,干预措施同上.移植后28 d RT-PCR检测各组动物耳蜗组织神经生长因子rnRNA的表达.结果:与正常对照组比较,移植后14,28 d致聋模型组、致聋后神经干细胞移植组、致聋后神经生长因子移植组的纯音听阈值均显著升高(P<0.05),但后2组升高幅度明显低于致聋模型组(P<0.05),且毛细胞排列整齐,无缺失、核溶解、碎裂等现象,螺旋神经节细胞的结构及形态基本接近正常对照组.移植后7 d,耳蜗底转的移植位点、鼓阶蜗轴侧周围及基底膜下方均町见大量BrdU阳性细胞,血管纹、鼓唇和蜗神经纤维神经生长因子免疫组化染色均呈阳性表达,28 d时致聋后神经干细胞移植组染色程度强于致聋后神经生长因子移植组.RT-PCR检测耳蜗神经生长凶子mRNA的表达与免疫组化染色结果基本一致.结论:内耳移植神经干细胞和肌肉注射神经生长因子对豚鼠损伤内耳的毛细胞、螺旋神经节以及听力保护作用基本相似,但免疫组化及RT-PCR结果表明前者耳蜗内分布的神经生长因子较后者更为密集.
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粒细胞集落刺激因子动员对大鼠内皮祖细胞体外扩增的影响
背景:内皮祖细胞在缺血件疾病治疗应用中存在数量低的问题,许多细胞因子影响其动员效果和功能.目的:观察粒细胞集落刺激因子动员对体外扩增骨髓源性内皮祖细胞数量及功能的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-08/2008 03存北京大学人民医院肝病研究所完成.材料:SPF级健康成年SD雄性大鼠16只,随机分为动员组和对照组,8只/组.重组人粒细胞集落刺激因子为麒麟鲲鹏生物药业有限公司产品.方法:实验前动员组大鼠皮下注射经生理盐水稀释的重组人粒细胞集落刺激因子10μ g/kg.2次/d,共5 d.采用密度梯度离心法分别从两组大鼠骨髓获取单个核细胞,洗涤后按2×107/孔接种在包被大鼠纤连蛋白的6孔板上,采用贴壁法纯化得到内皮祖细胞.主要观察指标:骨髓单个核细胞集落数及细胞表犁,骨髓源件内皮祖细胞贴壁情况及细胞表型,通过DiI-acLDL摄取、体外血管生成进行内皮祖细胞功能学鉴定,透射电镜观察细胞超微结构.结果:与对照组比较,动员组骨髓单个核细胞集落增多,CD45+/CD34+、CD133+和Flk-1+阳性率均明显升高(F=5.655～61.892,P<0.05).培养第7,9天与对照组比较,动员组骨髓源性内皮祖细胞贴壁数、CD45+/CD34+、CD133+和Flk-1+阳性率均明显升高(F=5.694～38.879,P<0.05).贴肇绌胞FITC-UEA-1/Dil-acLDL双荧光染色阳性率为90%,接种于Matrigel包被的培养板24 h后形成毛细血管索样结构,胞质内有Weibel-Palade小体存在.结论:粒细胞集落刺激因子动员能增加骨髓源性内皮祖细胞的数量,并促进其分化、增殖功能.
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急性移植物抗宿主病患者白细胞介素21水平的变化
回顾性分析2003-03/2007-01哈尔滨市第一医院骨髓移植科行异基因造血干细胞移植治疗的白血病患者20例,男8例,女12例,年龄8～55岁.其中慢性粒细胞白血病4例,急性粒细胞白血病(M2)5例,急性粒单细胞白血病(M4)2例,急性单核细胞白血病(M5)3例,急性淋巴细胞白血病6例.15例外周血干细胞移植只有1例HLA-CW位点亚型不合,其余HLA全部相合,1例无关骨髓移植HIA全部相合.观察伞部患者急性移植物抗宿主病的发病情况,移植前后定期采集20例患者外周血,采用双夹心酶联免疫吸附法检测其细胞因子白细胞介素21的水平.结粜显示异基因造血干细胞移植后20例患者全部获得造血功能重建,中性粒细胞恢复到0.5×109L-1,血小板恢复到20×109L-1的中位时间分别为移植后13.5 d及18 d.发生急性移植物抗宿主病患者的白细胞介素21水平较移植前及未发生患者明显升高(P<0.01).提示检测异基因造血干细胞移植后患者血清白细胞介素21水平有助于预测急性移植物抗宿主病的发生.
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外周血CD34+细胞形貌在系统性红斑狼疮患者与健康人的差异比较
背景:系统性红斑狼疮患者CD3矿细胞是否存在异常目前仍有争议.目的:以健康人为对照,应用原子力显微镜观察比较二者外周血CD34+细胞形貌特征.设计:病例一对照分析.对象:6例系统性红斑狼疮患者,男3例,女3例,平均年龄26.3岁,平均病程19.0个月,均符合1982年美国风湿病学会制定的诊断标准.3例健康志愿者为对照,两组对象基线资料具有可比性.方法:系统性红斑狼疮患者均静脉注射环磷酰胺4 e/m2,白细胞<1.0×109L-1时给予粒细胞集落刺激因子5μg/kg,待白细胞>5.58×109 L-1及CD34+>2%时采集外周血干细胞.3例健康志愿者采取甲用粒细胞集落刺激因子为动员方案.向外周血干细胞中加入CD34 MicroBeads FcR和FcR Blocking Reagent制备细胞悬液,离心弃上清,重恳后过滤,应用免疫磁珠细胞分选技术纯化CD34+细胞.主要观察指标:原予力显微镜观察细胞表面形貌,每例患者随机测20个细胞,每个细胞不同部位做2 μ m×2 μ m图像5幅,将5幅陶像的直径、平均粗糙度、均方根粗糙度、平均高度的均值作为该细胞的参数.结果:成像范围在12μm× 12μm时,可将细胞整体模拟成像.成像范围在2 μ m×2μm时,两组细胞表面均可见大小,深浅不一的凹陷及椭圆形球状突起,粗糙小平.与健展志愿者比较,系统性红斑狼疮患者外周血CD34+细胞的直径、平均粗糙度、均方根粗糙度、平均高度等参数经单向方差分析差异无显著性意义(F=0.203-4.553,P均>0.05).结论:应用原子力显微镜选择成像范围在2 μ m×2μm时可清晰观测外周血CD34+细胞的表面结构,且系统性红斑狼疮患者和健康人的外周血CD34+细胞形貌基本相似.
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兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定
背景:目前对骨髓间充质干细胞常用的分离方法有密度梯度离心法、贴壁筛选分离法.目的:联合应用密度梯度离心法和贴壁筛选分离法体外分离培养、扩增兔骨髓间充质干细胞,并对其进行罄定.设计、时间及地点:对比观察的细胞学实验,于2007-10/2008-03在上海市第六人民医院中心实验室完成.材料:2月龄新西兰纯种大耳白兔6只用于骨髓间充质干细胞取材与原代培养,1.073 ke/L的Percoll分离液.方法:实验采用Percol分离液利用密度梯度离心法及结合贴壁分离筛选法来分离、纯化骨髓间充质干细胞,在采用密度梯度离心法得到骨髓间充质干细胞后,经贴壁培养及反复换液纯化骨髓问充质干细胞.分别取第3,5,7,9代骨髓间充质干细胞,行细胞计数,绘制细胞生长曲线.主要观察指标:倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况.采用CD44及CD34抗体进行间接免疫荧光标记鉴定培养的干细胞.CD44染色呈阳性,CD34染色呈阴性,说明所提取、纯化的细胞是骨髓间充质干细胞.结果:增殖传代的骨髓问充质干细胞呈长梭形均匀分布生长,形态比原代培养的细胞更均匀,细胞生长旺盛、增殖迅速,胞核明显,核仁清晰,核浆比例大,细胞形态均匀,平行排列呈螺旋状或漩涡状,传代至第5代时无明显变化.随传代次数的增加,细胞增殖能力逐渐下降,第3～5代细胞增殖能力强.所分离培养的细胞均表达CD44,不表达CD34.结论:在体外采用密度梯度离心及贴壁培养法可获得高纯度的兔骨髓间充质干细胞.
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地中海贫血患儿血清特异性群体反应性抗体对脐血造血干细胞增殖、分化能力的影响
背景:已有报道证实群体反应性抗体在实体器官移植受者排斥反应中起着重要作用,并且与植入物功能衰竭呈正相关.目的:实验拟观察反复输血地中海贫血患儿血清中特异性群体反应性抗体对脐血造血干/祖细胞增殖、分化能力的影响.设计、时间及地点:体外细胞学实验,于2006-01/2007-08在中山大学附属第二医院医学研究中心完成.材料:5份健康足月产妇脐带血,每份80-100 mL.反复输血地中海贫血患儿的群体反应性抗体血清样本.5份健康儿童AB分型血清样本.6份阳性抗凝静脉血样本10 mL.方法:采用聚蔗糖-泛影葡胺梯度离心法分离脐带血单个核细胞.将1×105脐血单个核细胞与分别与健康儿童AB血清50 μ L、0,50,100μL不同浓度群体反应性抗体血清混合后,再将上述细胞混合物与兔补体共同孵育进行半固体集落培养.主要观察指标:倒置显微镜下观察并计数共培养第7,14天总集落数和各种集落数.结果:脐血造血干/祖细胞受群体反应性抗体血清作用后,其半固体集落培养的总集落数以及各种集落数均有不同程度的下降,其中总集落数和粒单系集落形成单位的下降数,经统计学处理差异具有显著性意义(P<0.01):群体反应性抗体血清量与总集落、粒单系集落形成单位、粒红单核巨核系集落形成单位、红系爆式集落形成单位、巨核系爆式集落形成单位、巨核系集落形成单位之间的肯德尔相关分析呈负相关,经统计学处理差异有显著性意义(P<0.05).结论:特异性群体反应性抗体对脐血造血干/祖细胞的增殖、分化能力具有抑制作用,并ⅱ且抑制作用与群体反应性抗体剂量相关:群体反应性抗体剂量越大,抑制作用越强.
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鼠脑C6胶质瘤细胞上清液诱导人骨髓间充质千细胞向神经元样细胞的分化
目的:观察人骨髓间充质干细胞经鼠脑C6胶质瘤细胞上清液诱导后向神经元样细胞方向的分化情况.方法:取肝素抗凝人骨髓血,Percoll梯度法体外分离培养骨髓间充质干细胞,胰酶消化后传代扩增.取第4～6代骨髓间充质干细胞,当细胞达90%融合时,按2×103/孔接种于24孔板内,第2天分为两组,诱导组用含有50%C6胶质瘤细胞上清液的完全培养基(含体积分数为0.1胎牛血清的L-DMEM培养基)诱导,每隔2 d换液1次;对照组单纯加入完全培养基进行培养.诱导后3 d,两组细胞采用S-P法进行免疫细胞化学染色,检测神经元特异性标志物的表达.结果:诱导24 h后,诱导组多数骨髓间充质干细胞表现出典型的神经元样外观,对照组细胞形态无明显变化.诱导3 d后,诱导组神经元烯醇化酶阳性细胞率显著高于对照组(P<0.01);诱导组神经丝蛋白阳性细胞率为(44.2±2.4)%,对照组为阴性:两组胶质纤维酸性蛋白均呈阴性表达.结论:鼠脑C6胶质瘤细胞上清液可成功诱导入骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化.
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骨髓间充质干细胞自体移植促进兔缺血肢体的血管生成
背景:常规药物治疗、介入或血管旁路移植手术对下肢动脉闭塞症的远期疗效均不理想.近年来采用干细胞的血管再生疗法在梗死部位修复或重新建立有效侧支循环逐渐成为可能.目的:验证骨髓间充质干细胞自体移植对兔缺血后肢血管再生的促进作用.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005 08/2006-11在江苏省血吸寄生虫病防治研究所完成.材料:选用新西兰大白兔8只,制备兔后肢缺血模犁.按随机数字表法分为2组,实验组及对照组各4只.方法:分离培养实验组兔骨髓间充质干细胞,5-溴-2-脱氧尿苷标记,将骨髓间克质干细胞制成悬液注射于实验组兔后肢缺血部位;对照组注射等量生理盐水.主要观察指标:2周后行兔股动脉二维及彩色多普勒超声检测,观察移植前后的血管内径、血流峰值速度及血流加速时间等;取缺血部位肌肉组织,通过免疫荧光及苏木精一伊红染色观察移植细胞分布及血管生成情况.结果:细胞移植2周后实验组兔的股动脉内径、血流峰值速度均大于对照组(P<0.01),血流加速时间短于对照组(P<0.01).免疫荧光染色结果显示实验组兔移植部位有抗5-溴-2-脱氧尿苷染色阳性细胞存在:苏木精-伊红染色结果显示实验组缺血部位血管密度高于对照组.结论:骨髓间充质干细胞具有促进血管生成的作用,自体移植可望成为一种简单的、有效的治疗下肢缺血的方法.
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18FDG和99Tcm-MIBI双核素心肌显像评价经心内膜心肌内移植骨髓间充质干细胞的效果
目的:比较18FDG和99Tcm=-MIBI双核素心肌显像评价经心内膜心肌内移植骨髓间充质干细胞的效果.方法:成年小型猪8头,麻醉后利用心血管支架置入技术栓塞冠状动脉左前降支远端建立心肌梗死模型,随机均分为2组.造模2周后将分离纯化的猪自体骨髓间质干细胞通过NOGA电机械标测系统经心内膜注射移植至细胞组梗死区,对照组仅注射胎牛血清.移植前及移植后4周分别行19FDG和99Tcm-MIBI双核素心肌显像.结果:移植前两组均可见左室心尖部及前壁呈显著放射性缺损.与对照组比较,移植后4周细胞组梗死区18FDG和99Tcm-MIBI双核素心肌显像所呈现的缺血/梗死节段数均明显减少(P<0.05).与移植前比较,移植后4周对照组无明显变化(P>0.05):细胞组梗死区18FDG和99Tcn-MIBI双核素心肌显像所呈现的缺血,梗死节段数均明显减少(P<0.05),且99Tcm-MIBI显像示减少幅度更大(P<0.05).结论:经心内膜心肌内注射移植骨髓间充质干细胞可显著改善心肌灌注损伤,增加存活心肌,且99Tcm-MIBI显像改善效果优于18FDG显像.
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3T3-L1前脂肪细胞的体外培养及胰岛素样生长因子1对其增殖、分化的作用
背景:前脂肪细胞是一类具有增殖和向脂肪细胞分化潜力的特异化的前体细胞,如果能够找到可以强力促进前脂肪细胞增殖和分化的因子或药物,在脂肪组织移植的同时使用,则有希望提高脂肪组织的移植效果.目的:摸索体外培养经典的3T3-L1前脂肪细胞的佳培养环境并积累培养经验,观察胰岛素样生长因子1对3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化的影响,并探求胰岛素样生长因子1的佳作用剂量.设计、时间及地点:以细胞为对象的对照观察实验,于2007-10/2008-02在辽宁医学院科学实验中心完成.材料:3T3-L1前脂肪细胞株购于上海中科院生命科学院:胰岛素样生长因子1购于美国Biological公司.方法:根据3T3-L1前脂肪细胞的体外培养条件分为6组:空白对照组应用含体积分数为0.1的胎牛血清的标准高糖DMEM培养基培养:各实验组分别应用含有5,10,20,50,100 μ g/L胰岛素样生长因子1的含体积分数为0.1的胎牛血清的高糖DMEM培养基培养.主要观察指标:倒置显微镜下观察各组3T3-L1前脂肪细胞的生长、增殖及分化情况并拍照记录.待细胞铺满瓶底达到单层汇合时,应用流式细胞仪检测细胞周期,应用四甲基偶氮唑盐比色法测定3T3-L1前脂肪细胞的增殖率:应用油红O染色提取法测定3T3-L1前脂肪细胞内脂肪含量的增殖率.结果:①倒置显微镜下观察分化前3T3-L1前脂肪细胞呈梭形,胞浆内无脂滴,分化后3T3-L1前脂细胞呈圆形,胞浆内舍有大量的脂滴,脂滴聚集于核周,被油红O染成橙红色,形成"戒环"样形态.②四甲基偶氮唑盐比色法和油红O染色提取法检测结果均显示,不同剂鞋的胰岛素样生长因子1组中3T3-L1前脂肪细胞的增殖率及细胞内脂肪含量的增殖率均高于空白对照组(P<0.05),胰岛素样生长因子1 20 μ g/L组对3T3-L1前脂肪细胞的增殖、分化作用为明显(P<0.05):流式细胞仪的分析结果与四甲基偶氮唑盐比色法及油红O染色提取法的枪测结果基本一致.结论:体外细胞培养实验表明,胰岛素样生长因子1对3T3-L1前脂肪细胞的增殖、分化有明显促进作用,其促进作用与浓度并非成正比,而是达到一定剂量后,其促进作用不再增加,而这个剂量接近本实验的佳剂量值,即20 μ g/L.
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鹿茸再生及干细胞研究进展
鹿茸是哺乳动物中惟一能再生的器官,也是再生医学和干细胞研究的热点领域,将成为一个很好的生物医学研究模型.鹿茸的再生是基于干细胞,自身的干细胞受到刺激而发生增殖与分化.与肢体发育有相似之处的发育模式,不同于蝾螈的再生.鹿茸发育的调控模式、鹿茸干细胞生长机制对于肢体再生医学、干细胞研究具有重要的意义.很多科学家对鹿茸进行了深入的研究,提出了很多理论假说.文章对鹿茸发育领域鹿茸再生和鹿茸干细胞的研究成果进行汇总分析,介绍了鹿茸发育领域的研究技术及其相关理论基础.
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低能激光照射及嗅鞘细胞移植在脊髓损伤中的应用
脊髓损伤是一种严重危害人类健康的疾病,因其少突胶质细胞不能形成轴突迁移引导的通道,并分泌抑制因子,以及星形胶质细胞在损伤区快速反应性增生形成胶质瘢痕,抑制轴突的生长,使脊髓损伤的治疗成为目前医学领域的一个棘手问题.嗅鞘细胞具有良好的轴突再生和准确形成靶特异性突轴连接的能力;低能激光照射对神经系统及嗅鞘细胞的作用包括,保留甚至促进受损神经元的活性,减少瘢痕的形成,阻止神经元的退行性改变,又能通过干拢一些因素而增强嗅鞘细胞的活性.嗅鞘细胞移植及低能激光照射在脊髓损伤的修复中具有重要的作用.
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干细胞移植心肌再生治疗的活体示踪技术
干细胞移植治疗心肌梗死正处在一个需要循证医学证据的关键时候,虽然国内外学者对于干细胞移植心肌再生技术做了很多尝试,但终的评估需要活体示踪技术来提供细胞定位及定量的客观证据.已有生物发光和荧光光学影像技术、超声影像技术、正电子发射计算机断层扫描、单光子发射计算机断层技术、核磁共振影像等技术的应用研究,但都有其优缺点,如:荧光光学影像技术只适用于小动物和浅表组织的研究;超卢影像技术虽然能够达到单个细胞追踪水平研究,但解剖探讨范围有限,定量困难;单光子发射计算机断层技术或正电子发射计算机断层扣描技术虽然具有高分辨率,但长期追踪需要调控干细胞的基因表达、转基因的稳定表达.对于干细胞的活体示踪研究尚属初步阶段,研究方法有待进一步发展和完善.
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肿瘤干细胞与胃癌术
与胚胎干细胞一样,成体干细胞也具有强大的分化可塑性,具有分化成其他细胞或组织的潜能.成为当今研究的热点.文章从干细胞研究着手,重点讲述肿瘤干细胞学说的兴起,认为肿瘤干细胞足肿瘤生长、侵袭、转移和复发的根源;并分析胃部组织干细胞,试图寻找胃癌与胃部组织干细胞有着某种联系,分析胃癌可能也是一种干细胞性疾病.
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信号转导通路在神经干细胞分化及其修复脊髓损伤过程中的作用
近年来神经干细胞的研究给中枢神经系统损伤患者带来了新的希望,但神经干细胞的分化诱导仍然是医学界的一大难题.文章试对神经干细胞分化发育过程的基因信号转导通路Notch信号途径、螺旋-环-螺旋转录因子家族信号途径及Wnt信号途径等作以综合分析.探讨这些基因信号转导通路对神经干细胞分化的作用及其修复脊髓损伤的前景.神经干细胞的分化发育受多种途径的共同作用,基因水平的调控,局部微环境以及各种生长因子的作用都对其分化发育有重要影响;其对脊髓损伤的修复具有重要作用.
